Bài viết Biểu hiện ALK và mối liên quan với một số đặc điểm mô bệnh học trong u nguyên bào thần kinh trình bày khảo sát biểu hiện hóa mô miễn dịch ALK và đánh giá mối liên quan giữa biểu hiện ALK với một số đặc điểm mô bệnh học của u nguyên bào thần kinh.
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 521 - THÁNG 12 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 BIỂU HIỆN ALK VÀ MỐI LIÊN QUAN VỚI MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC TRONG U NGUYÊN BÀO THẦN KINH Phan Đặng Anh Thư1, Tô Thùy Nhi2, Lý Thanh Thiện1, Nguyễn Thảo Quyên1 TÓM TẮT 20 Đặt vấn đề: Nhiều nghiên cứu cho thấy ALK gen sinh ung quan trọng u nguyên bào thần kinh đột biến ALK xác định liên quan đến khối u nguyên bào thần kinh gia đình lẻ tẻ Biểu ALK u nguyên bào thần kinh mối liên quan với số đặc điểm mô bệnh học nhiều vấn đề tranh cãi Mục tiêu: Khảo sát biểu hóa mơ miễn dịch ALK đánh giá mối liên quan biểu ALK với số đặc điểm mô bệnh học u nguyên bào thần kinh Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu biểu hóa mơ miễn dịch ALK (D5F3) mối liên quan với đặc điểm mô bệnh học 90 trường hợp u nguyên bào thần kinh chẩn đoán Bộ môn Mô phôi – Giải phẫu bệnh, Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh khoảng thời gian từ 01/01/2018 đến 31/12/2021 Kết quả: Biểu ALK ghi nhận 91,1% u nguyên bào thần kinh, 50% trường hợp bắt màu 4+ (> 75% tế bào u) U nguyên bào thần kinh khơng biệt hóa có tỉ Bộ mơn Mơ phơi – Giải phẫu bệnh, Đại học Y Dược TP.HCM Khoa Ung bướu – Huyết học, Bệnh viện Nhi Đồng Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Thảo Quyên Email: quyennguyen1191995@gmail.com Ngày nhận bài: 08.10.2022 Ngày phản biện khoa học: 07.10.2022 Ngày duyệt 24.10.2022 lệ dương tính ALK thấp so với nhóm biệt hóa khơng biệt hóa, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p = 0,024) Khơng có mối liên quan có ý nghĩa biểu ALK số phân bào – nhân vỡ nhóm tiên lượng mơ bệnh học theo Hội giải phẫu bệnh học u nguyên bào thần kinh quốc tế Kết luận: Sự biểu ALK chiếm tỉ lệ cao, đặc hiệu mơ u âm tính mơ bình thường, mở triển vọng cho phát triển kháng thể nhắm đích ALK Tỉ lệ dương tính ALK cao u NBTK biệt hóa Cần thêm nhiều nghiên cứu để sáng tỏ vai trị ALK q trình phát triển mào thần kinh Từ khóa: U nguyên bào thần kinh, ALK SUMMARY IMMUNOHISTOCHEMICAL EXPRESSION OF ALK IN NEUROBLASTOMA AND ITS RELATIONS WITH HISTOPATHOLOGICAL FEATURES Background: Mutated ALK has been identified as a significant oncogene associated with familial and sporadic neuroblastomas ALK expression in neuroblastoma and its relations with histopathological features remains controversial Objectives: To investigate the relations between ALK expression and some histopathological features of neuroblastoma Methods: 90 cases of neuroblastoma at the Department of Histoembryology - Pathology, University of Medicine and Pharmacy, Ho Chi 147 HỘI THẢO KHOA HỌC GIẢI PHẪU BỆNH – TẾ BÀO BỆNH HỌC VIỆT NAM LẦN THỨ 10 Minh City from 01/01/ 2018 to 12/31/2021, were stained with ALK (D5F3) antibody The ALK expression and its relations with some histopathological features were investigated Results: ALK expression was 91.1% (82/90 cases), more than 50% positive for 4+ (> 75% of tumor cells) The undifferentiated subtype had a lower ALK positivity rate than the poorly differentiated and differentiating subtypes; the difference was statistically significant (p = 0.024) There was no relation between ALK expression and Mitotic-Karyorrhectic Index and the prognostic groups according to the International Neuroblastoma Pathology Classification (INPC) Conclusion: Specific ALK positivity in neuroblastoma cells and negativity in normal tissues provides an opportunity to develop ALKtargeting antibodies The rate of ALK positivity is higher in more differentiated neuroblastoma tumors More studies are needed to elucidate the role of ALK in neural crest development Keywords: Neuroblastoma, ALK I ĐẶT VẤN ĐỀ U nguyên bào thần kinh (NBTK) u hệ thần kinh giao cảm có nguồn gốc từ tế bào thần kinh nguyên thủy mào thần kinh Đây khối u đặc ngoại sọ phổ biến trẻ em chiếm 12% tổng số ca tử vong ung thư trẻ em Các đột biến kích hoạt gen ALK u NBTK báo cáo từ năm 2008 [6] Khoảng 8% đến 10% khối u có đột biến ALK, khoảng 25% có khuếch đại gen biểu mức protein ALK Nhiều nghiên cứu cho thấy ALK gen sinh ung quan trọng u NBTK đột biến ALK xác định liên quan đến khối u NBTK gia đình lẻ tẻ [6] Mặt khác, phân bố hạn chế mô bình thường biểu thường 148 xuyên u NBTK, ALK kháng nguyên khối u lý tưởng để điều trị trúng đích [2] Những kết mở triển vọng cho chiến lược điều trị dựa ức chế tín hiệu qua trung gian ALK Có nhiều phương pháp đánh giá ALK u NBTK, nhuộm hóa mơ miễn dịch (HMMD) phương pháp dễ tiếp cận, dễ đánh giá có khả áp dụng thường quy Các nghiên cứu biểu HMMD ALK mối tương quan với số đặc điểm mô bệnh học u NBTK nhiều tranh cãi [4],[6] Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu ghi nhận đặc điểm biểu ALK HMMD u NBTK trẻ em, chúng tơi thực đề tài: “Đặc điểm biểu ALK u NBTK” để khảo sát đánh giá mối liên quan biểu ALK với số đặc điểm giải phẫu bệnh tiên lượng u NBTK” II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu thực 90 bệnh nhân ≤ 16 tuổi có chẩn đốn giải phẫu bệnh u NBTK nghèo mô đệm tế bào Schwann (theo phân loại Hội giải phẫu bệnh học u nguyên bào thần kinh quốc tế - INPC) Bộ môn Mô phôi – Giải phẫu bệnh, Đại học Y dược TPHCM khoảng thời gian từ 01/01/2018 đến 31/12/2021 Các trường hợp đưa vào nghiên cứu chọn theo phương pháp chọn mẫu thuận tiện, có đủ hồ sơ lưu trữ, tiêu H&E khối mô vùi nến để làm xét nghiệm hóa mơ miễn dịch Tiêu chuẩn loại trừ: - Các bệnh nhân hóa – xạ trị trước phẫu thuật/sinh thiết - Các trường hợp u tái phát mà khơng có mẫu phẫu thuật/sinh thiết u nguyên phát hết mẫu bệnh phẩm khối nến TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 521 - THÁNG 12 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 90 trường hợp thu thập thông tin hồ sơ tuổi lúc chẩn đoán Tiêu H&E đánh giá độ biệt hóa, số phân bào – nhân vỡ (Mitotic – Karyorrhectic Index MKI), tiên lượng mô bệnh học theo phân loại INPC [4] Ngoài ra, đặc điểm hoại tử u vơi hóa ghi nhận Hóa mô miễn dịch ALK phương pháp đánh giá Đối với bệnh phẩm phẫu thuật, vùng đại diện mô u chọn để làm xếp dãy mô nhỏ (Tissue Microarray – TMA), bệnh phẩm sinh thiết lấy toàn để nhuộm HMMD Kháng thể kháng ALK nguyên phát đơn dòng thỏ (dòng D5F3, VENTANA, Tucson, Arizona) độ pha loãng 1:50 sử dụng nghiên cứu Q trình nhuộm HMMD diễn hồn toàn tự động thiết bị BenchMark XT automated slide stainer (Ventana) Các trường hợp bắt màu bào tương màng xem dương tính [4],[6] Mức độ dương tính ALK ước tính sau: 1(+) 1-20% tế bào u bắt màu, không đồng nhất, yếu, (+) 20% - 50% tế bào u bắt màu, khơng đồng với cường độ yếu – trung bình, (+) > 50% tế bào u bắt màu, không đồng với cường độ trung bình – - cao, (+) > 75% tế bào u bắt màu mạnh, đồng Xử lý số liệu Dữ liệu xử lý phần mềm thống kê Stata, phiên 14.2 Khảo sát mối liên quan kiểm định χ2 kiểm định Fisher Mối liên quan xem có ý nghĩa kiểm định có p < 0,05 Y đức Nghiên cứu Hội Đồng Đạo Đức nghiên cứu y sinh học Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh thẩm định, xét duyệt, số 174/HĐĐĐ-ĐHYD, ngày 21/2/2022 III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đặc điểm mô bệnh học dân số nghiên cứu Đặc điểm tuổi mô bệnh học 90 bệnh nhân nghiên cứu trình bày Bảng Tuổi trung vị bệnh nhân nghiên cứu 24 tháng tuổi (15 ngày tuổi – 14 tuổi), nhóm 18 tháng tuổi chiếm đa số Hơn 80% u NBTK biệt hóa kém, số phân bào-nhân vỡ (MKI) thấp chiếm nhiều (60%) Tiên lượng mô bệnh học không thuận lợi chiếm nhiều với 57,8% Bảng 1: Đặc điểm tuổi mô bệnh học dân số nghiên cứu Đặc điểm Số trường hợp (%) Tuổi = 60 tháng 16 (17,8%) Độ biệt hóa Khơng biệt hóa 13 (14,4%) Biệt hóa 73 (81,1%) Đang biệt hóa (4,5%) MKI Thấp 54 (60%) 149 HỘI THẢO KHOA HỌC GIẢI PHẪU BỆNH – TẾ BÀO BỆNH HỌC VIỆT NAM LẦN THỨ 10 - Trung bình 16 (17,8%) Cao 20 (22,2%) Tiên lượng mô bệnh học Thuận lợi 38 (42,2%) Khơng thuận lợi 52 (57,8%) Hoại tử u Có 27 (30%) Khơng 63 (70%) Vơi hóa Có 22 (24,4%) Khơng 68 (75,6%) Đặc điểm biểu ALK Biểu dương tính với ALK ghi nhận 91,1% trường hợp (82/90 ca), 50% dương tính 4+ (> 75% tế bào u bắt màu) Tỉ lệ bắt màu 1+, 2+, 3+ tương đồng (Biểu đồ 1) Biểu đồ 1: Tỉ lệ biểu ALK mẫu nghiên cứu ALK biểu bào tương màng tế bào u NBTK, âm tính với lympho bào, mạch máu mơ tuyến thượng thận bình thường (Hình 1) Hình 1: A: Mơ u NBTK (bên trái) mơ tuyến thượng thận lành (bên phải, H&E 100x) B: Hóa mô miễn dịch ALK bắt màu mạnh mô u (bên trái), không bắt màu mô tuyến thượng thận lành (bên phải) (100x) 150 TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 521 - THÁNG 12 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 Hình 2: A: Tế bào u bắt màu ALK bào tương màng, cường độ mạnh, đồng (400x) B: Tế bào u bắt màu ALK cường độ trung bình, khơng đồng (400x) C: Tế bào u bắt màu yếu, không đồng (400x) Mối liên quan biểu ALK số đặc điểm mơ bệnh học Tỉ lệ dương tính ALK cao u NBTK biệt hóa hơn, khác biệt có ý nghĩa thống kê, p = 0,024 Tỉ lệ ALK dương tính mức MKI nhóm tiên lượng mơ bệnh học khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê (Bảng 2) Bảng 2: Mối liên quan biểu ALK số đặc điểm mơ bệnh học Đặc điểm ALK dương tính ALK âm tính p (Fisher’s exact) Độ biệt hóa - Khơng biệt hóa (69,2%) (30,8%) 0,024 - Biệt hóa 69 (94,5%) (5,5%) - Đang biệt hóa (100%) (0%) MKI - Thấp 45 (88,2%) (11,8%) 0,682 - Trung bình 18 (94,7%) (5,3%) - Cao 19 (95%) (5%) Tiên lượng mô học - Thuận lợi 35 (92,1%) (7,9%) 1,000 - Không thuận lợi 47 (90,4%) (9,6%) Khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê mức độ dương tính ALK đặc điểm mô bệnh học (Bảng 3) Bảng 3: Mối liên quan mức độ dương tính ALK số đặc điểm mô bệnh học Đặc điểm ALK 1+ ALK 2+ ALK 3+ ALK 4+ p Độ biệt hóa - Khơng biệt hóa (11,1%) (22,2%) (22,2%) (44,5%) 0,794* - Biệt hóa (11,6%) 10 (14,5%) 11 (15,9%) 40 (58%) - Đang biệt hóa (25%) (25%) (0%) (50%) MKI - Thấp (14,6%) (16,7%) (12,5%) 27 (56,2%) 0,911* - Trung bình (13,3%) (20%) (20%) (46,7%) - Cao (5,3%) (10,5%) (21%) 12 (63,2%) 151 HỘI THẢO KHOA HỌC GIẢI PHẪU BỆNH – TẾ BÀO BỆNH HỌC VIỆT NAM LẦN THỨ 10 Tiên lượng mô học - Thuận lợi - Không thuận lợi (20%) (6,4%) (11,4%) (19,1%) IV BÀN LUẬN Trong nghiên cứu này, đánh giá biểu ALK HMMD 90 trường hợp u NBTK Dòng kháng thể D5F3 chọn sử dụng vào nghiên cứu dựa báo cáo Yan [8], theo D5F3 cho thấy độ nhạy cao so với dòng kháng thể khác ALK 1, 5A4 kháng thể thích hợp để đánh giá tình trạng ALK thử nghiệm lâm sàng thuốc ức chế ALK điều trị u NBTK [7],[8] Nghiên cứu cho thấy tỉ lệ biểu ALK 91,1%, tương đồng với kết nhiều nghiên cứu khác [1],[4],[6],[7] Protein ALK protein xuyên màng chuỗi đơn bao gồm miền ngoại bào, xun màng nội bào, giải thích nhuộm HMMD ALK bắt màu màng bào tương Nhiều nghiên cứu ALK không biểu biểu giới hạn mơ bình thường [2],[7], điều phù hợp với quan sát chúng tôi, ALK không biểu mô tuyến thượng thận bình thường (Hình 1) Biểu ALK đặc hiệu bề mặt phần lớn tế bào u NBTK có khơng có đột biến ALK dịng mầm soma, khơng biểu mơ bình thường trẻ em, tạo hội cho phát triển kháng thể nhắm trúng đích ALK [2],[7] Chúng tơi ghi nhận tỉ lệ dương tính ALK cao u NBTK biệt hóa U NBTK khơng biệt hóa có tỉ lệ dương tính ALK thấp so với nhóm biệt hóa biệt hóa, khác biệt có ý nghĩa thống 152 (14,3%) 19 (54,3%) 0,269+ (17%) 27 (57,5%) *Fisher’s exact test, + χ2 test kê (p = 0,024) Tuy nhiên, khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê độ biệt hóa xét theo mức điểm dương tính ALK (p = 0,794), tương tự với số nghiên cứu khác [1] ALK biểu tế bào mào thần kinh trình phát triển ban đầu, hoạt hóa ALK có liên quan đến di cư tăng sinh tế bào mào thần kinh, dẫn đến ngừng biệt hóa tế bào mào thần kinh, vai trò thực ALK phát triển mào thần kinh người chưa hiểu rõ [5] Một điều đáng ngạc nhiên nghiên cứu chúng tơi có đến 4/13 trường hợp (30,8%) u NBTK khơng biệt hóa âm tính với ALK Vì biểu protein ALK khơng liên quan với biến đổi gen ALK phần lớn trường hợp (tỷ lệ biểu protein ALK mạnh nói chung 50% cao hơn, tỷ lệ khuếch đại / đột biến gen ALK khoảng 10%) [4],[6],[7], cần làm thêm xét nghiệm sinh học phân tử để xác định trường hợp âm tính với HMMD ALK có thực mang biến đổi gen ALK hay không Mức độ biểu ALK cao u NBTK có ý nghĩa sống cịn dự đốn đáp ứng điều trị [4],[7], trường hợp u NBTK khơng biệt hóa âm tính với ALK điểm cho không đáp ứng với điều trị thuốc ức chế ALK Khơng có mối liên quan biểu ALK MKI tiên lượng mô học theo INPC, tương đồng với nhiều nghiên cứu khác [1],[3],[5] Một nghiên cứu gần Nhật Bản đánh giá ALK HMMD, thu thập tình trạng gen MYCN nhóm TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 521 - THÁNG 12 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 INPC 195 khối u NBTK nguyên phát, kết