BÁO CÁO TIỂU LUẬN TỔNG QUAN VÀ ĐỀ CƯƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐẶNG THỊ TÙNG LOAN BÁO CÁO TIỂU LUẬN TỔNG QUAN VÀ ĐỀ CƯƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Sinh lí học Người Động vật Mã số chuyên ngành: 62420104 Khóa học năm: 2013 Người hướng dẫn khoa học: GS TS Trương Đình Kiệt Tp HCM, năm 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐẶNG THỊ TÙNG LOAN BÁO CÁO TIỂU LUẬN TỔNG QUAN VÀ ĐỀ CƯƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ XÁC NHẬN CỦA CBHD VÀ TRƯỞNG TIỂU BAN (Phần ghi sau báo cáo chỉnh sửa nộp cho phòng ĐT SĐH) XÁC NHẬN CỦA CBHD: (CBHD ký tên ghi họ tên) XÁC NHẬN CỦA TRƯỞNG TIỂU BAN: (Trưởng Tiểu ban ký tên ghi họ tên) Phần 1: Tiểu luận tổng quan Đái tháo đường bệnh tổn thương hay suy giảm chức tế bào tụy đảo sản phẩm (insulin), biểu nồng độ đường máu cao Bệnh có lượng bệnh nhân gia tăng nhanh thời gian gần đây, Việt Nam giới Hơn nữa, đái tháo đường gây nhiều biến chứng nguy hiểm suy thận, xuất huyết võng mạc, đục thủy tinh thể, mù lòa, bệnh tim, bệnh thần kinh, bệnh động mạch vành, bệnh mạch ngoại vi, … (Harris et al., 2009) Theo Tổ chức Y tế giới (WHO) Liên đoàn đái tháo đường giới (IDF), Việt Nam nước có tỷ lệ gia tăng bệnh đái tháo đường nhanh giới (khoảng - 10%/năm); vậy, đái tháo đường đánh giá ngang với bệnh dịch Năm 2012, theo công bố Bệnh viện nội tiết Trung ương, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường 5,7% số bệnh nhân có khả tăng gấp đôi vào năm 2020 (Hội Nội tiết Đái tháo đường Việt Nam) Trên giới, nghiên cứu đái tháo đường thực từ năm cuối kỉ 19 nghiên cứu điều trị có từ năm đầu kỉ 20 Tuy nhiên, nay, nhà khoa học tiếp tục công nghiên cứu nhằm hướng đến phương pháp điều trị hiệu lâu dài Các phương pháp điều trị có hạn chế như: (1) tiêm insulin : phụ thuộc lâu dài, tốn kém, khó điều chỉnh lượng insulin ngoại sinh phù hợp với thể trạng, tình trạng kháng insulin sử dụng thời gian dài; (2) ghép tụy, ghép đảo tụy, ghép tế bào đảo tụy: nguồn mơ, tế bào hiến tặng khơng sẵn có khan hiếm, thải ghép; khả trì phát triển mơ ghép khơng cao Vì vậy, phương pháp điều trị đái tháo đường không phụ thuộc insulin nguồn mơ hiến tặng có ý nghĩa lớn, khoa học ứng dụng thực tiễn Hiện nay, liệu pháp tế bào gốc đóng vai trị chủ lực cho y học tái tạo phục hồi Liệu pháp sử dụng tế bào gốc tế bào tiền thân công cụ hiệu việc ngăn ngừa, điều trị bệnh hay sửa chữa, thay quan bị hư hại Kết nghiên cứu giới cho thấy triển vọng việc ứng dụng liệu pháp tế bào gốc điều trị thành công đái tháo đường từ cận lâm sàng lâm sàng (Voltarelli et al., 2007; Xiao et al., 2008; Dong et al., 2008; Zhu et al., 2009; Ito et al., 2010; Chandra et al., 2011; Iskovich et al., 2012; Karaoz et al., 2013); theo đó, liệu pháp tế bào gốc thể khả dụng đặc biệt bệnh đái tháo đường type Tuy nhiên, việc điều trị liệu pháp tồn nhiều vấn đề chưa làm rõ nên việc tiếp tục đầu tư nghiên cứu cải thiện hạn chế, phát huy thành tựu nghiên cứu trước cần thiết, hướng đến việc tối ưu hóa phương pháp điều trị, từ ứng dụng người Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, luận án tập trung vào nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh đái tháo đường type liệu pháp tế bào gốc, sử dụng tế bào gốc từ mô mỡ phương pháp ghép thay tế bào Tình hình nghiên cứu nước Các nước Đơng Nam Á, có Việt Nam, có tốc độ mắc hàng năm tăng cao (9.2%) với biến chứng nguy hiểm, bệnh đái tháo đường thu hút quan tâm cộng đồng xã hội giới y – khoa học Các y, bác sĩ nhà nghiên cứu Việt Nam có nỗ lực nhằm điều trị hiệu quả, an toàn Tuy nhiên, nay, nghiên cứu điều trị đái tháo đường nước ta chủ yếu nghiên cứu điều trị hỗ trợ điều trị đái tháo đường dược chất tự nhiên tổng hợp như: thực phẩm chức năng, tác dụng nụ vối (Trương Tuyết Mai et al., 2010, 2013), metformin (Nguyễn Thiện Hải, 2012), polyphenol từ trà xanh (Nguyễn Thị Hà et al., 2005), mướp đắng (Đoàn Thị Nhu et al., 2004), nấm dược liệu (Nguyễn Thị Chính et al., 2011) …(Cục Thơng tin Khoa học Công nghệ Quốc gia) Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc khảo sát đường huyết số tiêu sinh hóa máu chuyển hóa lipid, chống oxi hóa Ngồi ra, số nghiên cứu