®¹i häc quèc gia hµ néi CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN 1H NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) 13C NMR Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectrosc[.]
CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN H-NMR : Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) C-NMR : Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13) 13 DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer (Phổ DEPT) H -1H-COSY: 1H -1H- Correlated Spectroscopy ( Phổ tương tác proton) HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết) IR : Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại) ESI-MS : Electron Spray Ionisation - Mass Spectroscopy (Phổ khối bụi electron) SKLM : Sắc ký lớp mỏng DMSO : DiMethylSulfoxide TMS : Tetramethylsilan s : singulet s (br) : singulet tù d : dublet dd : dublet dublet dt : dublet triplet m: : multiplet t : triplet td : triplet dublet J (Hz) : Hằng số tương tác tính Hz δ (ppm) : Độ dịch chuyển hố học tính ppm DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Số liệu phân đoạn thu chất tinh khiết 13 Bảng 2.2 : Số liệu phổ 1H-NMR chất A2 (500 MHz, CDCl3) 16 Bảng 2.3 : Số liệu phổ 1H-NMR chất A4 (500 MHz, DMSO) 19 Bảng 3.1: Kết định lượng alcaloid toàn phần rễ Lá ngón 23 Bảng 3.2: Kết SKLM hệ dung môi Toluen: aceton: ethanol: amoniac đặc [45: 45: 7: 3] 26 Bảng 3.3: Kết phân lập alcaloid sắc ký cột .28 MỞ ĐẦU Nguồn cỏ đất nước ta vô phong phú đa dạng Nó đã, trực tiếp gián tiếp góp phần giải nhu cầu đời sống ăn, mặc, ở, thuốc chữa bệnh, v.v Cùng với việc tìm hiểu để sử dụng mặt có lợi cỏ, từ lâu người ta quan tâm đến mặt trái vấn đề này, tác hại độc người động vật Lĩnh vực nghiên cứu độc, có liên quan đến giám định hố pháp vụ ngộ độc bị đầu độc cỏ Nhưng quan trọng mối liên hệ độc thuốc Người ta sử dụng nhiều độc để làm thuốc cà độc dược, mã tiền, đầu hoạt tính có tác dụng chữa bệnh dùng liều lượng bệnh độc trở thành thuốc Ngược lại, số thuốc dùng khơng định gây độc cho người bệnh Sự nhầm lẫn thường xảy dẫn tới vụ ngộ độc đáng tiếc không nước sử dụng rộng rãi cỏ để làm thuốc nước ta, mà nhiều nơi giới Cây Lá ngón (Gelsemium elegans Benth.) chứa hàm lượng alcaloid có độc tính mạnh [5] Hàng năm nước ta xảy nhiều vụ ngộ độc Lá ngón sử dụng nhầm lẫn, đầu độc, tự sát Theo thống kê Viện Pháp y Quốc gia, từ năm 2000 - 2004 số người tử vong ngộ độc Lá ngón giám định hóa pháp tỉnh miền Bắc 82 người Để đáp ứng yêu cầu giám định y pháp phục vụ công tác cấp cứu nạn nhân ngộ độc Lá ngón trung tâm chống độc cần phải có chất chuẩn, phục vụ cho phương pháp phân tích Trong luận văn chúng tơi xin đóng góp phần vào việc chiết tách, tinh chế, xác định cấu trúc số hợp chất alcaloid rễ Lá ngón (Gelsemium elegans Benth.) Việt Nam Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương độc 1.1.1 Khái niệm độc Cây độc mà người hay động vật ăn phải, có lượng nhỏ, gây bệnh rối loạn thể, nặng chết [5] Số lượng độc trái đất khơng phải ít, đến người ta biết hàng nghìn lồi Số lồi thường tập trung vào nhóm hạt kín ngành Nấm Đặc biệt lớp Ngọc lan (cây hai mầm) có tỷ lệ độc cao lớp Hành (cây mầm) Các họ thực vật có nhiều độc họ Thầu dầu, họ Trúc đào, họ Cà, họ Đậu, họ Mã tiền v.v… Số loài độc vùng nhiệt đới nhiều vùng ôn đới hàn đới [5] Nước ta có thảm thực vật phong phú, có hàng trăm lồi độc nhiều loài nấm độc [5] Các độc chia làm hai nhóm, nhóm có độc tính ổn định kéo dài suốt trình sinh trưởng phát triển chúng (như ngón, trúc đào, cà độc dược…) nhóm mà tính độc xuất giai đoạn định (như củ khoai tây, chất độc solanin xuất thời gian củ khoai tây nảy mầm tập trung mầm) [5] Các chất thường gặp độc phong phú đa dạng, chủ yếu alcaloid, glycozit, acid hữu cơ, lacton, nhiều chất khác chưa nghiên cứu [5] Sự phân bố chất độc phận không nhau, chúng tích luỹ phần định như: tập trung hạt (thầu dầu, mã tiền), (thuốc phiện, hồi núi), (trúc đào, cà độc dược…), rễ (ơ đầu, chút chít…), nhựa mủ (nhựa sui, nhựa xương rồng…) Cá biệt cịn có tương phản điển hình cây, củ đậu: người ta dùng củ đậu để ăn, hạt có chất độc, gây chết người ăn phải lượng nhỏ [5] Trong trình phơi sấy chế biến cỏ làm thay đổi số tính chất chúng, có chứa chất độc dễ bay Ngược lại, độc chứa alcaloid, độc tính không thay đổi phơi sấy Các độc chứa glycozit ủ làm thức ăn cho gia súc trình lên men phát triển dẫn tới phá huỷ hoàn toàn glycozit độc Trong số cây, chất độc lại hình thành trình phơi sấy, chế biến hay ủ làm thức ăn [5] 1.1.2 Hợp chất alcaloid độc Alcaloid hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, đa số có nhân dị vịng, có phản ứng kiềm, thường gặp thực vật động vật, thường có hoạt tính sinh học mạnh cho phản ứng hoá học với số thuốc thử gọi thuốc thử chung alcaloid [12] Trong cây, alcaloid thường dạng muối acid malic, limonic, oxalic, sucxinic, … Chúng dễ tan nước, dễ hấp thụ qua máy tiêu hoá người động vật Khi dạng tự do, chúng khó tan nước lại dễ tan dung môi hữu ethanol, ether, chloroform [5] Các alcaloid tác dụng với số acid acid silicotungstic, acid photphomolipdic tanin, dễ dàng bị tủa, trở thành chất khó tan nước Lợi dụng tính chất người ta dùng acid tanic nước sắc có chứa tanin để giải độc bị ngộ độc alcaloid [5] Hàm lượng alcaloid dễ dàng thay đổi Ngày nay, với phương pháp đại người ta phát vết chúng nhiều loài, quy ước nói có alcaloid hàm lượng chúng lớn phần vạn Tỷ lệ alcaloid nhiều chiếm từ phần vạn đến vài phần trăm so