DISTRIBUTION OF RARE AND LESSER KNOWN INSECTIVORES (SORICOMORPHA) IN VIETNAM HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 4 697 ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN GIỐNG LỢN NGOẠI N[.]
HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN GIỐNG LỢN NGOẠI NUÔI TẠI VIỆT NAM TẠ THỊ LOAN, NGUYỄN THỊ DIỆU THÚY Viện Công nghệ Sinh học NGUYỄN GIANG SƠN Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật ĐỖ VÕ ANH KHOA Trường Đại học Cần Thơ Lợn vật nuôi chiếm tỷ trọng cao ngành chăn nuôi Việt Nam với số lượng đàn khoảng 12 triệu Các giống lợn nội đa dạng, chiếm tới 60 - 90% số lượng chúng thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới điều kiện chăn nuôi vùng nông thôn nghèo Hiện giống lợn nhập nội, chủ yếu lợn Yorkshire lợn Landrace, nuôi phổ biến nước ta với ưu điểm tốc độ sinh trưởng nhanh, tỷ lệ nạc cao (45-55%) Các chương trình cải tạo nguồn gen chọn lọc hình thái truyền thống kết hợp với hỗ trợ thị di truyền liên quan đến tính trạng có giá trị kinh tế như: chất lượng thịt, tốc độ tăng trưởng, số lượng sinh ra/lứa mang lại lợi ích đáng kể cho ngành chăn ni lợn Khá nhiều cơng trình nghiên c ứu đánh giá mức độ đa hình nguồn gen liên quan tính trạng có giá trị kinh tế giống lợn nội Việt Nam tiến hành (Nguyễn Ngọc Tuân cs., 1999; Nguy ễn Văn Cường cs., 2003; Nguyễn Vân Anh cs., 2005; Nguyễn Thu Thúy cs., 2005a, b) Với mục đích xác định tương quan đa hình gen với số tính trạng có giá trị kinh tế, tạo sở khoa học để chọn lọc đàn giống lợn nhập ngoại, nghiên cứu tiến hành phân tích đa hình di truyền gen liên quan tính trạng kinh tế H-FABP (Heart Fatty Acid Binding Protein gene), LIF (Leukocyte Inhibitory Factor gene), MYOG (Myogenin gene), RYR1 (Ryanodine Receptor gene) phương pháp PCR-RFLP đối tượng dòng lợn lai máu Yorkshire x Landrace nuôi Trại Chăn nuôi thực nghiệm Hòa An thuộc Đại học Cần Thơ I PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 mẫu mô tai lợn đực thuộc nhóm lai máu Yorkshire x Landrace (YL) t nguồn gốc 14 mẹ khác nhau, có khối lượng 33 ± 4,02 kg, thu từ Trại Chăn nuôi thực nghiệm Hòa An, Đại học Cần Thơ Lợn ADN hệ gen tách chiết từ mẫu theo phương pháp Ausubel (1995) Cặp mồi nhân đặc hiệu đoạn gen H-FABP, LIF, MYOG, RYR1 thiết kế dựa sở trình tự gen cơng bố Genbank, có trình tự thể Bảng Bảng Trình tự mồi đặc hiệu gen Gen H-FABP LIF MYOG RYR1 Mồi xuôi (F)/ Mồi ngược (R) [5’-3’] F: ATT GCC TTC GGT GTG TTT GAG R: TCA GGA ATG GGA GTT ATT GG F: ATG TGG ATG TGG CCT ACG G R: GGG AAC AAG GTG GTG ATG G F: TCA GGA AGA ACT GAA GGC TG R: GTT TCC TGG GGT GTT GC F: GTT TGC CAC AGG TCC TAC CA R: ATT CAC CGG AGT GGA GTC TC Kích thước sản phẩm PCR [bp] 816 407 353 656 697 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Thành phần chu trình nhiệt PCR nhân đoạn gen đích trình bày Bảng Bảng Bảng Thành phần hỗn hợp PCR Thể tích [µl] Thành phần Taq DNA polymerase 5U Buffer 10x MgCl2 25 mM dNTPs 2,5 mM Primer F mM Primer R mM H2O DNA template H-FABP LIF MYOG RYR1 1,0 2,5 2,0 2,0 1,0 1,0 14,5 1,0 1,0 2,0 0,5 2,0 1,0 1,0 11,5 1,0 1,0 2,5 2,0 2,0 1,0 1,0 