Môi trường MRS

Pha dung dịch chất thị : Hòa tan 8g bromthymol blue vào hỗn hợp 250 ml ethanol 90% 250 ml nước cất Tiệt trùng môi trường 121 oC thời gian 15 phút Môi trường DRBC _ Dichoran Rose Bengal Chloramphenicol Thành phần Số lượng Đơn vị Glucose Peptone K2HPO4 MgSO4 Rose bengal (5%w/v) Dichloran (0,2% w/v ethanol) Chloramphenicol* Agar Nước cất pH cuối (25oC) 10 0,5 0,5 0,1 15 1000 7,0 ± 0,2 g g g g ml ml g g ml * Chloramphenicol để nguội đến 50 oC bổ sung vào Tiệt trùng môi trường 121 oC thời gian 15 phút Chú ý : - Môi trường có chứa dichloran rose bengal nên ức chế kéo dài khuẩn ty nấm mốc mọc nhanh , cho phép phát nấm mốc mọc chậm - Rose bengal chất dễ bị phân hủy ánh sáng, nên cần giữ môi trường tối Trang { PAGE } Tiệt trùng môi trường 121oC thời gian 15 phút Môi trường thạch nấm men – nấm sợi (Yeast Mould Agar) Thành phần Bột chiết nấm men Bột chiết malt Peptone Dextrose Agar Nước cất pH cuối (25oC) Số lượng Đơn vị 3 10 20 1000 6,2 ± 0,2 g g g g ml ml * Đường glucose, saccharose lactose Tiệt trùng môi trường 121 oC thời gian 15 phút Môi trường MRS (Man, Rogosa, Sharpe) Thành phần Số lượng Đơn vị Peptone Bột Lab-Lemco Bột chiết nấm men Glucose Sorbitan mono-oleate K2HPO4 Sodium acetate 3H20 Triammonium citrate MgSO4.7H20 MgSO4.4H20 Agar Nước cất pH cuối (25oC) 10 20 0,2 0,05 10 1000 6,2 ± 0,2 g g g g ml g g g g g g ml Tiệt trùng môi trường 121 oC thời gian 15 phút Môi trường lên men Thành phần Đường* Peptone Bột chiết nấm men Dd chất thị Nước cất pH cuối (25oC) Số lượng Đơn vị 10 1000 7,0 ± 0,2 g g g ml ml * Đường glucose, saccharose lactose Trang { PAGE } PHỤ LỤC Môi trường Cao thịt – Pepton Thành phần Cao thịt Pepton NaCl Agar Nước cất pH cuối Số lượng Đơn vị 10 15 1000 7,0 ± 0,2 g g g g ml Tiệt trùng môi trường 121oC thời gian 15 phút Môi trường Czapek – Dox Thành phần NaNO3 K2HPO4 MgSO4 KCl FeSO4 Saccharose Agar Nước cất pH cuối (25oC) Số lượng Đơn vị 2,0 1,0 0,5 0,5 0,1 30 15 1000 7,3 ± 0,2 g g g g g g g ml Tiệt trùng môi trường 121oC thời gian 15 phút Môi trường PDA _Potato Dextrose Agar Thành phần Khoai tây* Dextrose Agar Nước cất pH cuối (25oC) Số lượng Đơn vị 200 20 20 1000 5,6 ± 0,2 g g g ml * Dịch chiết từ 200 g khoai tây thay g bột chiết khoai tây Tiệt trùng môi trường 121oC thời gian 15 phút Dung dịch pha loãng SPW _ Salt Pepton Water Thành phần NaCl Pepton Nước cất Số lượng Đơn vị 85 10 1000 g g ml Trang { PAGE } TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật thực phẩm, nước mỹ phẩm, NXB Giáo dục, 2005 Lê Văn Việt Mẫn - Lại Mai Hương, Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm, NXB Đại học Quốc gia Tp HCM, 2006 Nguyễn Thành Đạt – Mai Thị Hằng, Sinh học vi sinh vật, NXB Giáo dục, 2000 Giáo trình thực tập Vi sinh năm IV, Khoa Sinh học – Trường ĐH Khoa học tự nhiên Tp HCM, năm học 2000 – 2001 Adams M.R., Moss M.O Food Microbiology 3rd ed – Chapter 10 Method for the microbiological examination of foods, RSC, 2008 Trang { PAGE } 6.5 Yêu cầu viết báo cáo - Nêu chế lên men ethanol - Quy trình bước tiến hành lên men sữa chua - Giải thích thơng số q trình Tiêu chí đánh giá 6.6 Bảng 6.2 Tiêu chí đánh giá Tiêu chí đánh giá STT Ý thức tổ chức, kỷ luật An toàn, vệ sinh Thời gian Chuẩn bị Thao tác : - Pha chế môi trường lên men 1,0 - Kiểm tra thơng số biến đổi q trình lên men (VD : pH) 1,0 Kết quả: - Xác định hàm lượng acid lactic tạo trình lên men gián tiếp giảm giá trị pH - Thảo luận kết 1,0 1,0 Báo cáo - Hình thức trình bày báo cáo - Nội dung báo cáo đầy đủ yêu cầu đề TỔNG 6.7 Điểm 0,5 1,5 10 Câu hỏi thảo luận Mục tiêu việc đo hàm lượng chất khô dịch sữa nguyên liệu? Tại phải ủ dịch lên men 40 – 43 oC? Nếu thay đổi nhiệt độ lên men chất lượng sản phẩm có thay đổi khơng thơng số thay đổi theo? Ngồi định tính acid lactic sinh trình lên men sữa chua pH kế, người ta sử dụng phương pháp để chứng minh acid lactic sinh cách xác ? Trang { PAGE } 6.3 Các bước tiến hành Quy trình cơng nghệ lên men sữa chua: Sữa tươi Làm ấm Phụ gia Phối chế Sữa bột Cấy men Men giống Rót hộp Hũ nhựa Ủ Bảo quản Sản phẩm Bước Chuẩn bị nguyên liệu phụ liệu Bước Xác định hàm lượng chất khô sữa Brix kế Bước Tính tốn hàm lượng chất phụ gia sữa bột cần phối chế (điều chỉnh độ Brix > 16% thêm phụ gia khác ) Bước Duy trì nhiệt độ canh trường 40 – 45 oC Bước Cấy men vào canh trường theo tỷ lệ 10% men giống Bước Sau khuấy men vào sữa, xác định pH điểm đầu rót dịch sữa vào hũ nhựa Bước Ủ 40o C – Bước Sau lên men, xác định pH điểm cuối bảo quản sữa chua tủ lạnh – oC 6.4 Kết - Đánh giá thơng số kiểm sốt q trình lên men (pH, nhiệt độ (oC)…) - Xác định lượng acid lactic sinh trình lên men Trang { PAGE } sản phẩm phụ diacetin, ester acid hữu bay nên sữa chua bổ dưỡng có hương vị thơm ngon Có thể sản xuất phương pháp lên men tự nhiện (nhờ hệ VSV nhiễm tự nhiên) phương pháp cấy giống khiết 6.2 Dụng cụ, thiết bị hóa chất Bảng 6.1 Dụng cụ, thiết bị hóa chất A HÓA CHẤT: STT TÊN HÓA CHẤT QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ 1,0 kg Lưu từ đầu Bông thấm nước Cồn Sữa đặc /sữa tươi hộp tổ Sữa chua hộp tổ Gelatin 95 0+ 700 + lít Tinh khiết 60 g QUY CÁCH SL/ĐVT 100ml 250ml 8cm x 15cm cái cái 10 cái 150 g QUY CÁCH SL/ĐVT 10-30% cái 10 cái lớp B DỤNG CỤ : STT TÊN DỤNG CỤ Cốc thủy tinh Cốc thủy tinh Đũa thủy tinh Nồi vừa Cốc thủy tinh Nhiệt kế Đồ khui sữa