Luận văn xác định cấu trúc của polysaccharide dạng agar chiết từ một số loài rong đỏ

8 MỞ ĐẦU Rong biển nguồn hoạt chất sinh học bao gồm carotenoid, acid béo, vitamin, muối khoáng ….[1] Trong số hoạt chất sinh học polysaccharide chất thu hút nhà nghiên cứu nhà sản xuất thực phẩm chức có cấu trúc đa dạng hoạt tính sinh học phong phú Polysaccharide dạng agar tách chiết từ loài rong thuộc ngành rong Đỏ (Agarophyte) Nhờ khả tạo gel đặc biệt hoạt tính oxi hóa cao mà sử dụng rộng rãi lĩnh vực công nghệ chế biến thực phẩm, nông nghiệp, y dược công nghệ sinh học Nguyên liệu chủ yếu để chế biến agar giới loài rong thuộc họ Gracilariales (Gracilaria Hydropuntia) chiếm 60% sản lượng nguyên liệu họ Gelidiales (Gelidium Pterocladia) chiếm 40% sản lượng ngun liệu [2] Đã có nhiều cơng trình cơng bố cấu trúc hoạt tính sinh học số loài rong Agarophytes vùng biển khác giới Kết cho thấy tùy theo lồi vị trí địa lý nơi rong sinh sống mà cấu trúc hóa học, tính chất gel hoạt tính sinh học polysaccharide chiết từ loài rong khác Tuy nhiên tất polysaccharide dạng agar thể số hoạt tính sinh học kháng u, kháng khuẩn chống oxi hóa [3], [4], [5], [6] Vùng biển nước ta có nguồn tài nguyên rong biển Agarophytes phong phú Chúng gồm tất loài rong thuộc chi Gracilaria vài loài thuộc chi Hydropuntia Gelidiella Đặc điểm hóa học, tính chất gel hoạt tính gây độc tế bào ung thư polysaccharide chiết từ loài rong thuộc chi Hydropuntia , Gracilaria Gelidiella công bố [7], [8] [9] Tuy nhiên chưa có cơng trình nghiên cứu polysaccharide từ rong Gracilaria Heteroclada (rong câu cước) Gracilaria Salicornia, loài rong phân bố rộng rãi vùng biển miền Trung dân ven biển thương mại hóa để làm thực phẩm với hình thức khác Do chúng tơi chọn đề tài “ Xác định cấu trúc polysaccharide dạng agar từ số loài rong Đỏ”, với mục tiêu nghiên cứu chiết tách, xác định đặc trưng cấu trúc, để góp phần định hướng cho việc sử dụng công nghiệp với điều kiện để đạt hiệu cao từ 02 loài rong Gracilaria Heteroclada, rong Gracilaria Salicornia từ q trình khảo sát tính chất gel polysaccharide chiết tách từ loài rong Để đạt mục tiêu nghiên cứu đặt ra, đặt nội dung nghiên cứu cụ thể là: Thu thập định danh rong Đỏ Gracilaria Salicornia Gracilaria Heteroclada Chiết tách, tinh chế polysaccharide từ loài rong Nghiên cứu đặc trưng cấu trúc polysaccharide thu Khảo sát tính chất gel polysaccharide thu 10 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 RONG ĐỎ 1.1.1 Giới thiệu phân loại rong Đỏ Rong biển nhóm thực vật thủy sinh bậc thấp, có kích thước hình dạng phong phú Chúng gọi seaweed, marine algae hay marine plant Rong biển sống thành quần thể biển vùng nước lợ ven biển, mọc rạn san hơ vách đá, mọc tầng nước sâu với điều kiện có ánh sáng mặt trời chiếu tới để quang hợp Rất đặc biệt so với nhóm thực vật bậc cao, tồn thể rong có chung chức tự dưỡng, có khả quang hợp, hơ hấp, trao đổi khí hấp thụ chất dinh dưỡng từ mơi trường Các phận rong biển lá, thân rễ giả chúng chưa có chức riêng biệt, ví dụ rễ phận tế bào có nhiệm vụ đính thể rong với vật bám, không hút chất dinh dưỡng vật bám, thân có chức tự dưỡng Quá trình phát sinh khơng có giai đoạn phơi thai mà có hợp tử, hợp tử có khả phát triển độc lập với thể mẹ [10] Nhờ có chất diệp lục, rong biển thu nhận nguồn lượng từ ánh sáng mặt trời, carbon dioxide (CO2) nước (H2O) để