0934 sử dụng chế phẩm bekimi để phòng bệnh do vi khuẩn aeromonas sp gây ra trên cá dĩa (symphysodon sp)

Nguyễn Thoại Ân tgk TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐHSP TPHCM _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ SỬ DỤNG CHẾ PHẨM BEKIMI ĐỂ PHÒNG BỆNH DO VI KHUẨN AEROMONAS SP GÂY RA TRÊN CÁ DĨA (SYMPHYSODON SP.) NGUYỄN THOẠI ÂN*, ĐOÀN THỊ QUỲNH HƯƠNG**, NGUYỄN THỊ HIẾU TRANG*, PHAN TRỌNG NGHĨA*, DƯƠNG NGỌC KIỀU THI* TÓM TẮT Vi khuẩn Aeromons hydrophila CD1 nguyên nhân gây bệnh xuất huyết cá dĩa phân lập Để phòng bệnh vi khuẩn gây ra, chế phẩm Bekimi có nguồn gốc từ thảo dược với thành phần trầu (Piper betle) sử dụng Kết cho thấy chế phẩm có khả kháng khuẩn mạnh Aeromonas hydrophila CD1 với đường kính vịng trịn kháng khuẩn 20,73 ± 0,87mm Nồng độ Bekimi pha lỗng với tỉ lệ 1:10 có khả ức chế phát triển vi khuẩn Cá dĩa cho ăn thức ăn có trộn chế phẩm với nồng độ 100ml/1kg trước gây cảm nhiễm ngày có khả phịng bệnh, cá khơng có dấu hiệu bị xuất huyết với tỉ lệ sống 77,78% Từ khóa: Aeromonas hydrophila CD1, Bekimi, cá dĩa, phòng bệnh ABSTRACT Using Bekimi to prevent disease caused by Aeromonas sp in discus fish (Symphysodon sp.) Aeromonas hydrophila CD1 which caused hemorrhagic septicaemia disease in discus fish (Symphysodon sp.) was isolated To prevent disease caused by A hydrophila, the effect of Bekimi was evaluated Bekimi is a product extracted from the herbal plants especially the betel leaf (Piper betle) Bekimi showed significantly antibacterial activiti against A hydrophila with the zone of inhibition is 20.73 ± 0.87mm The concentration dilution of Bekimi was 1:10 could inhibit the growth of Aeromonas hydrophila CD1.After feeding fish with mixed food, with concentration 100ml/1kg, fish did not have signal of diseases, hemorrhage in liver was completely disappeared with the survival rate was 77.78% Keywords: Aeromonas hydrophila CD1, Bekimi, Symphysodon sp., disease prevention Mở đầu Cá dĩa (Symphysodon sp.) loài cá ưa chuộng loại cá cảnh chúng có màu sắc sặc sỡ, đa dạng với loại hoa văn khác nhau, dáng bơi uyển chuyển, nhẹ nhàng Tuy nhiên cá dĩa nhạy cảm, dễ bị tác động điều kiện môi trường bên ngồi tác nhân nấm, kí sinh trùng, vi khuẩn vi rút có khả * Kĩ sư, Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao, TPHCM; Email: thoai_an90@yahoo.com ** Thạc sĩ, Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao, TPHCM lây nhiễm cao gây chết cá hàng loạt Trong đó, vi khuẩn Aeromonas hydrophila tác nhân gây chết cấp tính làm cho màu sắc thể sậm lại, vây tụm, cá lờ đờ, bơi thăng bằng, bỏ ăn, chướng bụng, thận lách sưng, mật sưng chuyển màu đen, gan sung huyết có mủ, tiết nhiều nhớt Khi cá bị nhiễm khuẩn nặng, mắt thể cá bị ăn sâu tạo thành vết loét [2] Thông