1. Trang chủ
  2. » Tất cả

0998 bước đầu đánh giá tác động của tế bào gốc trung mô từ dây rốn trên mô hình chuột tổn thương gan do tắc mật

17 2 0

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 17
Dung lượng 1,6 MB

Nội dung

Nguyễn Minh Thư cộng Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 16(1), - Bước đầu đánh giá tác động tế bào gốc trung mơ từ dây rốn mơ hình chuột tổn thương gan tắc mật Preliminary evaluating the effects of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on bile duct ligation induced liver injury mice Nguyễn Minh Thư1, Lê Văn Trình2, Đặng Minh Thành2, Trương Hải Nhung2* Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TPHCM, Việt Nam * Tác giả liên hệ, Email: thnhung@hcmus.edu.vn THƠNG TIN TĨM TẮT DOI:10.46223/HCMCOUJS Mục tiêu: Nghiên cứu nhằm đánh giá tính an tồn hiệu tế bào gốc trung mơ mơ hình chuột tổn thương gan tắc ống dẫn mật Phương pháp: Chuột Swiss tiến hành phẫu thuật thắt ống dẫn mật (BDL) để gây bệnh xơ gan Sau BDL ngày, chuột tiêm tế bào gốc trung mô từ mô dây rốn Ngày nhận: 09/04/2021 (umbilical cord blood-derived - UCB-MSC) với liều 5x105 tb/con Hiệu điều trị đánh giá thông qua tỉ lệ sống chết, Ngày nhận lại: 10/05/2021 số sinh hóa (AST, ALT, Albumin) thay đổi cấu trúc mô học Duyệt đăng: 25/05/2021 (nhuộm H&E), tích lũy collagen mơ gan (nhuộm Sirius Red), hoạt hóa tế bào hình (nhuộm hóa mô miễn dịch với marker α-SMA) Kết quả: Sau 12 ngày điều trị, so với nhóm đối chứng-PBS, chuột tiêm MSC có tỉ lệ sống cao (100%), giảm tổn thương gan (chỉ số sinh hóa men gan Alb, AST ALT trung bình 2.016 Dg/L, 432.9 UI/L 417.7 UI/L), giảm diện tích Từ khóa: xơ gan thơng qua diện tích hoại tử trung bình 7.529%, tích chuột tắc mật, liệu pháp tế bào gốc, điều trị tắc mật, bệnh lý gan, lũy collagen gan trung bình 1.968% tỷ lệ dương tính protein α-SMA 1.42725% Kết luận: Bước đầu đánh giá bệnh hẹp đường mật tính an tồn hiệu điều trị chuột tổn thương gan tắc ống dẫn mật tế bào gốc trung mô (MSC) ABSTRACT Keywords: Objective: The purpose of this research is to evaluate effective treatment of mesenchymal stem cells due to bile duct bile duct ligated mice, stem cell therapy, bile disease treatment, obstruction on mouse models with liver damage underwent bile duct ligation (BDL) Method: Swiss mice underwent bile duct liver disease, biliary astresia surgery (BDL) to cause cirrhosis After days of BDL, mice were injected with mesenchymal stem cells isolated from umbilical cord blood-derived (UCB-MSC) at a dose of 5x10 5cell/mice Treatment efficacy was assessed through mortality, biochemical indices (AST, ALT, Albumin) and histological changes (H&E staining), collagen accumulation in liver tissue (Sirious Red staining), astrocytes activation (immunohistochemistry with αSMA marker) Result: After 12 days of treatment, compared to the PBS-control group, mice injected with MSC had a high survival rate (100%), reduced liver damage (average liver enzymes of Alb, AST and ALT, respectively 2.016 Dg/L, 432.9 UI/L and 