sản xuất insulin tái tổng hợp tiến hành Việt Nam nhằm hướng đến tự sản xuất cung cấp insulin cho người dân Việt Nam với giá thành phù hợp với điều kiện kinh tế phần đông người dân Tiêu biểu nghiên cứu tiến sĩ Lê Văn Phủng cộng (2010); hay nghiên cứu phó giáo sư Phạm Thành Hổ đồng nghiệp trường Đại học Khoa học Tự nhiên (2010) Tuy nhiên, phương pháp điều trị hay hỗ trợ điều trị mang tính chất điều trị triệu chứng (đường huyết cao) không mang lại hiệu tốt lâu dài ghép tạng Vì nguồn tạng nên hướng tiếp cận nhà nghiên cứu cập nhật điều trị đái tháo đường liệu pháp thay tế bào, đặc biệt tế bào gốc Ở Việt Nam, nay, nghiên cứu tế bào gốc có nhiều bước tiến quan trọng Cụ thể, năm gần đây, nghiên cứu tế bào gốc gặt hái nhiều thành tựu nhiều đơn vị Phịng thí nghiệm Nghiên cứu Ứng dụng Tế bào gốc, Đại học Y – Dược TP HCM, Đại học Y Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện 108, Bệnh viện Bạch Mai Một số nghiên cứu đánh giá theo kịp trình độ giới (Phuc et al., 2011, Ngoc et al., 2011; Toai et al., 2010…) Bên cạnh đó, từ năm 1997 đến nay, việc ứng dụng liệu pháp tế bào gốc mang lại kết khả quan điều trị số bệnh như: ghép tế bào gốc điều trị bệnh ung thư máu (Bệnh viện Truyền máu - Huyết học, 2004), ghép thành công tế bào gốc tự thân điều trị bệnh xương (Bệnh viện 108, 2010), ghép tế bào gốc điều trị bệnh động mạch vành (Viện Tim mạch, 2011), ghép tế bào gốc điều trị bệnh nhồi máu tim, hỗ trợ điều trị ung thư điều trị bệnh thị giác (Đại học Y Hà Nội, 2007) … Phịng thí nghiệm Nghiên cứu Ứng dụng Tế bào gốc thành lập vào năm 2007, đơn vị nghiên cứu chuyên môn tế bào gốc nước ta Từ thành lập đến nay, đơn vị đạt thành tựu như: tạo vật liệu sinh học điều trị tổn thương da, trị bỏng (Trần Lê Bảo Hà et al., 2009); ghép tế bào gốc chữa bệnh mắt (Phan Kim Ngoc et al., 2011); biệt hóa tế bào gốc trung mô máu cuống rốn thành tế bào tiết insulin (Phạm Văn Phúc et al, 2011); nâng cao hiệu điều trị đái tháo đường ghép tế bào tiết insulin cô lập miễn dịch (Phan Kim Ngọc et al., 2011), điều trị tổn thương sụn khớp ghép SVF (stromal vascular fraction) từ mô mỡ (Phạm Văn Phúc et al., 2013), … Các thành tựu tiền đề cho nghiên cứu điều trị đái tháo đường liệu pháp tế bào gốc Việt Nam Tình hình nghiên cứu giới Liệu pháp thay tế bào gốc điều trị đái tháo đường hướng đến việc tạo mới, bổ sung tế bào beta hay tế bào tiết insulin cho thể Ghép tế bào gốc khắc phục hạn chế phương pháp ghép mô/tế bào tiểu đảo trước như: (i) không phụ thuộc nguồn mô/tế bào hiến tặng, (ii) có số lượng lớn đủ để ghép hiệu quả, điều thật quan trọng trường hợp đái tháo đường type 1, mà lượng tế bào ghép phải nhiều phát triển tế bào beta phải nhanh phá hủy hệ thống miễn dịch (Moorefield, 2012) Nhiều loại tế bào gốc sử dụng để biệt hóa thành tế bào tiết insulin (Insulin producing cell_IPC) sử dụng cho liệu pháp thay tế bào Cấy ghép tế bào gốc/ IPCs để điều trị tiểu đường kiểm tra năm gần sử dụng mơ hình chuột người Nhiều loại tế bào gốc khác kiểm tra với nhiều phương pháp khác a Tế bào gốc trung mô Việc cấy ghép tế bào gốc từ tủy xương máu cuống rốn giúp cải thiện đáng cải tình trạng chuột đái tháo đường (Dong et al., 2008; Li et al., 2010; Jurewicz et al., 2010; Ho et al., 2012; Iskovich et al., 2012) Trong phần nhỏ (1-3%) tế bào ghép có khả tiết insulin, vấn đề quan trọng nhà khoa học quan tâm chuột cấy tế bào gốc khả kích thích tăng sinh tế bào β thể chủ Điều cho lí giúp phục hồi nhanh chóng số lượng tế bào β cải thiện tình trạng bệnh (Hess et al 2003) Các tế bào tiền thân từ mô mỡ nghiên cứu từ năm đầu 1990 (Kirkland, 1993) đầu 2000,