14,5 1,0 1,0 2,5 1,5 2,0 1,0 1,0 14,0 2,0 Bảng Chu trình nhiệt PCR Bước Nhiệt độ [°C] - Thời gian [phút] H-FABP LIF MYOG RYR1 94 - 96 - 94 - 95 - Biến tính 94 - 0,75 96 - 0,5 94 - 94 - 0,75 Gắn mồi 57 - 60 - 0,5 60 - 64 - Tổng hợp 72 - 72 - 0,5 72 - 72 - Kết thúc 72 - 10 72 - 72 - 72 –10 Giữ mẫu 14 - ∞ 14 - ∞ 14 - ∞ 14 - ∞ Biến tính ban đầu Số chu kì 35 Sản phẩm PCR cắt enzyme giới hạn tương ứng gồm DraIII (LIF), HaeIII (H-FABP), Hin6I (RYR1), MspI (H-FABP MYOG), điện di gel agarose 1,5%, nhuộm ethidium bromide soi dư ới ánh sáng tử ngoại Thành phần phản ứng cắt gồm 15,0 µl sản phẩm PCR, 2,0 µl buffer 10x, 1,0 µl enzyme cắt giới hạn 2,0 µl nước, ủ điều kiện 37°C 14 II KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đa hình đoạn gen H-FABP Đoạn gen H-FABP mẫu nghiên cứu nhân thành công kỹ thuật PCR biểu thị băng điện di đặc hiệu có kích thước thiết kế (816 bp) (Hình 1) Trên đoạn gen có ểm đa hình vị trí nucleotide số 1489, 1556 nhận biết bị cắt enzyme MspI vị trí 1811 bị cắt enzyme HaeIII, tương ứng kiểu allele trình bày Bảng Sản phẩm cắt kiểu gen tổ hợp băng cắt allele tương ứng trình bày đại diện cho số mẫu nghiên cứu Hình 698 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Bảng Các điểm đa hình đoạn gen H-FABP (6q21→q26, Y16180: 1401-2216) Enzyme MspI MspI MspI HaeIII HaeIII Trình tự nhận biết Vị trí cắt Độ dài sản phẩm sau cắt (bp) C↓CGG C↓CGG C↓CGG GG↓CC GG↓CC Không 1489 1489, 1556 1517, 1533, 1811 1517, 1533 816 89/727 67/89/660 16/117/278/405 16/117/683 Vị trí đột biến 1489, 1556: T 1489: T→C 1489: T→C, 1556: T→C 1811: (G) 1811: G→C Allele a A B d D Đa hình đoạn gen LIF Đoạn gen LIF mẫu nghiên cứu nhân thành cơng kỹ thuật PCR có kích thước thiết kế (407 bp) Đoạn gen mang vị trí đa hình nhận biết bị cắt enzyme DraIII tương ứng với allele A B Allele A (mang đồng hốn Thymine→Cytosine vị trí 6988) không bị cắt enzyme, allele B bị cắt enzyme thành băng có kích thước 144 bp 266 bp (Bảng 5) kiểu gen AA, AB, BB cho sản phẩm cắt tương ứng thể đại diện cho số mẫu nghiên cứu Hình Hình 1: Điện di đồ sản phẩm PCR-RFLP gen H-FABP cắt Hình 2: Điện di đờ sản phẩm MspI HaeIII cắt đoạn gen LIF DraIII M: Thang cỡ đoạn DNA 100 bp; PCR: Sản phẩm PCR; 1-5, 7: Kiểu gen AA; 6: Kiểu gen aa; 8: Kiểu gen Aa M2: Thang cỡ đoạn DNA 100 bp; 9, 12-14: Kiểu gen dd; 10, 11: Kiểu gen Dd M: Thang cỡ đoạn DNA 100 bp; 1,3-6,8: Kiểu gen AB; 2, 9: Kiểu gen BB; 7: Kiểu gen AA Bảng Các điểm đa hình đoạn gen LIF (exon 3, AJ296176: 6843-7249) Trình tự nhận biết Vị trí cắt Độ dài sản phẩm sau cắt (bp) DraIII CACNNN↓GTG 6987 144/266 DraIII CACNNN↓GTG Khơng 407 Enzyme Vị trí: Biến dị Allele 6988: T→C B 6988: (T) A Đa hình đoạn gen MYOG Đoạn gen MyoG có vị trí đa hình nhận biết enzyme MspI tương ứng với allele A B Allele A không mang trìnhự tnhận biết enzyme cắt nên giữ nguyên kích thước sản phẩm PCR (353 bp) Allele B mang trình tự nhận biết enzyme cắt, sản phẩm cắt băng có kích thước 134 bp 219 bp (Bảng 6) Sản phẩm cắt kiểu gen AA, AB, BB thể cho số mẫu đại diện Hình 699 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Bảng