nghiên cứu cho thấy bệnh nhân có mức ALK cao (≥ 50% tế bào u dương tính) có tiên lượng xấu, loại INPC; tỷ lệ sống cịn trường hợp có mô bệnh học thuận lợi không thuận lợi 57,8% 40,7% (p = 0,72) [5] V KẾT LUẬN Biểu ALK (D5F3) màng bào tương u NBTK có tỉ lệ cao (trên 90%) đặc hiệu tế bào u U nguyên bào thần kinh khơng biệt hóa có tỉ lệ dương tính ALK thấp đáng kể so với nhóm biệt hóa biệt hóa Mức độ biểu ALK không liên quan với đặc điểm mô bệnh học độ biệt hóa, MKI, tiên lượng mơ học theo INPC Cần nhiều nghiên cứu sâu chế điều hòa bình thường chức ALK trình phát triển mào thần kinh người để hiểu tiến triển bệnh, đặc biệt phát sinh u NBTK dương tính với ALK, giúp phát triển chiến lược điều trị để điều trị hiệu giảm nguy tái phát LỜI CẢM TẠ: Bài báo hỗ trợ kinh phí đề tài nghiên cứu khoa học cấp sở Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Nhóm tác giả trân trọng cảm ơn Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh cấp kinh phí thực đề tài theo Hợp đồng số 07/2022/HĐ-ĐHYD ngày 18/4/2022 TÀI LIỆU THAM KHẢO Aygün Z., Batur Ş., Emre Ş., et al “Frequency of ALK and GD2 expression in neuroblastoma” Fetal and Pediatric Pathology 2019, 38(4), 326-334 Carpenter E L., Haglund E A., Mace E M., et al "Antibody targeting of anaplastic lymphoma kinase induces cytotoxicity of human neuroblastoma" 2012, 1(46), 48594867 Chang H H., Lu M Y., Yang Y L., et al “The prognostic roles of and correlation between ALK and MYCN protein expression in neuroblastoma” Journal of clinical pathology 2020, 73(3), 154-161 Duijkers F A M., Gaal J., Meijerink J P P., et al "High anaplastic lymphoma kinase immunohistochemical staining in neuroblastoma and ganglioneuroblastoma is an independent predictor of poor outcome" 2012, 180(3), 1223-1231 Nakazawa A “Biological categories of neuroblastoma based on the international neuroblastoma pathology classification for treatment stratification” Pathology International 2021, 71(4), 232-244 Passoni L., Longo L., Collini P., et al "Mutation-independent anaplastic lymphoma kinase overexpression in poor prognosis neuroblastoma patients" 2009, 69(18), 73387346 Sano R., Krytska K., Larmour C E., et al (2019) “An antibody-drug conjugate directed to the ALK receptor demonstrates efficacy in preclinical models of neuroblastoma” Science translational medicine 2019, 11(483) Yan B., Kuick C H., Lim M S., et al "Platform comparison for evaluation of ALK protein immunohistochemical expression, genomic copy number and hotspot mutation status in neuroblastomas" 2014, 9(9), e106575 153 ... ? ?Đặc điểm bi? ?u ALK u NBTK” để khảo sát đánh giá mối liên quan bi? ?u ALK với số đặc điểm giải ph? ?u bệnh tiên lượng u NBTK” II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C? ?U Đối tượng nghiên c? ?u Nghiên c? ?u. .. thường quy Các nghiên c? ?u bi? ?u HMMD ALK mối tương quan với số đặc điểm mô bệnh học u NBTK nhi? ?u tranh cãi [4],[6] Tại Việt Nam chưa có nghiên c? ?u ghi nhận đặc điểm bi? ?u ALK HMMD u NBTK trẻ em, chúng... ALK bào tương màng, cường độ mạnh, đồng (400x) B: Tế bào u bắt m? ?u ALK cường độ trung bình, khơng đồng (400x) C: Tế bào u bắt m? ?u y? ?u, không đồng (400x) Mối liên quan bi? ?u ALK số đặc điểm mô bệnh