417.7 UI/L,), reducing the area of cirrhosis through an average necrotic area of 7.529%, the mean liver collagen accumulation 1.968%, and the positive rate of α-SMA protein is 1,42725% Conclusion: Initially assess the safety and treatment effectiveness with liver damage caused by bile duct obstruction by mesenchymal stem cells (MSC) Giới thiệu Tắc mật bẩm sinh hay thủng đường mật trẻ sơ sinh dù gặp không phát sớm điều trị dẫn đến suy gan hay xơ gan (Bates, Bucuvalas, Alonso, & Ryckman, 1998) Dữ liệu thống kê cho thấy tỉ lệ mắc bệnh nước Châu Á cao so với châu Âu châu Mỹ, chẳng hạn tỉ lệ mắc bệnh Mỹ 1:19.000, Anh nước châu Âu 1:16.000, tỉ lệ mắc bệnh nước châu Á Nhật Bản Trung Quốc khoảng 1:9.600, đặc biệt cao Việt Nam với tỉ lệ 1:2400 (T Liu, Wang, Karsdal, Leeming, & Genovese, 2012) Khi ống dẫn mật bị tắt nghẽn dịch mật bị ứ đọng lại gây tình trạng bệnh lý nghiêm trọng xơ gan, nhiễm trùng đường mật, nhiễm trùng máu Tắc mật thời gian dài dẫn đến tình trạng gan bị xơ hóa, gan bị xơ hóa tổn thương gan lúc thường khơng phục hồi (Nam, Ko, & Sohn, 2019) Phương pháp điều trị tiến hành phẫu thuật Kasai (được phát triển bác sĩ người Nhật, Morio Kasai) Phương pháp giúp giảm bớt tắc mật cách phẫu thuật nối hỗng tràng với nhánh nhỏ mật gan (portoentersstomy) Các trường hợp bệnh nhân không tiến hành phẫu thuật tử vong vịng năm, với thời gian sống trung bình tháng (Bates et al., 1998) Tuy nhiên sau tiến hành phẫu thuật Kasai, bệnh nhân cần phải tiến hành ghép gan Tỷ lệ sống sót sau năm khơng ghép gan thay đổi từ 32% đến 63% tỷ lệ phẫu thuật Kasai thất bại cao (62%) (Shinkai et al., 2009) Mặc dù có nhiều tác dụng phụ, kháng sinh, thuốc vận mật (choleretics) steroid thường định sau phẫu thuật Kasai Bệnh nhi bị hẹp đường mật bẩm sinh cần kiểm sốt tình trạng suy gan mật để chuẩn bị cho việc ghép gan sau Tình trạng khan nguồn tạng ghép thời gian sống sót bệnh nhi sau phẫu thuật Kasai thách thức lớn y khoa Cơ sở lý thuyết Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cell- MSC) tế bào gốc trưởng thành đa chức phân lập từ nhiều nguồn khác từ tủy xương (bone marrow), dây rốn (umbilical cord), mô mỡ (adipose tissue), nội mạc tử cung (endometrium), nước ối (amniotic fluid), mô (dental tissue) (Ullah, Subbarao, & Rho, 2015) MSC có khả tăng sinh biệt hóa thành nhiều loại tế bào, lợi MSC thu nhận dễ dàng, có đặc tính điều hịa miễn dịch, sản sinh chất tiết yếu tố tăng trưởng, cytokine giúp cho MSC trở thành công cụ hiệu để điều trị bệnh viêm mạn tính (Ullah et al., 2015) Ngồi ra, MSC cịn có khả đến mơ tổn thương, ngăn chặn phản ứng viêm, giảm “apotosis” tế bào gan, tăng tái tạo tế bào, hồi phục xơ gan tăng cường chức gan (Kyung Ah Cho et al., 2009; Kyung‐Ah Cho, Woo, Seoh, Han, & Ryu, 2012) Tế bào gốc phân lập từ dây rốn (UCB-MSC) (M B Liu et al., 2017; Lou, Chen, Zheng, & Liu, 2017) có tỷ lệ tăng sinh tế bào cao biểu dấu hiệu lão hóa thấp đáng kể so với nguồn thu nhận từ tủy xương hay mơ mỡ Ngồi UCB-MSC cịn có khả chống viêm cao so với nguồn thu nhận từ tuỷ xương