hộp Túi nylon nhỏ 1000ml 0-1000C GHI CHÚ tổ tổ tổ tổ lớp lớp lớp SV chuẩn bị C THIẾT BỊ : STT TÊN THIẾT BỊ Nồi hấp tiệt trùng Tủ ấm Tủ lạnh Bếp điện pH kế Brix kế Trang { PAGE } GHI CHÚ lớp lớp lớp lớp lớp lớp BÀI LÊN MEN LACTIC Mục tiêu: Sau học xong này, sinh viên có khả năng: - Thực trình lên men lactic - Nhận biết dấu hiệu lên men lactic 6.1 Cơ sở lý thuyết Lên men lactic q trình chuyển hóa kỵ khí đường với tích lũy acid lactic môi trường Con người biết ứng dụng tượng từ lâu để chế biến loại thức ăn chua (sữa chua, muối dưa, muối cà…), ủ chua thức ăn cho gia súc hay sản xuất acid lactic phục vụ cho ngành công nghiệp thuộc da, dệt nhuộm, công nghiệp thực phẩm… Các vi khuẩn lactic xếp chung vào họ Lactobacteriaceae Mặc dù loại vi khuẩn khơng đồng với mặt hình thái (hình que ngắn, dài, hình cầu), song mặt sinh lý chúng lại tương đối đồng Tất vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử hầu hết không di động Thu nhận lượng từ việc phân giải hydrate carbon tiết acid lactic 6.1.1 Cơ chế lên men lactic Khi thủy phân đường điều kiện kỵ khí, VSV lactic chuyển hydro từ NADH sang pyruvate tạo thành acid lactic để tái tạo NAD+ NADH C6H12O6 NAD+ CH3COCOOH CH3 - CHOH - COOH + Q Căn vào sản phẩm sinh ra, trình lên men lactic chia làm kiểu: Lên men lactic đồng hình Các vi khuẩn lactic đồng hình chuyển hóa đường tạo thành sản phẩm chủ yếu acid lactic (95%) VSV lên men lactic đồng hình: - Giống Streptococcus: S cremoris, S lactis, S thermophillus… - Giống Lactobacillus: L bulgaricus, L acidophillus, L platarum… Lên men lactic dị hình Khi lên men vi khuẩn tạo 60% acid lactic phần lại acid acetic, rượu ethanol, glycerin số sản phẩm khác VSV lên men lactic dị hình: Lactobacillus brasicar fermentatae, Leuconostoc mesenteroides, Escherichia coli… 6.1.2 Lên men sữa chua Sữa chua loại sản phẩm lên men từ sữa tươi Sữa chua có giá trị dinh dưỡng cao có hương vị thơm ngon nên nhiều người ưa thích Ở nhiều quốc gia, sữa chua ăn hàng ngày nhân dân Vì sữa chua có hàm lượng acid lactic cao nên protein sữa không tiếp tục bị phân giải nữa, mà bị đơng tụ Bên cạnh đó, q trình lên men tạo Trang { PAGE } 5.4 Yêu cầu viết báo cáo - Nêu nguyên tắc phương pháp định lượng trực tiếp gián tiếp VSV - Trình bày chế lên men ethanol - Nêu bước tiến hành trình lên men ethanol - Phân tích yếu tố làm ảnh hưởng đến q trình lên men ethanol 5.5 Tiêu chí đánh giá Bảng 5.4 Tiêu chí đánh giá Tiêu chí đánh giá STT Ý thức tổ chức, kỷ luật An toàn, vệ sinh Thời gian Chuẩn bị Thao tác : - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc xác máy đếm khuẩn lạc 0,5 - Hoạt hóa định lượng trực tiếp tế bào nấm men kính hiển vi 1,0 - Nấu cơm nếp không khê, cháy 0,5 Kết quả: - Sản phẩm cơm rượu lên men không bị hư Giải thích biện luận tượng lên men ethanol Báo cáo - Hình thức trình bày báo cáo - Nội dung báo cáo đầy đủ yêu cầu đề TỔNG 5.6 Điểm 1,0 1,0 0,5 1,5 10 Câu hỏi thảo luận Nêu nhược điểm ưu điểm phương pháp đếm VSV buồng đếm hồng cầu Trong công nghiệp lên men, người ta thường sử dụng phương pháp định lượng VSV nhất, sao? Hãy phân tích khác biệt phương pháp định lượng VSV trực tiếp gián tiếp? Trong kỹ thuật lên men cơm rượu, ta phải để 1/4 - 1/3 thể tích trống vật chứa chất lên men? Ngoài phương pháp cảm quan, người ta cịn dùng phương pháp hóa học để định tính ethanol sinh trình lên men cơm rượu Nêu phương pháp Trang { PAGE } Bước Để cơm nếp gieo men vào vật chứa từ 2/3 – 3/4 thể tích (tuỳ theo hình thù vật chứa) bịt lại màng bao PVC (màng mỏng dùng để bao đĩa thức ăn) Bước Ủ 30 oC, - ngày cho sản phẩm cơm rượu Trang { PAGE } Hình 1.21 Kính hiển vi soi Kính hiển vi đối pha: Kính hiển vi đối pha (Phase contrast microscope_PCM) sử dụng để quan sát VSV sống không nhuộm màu Khi xuyên qua vật thể có độ dày mỏng khác nhau, ánh sáng có cường độ không thay đổi pha bị thay đổi Có thể làm tăng độ rõ ảnh cách biến thay đổi pha thành thay đổi cường độ nhờ phận đặc biệt kính Hình 1.22 Kính hiển vi đối pha Kính hiển vi huỳnh quang: Kính hiển vi huỳnh quang (Flourescent microscope_FM) loại kính lắp nguồn ánh sáng kích thích có độ dài sóng khác để kích thích tạo huỳnh quang Phần lớn VSV khơng có khả phát huỳnh quang có yếu Tuy nhiên nhuộm tế bào VSV phẩm nhuộm huỳnh quang khác Nhờ quan sát, theo dõi chuyên biệt bào quan đại phân tử quan tâm, tế bào sống, tăng trưởng Trang { PAGE } Vi khuẩn có kích thước nhỏ mắt thường thấy Cho đến năm 1676 Antony Leuwenhook hồn thiện kính hiển vi nhân loại người ta thấy hình ảnh loại vi khuẩn Ngày chế tạo nhiều loại kính hiển vi khác thấy hình ảnh vi sinh vật rõ nét từ vào tế bào, chí bào quan đại phân tử sinh học (protein, lipid…) Kính hiển vi quang học: Kính hiển vi quang học (optical microscope) hệ thống dùng để phóng đại VSV có kích thước nhỏ Độ phóng đại từ vài chục lần đến 2000 lần Cấu tạo:  Thị kính: nơi đặt mắt nhìn  Vật kính: nơi kề sát với mẫu quan sát, tiếp nhận ánh sáng từ mẫu vật qua  Bàn mẫu: nơi để phiến kính có chứa mẫu cần quan sát  Tụ quang: Nơi tiếp nhận ánh sáng từ nguồn sáng (đèn) để hội tụ lại thành chùm sáng hẹp  Ốc tụ quang: điều chỉnh tụ quang lên hay xuống quan sát mẫu nhuôm màu hay mẫu sống  Ốc chỉnh thô (ốc thứ cấp): nâng lên hay hạ bàn mẫu xuống để thay đổi tiêu cự tốc độ lớn  Ốc chỉnh tinh (ốc vi cấp): giống ốc chỉnh thô thay đổi tiêu cự