tổng hợp chất hữu thông qua q trình quang hợp Do có sinh khối lớn nên rong biển tạo nguồn vật chất dồi cho hệ sinh thái biển lượng lớn oxygen cho hô hấp người động vật cạn Qua trình nghiên cứu, nhà thực vật học chia giới thực vật thành bậc phân loại sau: ngành, lớp, bộ, họ, chi, lồi Trong tiến trình phát triển, phân loại học thực vật nói chung phân loại rong nói riêng liên tục cải tiến để ngày hoàn thiện phương pháp nghiên cứu hoàn thiện dần hệ thống phân loại [11] Hình 1.1 Biểu đồ so sánh ngành rong Thế giới 11 Có nhiều quan điểm khác cách phân loại rong biển Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, thành phần sắc tố, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh sản mà rong biển chia thành nhiều ngành khác Trong đó, ba ngành rong có giá trị kinh tế cao rong Lục (Chlorophyta), rong Nâu (Phaeophyta) rong Đỏ (Rhodophyta) [10] Rong Đỏ có mặt hầu hết đại dương tập trung vùng biển ấm nhiệt đới Rong Đỏ tươi thường có màu hồng lục, hồng tím, hồng nâu, có chứa sắc tố phycoerythrin phycocyanin, chlorophyll, β-carotene số xanthophyll Mức độ màu sắc rong phụ thuộc vào phối hợp tỷ lệ thành phần sắc tố Điểm khác biệt với hầu hết lồi rong khác rong Đỏ có sắc tố phycobilin gồm hai sắc tố phycoerythrin phycocyanin Thường phycoerythrin chiếm ưu phycocyanin hầu hết lồi Rong Đỏ thường có màu sắc rực rỡ loài sống vùng triều vùng bị che bóng Ngay lồi, theo chiều phân bố thẳng đứng, rong thay đổi màu tùy theo chất lượng ánh sáng tới chúng [12] Khi khô tùy theo phương pháp chế biến, rong chuyển sang màu nâu hay nâu vàng đến vàng [13] Ngành rong Đỏ có khoảng 2.500 lồi, gồm 400 chi thuộc nhiều họ khác nhau, phần lớn chúng cấu tạo từ nhiều tế bào, lại cấu tạo dạng tế bào hay quần thể Phần lớn rong Đỏ sống biển sâu, nơi có thủy triều thấp [10], [13] Trên giới, rong Đỏ sử dụng với khối lượng lớn để phục vụ sống người tùy vào thành phần mà cung cấp Cụ thể, số lồi có hàm lượng cao agar, carrageenan, furcellaran sử dụng để chế biến keo rong biển Các lồi rong Đỏ chia thành nhóm [13]: - Nhóm rong cho agar (Agarophite): Bao gồm chi Gelidium, Gracilaria, Gelidiella, - Nhóm rong cho carrageenan (Carrageenophite): Bao gồm chi Gigartina, Eucheuma, Chondrus, Iridaea Ngồi ra, cịn có nhóm rong furcellaran (Gelan): điển hình nhóm Furcellaria 12 Tại Việt Nam, có khoảng 827 lồi rong biển báo cáo, đó, ngành rong Đỏ Rhodophyta chiếm số lồi cao (412 loài), rong Lục (180 loài), rong Nâu Phaeophyceae (147 loài) cuối vi tảo Cyanobacteria (88 lồi) Số lồi so với Philippines (1011 loài), nhiều so với Đài Loan (288 loài), Thái Lan (182 loài) Malaysia (241 loài) [14] Các loài rong Đỏ chứa agar có Việt Nam khoảng 51 lồi Chúng thuộc chi Gracilaria (12 loài), Gracilariopsis (2 loài), Hydropuntia (6 loài), Gelidium (9 loài), Gelidiella (5 loài), Pterocladia (4 loài), Hypnea (13 lồi) Trong đó, nhiều lồi có tiềm khai thác nuôi trồng [15] Các tỉnh thuộc khu vực miền Trung Việt Nam Quảng Ngãi, Bình Định, Phú n, Khánh Hịa, Ninh Thuận có bờ biển dài với đa dạng kiểu thủy vực đầm, phá, cửa sơng, vũng, vịnh lồi đáy khác đáy cát, sỏi, đá tảng, san hơ chết thuận lợi cho lồi rong sinh trưởng phát triển, đặc biệt loài rong Đỏ [14] 1.1.2 Giới thiệu số loài rong Đỏ Việt Nam: Gracilaria Heteroclada Gracilaria Salicornia Cả hai loại rong Gracilaria Heteroclada Gracilaria Salicornia thuộc chi rong Câu – Gracilaria, họ Gracilariaceae, Gracilariales, lớp Florideophyceae, ngành rong Đỏ - Rhodophyta Hai loại rong đánh giá có giá trị kinh tế lớn, ngành tập trung nghiên cứu để khai thác tiềm Chúng sử dụng hai dạng khô tươi 1.1.2.1 Gracilaria Heteroclada Gracilaria Heteroclada có tên tiếng Việt rong câu cước, phát J.F.Zhang B.M.Xia năm 1988 Gracilaria Heteroclada phân bố vùng pH trung tính (pH từ -8) Các thủy vực nơi có xuất rong có độ mặn dao động khoảng 20-27 ppt Rong Gracilaria Heteroclada có sinh khối lớn, sinh trưởng tốt vào giai đoạn từ tháng đến tháng 6, chúng phát triển ao nước lợ đầm phá, bãi triều đất đá, phát triển tốt vào mùa đơng - xn Lồi rong sử dụng dạng tươi lẫn dạng khô 13 Trồng Gracilaria Heteroclada bắt đầu Việt Nam vào cuối năm 80 kỷ trước Rong bắt gặp tự nhiên (miền Trung Việt Nam) hai dạng: sinh sản hữu tính vơ tính, nhân vơ tính Dạng thứ Gracilaria phát triển vùng biển, đáy cứng, vùng triều, dạng thứ hai - đầm phá nước lợ, đáy cát bùn, thường dạng khơng bám Hình 1.2 Hình ảnh rong Gracilaria Heteroclada Trồng Gracilaria Heteroclada tỉnh miền Trung miền Nam chủ yếu tỉnh Phú Yên Bà Rịa Vũng Tàu Những lồi Gracilaria khơng trồng thâm canh bán thâm canh, mà nuôi ghép với tôm Rong giống rải đáy cát hay bùn Rong phát triển nhanh độ mặn 25 - 30 ‰ nhiệt độ 26 – 32oC với tốc độ 5-7%/ngày Độ mặn thấp 20‰ nhiệt độ cao 34oC tăng trưởng bị kìm hãm (Phạm Văn Huyên,1998) Nếu độ mặn vùng đầm phá năm không giảm xuống 20 ‰, Gracilaria Heteroclada trồng quanh năm Rong trồng ao nuôi tôm làm gia tăng thu hoạch tảo động vật giáp xác Hiện nay, Gracilaria Heteroclada trồng khoảng 100 Năng suất 1,5 - 2,0 khô/ Rong biển trồng chủ yếu để sản xuất agar thực phẩm chất lượng cao 14 1.1.2.2 Gracilaria Salicornia Gracilaria Salicornia lần phát bến cảng Hawaii khu vực lân cận (Smith Hunter Smith 2002) Hình 1.3 Hình ảnh rong Gracilaria Salicornia Gracilaria Salicornia thay đổi màu sắc từ màu vàng sáng đầu đến màu cam, xanh nâu gốc Thân có dạng hình trụ (đường kính 0,5 cm) phân nhánh nhị phân với co thắt đáy nhị phân Ở Hawai, thường phát triển mạnh địa hình, bám chặt vào lớp cứng dày tới 25-40 cm; mơi trường tĩnh, phát triển dạng thẳng đứng phân nhánh dễ dàng hơn, phát triển tự Gracilaria Salicornia sinh sản chủ yếu thông qua phân nhánh nhân giống tự nhiên (Smith Pers Comm 2003) Gracilaria Salicornia mọc đất đá, san hô chết khu vực bãi triều triều vào mùa xuân đầu mùa hè Ở vùng nhiệt đới, Gracilaria Salicornia gây mối đe dọa môi trường sống san hô sinh vật biển (Smith Hunter Smith 2002) phát triển với quy mơ rộng Một vài nghiên cứu thực hệ sinh thái Gracilaria Salicornia phạm vi khác Và nhà nghiên cứu rút hình thái hình thành thảm độc đáo Gracilaria Salicornia dễ dàng thích nghi chịu nhiều điều kiện ánh sáng khác (Beach et al 1997, Smith et al 2004) Ngồi ra, thích nghi với loại chất dinh dưỡng khác (Larned 1998, Smith et al 2004) Dựa thí nghiệm điều tra rong Gracilaria 15 Salicornia chịu đựng môi trường sống vô khắc nghiệt Nếu nhiệt độ nước biển 41oC với dung dịch muối bão hịa 75% hay 50%, Gracilaria Salicornia chết (Smith et al 2004) Khả chịu đựng cho phép Gracilaria Salicornia phát triển mạnh điều kiện từ nước đến nước biển, nhiệt độ chịu đựng dao động từ dòng chảy nước mát đến khu vực ấm (Smith et al 2004) Với sức sống mãnh liệt vậy, Gracilaria Salicornia chí đe dọa