thường, cá bị bệnh, người nuôi trồng thường sử dụng kháng sinh để phòng trị bệnh nhiễm khuẩn Tuy nhiên năm gần đây, việc dùng kháng sinh nhiều không theo quy định nên tượng kháng kháng sinh vi khuẩn gia tăng nhiều, đồng thời việc dùng kháng sinh ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường chất kháng sinh khó bị phân hủy Do đó, chất kháng khuẩn từ thiên nhiên quan tâm chúng có khả ức chế tiêu diệt mầm bệnh, thân thiện với mơi trường Dựa vào đặc tính ưu việt thảo dược khả kháng khuẩn trầu [1], [5], Bekimi – chế phẩm có nguồn gốc từ thảo dược với thành phần từ trầu nghiên cứu Viện Phát triển Công nghệ Đào tạo, sản xuất thử nghiệm Công ti TNHH Sản xuất Mĩ phẩm Lan Hảo Hiện việc sử dụng Bekimi đem lại hiệu đáng kể việc phòng trị số bệnh tôm Tuy nhiên, việc ứng dụng sản phẩm thủy sản hạn chế mặt đối tượng áp dụng Thấy tác dụng Bekimi để mở rộng phạm vi ứng dụng chế phẩm nuôi trồng thủy sản, thực nghiên cứu nhằm đánh giá hiệu chế phẩm loại cá cảnh, trước tiên cá dĩa Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu Cá dĩa nuôi Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao TP Hồ Chí Minh, chế phẩm Bekimi cung cấp Công ti TNHH Sản xuất Mĩ phẩm Lan Hảo Môi trường trypton soybean agar (TSA) (Liofilchem), Rimler-Shotts agar (RSA) (Himedia), Bile Salt Irgasan Brilliant Green Agar (BSGA) (Himedia), môi trường canh thang Luria Bertani (LB) (Liofilchem) môi trường thạch Mueller-Hinton (MH) (Himedia) Các môi trường hấp khử trùng 121oC, 15 phút trước sử dụng 2.2 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp phân lập vi khuẩn Cá dĩa với dấu hiệu bệnh thu nhận, giải phẫu cá, quan nội tạng cho vào dung dịch Phosphate buffered saline (PBS), nghiền nhỏ Dung dịch đồng cấy môi trường TSA Ủ 37oC 24- 48h Vi khuẩn tiếp tục làm thu khuẩn lạc đơn Các dòng sau phân lập môi trường TSA thử khả sinh catalase H2O2 3% (Sigma-Aldrich), sau cấy mơi trường chọn RSA BSGA đem nhuộm Gram Phương pháp định danh vi khuẩn Vi khuẩn sau sàng lọc định danh kĩ thuật giải trình tự vùng 16S rRNA DNA vi khuẩn li trích kit Wizard® Genomic DNA Purification Kit Promega, Mĩ Phản ứng PCR khuếch đại vùng 16S – rRNA sử dụng cặp mồi 27F 1488R (Invitrogen) có trình tự [8] 27F (5’-CCA GAG TTT GAT CGT GGC TCA G -3’) 1488R (5’-CGG TTA CCT TGT TAC GAC TTC ACC -3’) Phản ứng khuếch đại thực máy luân nhiệt (C-1000Biorad) với chu trình nhiệt sau Bước Giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kì o phút 1 Biến tính ban đầu 94 Biến tính 94o phút Bắt mồi 50o phút Kéo dài 72o phút Kéo dài cuối 72o 10 phút Giữ mẫu 4o 1 35 Các sản phẩm PCR đem gửi giải trình tự Công ti First BASE Laboratories Sdn Bhd., Singapore Các trình tự đại diện mẫu so sánh với trình tự sẵn có NCBI GenBank cách sử dụng BLAST alignment để nhận diện