tốc độ vi cấp cho phép nhìn ảnh nét Hình 1.20 Kính hiển vi quang học Kính hiển vi soi nổi: Kính hiển vi soi (Stereoscopic microscope) dạng kính lúp có độ phóng đại thay đổi từ 10 – 60 lần thường dùng quan sát vật có kích thước tương đối lớn Nguồn sáng thường chiếu từ phía xuống vật phản xạ vào kính, nhờ quan sát vật thể trạng thái không gian ba chiều Trang { PAGE } Được dùng để đảm bảo tính vơ trùng thao tác với VSV Khơng khí tủ cấy vô trùng lọc màng lọc vơ trùng Trong tủ có đèn UV (Ultra Violet) để khử trùng môi trường tủ cấy Trước thực hiện, bật đèn UV từ 30 - 60 phút, bên tủ phải che lại tối màu Hình 1.17 Tủ cấy vơ trùng (8) Nồi hấp (autoclave) Là thiết bị bắt buộc phải có PTN vi sinh cho phép tiêu diệt tất dạng sống VSV (tế bào sinh dưỡng, bào tử) Nồi hấp có cấu tạo lớp vỏ nên có khả chịu áp suất cao Buồng khử trùng có gắn valve khí, áp kế, nhiệt kế Hình 1.18 Nồi hấp khử trùng Khi sử dụng nên dùng nước cất hay nước vơ khống châm vào nồi, tránh bị đóng cặn Nước phải châm đến mức quy định (9) pH kế (pH meter) Sử dụng máy đo pH để bàn hay pH kế di động để xác định pH môi trường nuôi cấy VSV, dịch lên men hay dung dịch hóa chất Giá trị pH cuối mơi trường nuôi cấy VSV thường xác định 25 oC { INCLUDEPICTURE "http://www.thanglonginst.com/admin/anhnho/mV.jpg" * MERGEFORMATINET } Hình 1.19 pH kế (9) Kính hiển vi (Microscope) Trang { PAGE } Hình 1.12 Tủ sấy (3) Tủ ấm (lab incubator) Tủ ấm dùng cho mục đích ni cấy VSV Tủ ấm trì nhiệt độ ổn định Dải nhiệt độ tủ ấm thường từ – 50 oC Vi khuẩn thường nuôi cấy 37 oC Đối với đối tượng VSV cần điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Hình 1.13 Tủ ấm (4) Máy lắc (orbital shaker) Máy lắc nhằm đảo trộn môi trường nuôi cấy VSV, tăng cường oxi tan môi truờng dùng để ni VSV hiếu khí mơi trường lỏng { INCLUDEPICTURE "http://photos.labwrench.com/equipmentPhotos/2000/25714614.jpg" * MERGEFORMATINET } Hình 1.14 Máy lắc (5) Bể ổn nhiệt (water bath) Trong PTN VSV, bể ổn nhiệt sử dụng để trì nhiệt độ nóng chảy mơi trường thạch (45 oC) trước đổ đĩa Petri Hiện nay, cịn có loại bể điều nhiệt lắc (shaking water bath), loại có tác dụng đảo mơi trường trước sử dụng { INCLUDEPICTURE "http://img.directindustry.com/images_di/photo-g/shakingwater-bath-375366.jpg" * MERGEFORMATINET } Hình 1.15 Bể ổn nhiệt lắc (6) Máy lắc ống nghiệm (vortex mixer) Dùng để đảo trộn dịch VSV cần phân tích hay dung dịch hóa chất chứa ống nghiệm cho Hình 1.16 Máy lắc ống nghiệm (7) Tủ cấy vơ trùng (flow cabinet) Trang { PAGE } (1) (2) (3) (4) (5) (6) Hình 1.10 Pipetteman (1) – 20 l, (2) 20 – 100 l, (3) 20 – 200 l, (4) 200 – 1000 l, (5) 1000 – 5000 l, (6) 1000- 10000 l Chú ý:  Khi sử dụng cần lưu ý, cần bơm micropipette có hai nấc: nấc tương ứng với dung tích chọn hút dịch; nấc hai ấn vượt nấc để đuổi hết dịch mao quản đầu tip  Khơng dùng micropipette để hút loại hóa chất dễ bay hơi, như: acetic, HCl… 1.1.2.2 Thiết bị (1) Cân (lab scale) Thường sử dụng loại cân kỹ thuật (loại số lẻ) có độ xác đế 0,01 g Khi cần xác định lượng xác, người ta dùng cân phân tích (loại số lẻ) có độ xác đến 0,0001 g (0,1 mg) { INCLUDEPICTURE "http://atlanticsupply.com/pictures/%7B23A465F0-AE63-46A2-9D08C02567CD7EC7%7D_PIONEERANALYTICALBALANCE.jpg" * MERGEFORMATINET } Hình 1.11 Cân kỹ thuật (trái) cân phân tích (phải) Chú ý: cân phải đặt bề mặt phẳng, tránh gió lùa, khơng bị rung (2) Tủ sấy (drying oven) Dùng để sấy khô dụng cụ để khử trùng theo phương pháp nhiệt khơ Tủ sấy thường đốt nóng điện trở, nhiệt độ có lên đến 200 oC Khi nóng, nhiệt đảo quạt để tránh sai lệch nhiệt cục Trang { PAGE } thái sống, kính cần rửa lại nước rửa chén hay xà phịng, làm khơ ngâm cồn 95o - Các loại dụng cụ thuỷ tinh khác: loại cốc thuỷ tinh (becher), ống đong, ống hút… (2) Các loại que cấy - Que cấy thẳng: dùng để cấy sâu Hình 1.6 Que cấy thẳng - Que cấy vòng: dùng cấy ria mặt thạch hay phân lập VSV bề mặt thạch cấy chuyền mơi trường lỏng Hình 1.7 Que cấy vịng - Que cấy móc: dùng để cấy loại nấm mốc hay xạ khuẩn Hình 1.8 Que cấy móc - Que trang (trải): dùng để trải giọt sinh khối VSV bề mặt thạch Hình 1.9 Que trang (3) Micropipette Là loại ống hút máy, có độ xác đến l (tuỳ theo loại) dùng để định lượng thể tích xác dung dịch VSV, môi trường nuôi cấy (lỏng) hay dung dịch hóa chất Micropipette (pipetteman) có nhiều loại, loại có dải giới hạn dung tích, như: 0,1 – 10,0 l; – 20 l; 20 – 200 l; 100 – 1000 l; 1000 – 5000 l 1000 – 10.000 l (1000 l = ml) Tùy theo hãng sản xuất mà quy cách dung tích có thay đổi Trong dải dung tích cho phép, người ta điều chỉnh dung tích xác mong muốn Mỗi loại micropipette có loại đầu tip tương ứng Trang { PAGE } VSV, sử dụng nút bơng thay cho nắp vặn Khi phân tích VSV, sử dùng giấy nhôm hay nút silicon để hạn chế nhiễm VSV { INCLUDEPICTURE "http://www.indigo.com/images/product/60.jpg" * MERGEFORMATINET } Hình 1.1 Ống nghiệm giá đỡ ống nghiệm - Đĩa Petri (Petri dishes): Gồm nắp lớn đậy lên nắp nhỏ có hình trịn, đường kính 6, 8, 10, 12 cm Đĩa Petri gói lại giấy trước đem hấp tiêt trùng nhiệt ẩm hay sấy nhiệt khô Hiện có loại đĩa Petri nhựa vơ trùng bán sẵn, tiện lợi thường sử dụng phịng phân tích VSV Khác với đĩa thuỷ tinh tái sử dụng nhiều lần, đĩa nhựa chế tạo để sử dụng lần { INCLUDEPICTURE "http://sinhviet.com/sanpham/barloworld_files/0.jpg" * MERGEFORMATINET } Hình 1.2 Đĩa Petri - Bình tam giác (erlenmeyers): cịn gọi bình nón dùng để chứa môi trường nuôi cấy (lỏng hay rắn) hay dung mơi hóa chất pha chế mơi trường { INCLUDEPICTURE "http://hoahocdoisong.com/image/Articles/erlenmeyer%20flask%20three%20glassware.j pg" * MERGEFORMATINET } Hình 1.3 Bình tam giác - Đèn cồn (Alcohol bunners): loại đèn được đốt cồn 90o, toả nhiệt tạo vùng khơng gian xung quanh vơ trùng Đèn cồn dùng để khử trùng loại que cấy cách hơ hay đốt lửa đèn cồn { INCLUDEPICTURE "http://hoahocdoisong.com/image/Articles/alcoholburner%2001.jpg" * MERGEFORMATINET } Hình 1.4 Đèn cồn - Phiến kính (lame) kính (lamelle):  Phiến kính miếng thuỷ tinh hình chữ nhât, có độ suốt cao, dày mm dùng để chứa giọt VSV trạng thái sống hay nhuộm màu quan sát chúng kính hiển vi  Lá kính miếng thuỷ tinh hình vng, có độ suốt cao dày 0,1 - 0,2 mm dùng để đậy lên giọt VSV phiến kính để quan sát trạng thái sống tế bào VSV Hình 1.5 Phiến kính kính Phiến kính kính mua cần làm cách đun sôi NaOH 10% 10 phút, rửa nước cất, rửa HCl loãng sau rửa lại nước cất Phiến kính sử dụng để quan sát để nhuộm màu cần sử lý cách ngâm dung dịch sulfocromate (100 g H2SO4 đđ, 50 g K2Cr2O7 1000 ml nước cất) trước rửa nước tráng lại nước cất

Pha dung dịch chất thị : Hòa tan 8g bromthymol blue vào hỗn hợp 250 ml ethanol 90% 250 ml nước cất Tiệt trùng môi trường 121 oC thời gian 15 phút Môi trường DRBC _ Dichoran Rose Bengal Chloramphenicol Thành phần Số lượng Đơn vị Glucose Peptone K2HPO4 MgSO4 Rose bengal (5%w/v) Dichloran (0,2% w/v ethanol) Chloramphenicol* Agar Nước cất pH cuối (25oC) 10 0,5 0,5 0,1 15 1000 7,0 ± 0,2 g g g g ml ml g g ml * Chloramphenicol để nguội đến 50 oC bổ sung vào Tiệt trùng môi trường 121 oC thời gian 15 phút Chú ý : - Môi trường có chứa dichloran rose bengal nên ức chế kéo dài khuẩn ty nấm mốc mọc nhanh , cho phép phát nấm mốc mọc chậm - Rose bengal chất dễ bị phân hủy ánh sáng, nên cần giữ môi trường tối Trang { PAGE } Tiệt trùng môi trường 121oC thời gian 15 phút Môi trường thạch nấm men – nấm sợi (Yeast Mould Agar) Thành phần Bột chiết nấm men Bột chiết malt Peptone Dextrose Agar Nước cất pH cuối (25oC) Số lượng Đơn vị 3 10 20 1000 6,2 ± 0,2 g g g g ml ml * Đường glucose, saccharose lactose Tiệt trùng môi trường 121 oC thời gian 15 phút Môi trường MRS (Man, Rogosa, Sharpe) Thành phần Số lượng Đơn vị Peptone Bột Lab-Lemco Bột chiết nấm men Glucose Sorbitan mono-oleate K2HPO4 Sodium acetate 3H20 Triammonium citrate MgSO4.7H20 MgSO4.4H20 Agar Nước cất pH cuối (25oC) 10 20 0,2 0,05 10 1000 6,2 ± 0,2 g g g g ml g g g g g g ml Tiệt trùng môi trường 121 oC thời gian 15 phút Môi trường lên men Thành phần Đường* Peptone Bột chiết nấm men Dd chất thị Nước cất pH cuối (25oC) Số lượng Đơn vị 10 1000 7,0 ± 0,2 g g g ml ml * Đường glucose, saccharose lactose Trang { PAGE } PHỤ LỤC Môi trường Cao thịt – Pepton Thành phần Cao thịt Pepton NaCl Agar Nước cất pH cuối Số lượng Đơn vị 10 15 1000 7,0 ± 0,2 g g g g ml Tiệt trùng môi trường 121oC thời gian 15 phút Môi trường Czapek – Dox Thành phần NaNO3 K2HPO4 MgSO4 KCl FeSO4 Saccharose Agar Nước cất pH cuối (25oC) Số lượng Đơn vị 2,0 1,0 0,5 0,5 0,1 30 15 1000 7,3 ± 0,2 g g g g g g g ml Tiệt trùng môi trường 121oC thời gian 15 phút Môi trường PDA _Potato Dextrose Agar Thành phần Khoai tây* Dextrose Agar Nước cất pH cuối (25oC) Số lượng Đơn vị 200 20 20 1000 5,6 ± 0,2 g g g ml * Dịch chiết từ 200 g khoai tây thay g bột chiết khoai tây Tiệt trùng môi trường 121oC thời gian 15 phút Dung dịch pha loãng SPW _ Salt Pepton Water Thành phần NaCl Pepton Nước cất Số lượng Đơn vị 85 10 1000 g g ml Trang { PAGE } TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật thực phẩm, nước mỹ phẩm, NXB Giáo dục, 2005 Lê Văn Việt Mẫn - Lại Mai Hương, Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm, NXB Đại học Quốc gia Tp HCM, 2006 Nguyễn Thành Đạt – Mai Thị Hằng, Sinh học vi sinh vật, NXB Giáo dục, 2000 Giáo trình thực tập Vi sinh năm IV, Khoa Sinh học – Trường ĐH Khoa học tự nhiên Tp HCM, năm học 2000 – 2001 Adams M.R., Moss M.O Food Microbiology 3rd ed – Chapter 10 Method for the microbiological examination of foods, RSC, 2008 Trang { PAGE } 6.5 Yêu cầu viết báo cáo - Nêu chế lên men ethanol - Quy trình bước tiến hành lên men sữa chua - Giải thích thơng số q trình Tiêu chí đánh giá 6.6 Bảng 6.2 Tiêu chí đánh giá Tiêu chí đánh giá STT Ý thức tổ chức, kỷ luật An toàn, vệ sinh Thời gian Chuẩn bị Thao tác : - Pha chế môi trường lên men 1,0 - Kiểm tra thơng số biến đổi q trình lên men (VD : pH) 1,0 Kết quả: - Xác định hàm lượng acid lactic tạo trình lên men gián tiếp giảm giá trị pH - Thảo luận kết 1,0 1,0 Báo cáo - Hình thức trình bày báo cáo - Nội dung báo cáo đầy đủ yêu cầu đề TỔNG 6.7 Điểm 0,5 1,5 10 Câu hỏi thảo luận Mục tiêu việc đo hàm lượng chất khô dịch sữa nguyên liệu? Tại phải ủ dịch lên men 40 – 43 oC? Nếu thay đổi nhiệt độ lên men chất lượng sản phẩm có thay đổi khơng thơng số thay đổi theo? Ngồi định tính acid lactic sinh trình lên men sữa chua pH kế, người ta sử dụng phương pháp để chứng minh acid lactic sinh cách xác ? Trang { PAGE } 6.3 Các bước tiến hành Quy trình cơng nghệ lên men sữa chua: Sữa tươi Làm ấm Phụ gia Phối chế Sữa bột Cấy men Men giống Rót hộp Hũ nhựa Ủ Bảo quản Sản phẩm Bước Chuẩn bị nguyên liệu phụ liệu Bước