Các điểm đa hình đoạn gen MYOG (NST9, X89209: 39-391) Trình tự nhận biết C↓CGG C↓CGG Enzyme MspI MspI Vị trí cắt 173 Không Độ dài sản phẩm sau cắt (bp) 134/219 353 Vị trí: Biến dị Allele 173: (C) 173: C→D B A Đa hình đoạn gen RYR1 Hình Điện di đồ sản phẩm cắt đoạn gen Myogenin M: Thang cỡ đoạn DNA 100 bp; 1, 2, 3, 5, 7: Kiểu gen BB; 4, 8, 9, 10: Kiểu gen AB; 6: Kiểu gen AA Hình Điện di đồ sản phẩm cắt đoạn gen RYR1 M: Thang cỡ đoạn DNA 100 bp; PCR: sản phẩm PCR; 63-80, 82: Kiểu gen NN; 81: Kiểu gen Nn Đoạn gen RYR1 có kích thước sản phẩm PCR theo thiết kế 656 bp (Hình 4) Trên đoạn gen có điểm đa hình phân biệt enzyme Hin6I tạo allele N n Allele N mang trình tự nhận biết enzyme, cho sản phẩm cắt gồm băng có kích thước 167 bp 489 bp Allele n mang đồng hoán Cytosine → Thymine làm vị trí nhận biết enzyme nên khơng bị cắt, giữ nguyên kích thước 656 bp (Bảng 7) Các kiểu gen có sản phẩm bị cắt tương ứng thể cho số mẫu đại diện Hình Bảng Các điểm đa hình đoạn gen RYR1 (6p11→q21, Z49778: 18129-18784) Enzyme Hin6I Hin6I Trình tự nhận biết G↓CGC G↓CGC Vị trí cắt 18617 Khơng Độ dài sản phẩm sau cắt (bp) 167/489 656 Vị trí biến dị 18618: (C) 18618: C→T Allele N n Tần suất xuất kiểu gen giống lợn lai Yorkshire x Landrace Kết phân tích đa hình PCR-RFLP đoạn gen H -FABP, LIF, MYOG, RYR1 33 mẫu lợn lai Yorkshire x Landrace (YL) thống kê Bảng Phân tích đa hình gen H -FABP/MspI, quan sát kiểu allele kiểu gen có tần s ố xuất tương ứng là: kiểu allele A: 84,8%; kiểu allele a: 15,2%; kiểu gen AA: 72,7%, kiểu gen Aa: 24,2% kiểu gen aa: 3,0% Theo nghiên cứu Thúy cs (2005), không ghi nhận allele B hai giống lợn ngoại Yorkshire Landrace Như vậy, khơng có allele B giống lợn lai Yorkshire Landrace (YL) nghiên cứu phù hợp Trong giống lợn lai YL kiểu gen dị hợp tử Aa có tần số lớn (24,2%) so sánh với giống lợn chủng Yorkshire (5,56%) Landrace (7,14%) Kiểu gen đồng hợp aa ghi nhận giống lợn lai YL, có lẽ q trình lai tạo kiểu gen đồng hợp aa 700 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Bảng Kết phân tích đa hình PCR-RFLP đoạn gen H-FABP, LIF, MyoG, RYR1 Gen Kiểu gen Tổng số (n) Tần số kiểu gen Kiểu allele Tổng số (2n) Tần số allele AA 24 0,727 A 56 0,848 Aa 0,242 a 10 0,152 aa 0,030 Dd 11 0,333 D 11 0,167 dd 22 0,667 d 55 0,833 AA 0,156 A 33 0,516 AB 23 0,719 B 31 0,484 BB 0,125 AA 0,091 A 20 0,303 AB 14 0,424 B 46 0,697 BB 16 0,485 NN 31 0,939 N 64 0,970 Nn 0,061 n 0,030 H-FABP LIF MYOG RYR1 Tần số allele d giống lợn châu Âu cao ấr t nhiều so với giống lợn Việt Nam Trung Quốc Allele D chiếm ưu gần tuyệt đối giống lợn địa phương Châu Á Ở tất giống lợn, allele A chiếm tỷ lệ cao nhiều so với allele a, trừ giống lợn Duroc Hà Lan có allele a ưu allele A Nhìn chung, giống lợn ngoại có đa hình kiểu gen H-FABP cao nhiều so với giống lợn Việt Nam Tru ng Quốc Sự xuất allele B chứng tỏ khả xảy đột biến gen H-FABP giống lợn nội cao nhiều so với giống lợn ngoại Bảng Tần số kiểu gen H-FABP theo Thúy cs (2005) Tần số kiểu gen H-FABP (%) Số lượng mẫu phân tích DD Dd dd Landrace n = 28 21,43 39,29 39,29 Yorkshire n = 18 44,44 44,44 