1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐẶNG THỊ TÙNG LOAN BÁO CÁO TIỂU LUẬN TỔNG QUAN VÀ ĐỀ CƯƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Sinh lí học Người Động vật Mã số chuyên ngành: 62420104 Khóa học năm: 2013 Người hướng dẫn khoa học: GS TS Trương Đình Kiệt Tp HCM, năm 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐẶNG THỊ TÙNG LOAN BÁO CÁO TIỂU LUẬN TỔNG QUAN VÀ ĐỀ CƯƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ XÁC NHẬN CỦA CBHD VÀ TRƯỞNG TIỂU BAN (Phần ghi sau báo cáo chỉnh sửa nộp cho phòng ĐT SĐH) XÁC NHẬN CỦA CBHD: (CBHD ký tên ghi họ tên) XÁC NHẬN CỦA TRƯỞNG TIỂU BAN: (Trưởng Tiểu ban ký tên ghi họ tên) Phần 1: Tiểu luận tổng quan Đái tháo đường bệnh tổn thương hay suy giảm chức tế bào tụy đảo sản phẩm (insulin), biểu nồng độ đường máu cao Bệnh có lượng bệnh nhân gia tăng nhanh thời gian gần đây, Việt Nam giới Hơn nữa, đái tháo đường gây nhiều biến chứng nguy hiểm suy thận, xuất huyết võng mạc, đục thủy tinh thể, mù lòa, bệnh tim, bệnh thần kinh, bệnh động mạch vành, bệnh mạch ngoại vi, … (Harris et al., 2009) Theo Tổ chức Y tế giới (WHO) Liên đoàn đái tháo đường giới (IDF), Việt Nam nước có tỷ lệ gia tăng bệnh đái tháo đường nhanh giới (khoảng - 10%/năm); vậy, đái tháo đường đánh giá ngang với bệnh dịch Năm 2012, theo công bố Bệnh viện nội tiết Trung ương, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường 5,7% số bệnh nhân có khả tăng gấp đôi vào năm 2020 (Hội Nội tiết Đái tháo đường Việt Nam) Trên giới, nghiên cứu đái tháo đường thực từ năm cuối kỉ 19 nghiên cứu điều trị có từ năm đầu kỉ 20 Tuy nhiên, nay, nhà khoa học tiếp tục công nghiên cứu nhằm hướng đến phương pháp điều trị hiệu lâu dài Các phương pháp điều trị có hạn chế như: (1) tiêm insulin : phụ thuộc lâu dài, tốn kém, khó điều chỉnh lượng insulin ngoại sinh phù hợp với thể trạng, tình trạng kháng insulin sử dụng thời gian dài; (2) ghép tụy, ghép đảo tụy, ghép tế bào đảo tụy: nguồn mơ, tế bào hiến tặng khơng sẵn có khan hiếm, thải ghép; khả trì phát triển mơ ghép khơng cao Vì vậy, phương pháp điều trị đái tháo đường không phụ thuộc insulin nguồn mơ hiến tặng có ý nghĩa lớn, khoa học ứng dụng thực tiễn Hiện nay, liệu pháp tế bào gốc đóng vai trị chủ lực cho y học tái tạo phục hồi Liệu pháp sử dụng tế bào gốc tế bào tiền thân công cụ hiệu việc ngăn ngừa, điều trị bệnh hay sửa chữa, thay quan bị hư hại Kết nghiên cứu giới cho thấy triển vọng việc ứng dụng liệu pháp tế bào gốc điều trị thành công đái tháo đường từ cận lâm sàng lâm sàng (Voltarelli et al., 2007; Xiao et al., 2008; Dong et al., 2008; Zhu et al., 2009; Ito et al., 2010; Chandra et al., 2011; Iskovich et al., 2012; Karaoz et al., 2013); theo đó, liệu pháp tế bào gốc thể khả dụng đặc biệt bệnh đái tháo đường type Tuy nhiên, việc điều trị liệu pháp tồn nhiều vấn đề chưa làm rõ nên việc tiếp tục đầu tư nghiên cứu cải thiện hạn chế, phát huy thành tựu nghiên cứu trước cần thiết, hướng đến việc tối ưu hóa phương pháp điều trị, từ ứng dụng người Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, luận án tập trung vào nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh đái tháo đường type liệu pháp tế bào gốc, sử dụng tế bào gốc từ mô mỡ phương pháp ghép thay tế bào Tình hình nghiên cứu nước Các nước Đơng Nam Á, có Việt Nam, có tốc độ mắc hàng năm tăng cao (9.2%) với biến chứng nguy hiểm, bệnh đái tháo đường thu hút quan tâm cộng đồng xã hội giới y – khoa học Các y, bác sĩ nhà nghiên cứu Việt Nam có nỗ lực nhằm điều trị hiệu quả, an toàn Tuy nhiên, nay, nghiên cứu điều trị đái tháo đường nước ta chủ yếu nghiên cứu điều trị hỗ trợ điều trị đái tháo đường dược chất tự nhiên tổng hợp như: thực phẩm chức năng, tác dụng nụ vối (Trương Tuyết Mai et al., 2010, 2013), metformin (Nguyễn Thiện Hải, 2012), polyphenol từ trà xanh (Nguyễn Thị Hà et al., 2005), mướp đắng (Đoàn Thị Nhu et al., 2004), nấm dược liệu (Nguyễn Thị Chính et al., 2011) …(Cục Thơng tin Khoa học Công nghệ Quốc gia) Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc khảo sát đường huyết số tiêu sinh hóa máu chuyển hóa lipid, chống oxi hóa Ngồi ra, số nghiên cứu sản xuất insulin tái tổng hợp tiến hành Việt Nam nhằm hướng đến tự sản xuất cung cấp insulin cho người dân Việt Nam với giá thành phù hợp với điều kiện kinh tế phần đông người dân Tiêu biểu nghiên cứu tiến sĩ Lê Văn Phủng cộng (2010); hay nghiên cứu phó giáo sư Phạm Thành Hổ đồng nghiệp trường Đại học Khoa học Tự nhiên (2010) Tuy nhiên, phương pháp điều trị hay hỗ trợ điều trị mang tính chất điều trị triệu chứng (đường huyết cao) không mang lại hiệu tốt lâu dài ghép tạng Vì nguồn tạng nên hướng tiếp cận nhà nghiên cứu cập nhật điều trị đái tháo đường liệu pháp thay tế bào, đặc biệt tế bào