Phương pháp đánh giá khả kháng khuẩn chế phẩm Khả kháng khuẩn chế phẩm Bekimi dựa phương pháp kháng sinh đồ khuyếch tán đĩa thạch Kirby-Bauer Huyền phù vi khuẩn chuẩn bị có độ đục tương đương với độ đục ống chuẩn 0,5 Mc-Farland với nồng độ vi khuẩn 12×108CFU/ml Mẫu đối chứng dương: Kháng sinh Oxytetracyclin nồng độ 0,02g/l Mẫu đối chứng âm: nước cất hấp khử trùng Dùng tăm vô trùng cấy khuẩn lên mặt thạch MH, chờ thạch khơ vịng đến phút Đục lỗ mặt thạch với đường kính 6mm/lỗ Mỗi lỗ thạch, nhỏ 100µl chế phẩm Bekimi (nồng độ Bekimi khơng pha loãng) Đĩa ủ 370C, sau 24 giờ, đường kính vịng kháng khuẩn đo Mỗi thí nghiệm lặp lại lần Phương pháp xác định nồng pha loãng ức chế tối đa chế phẩm Nồng độ pha loãng ức chế tối đa chế phẩm thực dựa vào phương pháp Anja K cộng (2010) Chế phẩm pha loãng với nước theo nồng độ 1:1, 1:10, 1: 100, 1: 1000 Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn với nồng độ 10 6-107 CFU/ml môi trường MH Mẫu đối chứng dương: vi khuẩn môi trường MH không bổ sung chế phẩm Mẫu đối chứng âm: chế phẩm dung dịch mơi trường MH Cho 50 µl chế phẩm pha loãng với nồng độ khác vào giếng khay 96 giếng, thêm 50µl huyền dịch vi khuẩn Khay 96 giếng đem lắc 900 vòng phút ủ 37oC 24 Để quan sát rõ kết quả, sau ủ 24 giờ, chất thị màu 2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride (TTC) bổ sung vào giếng, ủ khay giếng 37oC tránh ánh sáng sau quan sát tượng màu Vi khuẩn khử muối tetrazolium thành dẫn xuất màu formazan quan sát [4] Thử nghiệm chế phẩm cá dĩa Trước thử nghiệm chế phẩm, cho cá dĩa ăn thức ăn trộn với chế phẩm nhằm thực thí nghiệm an tồn Thí nghiệm cảm nhiễm thực cách tiêm vào bụng cá 0,1 ml vi khuẩn nồng độ 109cfu/ml, 108cfu/ml, 107cfu/ml Cá đối chứng tiêm nước muối sinh lí Mật độ vi khuẩn gây chết 50% cá thí nghiệm xác định từ thí nghiệm sử dụng để gây cảm nhiễm cá bố trí thí nghiệm phịng bệnh chế phẩm Thí nghiệm phịng bệnh bố trí với nghiệm thức thí nghiệm, nghiệm thức gồm 30 cá dĩa: NT đối chứng: cá không sử dụng chế phẩm; NT1: cá cho ăn thức ăn có trộn chế phẩm nồng độ 10ml/kg; NT2: cá cho ăn thức ăn có trộn chế phẩm nồng độ 30ml/kg; NT3: cá cho ăn thức ăn có trộn chế phẩm nồng độ 60ml/kg; NT4: cá cho ăn thức ăn có trộn chế phẩm nồng độ 100ml/kg Cho cá ăn chế phẩm trước ngày trước tiêm khuẩn sau 10 ngày sau tiêm khuẩn kết thúc thí nghiệm Số lượng cá chết ghi nhận ngày Cá bệnh mổ khám quan sát bệnh tích Kết thảo luận Phân lập vi khuẩn Quan sát khuẩn lạc phân lập môi trường TSA, khuẩn lạc thuộc nhóm Aeromonas sp có dạng hình trịn, lồi, màu kem, kích thước từ 2-3mm có khả sinh catalase (Hình 1) Hình Hình dạng khuẩn lạc môi trường TSA khả sinh catalase Những dịng có khuẩn lạc cho kết catalase dương tính cấy sang mơi trường chọn lọc RSA có màu cam Đối với mơi trường