hay mỡ, nên UCB-MSC trở thành mơ hình hữu ích cho ứng dụng lâm sàng liệu pháp tế bào liệu pháp điều trị viêm gan (Eom, Shim, & Baik, 2015; Jin et al., 2013; Lou et al., 2017; Wang, Yuan, & Xie, 2018) Ngồi ra, MSC có khả điều hịa miễn dịch, tương tác với hàng rào miễn dịch hoạt động tế bào trình diện kháng nguyên nên giúp giảm thiểu thải ghép với vật chủ mối quan tâm nhà khoa học (Castillo, Liu, Bonilla, & Rameshwar, 2007) Vì MSC có tiềm biệt hóa thành tế bào gan (Ullah et al., 2015), giảm viêm gan thúc đẩy tái tạo gan (Kyung Ah Cho et al., 2009) nên đường phát triển đầy tiềm cho việc điều trị bệnh lý gan Tại Việt Nam, số công trình nghiên cứu sử dụng MSC để điều trị bệnh xơ gan như: sử dụng tế bào gốc trung mô từ tủy xương để đánh giá hiệu điều trị xơ gan mơ hình chuột CCl4 (N H Truong, Trình, et al., 2016) hay MSC từ mơ mỡ người kết hợp huyết tương giàu tiểu cầu yếu tố tăng trưởng tế bào gan làm giảm xơ hóa gan chuột CCl (N H Truong, Nguyen, et al., 2016); hay sử dụng tế bào gốc tủy xương tự thân điều trị xơ gan bù virus viêm gan B (G D Truong et al., 2018) Hiện chưa có nhiều nghiên cứu tiếp cận điều trị tổn thương gan tắc mật chuột thực nghiệm liệu pháp tế bào gốc Do nghiên cứu này, chúng tơi bước đầu đánh giá tính an tồn hiệu liệu pháp ghép tế bào gốc trung mô từ mô dây rốn (UCB-MSC) (5x105 tb/con) mơ hình chuột Swiss tổn thương gan tắc mật nhằm tiềm điều trị tế bào bệnh lý tắc mật nói riêng tổn thương gan nói chung Phương pháp nghiên cứu 3.1 Đối tượng thí nghiệm Chuột Swiss 6-8 tuần tuổi trọng lượng 25-30g (do Phịng thí nghiệm chăm sóc sử dụng Động vật, Viện tế bào gốc, trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia TPHCM cung cấp) phẫu thuật thắt ống dẫn mật (BDL) để tạo mơ hình tổn thương gan tắc ống dẫn mật Sau ngày chuột có biểu vàng tai, vàng phân thành nhóm thí nghiệm (đối chứng tiêm PBS, ghép tế bào gốc UCB-MSC cung cấp Viện tế bào gốc, Trường ĐH Khoa học tự Nhiên, ĐH Quốc gia TPHCM với liều 5x105 tế bào/con) 3.2 Tạo mơ hình chuột tổn thương tắc ống dẫn mật phương pháp phẫu thuật thắt ống dẫn mật (BDL) Chuột nhịn đói trước tiến hành phẫu thuật thắt ống dẫn mật Sau gây mê (hỗn hợp thuốc mê Xylazine - Zoletil), cố định chuột khay, cạo lông khử trùng vùng bụng thuốc sát khuẩn Povidine, tiến hành mở khoang bụng vị trí ống mật chủ, hồnh Xác định ống mật chủ, dùng vô trùng thắt chặt ống mật chủ vị trí vùng gần cửa gan vùng gần tá tràng (Hình 1) Mục đích phương pháp gây tắc ống dẫn mật làm mật bị ứ đọng gan, mơ lại bệnh lý tắc mật người Hình Phẫu thuật thắt ống dẫn mật (BDL) chuột Swiss 3.3 Tiêm MSC Chuột sau BDL ngày tiêm 1ml dịch huyền phù UCB-MSC (nồng độ 5x10 tb/con) Ringer Lactat vào tĩnh mạch đuôi 3.4 Đánh giá tỷ lệ sống sót, thay đổi khối lượng thể gan Chuột theo dõi tình trạng sống/chết ngày cân đo khối lượng thể theo mốc ngày, ngày, 19 ngày Khối lượng gan cân ngày thứ 19 sau BDL để tiến hành đánh giá 3.5 Đánh giá số bạch cầu để xác định tình trạng viêm chuột tổn thương gan Máu tĩnh mạch thu nhận chuẩn bị tiêu máu