gốc Ở Việt Nam, nay, nghiên cứu tế bào gốc có nhiều bước tiến quan trọng Cụ thể, năm gần đây, nghiên cứu tế bào gốc gặt hái nhiều thành tựu nhiều đơn vị Phịng thí nghiệm Nghiên cứu Ứng dụng Tế bào gốc, Đại học Y – Dược TP HCM, Đại học Y Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện 108, Bệnh viện Bạch Mai Một số nghiên cứu đánh giá theo kịp trình độ giới (Phuc et al., 2011, Ngoc et al., 2011; Toai et al., 2010…) Bên cạnh đó, từ năm 1997 đến nay, việc ứng dụng liệu pháp tế bào gốc mang lại kết khả quan điều trị số bệnh như: ghép tế bào gốc điều trị bệnh ung thư máu (Bệnh viện Truyền máu - Huyết học, 2004), ghép thành công tế bào gốc tự thân điều trị bệnh xương (Bệnh viện 108, 2010), ghép tế bào gốc điều trị bệnh động mạch vành (Viện Tim mạch, 2011), ghép tế bào gốc điều trị bệnh nhồi máu tim, hỗ trợ điều trị ung thư điều trị bệnh thị giác (Đại học Y Hà Nội, 2007) … Phịng thí nghiệm Nghiên cứu Ứng dụng Tế bào gốc thành lập vào năm 2007, đơn vị nghiên cứu chuyên môn tế bào gốc nước ta Từ thành lập đến nay, đơn vị đạt thành tựu như: tạo vật liệu sinh học điều trị tổn thương da, trị bỏng (Trần Lê Bảo Hà et al., 2009); ghép tế bào gốc chữa bệnh mắt (Phan Kim Ngoc et al., 2011); biệt hóa tế bào gốc trung mô máu cuống rốn thành tế bào tiết insulin (Phạm Văn Phúc et al, 2011); nâng cao hiệu điều trị đái tháo đường ghép tế bào tiết insulin cô lập miễn dịch (Phan Kim Ngọc et al., 2011), điều trị tổn thương sụn khớp ghép SVF (stromal vascular fraction) từ mô mỡ (Phạm Văn Phúc et al., 2013), … Các thành tựu tiền đề cho nghiên cứu điều trị đái tháo đường liệu pháp tế bào gốc Việt Nam Tình hình nghiên cứu giới Liệu pháp thay tế bào gốc điều trị đái tháo đường hướng đến việc tạo mới, bổ sung tế bào beta hay tế bào tiết insulin cho thể Ghép tế bào gốc khắc phục hạn chế phương pháp ghép mô/tế bào tiểu đảo trước như: (i) không phụ thuộc nguồn mô/tế bào hiến tặng, (ii) có số lượng lớn đủ để ghép hiệu quả, điều thật quan trọng trường hợp đái tháo đường type 1, mà lượng tế bào ghép phải nhiều phát triển tế bào beta phải nhanh phá hủy hệ thống miễn dịch (Moorefield, 2012) Nhiều loại tế bào gốc sử dụng để biệt hóa thành tế bào tiết insulin (Insulin producing cell_IPC) sử dụng cho liệu pháp thay tế bào Cấy ghép tế bào gốc/ IPCs để điều trị tiểu đường kiểm tra năm gần sử dụng mơ hình chuột người Nhiều loại tế bào gốc khác kiểm tra với nhiều phương pháp khác a Tế bào gốc trung mô Việc cấy ghép tế bào gốc từ tủy xương máu cuống rốn giúp cải thiện đáng cải tình trạng chuột đái tháo đường (Dong et al., 2008; Li et al., 2010; Jurewicz et al., 2010; Ho et al., 2012; Iskovich et al., 2012) Trong phần nhỏ (1-3%) tế bào ghép có khả tiết insulin, vấn đề quan trọng nhà khoa học quan tâm chuột cấy tế bào gốc khả kích thích tăng sinh tế bào β thể chủ Điều cho lí giúp phục hồi nhanh chóng số lượng tế bào β cải thiện tình trạng bệnh (Hess et al 2003) Các tế bào tiền thân từ mô mỡ nghiên cứu từ năm đầu 1990 (Kirkland, 1993) đầu 2000, tế bào gốc từ mô mỡ phân lập định danh (Gimble, 2003) Gần 10 năm sau đó, nguồn tế bào gốc sử dụng nhiều phổ biến chúng có khả điều biến miễn dịch (immunomodulatory) cao tế bào gốc tủy xương (Melief et al., 2013) Việc điều trị đái tháo đường tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thực nhiều nghiên cứu cho kết khả quan nhu cầu insulin giảm, đường huyết giảm ổn định nhiều tháng (Trivedi et al., 2008; Cramer et al., 2010; Yang et al., 2010; Bassi, 2012; Li et al 2012; Dave et al., 2013) Nghiên cứu gần tế bào gốc mơ mỡ có khả cận tiết để bảo vệ chống lại tăng đường huyết Streptozotocin (Kono et al., 2014) b Tế bào gốc phôi (Embryonic Stem cell_ESC) Tế bào gốc phôi tế bào gốc tồn Chúng biệt hóa thành tất tế bào có chức từ lớp mầm, lớp tạo nên tế bào beta tế bào tiết insulin Nhiều nghiên cứu biệt hóa ESC thành IPC cách mơ đường tín hiệu phát triển tụy giai đoạn phôi (D’Amour et al., 2006, Jiang et al., 2007) Quá trình biệt hóa nhiều giai đoạn có bổ sung yếu tố tăng trưởng phân tử nhỏ tái lại giai đoạn biệt hóa tế bào beta hình thành nội mơ, biệt hóa thành tụy phát triển chức nội tiết, cuối trưởng thành tế bào beta Mặc dù chế biến