chọn lọc BSGA, sau nhỏ dung dịch KI lên khuẩn lạc mọc môi trường BSGA thấy xuất vịng sáng (Hình 2) Hình Hình dạng khuẩn lạc môi trường RSA môi trường BSGA Quan sát nhuộm gram kính hiển vi, vi khuẩn có tế bào dạng hình que, màu hồng (Hình 3) Hình Hình dạng tế bào vi khuẩn kính hiển vi Từ đặc tính đó, bước đầu phân lập dịng vi khuẩn có đặc điểm giống Aeromonas sp phân lập từ gan, mang vây cá Kết định danh phương pháp giải trình tự vùng 16S rRNA Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mã hóa cho 16S rRNA chủng phân lập dùng cặp mồi 27F- 1488R cho sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1500bp tất mẫu phân lập (Hình 4) bp 1500 1000 750 500 250 Hình Gel điện di sản phẩm PCR khuếch đại vùng 16S dòng vi khuẩn phân lập dùng primer 27F 1488R Ladder 1kb Vùng trình tự 16S rRNA giải trình tự so sánh độ tương đồng di truyền với lồi ngân hàng gen NCBI cơng cụ BLAST Kết trình bày Bảng Bảng Danh sách tên dòng vi khuẩn phân lập từ cá dĩa dựa kết giải trình tự vùng 16S rRNA dùng primer 27F 1488R tra NCBI/BLAST STT Tên loài A.hydrophila strain TB2 Aeromonas sp HR8 A veronii strain B7 Citrobacter freundii Nguồn gốc mẫu tương đồng/ địa genbank Độ tương đồng Nguồn gốc mẫu phân lập Cá họ Chìa vơi (Ephippus orbis) Trung Quốc, KC252599 93% Ruột ốc sên (Helisoma sp.) USA, KM363229 80% Vùng miệng cá dĩa trắng Mang cá dĩa bồ câu Cá vàng (Carassius auratus) 98% Gan cá dĩa bồ câu 98% Vây cá dĩa đỏ Ấn Độ, KF661548 Ghẹ chấm bị bệnh (Portunus trituberculatus L.) Trung Quốc, HQ 170626 Dựa vào kết phân tích trình tự vùng 16S rRNA xác định chủng Aeromonas hydrophila có khả gây bệnh cá A hydrophila loài có khả gây bệnh cá nước A hydrophila nguyên nhân gây bệnh xuất huyết cá [9] Do đó, vi khuẩn phân lập có đặc điểm hình thái giống A hydrophila kí hiệu Aeromonas hydrophila CD1 nguồn vi khuẩn để thực thí nghiệm Đánh giá khả kháng khuẩn chế phẩm Sau 24hthực ủ đĩa chứa chế phẩm vi khuẩn A hydrophila CD1, kết đường kính vịng trịn kháng khuẩn trình bày Bảng Hình Sau đĩa ủ tiếp vịng tuần, kết khơng thay đổi Điều chứng tỏ chế phẩm có khả tiêu diệt hồn toàn vi khuẩn gây bệnh Dựa vào kết cho thấy Bekimi với nồng độ chưa pha loãng từ sản phẩm ban đầu kháng khuẩn mạnh với đường kính vịng tròn kháng khuẩn 20,73 ± 0,87 mm Kết cao nghiên cứu khả kháng khuẩn thảo dược với vi khuẩn A hydrophila Panuwat Suppakul cộng với đường kính vịng trịn kháng khuẩn 12,40±0,28 mm [7] Bảng Đường kính vịng trịn kháng khuẩn Bekimi oxytetracycline Đường kính vịng tròn kháng khuẩn (mm) Đối chứng âm (nước) Đối chứng dương (oxytetracycline) 31,7 ± 0,53a Chế phẩm 20,73 ± 0,87b Trong cột giá trị trung bình có kí tự theo sau khác có khác biệt mặt thống kê oxytetracyclin H2O Chế phẩm Hình Đường kính vịng trịn kháng khuẩn Bekimi có khả kháng