lame, để tiêu khô tự nhiên, cố định cồn nhuộm với thuốc nhuộm Giemsa để xác định công thức bạch cầu Để xác định số lượng bạch cầu tổng, máu trộn ống trộn bạch cầu đếm số lượng buồng đếm 3.6 Định lượng số sinh hóa máu để đánh giá chức gan Huyết chuột chuẩn bị từ 500 µl máu theo quy trình đơng máu tự nhiên ly tâm 3000rpm/30 phút để thu phần huyết AST (Aspartate transaminase), ALT (Alanine tranaminase) huyết xác định kit SGOT/SGPT (HUMAN Diagnostics, Germany) theo hướng dẫn nhà sản xuất máy đọc đĩa DTX 880 Multidector bước sóng 340nm Albumin huyết xác định KIT QuantiChrom TM BCG Albumin Assay kit (BioAssay Systems, USA) theo hướng dẫn nhà sản xuất máy đọc đĩa DTX 880 Multidector bước sóng 620nm 3.7 Đánh giá mơ học 3.7.1 Nhuộm Hematoxylin Eosin để đánh giá vùng viêm hoại tử Lát cắt mơ khử parafin sau nhuộm với Hematoxylin Eosin Hình ảnh mơ học chụp kính hiển vi AxioVision Các vùng hoại tử xác định cách khoanh vùng hình chụp phần mềm Axio Vision SE64 Rel.4.9.1 Việc đo tính tốn vùng hoại tử tiến hành theo phương pháp mù (blinded) 3.7.2 Nhuộm Sirius Red để đánh giá tích luỹ collagen gan Lát cắt mơ khử parafin sau nhuộm với thuốc nhuộm Picrosirius Red F3B (PolyScience, Mỹ) theo hướng dẫn nhà sản xuất Các vùng bắt màu đỏ thuốc nhuộm vùng dương tính collagen Hình ảnh chụp kính hiển vi Axio Vision Tỉ lệ diện tích vùng dương tính colagen tính phần mềm ImageJ 3.7.3 Nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) để đánh giá protein gây viêm gan, xơ gan Lát cắt mô gan khử paraffin phục hồi kháng nguyên dung dịch đệm Tris EDTA (pH=9) Nhuộm IHC theo quy trình nhóm nghiên cứu (N H Truong, Trình, et al., 2016) nhân tế bào nhuộm với Hematoxylin (Merck Millipore, Đức) Tỉ lệ diện tích vùng dương tính colagen tính phần mềm ImageJ 3.8 Phương pháp thống kê Các số liệu thí nghiệm xử lý phần mềm GraphPad Prism 8: Phương pháp thống kê student t-test Khác biệt có ý nghĩa thống kê pvalue ≤ 0.05 Kết nghiên cứu 4.1 Kết tạo mơ hình chuột tổn thương tắc ống dẫn mật phương pháp phẫu thuật thắt ống dẫn mật (BDL) 4.1.1 Biểu hình thái bên ngồi Kết thí nghiệm thắt ống dẫn mật tạo tắc nghẽn dòng chảy mật xuống ruột non khiến cho túi mật căng to tích lũy acid/muối mật Chuột sau BDL thành cơng có biểu rõ rệt hình thái bệnh lý viêm gan vàng da (tai đi) (Hình 2B) sụt cân A B Hình So sánh hình thái bên ngồi chuột thường (Normal) chuột BDL sau 19 ngày A: Chuột Normal tai, đuôi màu trắng B: Chuột BDL có tai, màu vàng 4.1.2 Đánh giá tỷ lệ sống chết mơ hình chuột thắt ống dẫn mật Biểu đồ Tỉ lệ sống chết nhóm Normal nhóm BDL Từ biểu đồ cho thấy tỉ lệ sống nhóm chuột Normal 100% nhóm BDL 66.67% sau 19 ngày thắt ống mật Điều chứng tỏ thắt ống dẫn mật gây tổn thương gan dẫn tới tử vong chuột Swiss 4.1.3 Kết thay đổi khối lượng thể gan A B Biểu đồ Sự thay đổi khối lượng thể gan nhóm Normal nhóm BDL Biểu đồ cho thấy chuột bình thường (Normal) tăng cân chuột tổn thương tắc ống dẫn mật (BDL) bị sụt cân (p

Ngày đăng: 05/01/2023, 10:50

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w