với trọng lượng khô Đặc biệt, vỏ canhkina tới 10 phần trăm [5] Nhiều tổng kết cho thấy đại đa số có chứa alcaloid hai mầm Theo thống kê đến thuộc thảo bụi có nhiều alcaloid gỗ Cây năm thường chứa nhiều alcaloid lưu niên [7] 1.2 Cây Lá ngón 1.2.1 Đặc điểm thực vật phân bố Hình 1: Gelsemium elegans Benth Cây Lá ngón mọc Việt Nam có tên khoa học Gelsemium elegans Benth., thuộc họ Mã tiền (Loganiaceae) [6], cịn có tên gọi là: Co ngón, Thuốc r út ruột, Hồ mạn trường, Đại trà đắng, Hồ mạn đằng, Hoàng đằng, Cầu [5], Đoạn trường thảo, Ngón vàng, Khau ngn [11] Cây Lá ngón loại mọc leo, dài - m Thân cành hình trụ [11], khơng có lơng , thân có khía dọc Lá mọc đối, hình trứng thn dài, hình mác, mép ngun, mặt nhẵn bóng [1] Hoa mọc hình xim đầu cành hay kẽ lá, cánh hoa màu vàng có hoa trắng [4] Quả nang, màu nâu Hạt nhỏ, có rìa mỏng bao quanh, mép khía rách Mùa hoa vào tháng 10 - 12, mùa vào tháng - [11] Cây Lá ngón phân bố chủ yếu Nam Đông Nam châu Á như: Ấn Độ, Thái Lan, Indonesia, Lào, Srilanca, Malaysia, Trung Quốc, Việt Nam [15] Ở Việt Nam mọc hoang phổ biến vùng núi cao như: Hà Giang, Tuyên Quang, Lai Châu, Sơn La, Lào Cai, Lạng Sơn, Hồ Bình, Quảng Ninh, Quảng nam, tỉnh Tây Nguyên…[2, 11] Ngoài lồi Gelsemium elegans Benth., giới cịn có lồi Lá ngón mọc Bắc Mĩ [11] có tên khoa học là: Gelsemium sempervirens (Linne) [21] Gelsemium rankinii [20] 1.2.2 Độc tính tác dụng Cây Lá ngón có độc tính mạnh, Chất độc alcaloid có tồn Độc rễ non, đến thường hoa, thân quả; thân già độc thân non Nguời ta cho cần ăn kèm theo chén rượu làm chết người sau vài Chính nhân dân ta thường khơng dùng Lá ngón để làm thuốc [5, 6, 11] Triệu chứng ngộ độc Lá ngón khát nước, sốt, đau rát họng, đau bụng, nôn mửa, hoa mắt, cắn chặt, sùi bọt mép, thân nhiệt hạ, huyết áp hạ, cuối cúng chết ngừng hô hấp [11] Trong dân gian người ta thường dùng mỡ lợn, dầu lạc để uống, dùng dịch chiết rau má rau muống để làm hồi tỉnh lại [1] Theo Võ Văn Chi, Lá ngón có vị đắng, cay, tính nóng, độc; có tác dụng nhiệt, tiêu thũng, bạt độc, giảm đau, sát trùng, chống ngứa Lá tươi giã nhỏ đắp nấu nước rửa để trị bệnh như: eczema, nấm chân, thân; đòn ngã tổn thương, đụng giập; trĩ, tràng nhạc; đinh nhọt, viêm mủ da; phong hủi [1] Trong y học cổ truyền Nhật Bản, người ta sử dụng Lá ngón để trị bệnh lở loét, viêm da, ung nhọt [16] Ở Trung Quốc Bắc Mĩ bên cạnh sử dụng tương tự người ta sử dụng rễ để chữa bệnh động kinh giảm đau [6] Gần có nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu tác dụng dược lý như: giảm đau, chống viêm, chống ung thư từ Lá ngón [3, 16, 18] 1.2.3 Các hợp chất alkaloid Những năm gần đây, nhà khoa học giới nghiên cứu nhiều độc Gelsemium elegans Benth., thu hái Bắc