khuẩn thành phần chứa trầu có chất có khả kháng khuẩn eugenol, chavibetol, chavibetol acetate 4allilpyrocatechol diacetate [3] Các chất tương tác với thành phần màng tế bào vi khuẩn làm tổn thương màng tế bào, gây rối loạn trình trao đổi chất màng tế bào, ức chế trình sinh tổng hợp protein nucleic acid dẫn đến việc ngăn cản phát triển tiêu diệt vi khuẩn [6] Xác định nồng pha loãng tối đa chế phẩm ức chế vi khuẩn Quan sát màu sắc giếng cho kết sau, giếng B2, B3, B4 chứa dịch khuẩn, không chứa Bekimi làm đối chứng dương, vi khuẩn có khả khử TTC thành chất formazan tạo màu đỏ Ở giếng B5, B6, B7 chứa dung dịch Bekimi không chứa dịch khuẩn làm đối chứng âm B5, B6, B7 có màu vàng Ở giếng C1, C2, C3 chứa bekimi không pha lỗng dịch khuẩn có màu vàng, chứng tỏ Bekimi ức chế phát triển vi khuẩn sau 24h nên khơng cịn vi khuẩn để khử TTC tạo màu Giếng C4, C5, C6 chứa Bekimi pha lỗng 10 lần (1:10) dịch khuẩn có màu vàng, chứng tỏ với nồng độ pha loãng 1:10, Bekimi có khả tiêu diệt phát triển vi khuẩn Ở hai nồng độ pha loãng Bekimi 1:100 1:1000, giếng C7, C9, C10 giếng G2, G3, G4 có màu đỏ, chứng tỏ hai nồng độ pha lỗng Bekimi khơng cịn khả ức chế phát triển vi khuẩn Như vậy, nồng độ pha loãng tối đa để chế phẩm 1:10 có khả ức chế phát triển vi khuẩn A hydrophila CD1 điều kiện in vitro (hình 6) 2345 6789 10 11 12 Giếng B1, B2, B3: đối chứng âm AB C D E FGiếng B4, B5, B6: đối chứng dương GH Giếng C2, C3, C4: Bekimi khơng pha lỗng Giếng C5, C6, C7: Bekimi pha loãng 10 lần Giếng C8, C9, C10: Bekimi pha loãng 100 lần Giếng D2, D3, D4: Bekimi pha lỗng 100 lần Hình Xác định nồng độ ức chế phương pháp pha loãng nồng độ Kết thử nghiệm cảm nhiễm Ở nghiệm thức cảm nhiễm, cá bệnh có dấu hiệu bệnh lí tương tự gần giống với dấu hiệu bệnh lí cá bệnh ngồi tự nhiên Sau tiêm cá có dấu hiệu bơi lờ đờ, thăng bằng, ăn ít, đồng thời có dấu hiệu điển xuất huyết quan nội tạng gan, ruột, tì tạng bị thâm đen với tỉ lệ chết nồng độ khác (Hình 7) Hình Tỉ lệ chết cá nghiệm thức thí nghiệm gây cảm nhiễm Ở thí nghiệm cảm nhiễm nồng độ cao 109CFU/ml cá bắt đầu chết sau 16h với tỉ lệ cao khoảng 70% toàn số cá bể chết sau 24h tiêm Ở nồng độ 108CFU/ml, theo dõi sau 16h cá chết với tỉ lệ thấp 20%, sau 24h cá chết 50% chết từ từ, đến sau 48h cá chết hồn tồn Ở thí nghiệm cảm nhiễm nồng độ 107CFU/ml, cá có dấu hiệu lờ đờ, ăn yếu, khơng có chết hàng loạt, cá chết sau 96h với tỉ lệ thấp khoảng 20% Ở lô cá đối chứng, cá khỏe mạnh bình thường, khơng có dấu hiệu bệnh Với nồng độ khác nhau, cá biểu bệnh với triệu chứng khác có dấu hiệu xuất huyết bên thể (Hình 8) Hình Biểu cá sau tiêm vi khuẩn (1) Xuất huyết vây; (2) Nội tạng bị xuất huyết; (3) Nội tạng bị thâm đen Sau kết thí nghiệm cảm nhiễm ngược, với liều lượng gây chết 50% số cá thí nghiệm, A