11,11 Giống lợn Gen H-FABP cho có liên quan đến tích lũy mỡ mơ coi thị hàm lượng mỡ mô Gerben cs (1999) nhận thấy kiểu gen đồng hợp tử aa/dd (của RFLP-MspI, RFLP-HaeIII) lợn Duroc tương quan với hàm lượng mỡ cao giống lợn Sự tương quan cịn tìm thấy lai lợn Meishan với lợn Large White Dutch Landrace (Gerben et al., 2000), lai lợn Iberian Landrace (Ovilo et al., 2002) Điều đặt vấn đề cần quan tâm tạo dòng lai YL cần tránh loại bỏ lai mang kiểu gen đồng hợp aa/dd muốn khai thác thịt có tỷ lệ thịt nạc cao Phân tích đa hình gen LIF/ DraIII quan sát kiểu all ele có ầt n suất đồng (allele A: 51,6%, allele B: 48,4%) kiểu gen (AA: 15,6%, AB: 71,9%, BB: 12,5%) Spotter cs (2005) cho thấy tần số xuất kiểu gen AA, AB, BB phân tích đa hình 701 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TỒN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ DraIII - LIF lợn lai Duroc x Large White 7%, 40% 53% Cũng theo nghiên cứu cho thấy tỷ lệ lợn sinh sống sót cá thể mẹ có allele A cao so với mang allele B Lin cs (2009) lại lợn mẹ có kiểu gen AA BB có tỷ lệ lợn sinh cịn sống sót cao so với kiểu gen AB Phân tích đa hình gen MYOG/ MspI ghi nhận kiểu allele, allele A: 30,3% allele B: 69,7%, ki ểu gen: AA: 9,1%, AB: 42,4%, BB: 48,5% Đối chiếu với nghiên cứu Soumillion cs (1997) Te Pas cs (1999) cho thấy tần s ố kiểu gen AA bị suy giảm mạnh, tần số kiểu gen BB lại có xu hướng tăng lên nhiều dòng lợn lai YL Theo Te Pas cs (1999), đa hình đoạn gen MYOG có liên kết với tốc độ tăng trưởng tỷ lệ thịt nạc lợn, việc chọn lọc cá thể mang kiểu gen BB làm tăng trọng lượng sơ sinh, giảm tỷ lệ chết lợn khoảng 1%, tăng tốc độ tăng trưởng tỷ lệ nạc Như vậy, dịng lợn lai YL có ưu với tần suất kiểu gen BB cao Phân tích đa hình gen RYR1/ Hin6I ghi nhận kiểu allele (N: 97%, n: 3%) kiểu gen (NN: 93,9%, Nn: 6,1%) T ần suất lớn allele N quan sát giống lợn lai YL nghiên cứu phù hợp với tần suất cao allele N lợn Yorkshire Landrace nghiên cứu Thúy cs (2005) Đột biến gen RYR1 có làm tăng tỷ lệ thịt nạc lại gây bệnh tăng thân nhiệt ác tính lợn, gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới hiệu kinh tế chăn nuôi, làm ảm gi chất lượng thịt (thịt có màu tái, mềm, ứa dịch) (Jokubka Miceikience, 1995) Vì , cá thể có kiểu gen RYR1 đột biến (kiểu gen nn) cần phải loại bỏ Kết nghiên cứu đa hình RYR1/Hin6I cho thấy kiểu gen đột biến (nn) khơng xuất quần thể mẫu nghiên cứu, tần số allele lặn (n) thấp, nên dịng lợn lai YL có giá trị chọn giống IV KẾT LUẬN Các đoạn gen H-FABP, LIF, MYOG, RYR1 đ ã nhân đặc hiệu sử dụng cho phân tích đa hình RFLP với enzyme cắt giới hạn phù hợp Kết phân tích đa hình cho thấy dòng lợn lai hai máu Landrace x Yorkshire có s ự đa hình gen nghiên cứu với tần số khác theo hướng có lợi cho chăn nuôi Đặc biệt, kiểu gen BB (MYOG/MspI) có tần số xuất lớn, kiểu gen đồng hợp tử lặn nn (RYR1/Hin6I) khơng đư ợc tìm thấy quần thể nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K., 1995: Short protocols in Molecular Biology, 3rd, ed John Wilert and Sons, Inc Gerbens F, de Koning DJ, Harders FL, Meuwissen THE, Janss LLG et