Xác định hàm lượng chất khô sữa Brix kế Bước Tính tốn hàm lượng chất phụ gia sữa bột cần phối chế (điều chỉnh độ Brix > 16% thêm phụ gia khác ) Bước Duy trì nhiệt độ canh trường 40 – 45 oC Bước Cấy men vào canh trường theo tỷ lệ 10% men giống Bước Sau khuấy men vào sữa, xác định pH điểm đầu rót dịch sữa vào hũ nhựa Bước Ủ 40o C – Bước Sau lên men, xác định pH điểm cuối bảo quản sữa chua tủ lạnh – oC 6.4 Kết - Đánh giá thơng số kiểm sốt q trình lên men (pH, nhiệt độ (oC)…) - Xác định lượng acid lactic sinh trình lên men Trang { PAGE } sản phẩm phụ diacetin, ester acid hữu bay nên sữa chua bổ dưỡng có hương vị thơm ngon Có thể sản xuất phương pháp lên men tự nhiện (nhờ hệ VSV nhiễm tự nhiên) phương pháp cấy giống khiết 6.2 Dụng cụ, thiết bị hóa chất Bảng 6.1 Dụng cụ, thiết bị hóa chất A HÓA CHẤT: STT TÊN HÓA CHẤT QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ 1,0 kg Lưu từ đầu Bông thấm nước Cồn Sữa đặc /sữa tươi hộp tổ Sữa chua hộp tổ Gelatin 95 0+ 700 + lít Tinh khiết 60 g QUY CÁCH SL/ĐVT 100ml 250ml 8cm x 15cm cái cái 10 cái 150 g QUY CÁCH SL/ĐVT 10-30% cái 10 cái lớp B DỤNG CỤ : STT TÊN DỤNG CỤ Cốc thủy tinh Cốc thủy tinh Đũa thủy tinh Nồi vừa Cốc thủy tinh Nhiệt kế Đồ khui sữa hộp Túi nylon nhỏ 1000ml 0-1000C GHI CHÚ tổ tổ tổ tổ lớp lớp lớp SV chuẩn bị C THIẾT BỊ : STT TÊN THIẾT BỊ Nồi hấp tiệt trùng Tủ ấm Tủ lạnh Bếp điện pH kế Brix kế Trang { PAGE } GHI CHÚ lớp lớp lớp lớp lớp lớp BÀI LÊN MEN LACTIC Mục tiêu: Sau học xong này, sinh viên có khả năng: - Thực trình lên men lactic - Nhận biết dấu hiệu lên men lactic 6.1 Cơ sở lý thuyết Lên men lactic q trình chuyển hóa kỵ khí đường với tích lũy acid lactic môi trường Con người biết ứng dụng tượng từ lâu để chế biến loại thức ăn chua (sữa chua, muối dưa, muối cà…), ủ chua thức ăn cho gia súc hay sản xuất acid lactic phục vụ cho ngành công nghiệp thuộc da, dệt nhuộm, công nghiệp thực phẩm… Các vi khuẩn lactic xếp chung vào họ Lactobacteriaceae Mặc dù loại vi khuẩn khơng đồng với mặt hình thái (hình que ngắn, dài, hình cầu), song mặt sinh lý chúng lại tương đối đồng Tất vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử hầu hết không di động Thu nhận lượng từ việc phân giải hydrate carbon tiết acid lactic 6.1.1 Cơ chế lên men lactic Khi thủy phân đường điều kiện kỵ khí, VSV lactic chuyển hydro từ NADH sang pyruvate tạo thành acid lactic để tái tạo NAD+ NADH C6H12O6 NAD+ CH3COCOOH CH3 - CHOH - COOH + Q Căn vào sản phẩm sinh ra, trình lên men lactic chia làm kiểu: Lên men lactic đồng hình Các vi khuẩn lactic đồng hình chuyển hóa đường tạo thành sản phẩm chủ yếu acid lactic (95%) VSV lên men lactic đồng hình: - Giống Streptococcus: S cremoris, S lactis, S thermophillus… - Giống Lactobacillus: L bulgaricus, L acidophillus, L platarum… Lên men lactic dị hình Khi lên men vi khuẩn tạo 60% acid lactic phần lại acid acetic, rượu ethanol, glycerin số sản phẩm khác VSV lên men lactic dị hình: Lactobacillus brasicar fermentatae, Leuconostoc mesenteroides, Escherichia coli… 6.1.2 Lên men sữa chua Sữa chua loại sản phẩm lên men từ sữa tươi Sữa chua có giá trị dinh dưỡng cao có hương vị thơm ngon nên nhiều người ưa thích Ở nhiều quốc gia, sữa chua ăn hàng ngày nhân dân Vì sữa chua có hàm lượng acid lactic cao nên protein sữa không tiếp tục bị phân giải nữa, mà bị đơng tụ Bên cạnh đó, q trình lên men tạo Trang { PAGE } 5.4 Yêu cầu viết báo cáo - Nêu nguyên tắc phương pháp định lượng trực tiếp gián tiếp VSV - Trình bày chế lên men ethanol - Nêu bước tiến hành trình lên men ethanol - Phân tích yếu tố làm ảnh hưởng đến q trình lên men ethanol 5.5 Tiêu chí đánh giá Bảng 5.4 Tiêu chí đánh giá Tiêu chí đánh giá STT Ý thức tổ chức, kỷ luật An toàn, vệ sinh Thời gian Chuẩn bị Thao tác : - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc xác máy đếm khuẩn lạc 0,5 - Hoạt hóa định lượng trực tiếp tế bào nấm men kính hiển vi 1,0 - Nấu cơm nếp không khê, cháy 0,5 Kết quả: - Sản phẩm cơm rượu lên men không bị hư Giải thích biện luận tượng lên men ethanol Báo cáo - Hình thức trình bày báo cáo - Nội dung báo cáo đầy đủ yêu cầu đề TỔNG 5.6 Điểm 1,0 1,0 0,5 1,5 10 Câu hỏi thảo luận Nêu nhược điểm ưu điểm phương pháp đếm VSV buồng đếm hồng cầu Trong công nghiệp lên men, người ta thường sử dụng phương pháp định lượng VSV nhất, sao? Hãy phân tích khác biệt phương pháp định lượng VSV trực tiếp gián tiếp? Trong kỹ thuật lên men cơm rượu, ta phải để 1/4 - 1/3 thể tích trống vật chứa chất lên men? Ngoài phương pháp cảm quan, người ta cịn dùng phương pháp hóa học để định tính ethanol sinh trình lên men cơm rượu Nêu phương pháp Trang { PAGE } Bước Để cơm nếp gieo men vào vật chứa từ 2/3 – 3/4 thể tích (tuỳ theo hình thù vật chứa) bịt lại màng bao PVC (màng mỏng dùng để bao đĩa thức ăn) Bước Ủ 30 oC, - ngày cho sản phẩm cơm rượu Trang { PAGE } Hình 1.21 Kính hiển vi soi Kính hiển vi đối pha: Kính hiển vi đối pha (Phase contrast microscope_PCM) sử dụng để quan sát VSV sống không nhuộm màu Khi xuyên qua vật thể có độ dày mỏng khác nhau, ánh sáng có cường độ không thay đổi pha bị thay đổi Có thể làm tăng độ rõ ảnh cách biến thay đổi pha thành thay đổi cường độ nhờ phận đặc biệt kính Hình 1.22 Kính hiển vi đối pha Kính hiển vi huỳnh quang: Kính hiển vi huỳnh quang (Flourescent microscope_FM) loại kính lắp nguồn ánh sáng kích