hydrophila CD1 sử dụng nồng độ 108cfu/ml để tiêm vào cá thí nghiệm thử hiệu chế phẩm Bekimi Kết thử nghiệm chế phẩm Để khẳng định chế phẩm an toàn cho cá dĩa, cá khỏe chọn ăn thức ăn có trộn chế phẩm, sau cho cá ăn nồng độ cao 100ml/kg, quan sát thấy cá ăn bình thường, cá khơng bị ảnh hưởng chế phẩm Tuy nhiên, sử dụng chế phẩm cách ngâm vào nước với nồng độ 10ml/L 30ml/L, cá chết sau khoảng nồng độ cao hơn, cịn nồng độ 10ml/L cá chết hàng loạt sau 12 Do việc sử dụng phương pháp ngâm chế phẩm để phịng bệnh khơng thực hiện, thực thí nghiệm trộn chế phẩm vào thức ăn để phịng bệnh cho cá Trong thí nghiệm sử dụng chế phẩm trộn vào thức ăn để phòng bệnh cho cá Ban đầu cá cho ăn thức ăn tim bị có trộn chế phẩm hai lần ngày, quan sát thấy cá ăn bình thường Sau tuần, nồng độ vi khuẩn 10 8cfu/ml tiêm vào toàn cá nghiệm thức cá tiếp tục cho ăn thức ăn có trộn chế phẩm với nồng độ khác Cá ăn lượng ăn trước tiêm khuẩn Sau ngày cho cá ăn sau tiêm khuẩn, tỉ lệ sống cá có thay đổi rõ rệt Hình Tỉ lệ sống cá nghiệm thức thí nghiệm: NT đối chứng: cá khơng sử dụng chế phẩm; NT1: cá cho ăn thức ăn có trộn chế phẩm nồng độ 10ml/kg; NT2: cá cho ăn thức ăn có trộn chế phẩm nồng độ 30ml/kg; NT3: cá cho ăn thức ăn có trộn chế phẩm nồng độ 60ml/kg; NT4: cá cho ăn thức ăn có trộn chế phẩm nồng độ 100ml/kg Ở nghiệm thức không cho ăn chế phẩm cho ăn với nồng độ 10ml/kg 30ml/kg, cá sống với tỉ lệ 50% Nhưng với nồng độ cao 60ml/kg 100ml/kg tỉ lệ sống cá cao lần lược 68,89% 84,44% Sau ngày, cá chết 100% nghiệm thức không cho ăn chế phẩm (NT đối chứng) NT trộn chế phẩm với nồng độ 10ml/kg Ở hai nồng độ 30ml/kg, 60ml/kg, liều bổ sung vào thức ăn thấp nên tỉ lệ cá sống sau ngày tiêm vi khuẩn 50% với tỉ lệ 28,89% 44,44% Tuy nhiên, nồng độ 30ml/kg, cá tiếp tục chết với tỉ lệ sống 24,44% sau 10 ngày Ở nồng độ 100ml/kg, cá chết ngày đầu với tỉ lệ thấp khoảng 15,56% sau gây cảm nhiễm Sau cá chết từ từ đến ngày thứ 3, tỉ lệ sống cá 77,78% cá ngưng chết kết thúc thí nghiệm (Hình 9) Với cá chết thí nghiệm đem mổ để quan sát nội tạng Kết điều trị cho thấy, nồng độ trộn chế phẩm cao 100ml/kg, cá khơng cịn xuất tình trạng xuất huyết gan nồng độ khác (Hình 10) Điều chứng tỏ chế phẩm có tác dụng phịng bệnh với liều bổ sung vào thức ăn 100ml/kg Hình 10 (1) gan bị xuất huyết nặng không dùng chế phẩm; (2) gan bị xuất huyết nhẹ dùng chế phẩm nồng độ thấp 30ml/kg, 60ml/kg; (3) gan bình thường dùng chế phẩm nồng độ 100ml/kg Kết luận Chế phẩm Bekimi có khả kháng khuẩn mạnh với đường kính vòng tròn kháng khuẩn cao 20,73 ± 0,87 mm vi khuẩn bị tiêu diệt hoàn toàn Bekimi sử dụng mức độ pha loãng tối đa 1:10 điều kiện in vitro ức chế dược vi khuẩn Đối với việc sử dụng phương pháp ăn để phòng bệnh cho cá, phương pháp đem lại hiệu cho cá sử dụng với