dưỡng glucose kiểm sốt, hiệu biệt hóa thành cơng ESC thành tế bào β thấp (khoảng 10%) khả hình thành khối ESC cao Bên cạnh đó, việc sử dụng ESC gặp nhiều khó khăn tính nhạy cảm xã hội có liên quan đến y đức đạo lí sinh học; nhà nghiên cứu quan ngại đưa ESC vào ứng dụng lâm sàng c Tế bào gốc đa tiềm cảm ứng (Induced pluripotent stem cell_IPSC) Bước tiến quan trọng lĩnh vực tế bào gốc phát triển dòng tế bào đa tiềm tạo từ nguyên bào sợi da IPSC có đặc điểm giống ESC vậy, IPSCs biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào khác tế bào thần kinh (Dimos et al., 2008; Chambers et al., 2008), tế bào tim (Zhang et al., 2009) tế bào tiết insulin (Tateishi et al., 2008; Zhang et al., 2009) Đồng thời, tương tự ESC, IPSC có khả sinh ung thư Vì vậy, việc ứng dụng IPSC cịn phải nghiên cứu kĩ d Cấy ghép IPC biệt hóa từ tế bào gốc trung mơ từ tủy xương mô mỡ Tế bào gốc trung mô biệt hố thành cơng in vitro thành tế bào tiết insulin làm giảm đường huyết động vật người sau cấy ghép (Chandra et al., 2011) Tương tự việc cấy ghép tế bào gốc, IPC nghiên cứu với nhiều phương pháp ghép vào mơ hình chuột ví dụ: tĩnh mạch cửa, màng bụng, gan, tĩnh mạch đuôi vỏ thận Các IPC biệt hóa từ MSC thu nhận từ tủy xương dị ghép loài vào tĩnh mạch cửa chuột cống để điều trị cho chuột rat bị đái tháo đường Sau ghép, IPC di cư vào gan, biểu hormone tiểu đảo hàm lượng glucose thấp chuột rat bị đái tháo đường vào ngày thứ đến ngày thứ 20 (Wu et al., 2007) Gần đây, tế bào gốc trung mô tủy xương thu nhận từ bệnh nhân đái tháo đường type biệt hóa thành IPCs, sau IPCs ghép vào vỏ thận chuột nude mắc đái tháo đường Kết bệnh kiểm soát tháng kiểm tra huyết chuột phát có insulin C-peptide người lượng nhỏ insulin chuột (Gabr et al., 2012) Nghiên cứu Tsai cộng (2013) cho kết tương tự IPCs biệt hóa từ MSCs thu nhận từ mơ mỡ Các tế bào sau biệt hóa biểu đặc điểm lớp nội mô (Hnf3β, TCF2 Sox17) đặc điểm tế bào tụy (PDX1, Ngn3, NeuroD, Pax4) tiết insulin Các tế bào sau biệt hóa ghép vào chuột đái tháo đường cho kết đường huyết giữ mức gần bình thường 3-4 tuần Đồng thời, máu chuột phát có insulin có nguồn gốc từ tế bào người ghép vào (Chandra et al., 2011) Nghiên cứu Zhang cộng (2011) cho việc ghép tế bào IPC có nguồn gốc từ MSC mơ mỡ kết hợp với việc blocking đường truyền tín Fas TNF giúp trì tồn tế bào ghép thời gian dài Hiệu điều trị đái tháo đường ghi nhận tốt đồng ghép tế bào gốc trung mô với tiểu đảo hay cụm tế bào giống tiểu đảo biệt hóa từ tế bào gốc trung mơ (Figliuzzi et al., 2009; Ito et al., 2010; Rackham et al., 2011; Okcu et al., 2013) Phần 2: Đề cương luận án Tên đề tài luận án “Nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh đái tháo đường type liệu pháp tế bào gốc” Mục đích nghiên cứu  Tối ưu hóa xây dựng mơ hình chuột đái tháo đường type ;  Xây dựng thành công quy trình phân lập, biệt hóa tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thành tế bào tiết insulin ;  Đánh giá tính an tồn khả di cư tế bào ghép ;  Xây dựng thành cơng quy trình điều trị bệnh đái tháo đường type liệu pháp tế bào gốc từ mô mỡ mơ hình động vật thực nghiệm ; Đối tượng phương pháp nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu Chuột sử dụng để xây dựng mô hình bệnh đái tháo đường type thí nghiệm liên quan Chuột cung cấp đạt tiêu chuẩn Viện Pasteur Tp HCM dành cho động vật thí nghiệm Các thao tác động vật thí nghiệm phù hợp với quy định, hướng dẫn Phịng thí nghiệm Nghiên cứu Ứng dụng Tế bào gốc 3.2 Phương pháp 3.2.1 Cách tiếp cận  Kiến thức: thơng qua việc đọc, tìm hiểu, tổng hợp tài liệu có liên quan ngồi nước; thơng qua việc học tập khóa học, hội nghị; thông qua việc học tập, tiếp xúc với chuyên gia, nhà khoa học đầu ngành,…  Kĩ thuật: thông qua q trình nghiên cứu, tìm hiểu; thơng qua khóa huấn luyện (training) kĩ thuật, … 10 3.2.2 Giản đồ thí nghiệm MƠ MỠ Tế bào gốc trung mơ Tế bào tiết insulin ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TỒN VÀ SỰ DI CƯ Mơ hình chuột đái tháo đường TYPE NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ 3.2.3 Phương pháp thu nhận, nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột 3.2.3.1 Phương pháp thu nhận, nuôi