Mĩ, Thái Lan, Trung Quốc Nhiều alcaloid có nhân indol (1) phân lập xác định cấu trúc, chủ yếu alcaloid thuộc phân nhóm oxindol indolenin [3, 19] (1) Chúng ta chia alcaloid có nhân indol Lá ngón thành phân nhóm [19] - Nhóm 1: Các alcaloid loại sarpagin - Nhóm 2: Các alcaloid loại koumin - Nhóm 3: Các alcaloid loại humantenin - Nhóm 4: Các alcaloid loại gelsemin - Nhóm 5: Các alcaloid loại gelsedin gelselegin Trong alcaloid thuộc nhóm có nhân indol, thuộc nhóm 3, 4, có khung oxindol [19], cịn alcaloid thuộc nhóm có khung indolenin [3] Nhóm bao gồm alcaloid: koumidin (2), 19 - (z)- akuammidin (3) [3] (2) koumidin (3) 19 - (z) - akuammidin Nhóm bao gồm alcaloid: koumin (4) [14], 19 - (R) hydroxydihydrokoumin (5), 19 - (S) - hydroxydihydrokoumin (6) [3] (4) koumin (5) 19 - (R) - hydroxydihydrokoumin (6) 19 - (S) - hydroxydihydrokoumin Nhóm bao gồm alcaloid: humantenirin (7), humantenin (8), 11 hydroxyhumantenin (9), 11 - metoxyhumantenin (10), rankinidin (11), N desmetoxyrankinidin (12), 11- hydroxyrankinidin (13) [3], Ngồi cịn có 11 hydroxyhuman - humantenine [15] (7) R1 = OCH3 R2 = H R3 = OCH3 : humantenirin [19] (8) R1 = OCH3 R2 = H R3 = H : humantenin [19] (9) R1 = OCH3 R2 = OCH3 R3 = OH : 11 - hydroxyhumantenin (10) R1= OCH3 R2 = OCH3 R3 = OCH3 : 11 - metoxyhumantenin (11) R1 = OCH3 R2 = H R3 = H : rankinidin (12) R1 = H R2 = H R3 = H : N - desmetoxyrankinidin (13) R1 = OCH3 R2 = H R3 = OH : 11 - hydroxyrankinidin Nhóm bao gồm alcaloid: gelsemin (14), gelsevirin (15), 21 oxogelsemin (16), 21 - oxogelsevirin (17), 19 - (R) - hydroxydihydrogelsevirin (18), 19 - (R) - acetyldihydrogelsevirin (19), 19 - (S) - hydroxydihydrogelsevirin (20), 19 - (R) - hydroxydihydrogelsemin (21) [3] (14) R = H : gelsemin (16) R = H : 21 - oxogelsemin (15) R = OCH3 : gelsevirin(17) R = OCH3 : 21 - oxogelsevirin (18) R1 = OCH3 R2 = OH : 19 - (R) - hydroxydihydrogelsevirin (19) R1 = OCH3 R2 = OAc : 19 - (R) - hcetyldihydrogelsevirin (20) R1 = OCH3 R2 = OH : 19 - (S) - hydroxydihydrogelsevirin (21) R1 =H R2 = OH : 19 - (R) - hydroxydihydrogelsemin Nhóm bao gồm alcaloid: gelselegin (22), 11 - metoxy - 19 hydroxygelselegin (23) [19, 3], gelsenicin (24), elegansamin (25), gelsedin (26), gelsemicin (27), 14 - ß - hydroxygelsedin (28), 14 - ß - hydroxygelsemicin (29) [3], 14,15 dihydroxygelsenicine (30), 14 - hydroxy - 19 - oxogelsenicin (31), 14 acetoxygelsenicin (32), 14 - acetoxy - 15 - hydroxygelsenicin (33), 14 acetoxygelselegin (34) [16, 17], gelsamydin (35), 19 - hyđroxygelsamyin (36), [3] Ngoài cịn có monoterpenoid oxindol alcaloid tách từ phần lá, có liên quan đến Gelsenicin là: gelsedilam C 17H18N2O4, 14 - acetoxygelsedilam C19H20N2O6, gelsefuranidin