nồng độ 100ml/kg thức ăn tim bò Sử dụng Bekimi với liều lượng 100ml/kg không gây hại cho cá đồng thời việc sử dụng chế phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên không gây ô nhiễm nguồn nước thân thiện với môi trường TÀI LIỆU THAM KHẢO Huỳnh Kim Diệu Nguyễn Thành Văn (2011), “Sự chủng hoạt tính kháng khuẩn trầu khơng (Piper betle) lốt (Piper lolot) đồng sông Cửu Long”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, tr 282-288 Nguyễn Ngọc Du (2008), “Bệnh thường gặp cá Koi (Cyprinus carpio), cá dĩa (Symphysodon discus) biện pháp phịng trị”, Đề tài Sở Khoa học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh Viện Nghiên cứu Ni trồng Thủy sản Nguyễn Thị Lý Trần Thị Hồng Vân (2007), “Tách tinh dầu carotenoid từ trầu (Piper betle L.), Hội nghị Khoa học Công nghệ lần 9, TPHCM Anja, K Sasa, P Barbara, J., & Sonja, M (2010), “Evaluation of diffusion and dilution methods to determine the antibacterial activiti of plant extracts”, Journal of Microbiological Methods, 81, 121- 126 Jahir, K., & Naveen, K (2011), “Evaluation of antibacterial properties of extract of piper betel leaf”, Journal of pharmaceutical and biomedical sciences, 11(01), 1-3 Oyedemi, S., Okoh, A., Mabinya, L., Pirochenva, G., & Afolayan, A (2009), “The proposed mechanism of bactericidal action of eugenol, α-terpineol and γ-terpinene against Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes, Proteus vulgaris and Escherichia coli”, African Journal of Biotechnology, (7), 1280-1286 Panuwat, S., Nutcha, S., & Panchuti, P (2006), “Antimicrobial and Antioxidant Activities of Betel Oil”, Kasetsart Universiti, 40, 91-100 Rajesh, P., Madhav, U., Varsha, K., Katchi, V., Kulkarni, G., & Shouche, Y (2011), “Isolation and identification of two new strains of Aeromonas spp from diseased golurami fish and aquarium water”, International Journal of Life Sciences, 5(1), pp.2531 Ruth Francis-Floyd (2002), “Aeromonas infection”, http://www.simplidiscus.com/library/disease_medications/external/aeromonas_infect ions.shtml (Ngày Tòa soạn nhận bài: 22-10-2015; ngày phản biện đánh giá: 03-11-2015; ngày chấp nhận đăng: 13-6-2016) ... cá chết hàng loạt sau 12 Do vi? ??c sử dụng phương pháp ngâm chế phẩm để phịng bệnh khơng thực hiện, thực thí nghiệm trộn chế phẩm vào thức ăn để phịng bệnh cho cá Trong thí nghiệm sử dụng chế phẩm. .. hydrophila CD1 sử dụng nồng độ 108cfu/ml để tiêm vào cá thí nghiệm thử hiệu chế phẩm Bekimi Kết thử nghiệm chế phẩm Để khẳng định chế phẩm an toàn cho cá dĩa, cá khỏe chọn ăn thức ăn có trộn chế phẩm, ... xuất Mĩ phẩm Lan Hảo Hiện vi? ??c sử dụng Bekimi đem lại hiệu đáng kể vi? ??c phòng trị số bệnh tôm Tuy nhiên, vi? ??c ứng dụng sản phẩm thủy sản hạn chế mặt đối tượng áp dụng Thấy tác dụng Bekimi để mở