cấy tế bào gốc ứng viên từ mô mỡ chuột  Chuột sau gây mê ketamin (5 mg/0,1 ml/con), việc thu nhận mỡ tiến hành cách giải phẫu Vị trí thu nhận mỡ cách lỗ sinh dục cm hướng phía bụng; mỡ lấy từ vết cắt mở ngang khoảng cm Sau đó, vết mổ khâu xử lí lại cẩn thận mô mỡ thu nhận bảo quản PBS lạnh có bổ sung kháng sinh 5X  Mỡ chuột (dạng khối) rửa nhiều lần PBS-kháng sinh vortex kĩ để loại bỏ hồng cầu làm cho mơ mỡ trở nên lỏng lẻo Sau đó, mỡ xử lí với với hỗn hợp super extract li tâm hai giai đoạn: li tâm tốc độ 500g phút, lấy dịch nổi, sau li tâm dịch 1000 g 10 phút thu cặn Cặn tế bào huyền phù môi trường DMEM/F12 10% FBS tế bào nuôi điều kiện 370C, 5% CO2 Môi 11 trường thay ngày đến tế bào phát triển 70% bề mặt flask việc cấy chuyền dùng trypsin 0,25% 3.2.3.2 Định danh tế bào gốc ứng viên phân lập từ mô mỡ chuột Tế bào gốc ứng viên phân lập từ mô mỡ định danh tế bào gốc trung mô phải đạt tiêu chuẩn ISCT (International Society for Cellular Therapy) (Dominici et al., 2006) sau: i) Hình thái giống ngun bào sợi; ii) Có khả tự làm mới; iii) Có khả biệt hóa thành tế bào xương, tế bào mỡ; iv) Biểu số marker đặc trưng tế bào gốc trung mô như: CD13, CD44, CD90, CD133, CD105 không biểu marker tế bào gốc tạo máu CD14, CD34, CD45 Việc phân tích tiến hành kĩ thuật flow cytometry 3.2.4 Biệt hóa tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thành tế bào tiết insulin in vitro hóa chất Tế bào gốc trung mơ biệt hóa thành tế bào tiết insulin (Insulin producing cell_IPC) phương pháp sử dụng tác nhân cảm ứng, định hướng biệt hóa Q trình biệt hóa tế bào gốc trung mơ thành tế bào IPC chia thành bước: - Bước 1: cảm ứng chuyển biệt hóa sang dạng tế bào thuộc lớp ngoại phơi bì tác nhân N2 mơi trường DMEM/F12; - Bước 2: cảm ứng chuyển biệt hóa thành dạng tế bào nội phơi bì dạng tế bào tiểu đảo N2, B27, b-FGF nicotinamide; - Bước 3: biệt hóa thành tế bào tiết insulin tác nhân: N2, B27, b-FGF, nicotinamide, sodium pyruvate * Đánh giá tế bào sau biệt hóa: tế bào sau biệt hóa phân tích thành cơng q trình biệt hóa theo tiêu sau: i) Sự hình thành tiểu đảo: tế bào môi trường biệt hóa kết cụm lại, hình thành cụm tế bào giống tiểu đảo (islet-like cluster) Sau nhuộm với Dithizone, cụm tế bào có sản xuất Zn tiểu đảo bắt màu với thuốc nhuộm 12 ii) Phân tích biểu gene mức phiên mã gene tế bào beta tiểu đảo tụy: tế bào sau biệt hóa phân tích biểu gen Pdx-1, Ngn3, Nkx6, Pax4, Insulin mức phiên mã kĩ thuật Realtime Reverse Transcriptase PCR (Realtime RT-PCR) iii) Tế bào sau biệt hóa kiểm tra khả tiết insulin c-peptide bằng: thứ nhất, kĩ thuật Elisa để kiểm tra diện insulin, c-peptide môi trường nuôi cấy; nhuộm hóa miễn dịch tế bào (Immunocytochemstry) để kiểm tra tồn insulin, c-peptide tế bào 3.2.5 Phương pháp xây dựng chuẩn hóa quy trình tạo mơ hình chuột đái tháo đường type a Xây dựng mơ hình chuột đái tháo đường type Streptozotocin - Chuột giới tính, độ tuổi, thể trọng tương đương (20-25 gram) nuôi ổn định tuần, kiểm tra đường huyết trước sử lí STZ; - Cho chuột nhịn đói tiếng trước xử lí với STZ; - Tiêm xoang bụng chuột dung dịch STZ với liều khảo sát: 100, 120 140, 160, 180, 200 mg/kg (n=10/lô); - Cho chuột uống nước chứa 10% sucrose qua đêm để tránh sốc cao đường huyết sau tiêm; - Kiểm tra tình trạng sinh lí chuột hàng ngày, vệ sinh chuồng lần/tuần, chế độ ánh sáng 12 giờ/ngày, nuôi nhốt 3-4 con/chuồng b Đánh giá hiệu quy trình i) Trọng lượng Cân nặng chuột ghi nhận hàng tuần suốt tuần khảo sát ii) Đường huyết  Kiểm tra đường huyết chuột ngày/lần suốt tuần sau xử lí với STZ  Đo đường huyết máy đo đường huyết One Touch Ultra hãng Lifescan – Johnson & Johnson (USA)  Tiêu chuẩn đạt đái tháo đường: chuột có nồng độ đường huyết tăng cao 200 mg/dl trì đến tuần thứ sau xử lí STZ, 13 80% tế bào beta tụy bị hủy hoại, insulin huyết thấp chuột bình thường tối thiểu lần iii) Test dung nạp glucose (Ayala et al., 2010)  Chuột bị bỏ đói khoảng trước tiến hành test;  Đo đường huyết chuột trước tiến hành test;  Tiêm vô trùng dung dịch D-glucose 20% với lượng gram/kg thể trọng vào khoang bụng chuột;  Đo đường huyết chuột vào thời điểm 15, 30, 60, 120 phút  Đường huyết bình thường vào