rạn san hô sinh vật đáy Hawaii nơi khác Bởi làm giảm đa dạng thay đổi cấu trúc loài sinh vật biển Trong nhiều trường hợp, Gracilaria Salicornia trở nên chiếm ưu mặt sinh thái phát triển rạn san hô, làm giảm số lượng giá trị rạn san hô (Hughes 1994, Smith Hunter Smith 2002) Ví dụ, khu vực Hawaii Waikiki, Gracilaria Salicornia trở thành loài sinh vật đáy chiếm phần diện tích lớn khu vực này, trước có 60 lồi tảo khác sinh sống (Doty 1969, Smith et al 2004) Gracilaria Salicornia sinh sản chủ yếu thông qua phân nhánh nhân giống tự nhiên (Smith Pers Comm 2003) Chính vậy, việc sử dụng loại rong công nghệ thực phẩm phần giải vấn đề môi trường mà nhà khoa học quan tâm, đồng thời đem lại giá trị vô to lớn kinh tế sức khỏe cộng đồng 1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ POLYSACCHARIDE DẠNG AGAR 1.2.1 Nguồn gốc, tính chất gel ứng dụng 1.2.1.1 Nguồn gốc Agar chất dinh dưỡng rong Đỏ tích lũy theo thời gian sinh trưởng, dạng polymer phức tạp liên kết với ion khống có rong [13] Agar hay cịn gọi agar-agar, phycocolloid có nguồn gốc cổ xưa (giữa kỷ XVII) Tại Nhật Bản, agar phát Minoya Tarozaemon năm 1658 [16] Tuy nhiên, tên agar-agar lại xuất phát Malaysia Ngồi ra, agar cịn gọi kanten (Nhật Bản), dongfen (Trung Quốc), gelose (các nước nói tiếng Pháp Bồ Đào Nha) [17] 16 Agar chiết xuất từ lồi rong nhóm Agarophyte thuộc chi khác như: Gelidium (Gelidium sesquipedale, Gelidium amansii, Gelidium robustum ), Gracilaria (Gracilaria chilense, Gracilaria tenuistipitata, Gracilaria edulis, Gracilaria acerosa ), Gracilariopsis (Gracilariopsis lamaneiformis, Gracilariopsis sjostedtii [18] 1.2.1.2 Tính chất gel Agar chất vơ định hình, dạng gel khơng màu, khơng vị, dạng bột dạng sợi có màu trắng trắng ngà Agar không tan nước lạnh, trương phồng đáng kể nước, hịa tan nước nóng làm nguội đơng lại tạo thể gel khối có tính đàn hồi Agar kết tủa ethanol, acetone, amylic alcohol Agar có khả tạo gel để nguội hay làm lạnh dung dịch Khác với carragenan alginate, gel agar không cần dùng ion tạo gel [13], [17] Một số tính chất đặc biệt agar có khả hình thành gel cách thuận nghịch với nhiệt độ (hình 1.4) trễ nhiệt tạo gel (gelation hysteresis) –sự khác biệt lớn nhiệt độ nóng chảy nhiệt độ tạo gel Agar từ lồi rong khác tính chất gel chịu ảnh hưởng nhiệt độ khác Agar từ Gelidium đông đặc khoảng từ 28oC đến 31oC nhiệt độ tan chảy từ 80oC đến 90oC Agar từ Gracilaria đông đặc nhiệt độ khoảng từ 29oC đến 42oC tan chảy nhiệt độ từ 76oC đến 92oC Hàm lượng methoxy ảnh hưởng đến nhiệt độ tạo gel agar Khi hàm lượng methoxy agarose Gracilaria tăng, nhiệt độ tạo gel tương ứng tăng lên [17] Ở thể gel, agar chịu lực (sức đông) Đây số thông số chất lượng quan trọng gel agar Các yếu tố ảnh hưởng đến sức đơng gel agar lồi rong mơi trường sinh thái, thời gian thu hoạch phương pháp xử lý rong Agar bị thủy phân cắt mạch gặp yếu tố thủy phân acid, kiềm, enzyme Từ tính chất này, cần đặc biệt lưu ý cho rong tiếp xúc với môi trường acid hay kiềm, nhiệt độ cao q trình gia cơng xử lý, nấu chiết tẩy trắng Khi hòa tan, agar tạo dung dịch có độ nhớt cao, có tính keo Độ nhớt dung dịch agar thay đổi phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu điều kiện chiết xuất agar [13] 17 Các tính chất gel agar khơng phụ thuộc vào thành phần hóa học chúng agarose, sulfate, methoxy, pyruvic acid mà phụ thuộc