al., 2000: J Anim Sci 78: 552–559 Nguyễn Vân Anh, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Nguyễn Văn Cường, Nguyễn Kim Độ , 2005: Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 3(3): 311-317 Nguyễn Văn Cường, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Nguyễn Thu Thúy, Đậu Hùng Anh, Nguyễn Đăng Vang, 2003: Tạp chí Công nghệ Sinh học, 1(1): 39-46 Nguyen Ngoc Tuan, Tran Thi Dan, Le Thanh Hien, Ngo Tien Dung, Chau Thanh Truc, 2001: Halothane gene frequency and its association to growth rate, meat quality and reproduction of pig in HoChiMinh City Summary of Scientific conference of molecular biology and Biochemistry, 25-29/6/2001 Tp HCM Nguyễn Thu Thúy, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Nguyễn Kim Độ, Nguyễn Văn Cường, 2005: Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(3): 303-309 702 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Nguyễn Thu Thúy, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Nguyễn Kim Độ, Nguyễn Văn Cường, 2005: Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 3(4): 453-458 Ovilo C, A Clop, L Noguera, M A Oliver, C Barragan, C Rodriguez, L Silio, M A Toro, A Coll, J M Folch, A Sanchez, D Babot, L Varona, M PerezEnciso, 2002: J Anim Sci 80: 2801-2808 Soumillion A, Erkens JHF, Lenstra JA, Rettenberger G, Te Pas MFW., 1997: Mammalian Genome 8: 564-568 GENETIC RESOURCES OF SYNTHETIC PIGS BRED IN VIETNAM TA THI LOAN, NGUYEN THI DIEU THUY, NGUYEN GIANG SON, DO VO ANH KHOA SUMMARY Genetic resource analysis was carried out with the Yorkshire x Landrace pigs in Hoa An Bio-diversity Research and Experimental Center, Can Tho University Genetic variation of candidate genes associated with economic traits such as: H-FABP - Heart Fatty Acid Binding Protein gene, LIF - Leukocyte Inhibitory Factor gene, MYOG - Myogenin gene, RYR1 Ryanodine Receptor gene were analysed using PCR-RFLP method The results showed that the genetic variation was observed in all our candidate genes with identical genotype frequencies which are potential for breeding Considering that the BB genotype of MYOG/MspI appeared with high frequency whereas homology genotype of nn was not observed within RYR1/Hin6I The comparison of the variation in genetic resources of Vietnam indigenous pig revealed that the genetic diversity level of analysed synthetic pigs was lower, reflecting the influence of the applied breeding programme on Yorkshire x Landrace pig population 703 ... resources of Vietnam indigenous pig revealed that the genetic diversity level of analysed synthetic pigs was lower, reflecting the influence of the applied breeding programme on Yorkshire x Landrace... for breeding Considering that the BB genotype of MYOG/MspI appeared with high frequency whereas homology genotype of nn was not observed within RYR1/Hin6I The comparison of the variation in genetic... Halothane gene frequency and its association to growth rate, meat quality and reproduction of pig in HoChiMinh City Summary of Scientific conference of molecular biology and Biochemistry, 25-29/6/2001