thích có độ dài sóng khác để kích thích tạo huỳnh quang Phần lớn VSV khơng có khả phát huỳnh quang có yếu Tuy nhiên nhuộm tế bào VSV phẩm nhuộm huỳnh quang khác Nhờ quan sát, theo dõi chuyên biệt bào quan đại phân tử quan tâm, tế bào sống, tăng trưởng Trang { PAGE } Vi khuẩn có kích thước nhỏ mắt thường thấy Cho đến năm 1676 Antony Leuwenhook hồn thiện kính hiển vi nhân loại người ta thấy hình ảnh loại vi khuẩn Ngày chế tạo nhiều loại kính hiển vi khác thấy hình ảnh vi sinh vật rõ nét từ vào tế bào, chí bào quan đại phân tử sinh học (protein, lipid…) Kính hiển vi quang học: Kính hiển vi quang học (optical microscope) hệ thống dùng để phóng đại VSV có kích thước nhỏ Độ phóng đại từ vài chục lần đến 2000 lần Cấu tạo:  Thị kính: nơi đặt mắt nhìn  Vật kính: nơi kề sát với mẫu quan sát, tiếp nhận ánh sáng từ mẫu vật qua  Bàn mẫu: nơi để phiến kính có chứa mẫu cần quan sát  Tụ quang: Nơi tiếp nhận ánh sáng từ nguồn sáng (đèn) để hội tụ lại thành chùm sáng hẹp  Ốc tụ quang: điều chỉnh tụ quang lên hay xuống quan sát mẫu nhuôm màu hay mẫu sống  Ốc chỉnh thô (ốc thứ cấp): nâng lên hay hạ bàn mẫu xuống để thay đổi tiêu cự tốc độ lớn  Ốc chỉnh tinh (ốc vi cấp): giống ốc chỉnh thô thay đổi tiêu cự tốc độ vi cấp cho phép nhìn ảnh nét Hình 1.20 Kính hiển vi quang học Kính hiển vi soi nổi: Kính hiển vi soi (Stereoscopic microscope) dạng kính lúp có độ phóng đại thay đổi từ 10 – 60 lần thường dùng quan sát vật có kích thước tương đối lớn Nguồn sáng thường chiếu từ phía xuống vật phản xạ vào kính, nhờ quan sát vật thể trạng thái không gian ba chiều Trang { PAGE } Được dùng để đảm bảo tính vơ trùng thao tác với VSV Khơng khí tủ cấy vô trùng lọc màng lọc vơ trùng Trong tủ có đèn UV (Ultra Violet) để khử trùng môi trường tủ cấy Trước thực hiện, bật đèn UV từ 30 - 60 phút, bên tủ phải che lại tối màu Hình 1.17 Tủ cấy vơ trùng (8) Nồi hấp (autoclave) Là thiết bị bắt buộc phải có PTN vi sinh cho phép tiêu diệt tất dạng sống VSV (tế bào sinh dưỡng, bào tử) Nồi hấp có cấu tạo lớp vỏ nên có khả chịu áp suất cao Buồng khử trùng có gắn valve khí, áp kế, nhiệt kế Hình 1.18 Nồi hấp khử trùng Khi sử dụng nên dùng nước cất hay nước vơ khống châm vào nồi, tránh bị đóng cặn Nước phải châm đến mức quy định (9) pH kế (pH meter) Sử dụng máy đo pH để bàn hay pH kế di động để xác định pH môi trường nuôi cấy VSV, dịch lên men hay dung dịch hóa chất Giá trị pH cuối mơi trường nuôi cấy VSV thường xác định 25 oC { INCLUDEPICTURE "http://www.thanglonginst.com/admin/anhnho/mV.jpg" \* MERGEFORMATINET } Hình 1.19 pH kế (9) Kính hiển vi (Microscope) Trang { PAGE } Hình 1.12 Tủ sấy (3) Tủ ấm (lab incubator) Tủ ấm dùng cho mục đích ni cấy VSV Tủ ấm trì nhiệt độ ổn định Dải nhiệt độ tủ ấm thường từ – 50 oC Vi khuẩn thường nuôi cấy 37 oC Đối với đối tượng VSV cần điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Hình 1.13 Tủ ấm (4) Máy lắc (orbital shaker) Máy lắc nhằm đảo trộn môi trường nuôi cấy VSV, tăng cường oxi tan môi truờng dùng để ni VSV hiếu khí mơi trường lỏng { INCLUDEPICTURE "http://photos.labwrench.com/equipmentPhotos/2000/25714614.jpg" \* MERGEFORMATINET } Hình 1.14 Máy lắc (5) Bể ổn nhiệt (water bath) Trong PTN VSV, bể ổn nhiệt sử dụng để trì nhiệt độ nóng chảy mơi trường thạch (45 oC) trước đổ đĩa Petri Hiện nay, cịn có loại bể điều nhiệt lắc (shaking water bath), loại có tác dụng đảo mơi trường trước sử dụng { INCLUDEPICTURE "http://img.directindustry.com/images_di/photo-g/shakingwater-bath-375366.jpg" \* MERGEFORMATINET } Hình 1.15 Bể ổn nhiệt lắc (6) Máy lắc ống nghiệm (vortex mixer) Dùng để đảo trộn dịch VSV cần phân tích hay dung dịch hóa chất chứa ống nghiệm cho Hình 1.16 Máy lắc ống nghiệm (7) Tủ cấy vơ trùng (flow cabinet) Trang { PAGE } (1) (2) (3) (4) (5) (6) Hình 1.10 Pipetteman (1) – 20 l, (2) 20 – 100 l, (3) 20 – 200 l, (4) 200 – 1000 l, (5) 1000 – 5000 l, (6) 1000- 10000 l Chú ý:  Khi sử dụng cần lưu ý, cần bơm micropipette có hai nấc: nấc tương ứng với dung tích chọn hút dịch; nấc hai ấn vượt nấc để đuổi hết dịch mao quản đầu tip  Khơng dùng micropipette để hút loại hóa chất dễ bay hơi, như: acetic, HCl… 1.1.2.2 Thiết bị (1) Cân (lab scale) Thường sử dụng loại cân kỹ thuật (loại số lẻ) có độ xác đế 0,01 g Khi cần xác định lượng xác, người ta dùng cân phân tích (loại số lẻ) có độ xác đến 0,0001 g (0,1 mg) { INCLUDEPICTURE "http://atlanticsupply.com/pictures/%7B23A465F0-AE63-46A2-9D08C02567CD7EC7%7D_PIONEERANALYTICALBALANCE.jpg" \* MERGEFORMATINET } Hình 1.11 Cân kỹ thuật (trái) cân phân tích (phải) Chú ý: cân phải đặt bề mặt phẳng, tránh gió lùa, khơng bị rung (2) Tủ sấy (drying oven) Dùng để sấy khô dụng cụ để khử trùng theo phương pháp nhiệt khơ Tủ sấy thường đốt nóng điện trở, nhiệt độ có lên đến 200 oC Khi nóng, nhiệt đảo quạt để tránh sai lệch nhiệt cục Trang { PAGE } thái sống, kính cần rửa lại nước rửa chén hay xà phịng, làm khơ ngâm cồn 95o - Các loại dụng cụ thuỷ tinh khác: loại cốc thuỷ tinh (becher), ống đong, ống hút… (2) Các loại que cấy - Que cấy thẳng: dùng để cấy sâu Hình 1.6 Que cấy thẳng - Que cấy vòng: dùng cấy ria mặt thạch hay phân lập VSV bề mặt thạch cấy chuyền mơi trường lỏng Hình 1.7 Que cấy vịng - Que cấy móc: dùng để cấy loại nấm mốc hay xạ khuẩn Hình 1.8 Que cấy móc - Que trang (trải): dùng để trải giọt sinh khối VSV bề mặt thạch Hình 