khoảng 7.8 mmol/L (140 mg/dL) thời điểm 120 phút; khoảng từ 140 – 200 mg/dL cho rối loạn dung nạp đường; 200 mg/dL cho đái tháo đường (theo WHO) iv) Phương pháp kiểm tra mức độ chịu đựng insulin  Chuột nhịn đói  Pha insulin liều 0,75 mg/kg PBS  Kiểm tra nồng độ glucose máu vào thời điểm 30 phút trước tiêm  Tiêm dung dịch insulin chuẩn bị  Kiểm tra nồng độ glucose máu vào thời điểm 30, 60, 120 phút sau tiêm v) Định lượng insulin, HbA1C máu HbA1C hay A1C phức hợp Hemoglobin glucose máu Test nồng độ HbA1C có ý nghĩa quan trọng đường huyết tính ổn định thời gian tương đối dài (8 -12 tuần, thời gian tồn trung bình hồng cầu máu) Nồng độ insulin, HbA1C máu phân tích kĩ thuật Elisa vi) Đánh giá cấu trúc mơ tụy nhuộm hóa mơ Hematoxyline Eosin  Giết chuột, thu nhận mẫu mô tụy chuyển vào dung dịch 4% paraformaldehyde qua đêm  Đúc mẫu paraffin, sau cắt thành tiêu có độ dày 4m nhuộm với Hematoxylin Eosin 14 3.2.6 Đánh giá tính an tồn tế bào/ cụm tế bào sử dụng để ghép vào chuột 3.2.6.1 Đánh giá toàn vẹn nhiễm sắc thể Sự toàn vẹn số lượng nhiễm sắc thể tế bào kiểm tra kĩ thuật Nhiễm sắc thể đồ (Karyotype) 3.2.6.2 Khả gây ung thư a Kiểm tra mức biểu gen sinh u (oncogenes) gen ức chế khối u (tumor suppressor genes) mức phiên mã Các gen sinh u kiểm tra: Oct4, nanog, sox2, SSEA Các gen ức chế khối u kiểm tra: p15, p16, p53 Sự biểu gen mức phiên mã kiểm tra thông qua kĩ thuật RT-PCR với cặp mồi đặc trưng cho gen b Đánh giá tính sinh u in vivo – Khả tạo u mơ hình chuột Để đánh giá nguy tạo u tế bào ghép, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ tế bào IPC ghép vào da chuột với mật độ 2-5x106 tế bào gốc từ mô mỡ 500 – 1000 cụm tế bào IPC Sau đó, chuột theo dõi hình thành khối u khoảng thời gian 10 – 12 tuần Sau thời gian trên, vùng da ghép tế bào cắt kiểm tra hình thái mơ học kĩ thuật nhuộm hóa mơ H&E 3.2.6.3 Khả gây chết Tế bào mục tiêu ghép vào chuột tình trạng sinh lí chuột sau ghép theo dõi tuần 3.2.7 Kiểm tra di cư tế bào ghép Tế bào gốc trung mô biểu protein phát huỳnh quang (Green florescent protein_GFP) mạnh ổn định (thương mại) sử dụng cho thí nghiệm Trước ghép, mật độ tế bào sống xác định điều chỉnh liều ghép 5x106 tế bào/ 0,1 ml PBS Chuột gây mê ketamine (5 mg/0,1 ml/con) tiêm vào da Sau đó, tiến hành ghép tế bào vào chuột vị trí tĩnh mạch Sau 7, 14, 28 ngày, vị trí tế bào phát huỳnh quang phát thơng qua scan hình ảnh chuột hệ thống UVP Imaging 15 3.2.8 Phương pháp điều trị đái tháo đường type liệu pháp tế bào gốc mơ hình chuột Trong nghiên cứu này, việc điều trị đái tháo đường type liệu pháp tế bào gốc dựa vào chiến lược thay tế bào cách ghép tế bào gốc trung mô tế bào IPC phối hợp hai loại Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ Tiêm tĩnh mạch 107 tế bào/con Tế bào tiết insulin Kết hợp đuôi Tiêm vỏ thận 1000 cụm tế bào/ 106 tế bào MSC + 500 cụm tế bào /con Chuột sau ghép nuôi nhốt điều kiện theo dõi 12 tuần Hiệu điều trị đánh giá thơng qua tiêu: - Tình trạng sinh lí chuột: ổn định cải thiện; - Đường huyết, nồng độ HbA1C máu giảm gần mức bình thường; - Khả dung nạp glucose chịu đựng insulin mức gần mức bình thường; - Cấu trúc mơ tụy Nội dung phạm vi vấn đề sâu nghiên cứu Nội dung 1: Thiết lập quy trình tạo mơ hình chuột đái tháo đường type hóa chất; Nội dung : Thiết lập quy trình phân lập tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột; Nội dung 3: Thiết lập quy trình biệt hóa tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thành tế bào tiết insulin in vitro; Nội dung : Đánh giá tính an tồn tế bào gốc trung mơ từ mơ mỡ tế bào tiết insulin; Nội dung : Đánh giá di cư tế bào ghép chuột Nội dung : Nghiên cứu điều trị bệnh đái tháo đường type liệu pháp thay tế bào 16 Dự kiến kết đạt (kết nghiên cứu, báo khoa học) 5.1 Kết nghiên cứu  Xây dựng mơ hình chuột đái tháo đường type tối ưu hóa : quy trình tối ưu đạt 80% chuột có đái tháo đường (theo tiêu theo dõi) trì đến tuần  Biệt hóa thành cơng tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thành tế bào tiết insulin in vitro  Đánh giá tính an tồn tế bào gốc từ mơ mỡ tế bào tiết insulin  Tế bào ghép không biểu biểu thấp gen ung thư biểu cao gen đặc trưng (gen đặc