C24H25N2O5, gelseiridon C29H35N2O8 [17] (22) R1 = H R2 = H: gelselegin (23) R1 = OCH3 R2 = OH : 11 - methoxy - 19 - hydroxygelselegin proton J (Hz) hóa học δ (ppm) H9 1H d J = Hz 7,57 H12 1H d J = 7,5 Hz 7,51 H11 1H dt J = 1,5 Hz; J = 7,5 Hz 7,33 H10 1H dt J = 1,5 Hz; J = Hz 7,24 H18α 1H dd J = Hz; J = 18 Hz 4,83 H3 1H t J = 1,5 Hz 4,81 H18β 1H dd J = Hz; J=11,5 Hz 4,74 H19 1H dd J = 11,5 Hz; J = 18 4,57 Hz H21α 1H dd J = 4,5 Hz; J= 11,5 4,14 Hz H21β 1H d J = 11,5 Hz 3,51 H17α 1H d J = 11 Hz 3,05 H17β 1H d J = 11 Hz 2,96 H5 1H m 2,74 H16 1H m 2,71 H14α 1H td N-CH3 3H s 2,48 H15 1H m 2,26 H6α 1H m 2,24 H6β 1H dd J = Hz; J = 14 Hz 2,13 H14β 1H td J = Hz; J = 14,5 Hz 1,67 J = 3,5 Hz; J = 15 Hz 2,58 Phổ cộng hưởng từ chiều 13C-NMR, DEPT 90 DEPT 135 cho biết chất A4 có 20 nguyên tử carbon, có nhóm CH 3, nhóm CH2, nhóm CH carbon bậc (Cq) Phổ hai chiều HSQC cho biết tương tác 1J proton với nguyên tử carbon Đặc biệt nhóm methylene (CH 2) có proton tương tác với nguyên tử carbon δH 4,83 ; 4,74/δC 115,74 proton H18 - C18; δH 4,14 ; 3,51/δC 60,5 proton H21 - C12; δH 3,05 ; 2,96/δC 56,9 proton H17 - C17; δH 2,58 ; 1,67/δC 24,7 proton H14 - C14; δH 2,24 ; 2,13/δC 28,6 proton H6 - C6 Từ phổ HSQC carbon bậc (CH 3), bậc (CH2) bậc (CH) xác định Từ nguyên tử carbon xác định kết hợp với phổ HMBC (tương tác xa 3J hay 4J proton nguyên tử carbon) carbon bậc (Cq) xác định Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO, δ ppm) : 185,5 (C2); 154,5 (C13); 143,8 (C8); 137,5 (C19); 127,9 (C11); 125,8 (C10); 123,1 (C9); 120,4 (C12); 115,7 (C18); 69,9 (C3); 60,5 (C21); 57,4 (C7); 56,9 (C17); 55,8 (C5); 44,8 (C20); 42,2 (N-CH3); 37,9 (C16); 32,4 (C15); 28,6 (C6); 24,7 (C14) Qua phân tích phổ so sánh với số liệu công bố tài liệu [3, 13], chất A4 xác định cấu trúc koumin Koumin (Kou - Wen) tiếng Trung Quốc có nghĩa độc, phân lập từ Gelsemium elegans vào năm 1932, đến năm 1981 cấu trúc xác định phổ cộng hưởng từ phân giải cao khẳng định lại phương pháp phổ nhiễu xạ tia X [13] Koumin có cấu trúc nhóm chất corynanthein alcaloid có cấu hình tuyệt đối C15 Chương 3: THỰC NGHIỆM ... triển chúng (như ngón, trúc đào, cà độc dược…) nhóm mà tính độc xuất giai đoạn định (như củ khoai tây, chất độc solanin xuất thời gian củ khoai tây nảy mầm tập trung mầm) [5] Các chất thường gặp... ta xảy nhiều vụ ngộ độc Lá ngón sử dụng nhầm lẫn, đầu độc, tự sát Theo thống kê Viện Pháp y Quốc gia, từ năm 2000 - 2004 số người tử vong ngộ độc Lá ngón giám định hóa pháp tỉnh miền Bắc 82 người... lại, độc chứa alcaloid, độc tính khơng thay đổi phơi sấy Các độc chứa glycozit ủ làm thức ăn cho gia súc trình lên men phát triển dẫn tới phá huỷ hoàn toàn glycozit độc Trong số cây, chất độc lại