vào vị trí nhóm [13], [17], [19] Khi dung dịch nóng, agar dạng hịa tan, phân tử agar nằm ngẫu nhiên dung dịch Khi nhiệt độ thấp dần, phân tử agar tiến đến gần bắt đầu cuộn xoắn vào nhau, trình tạo gel bắt đầu Cấu trúc gel agar phân tử trung tính hình thành chuỗi xoắn kép tương tác Van der Waals liên kết hidrogen tạo thành, sau nhiều mối liên kết hình thành nên mạng lưới vĩ mơ tạo nên độ gel Vì có mặt nhóm phân cực hay mang điện tích mặt, ảnh hưởng đến độ bền liên kết hydrogen gel, mặt khác ảnh hưởng đến trật tự cấu trúc nguyên tử mạng lưới gel agar, ảnh hưởng đến tính chất gel agar Bên cạnh đó, cịn có yếu tố ảnh hưởng lớn đến đặc tính gel agar hàm lượng LA độ lặp lại monomer DG LA Gel agar có cấu trúc xoắn xác định phương pháp nhiễu xạ tia X Vì agar chứa LA, gel có cấu trúc xoắn trái So với gel carrageenan, gel agar có bước xoắn nhỏ 26 Å chứa nhóm sulfate Khi chứa nhóm sulfate, vịng xoắn gel chặt gọn [17] Trong dung dịch nước, nhóm hydroxyl nhóm sulfate phân tử agar tạo thành liên kết hydro với phân tử nước, vùng tương tác phân tử nội phân tử hình thành hai loại phân tử loại kết hợp loại không kết hợp Trạng thái sol tồn hai loại hạt có kích thước khác loại hạt đơn có kích thước từ 20-50nm loại hạt kết hợp có kích thước từ 200-700nm Khi hạ nhiệt độ đến khoảng 40oC, bán kính thủy lực hạt tăng dần lên chuyển từ cấu trúc hạt sang cấu hình gậy, mạng lưới gel bắt đầu hình thành làm tăng tính dị thể cấu trúc Khi mạng lưới gel nhỏ hình thành, nằm cân động với mạng lưới, nghĩa bị xáo trộn phục hồi thường xuyên sau khoảng thời gian, sau phân tử agar tham gia vào mạng lưới nhiều hơn, đạt đến trạng thái cân bền [17] Agar thường tương thích với hầu hết polysaccharide khác với protein gần vô điều kiện mà khơng có kết tủa hay dẫn đến thoái PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ 1H NMR agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria heteroclada Phụ lục 2: Phổ 13C NMR agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria heteroclada Phụ lục 3: Phổ HSQC agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria heteroclada Phụ lục 4: Phổ HMBC agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria heteroclada Phụ lục 5: Phổ COSY agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria heteroclada Phụ lục 6: Phổ 1H NMR agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria salicornia Phụ lục 7: Phổ 13C NMR agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria salicornia Phụ lục 8: Phổ HSQC agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria Salicornia Phụ lục 9: Phổ HMBC agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria Salicornia Phụ lục 10: Phổ COSY agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria salicornia ... Trong cơng trình nghiên cứu cấu trúc hóa học tính chất agar chiết từ loài rong chi Gracilaria năm 1995, Murano E tổng kết agar chiết từ loài rong thuộc chi Gracilaria có hàm lượng methyl lớn agar. .. có mặt porphyran (agaropectin) - Kết phân tích nhận khẳng định có mặt agarobiose agaran polysaccharide chiết từ rong agarophite cấu trúc agar dự đoán - Phân đoạn polysaccharide chiết tự nhiên (xử... hấp thụ tần số để định lượng tổng số đường agar (đại lượng đặc trưng cho tổng số đường agar) Bảng 3.6 Một số số sóng đặc trưng phổ phổ hồng ngoại (IR) 02 mẫu agar chiết từ 02 loài rong Gracilaria