1.9 Que trang (3) Micropipette Là loại ống hút máy, có độ xác đến l (tuỳ theo loại) dùng để định lượng thể tích xác dung dịch VSV, môi trường nuôi cấy (lỏng) hay dung dịch hóa chất Micropipette (pipetteman) có nhiều loại, loại có dải giới hạn dung tích, như: 0,1 – 10,0 l; – 20 l; 20 – 200 l; 100 – 1000 l; 1000 – 5000 l 1000 – 10.000 l (1000 l = ml) Tùy theo hãng sản xuất mà quy cách dung tích có thay đổi Trong dải dung tích cho phép, người ta điều chỉnh dung tích xác mong muốn Mỗi loại micropipette có loại đầu tip tương ứng Trang { PAGE } VSV, sử dụng nút bơng thay cho nắp vặn Khi phân tích VSV, sử dùng giấy nhôm hay nút silicon để hạn chế nhiễm VSV { INCLUDEPICTURE "http://www.indigo.com/images/product/60.jpg" \* MERGEFORMATINET } Hình 1.1 Ống nghiệm giá đỡ ống nghiệm - Đĩa Petri (Petri dishes): Gồm nắp lớn đậy lên nắp nhỏ có hình trịn, đường kính 6, 8, 10, 12 cm Đĩa Petri gói lại giấy trước đem hấp tiêt trùng nhiệt ẩm hay sấy nhiệt khô Hiện có loại đĩa Petri nhựa vơ trùng bán sẵn, tiện lợi thường sử dụng phịng phân tích VSV Khác với đĩa thuỷ tinh tái sử dụng nhiều lần, đĩa nhựa chế tạo để sử dụng lần { INCLUDEPICTURE "http://sinhviet.com/sanpham/barloworld_files/0.jpg" \* MERGEFORMATINET } Hình 1.2 Đĩa Petri - Bình tam giác (erlenmeyers): cịn gọi bình nón dùng để chứa môi trường nuôi cấy (lỏng hay rắn) hay dung mơi hóa chất pha chế mơi trường { INCLUDEPICTURE "http://hoahocdoisong.com/image/Articles/erlenmeyer%20flask%20three%20glassware.j pg" \* MERGEFORMATINET } Hình 1.3 Bình tam giác - Đèn cồn (Alcohol bunners): loại đèn được đốt cồn 90o, toả nhiệt tạo vùng khơng gian xung quanh vơ trùng Đèn cồn dùng để khử trùng loại que cấy cách hơ hay đốt lửa đèn cồn { INCLUDEPICTURE "http://hoahocdoisong.com/image/Articles/alcoholburner%2001.jpg" \* MERGEFORMATINET } Hình 1.4 Đèn cồn - Phiến kính (lame) kính (lamelle):  Phiến kính miếng thuỷ tinh hình chữ nhât, có độ suốt cao, dày mm dùng để chứa giọt VSV trạng thái sống hay nhuộm màu quan sát chúng kính hiển vi  Lá kính miếng thuỷ tinh hình vng, có độ suốt cao dày 0,1 - 0,2 mm dùng để đậy lên giọt VSV phiến kính để quan sát trạng thái sống tế bào VSV Hình 1.5 Phiến kính kính Phiến kính kính mua cần làm cách đun sôi NaOH 10% 10 phút, rửa nước cất, rửa HCl loãng sau rửa lại nước cất Phiến kính sử dụng để quan sát để nhuộm màu cần sử lý cách ngâm dung dịch sulfocromate (100 g H2SO4 đđ, 50 g K2Cr2O7 1000 ml nước cất) trước rửa nước tráng lại nước cất Sau quan sát VSV trạng Trang { PAGE } BÀI HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ QUAN SÁT TIÊU BẢN VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC Mục tiêu: Sau học xong này, sinh viên có khả năng: - Chuẩn bị trang thiết bị cần thiết phịng thí nghiệm vi sinh vật - Vận dụng quy tắc an tồn phịng thí nghiệm vi sinh vật - Làm tiêu quan sát vi sinh vật 1.1 Cơ sở lý thuyết 1.1.1 Các quy tắc an tồn phịng thí nghiệm - Hiểu nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật (VSV) - Thao tác an toàn đối tượng VSV mật độ cao - Không ăn uống, hút thuốc phịng thí nghiệm (PTN) VSV - Mặc áo blouse thời gian thực hành - Không dùng miệng hút ống hút (pipette) để định lượng VSV hay hóa chất, mà phải dùng bóp cao su thao tác hút ống hút - Hộp Petri đổ môi trường sau nuôi cấy VSV, không mở nắp, dùng tay để sờ dùng mũi để ngửi - Khi lỡ tay làm đổ VSV nơi làm việc, dùng khăn hay giấy tẩm cồn 70 o để lau lau lại khăn hay giấy tẩm cồn 70 o khác - Khi sử dụng que cấy để gieo cấy VSV cần phải khử trùng cách đốt lửa đèn cồn tránh vương vãi xung quanh - Trước sau thao tác VSV cần lau tay kỹ cồn 70 o Khi thực thao tác cần phải tránh xa lửa đèn cồn tay ướt - Cần ghi tên chủng VSV ngày tháng thí nghiệm lên dụng cụ chứa môi trường nuôi cấy VSV - Tất chất thải môi trường chứa nhiễm VSV cần hấp khử trùng trước đem đổ vào thùng rác Các dụng cụ nhiễm VSV cần ngâm dung dịch sát khuẩn trước rửa - Không đổ thạch vào bồn rửa ống nước 1.1.2 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm vi sinh vật 1.1.2.1 Dụng cụ (1) Dụng cụ thuỷ tinh: - Ống nghiệm (test tubes): dùng để chứa môi trường nuôi cấy nuôi cấy VSV Mơi trường dạng lỏng hay rắn Miệng ống nghiệm đậy nút bơng khơng thấm nước, silicon, giấy nhôm hay nắp vặn Trong trường hợp nuôi cấy Trang { PAGE } Đánh giá thực hành Bảng Tiêu chí đánh giá chung STT Tiêu chí đánh giá Điểm Ý thức tổ chức, kỷ luật An toàn, vệ sinh Thời gian Chuẩn bị Thao tác Kết Báo cáo TỔNG Trang { PAGE } 10 GI ỚI THIỆU HỌC PHẦN Mục tiêu học phần Sau học xong học phần này, sinh viên có khả về: Kiến thức:  Phân biệt xác nấm men, nấm mốc, vi khuẩn;  Củng cố kiến thức sinh lý, sinh hoá vi sinh vật mà sinh viên học học phần lí thuyết Kĩ năng:  Thực thao tác sử dụng kính hiển vi, làm tiêu quan sát vi sinh vật;  Pha chế số môi trường thông dụng môi trường đặc hiệu để nuôi vi sinh vật;  Thực kỹ thuật gieo cấy, nuôi, phân lập vi sinh vật;  Thực kỹ thuật phát định lượng vi sinh vật tiêu vệ sinh an toàn thực phẩm Thái độ: Rèn luyện tính cẩn thận, làm việc có khoa học; Có quan điểm vi sinh vật lên men, bảo quản vệ sinh an toàn thực phẩm Phân bố chương trình thực hành Thời gian lý thuyết: tiết Thời gian thực hành: 30 tiết, chia thành bài, tiết Nội dung thực hành vi sinh vật bao gồm: - Chuẩn bị trang thiết bị dụng cụ phịng thí nghiệm, quan sát vi sinh (tiêu sống, nhuộm màu); - Kỹ thuật pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật; - Kỹ thuật phân tích vi sinh vật; - Một số trình lên men thực phẩm Đánh giá học phần Mỗi buổi thực hành, sinh viên phải soạn báo cáo trước (kết ghi sau) đến phịng thí nghiệm ký xác nhận thầy cô Sinh viên không soạn báo cáo trước xem không thực hành buổi thí nghiệm Sinh viên làm báo cáo đóng thành cuốn, nộp vào buổi cuối Bố cục báo cáo thang điểm: viết ngắn gọn nội dung sau khổ giấy A4: Cơ sở lý thuyết Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất thiết bị Các bước thực Kết Nhận xét thảo luận Trang { PAGE } DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT & THUẬT NGỮ Chữ viết tắt: VSV_ Vi sinh vật PTN _ Phịng thí nghiệm OD _ Optical density EMP _ Embden Meyerhof Parnas CFU _ Coloning Form Unit VKHK _ Vi khuẩn hiếu khí NM-NM _ Nấm men nếm mốc NADH _ Nicotinamide Adenine Dinucleotide Thuật ngữ: Tiêu bản: phiến kính có chứa vi sinh vật trạng thái sống chết, dùng để quan sát hình thái vi sinh vật Lame: Hay cịn gọi phiến kính, dùng tiêu vi sinh vật Lamelle: Hay gọi kính, dùng làm tiêu giọt ép để quan sát vi sinh vật Môi trường thạch: Môi trường dinh dưỡng rắn đóng khối thành phần agarose Canh trường: Môi trường dinh dưỡng lỏng để nuôi cấy định danh vi sinh vật Canh khuẩn: Môi trường lỏng có vi sinh vật sinh trưởng Mơi trường đơng khô thương phẩm: Môi trường dinh dưỡng thương phẩm để nuôi cấy vi sinh vât phối chế sẵn Sinh khối: Khối lượng tế bào vi sinh vật không gian xác định Khuẩn lạc: Một khối tế bào vi sinh vật phát triển từ tế bào bào tử Trang { PAGE } Hình 4.4 Mơ hình kỹ thuật hộp trải 44 Hình 4.5 Phương pháp phân tích vi sinh kĩ thuật hộp đổ 45 Hình 5.1 Buồng đếm hồng cầu 47 Hình 5.2 Cấu tạo buồng đếm Neubauer cải tiến 48 Hình 5.3 Buồng đếm Neubauer cải tiến 49 Hình 5.4 Đồ thị đường tương quan tuyến tính mật độ quang số lượng tế bào VSV 51 Hình 5.5 Đếm khuẩn lạc TS VKHK (Mơi trường cao thịt-pepton) 54 Hình 5.6 Số lượng dạng khuẩn lạc Petri sau ni cấy 55 Hình 5.7 Cách cho dịch vi sinh vật vào buồng đếm 55 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Dụng cụ hóa chất 18 Bảng 1.2 Tiêu chí đánh giá 22 Bảng 2.1 Nhu cầu khoáng số vi sinh vật 23 Bảng 2.2 Mối quan hệ nhiệt độ áp suất 27 Bảng 2.3 Thành phần số loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật 27 Bảng 2.4 Dụng cụ thiết bị 27 Bảng 2.5 Tiêu chí đánh giá 31 Bảng 3.1 Dụng cụ, thiết bị hóa chất 34 Bảng 3.2 Tiêu chí đánh giá 37 Bảng 4.1 Lượng mẫu tối thiểu cần thiết để phân tích 39 Bảng 4.2 Dụng cụ, thiết bị hóa chất 43 Bảng 4.3 Tiêu chí đánh giá 47 Bảng 5.1 Các loại buồng đếm 51 Bảng 5.2 Các giá trị tương quan mật độ quang số lượng tế bào vi sinh vật 52 Bảng 5.3 Dụng cụ, hóa chất thiết bị 54 Bảng 5.4 Tiêu chí đánh giá 58 Bảng 6.1 Dụng cụ, thiết bị hóa chất 59 Bảng 6.2 Tiêu chí đánh giá 61 Trang { PAGE } DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Ống nghiệm giá đỡ ống nghiệm Hình 1.2 Đĩa Petri Hình 1.3 Bình tam giác Hình 1.4 Đèn cồn Hình 1.5 Phiến kính kính Hình 1.6 Que cấy thẳng Hình 1.7 Que cấy vịng 10 Hình 1.8 Que cấy móc 10 Hình 1.9 Que trang 10 Hình 1.10 Pipetteman 10 Hình 1.11 Cân kỹ thuật (trái) cân phân tích (phải) 11 Hình 1.12 Tủ sấy 11 Hình 1.13 Tủ ấm 12 Hình 1.14 Máy lắc 12 Hình 1.15 Bể ổn nhiệt lắc 12 Hình 1.16 Máy lắc ống nghiệm 13 Hình 1.17 Tủ cấy vơ trùng 13 Hình 1.18 Nồi hấp khử trùng 13 Hình 1.19 pH kế 14 Hình 1.20 Kính hiển vi quang học 15 Hình 1.21 Kính hiển vi soi 15 Hình 1.22 Kính hiển vi đối pha 16 Hình 1.23 Kính hiển vi huỳnh quang 16 Hình 1.24 Kính hiển vi điện tử 17 Hình 1.25 Cách làm tiêu quan sát vi sinh vật trạng thái sống 19 Hình 1.26 Vi khuẩn Gram dương bắt màu tím 20 Hình 1.27 Vi khuẩn Gram âm (có màu hồng đỏ) 20 Hình 3.1 Các kiểu ria môi trường thạch 33 Hình 3.2 Kỹ thuật cấy ria đĩa thạch 36 Hình 4.1 Kỹ thuật hộp trải 41 Hình 4.2 Kỹ thuật hộp đổ 41 Hình 4.3 Kỹ thuật pha lỗng 43 Trang { PAGE } MỤC LỤC Trang Danh mục hình Danh mục bảng Danh mục chữ viết tắt thuật ngữ Giới thiệu học phần Bài HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ QUAN SÁT TIÊU BẢN VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC Bài KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG 22 Bài KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT 32 Bài KỸ THUẬT PHÂN TÍCH VI SINH VẬT 38 Bài PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT - LÊN MEN ETHANOL 47 Bài LÊN MEN LACTIC 58 Phụ lục 62 Trang { PAGE } TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM Thí nghiệm VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM (Dành cho hệ Đại học, Cao đẳng Trung cấp) Biên soạn: Trần Quốc Huy TP Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2011 ... nghiệm - Tên mẫu thực phẩm thử tên nhà sản xuất - Tên quan lấy mẫu gửi mẫu - Ngày tiếp nhận mẫu PTN - Trạng thái bao bì - Yêu cầu kiểm nghiệm - Kết phân tích Chú ý: Kết kiểm nghiệm cần ghi theo... bảo gửi gấp đến nơi kiểm nghiệm thời gian ngắn kết xác tình trạng thực phẩm - Thực phẩm gửi đến PTN phải có phiếu yêu cầu kiểm nghiệm kèm theo nhãn dán bao gồm: o Cơ quan nhà máy sản xuất o Ngày,... mẫu từ đến tháng, tùy theo mức độ dễ hư hỏng mẫu hàng 4.1.1.3 Chuẩn bị thử mẫu Thực phẩm đưa đến PTN cần tiến hành theo trình tự sau: - Kiểm tra bao bì, xem có hợp lệ hay khơng - Kiểm tra lại phiếu