trưng cho tế bào beta tế bào tiết insulin) ;  Tế bào ghép có khả di cư, tồn thể chuột tuần sau ghép  Xây dựng thành cơng quy trình điều trị bệnh đái tháo đường type liệu pháp tế bào gốc từ mơ mỡ mơ hình động vật thực nghiệm: Hiệu điều trị đạt 50-70% chuột có biểu giảm hay ổn định đường huyết; kéo dài tuổi thọ chuột khoảng 50-70% số chuột nghiên cứu tháng so với không điều trị 5.2 Bài báo khoa học – báo quốc tế – báo nước – tham gia Hội nghị Nơi thực đề tài Đề tài thực Phịng thí nghiệm Nghiên cứu Ứng dụng Tế bào gốc, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh 17 Phân bố thời gian thực đề tài Năm thứ Năm thứ hai TT Tên công việc Viết đề cương bảo vệ đề cương nghiên cứu X Nội dung X Nội dung Nội dung Nội dung X X Nội dung Nội dung Viết báo Tổng hợp, viết báo cáo Bảo vệ luận án Q Q Q Q X X X X X X X X X X Q Q Q X X Q Q X X X X X X X X X X X X X Năm thứ ba Q Q Q X X X X X X X X 18 Tiến độ thực Kết STT Nội dung Kết đạt Khó khăn gặp phải Nội dung 1: Thiết - Nồng độ STZ Chưa thực lập quy trình tạo mơ 140 Hướng khắc phục 160 kiểm tra – hình chuột đái tháo mg/kg cho hiệu dung nạp đường, dung nạp insulin, đường type tốt hóa chất - Ở liều STZ nhuộm hóa mơ này, 100% (10/10) HE, nồng chuột insulin, độ HbA1C nhắt trắng bị cao huyết tương đường huyết (>250 mg/dL) Nội dung 2: Thiết Tóm tắt quy trình lập quy trình phân - Trữ mơ mỡ PBS+ (có kháng sinh); lập tế bào gốc trung - Rửa mô mỡ nhiều lần với dung dịch Washing buffer mô từ mô mỡ (WB) (thương mại); - Bổ sung vào mô mỡ dung dịch WB2; - Xử lí mơ mỡ với hỗn hợp enzyme thương mại Super Extract quan sát thấy đốm/sợi màu trắng đục (collagen); - Thu cặn tế bào, loại mỡ cách li tâm 3000 vòng/phút phút; - Rửa cặn tế bào li tâm (3000 vòng/phút phút) dung dịch WB3; - Huyền phù tế bào vào dung dịch nuôi MSC Cult Kit (thương mại) - Điều kiện nuôi cấy 37oC, 5% CO2 Nội dung 3: Biệt - Quy trình biệt - Chưa đánh giá hóa tế bào gốc mơ hóa mỡ thành tế bào tiết bước; insulin gồm tiết insulin hay diện - Có hình insulin/proinsulin 19 thành khối nội bào; cầu tế bào giống - Chưa đánh giá tiểu đảo (islet- khả dung like nạp đường sphere_ILS); tế bào - Các ILS bắt màu cam đỏ với thuốc nhuộm Dithizone Tài liệu tham khảo [1] Ayala JE, Samuel VT, Morton GJ, Obici S, Croniger CM, Shulman GI, Wasserman DH, McGuinness OP (2010) Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice Dis Model Mech 3(9-10): 525–534 [2] Chandra V et al (2011) "Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice." PLoS One 6(6): e20615 [3] Cramer, C., et al (2010) "Persistent high glucose concentrations alter the regenerative potential of mesenchymal stem cells." Stem Cells Dev 19(12): 1875-1884 [4] D'Amour KA, Bang AG, Eliazer S, Kelly OG, Agulnick AD, Smart NG, Moorman MA, Kroon E, Carpenter MK, Baetge EE (2006) Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells Nat Biotechnol 24:1392–1401 [5] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, Deans R, Keating A, Prockop Dj, Horwitz E (2006) Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells The International Society for Cellular Therapy position statement Cytotherapy 8(4):315-7 20 [6] Dimos JT, Rodolfa KT, Niakan KK (2008) Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons, Science 321: 1218—1221 [7] Dong QY, Chen L, Gao GQ, Wang L, Song J, Chen B, Xu YX, Sun L (2008) Allogeneic diabetic mesenchymal stem cells transplantation in streptozotocin-induced diabetic rat Clin Invest Med 31(6):E328-37 [8] Figliuzzi M, Cornolti R, Perico N, Rota C, Morigi M, Remuzzi G, Remuzzi A, Benigni A (2009) Bone marrow-derived mesenchymal stem cells improve islet graft function in diabetic rats Transplant Proc 41(5): 1797-800 [9] Gabr MM, Zakaria MM, Refaie AF, Ismail AM, Abou-El-Mahasen MA, Ashamallah SA, Khater SM, El-Halawani SM, Ibrahim RY, Uin GS, Kloc M, Calne RY, Ghoneim MA (2012) Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stem cells control streptozotocin-induced diabetes in nude mice Cell Transplant 22(1): 133-45 [10] Harris DT, Badowski M, Harman SM (2009) Treatment of Type I Diabetes in the NOD Mouse with Syngeneic Cord Blood Stem Cells The Open Stem Cell Journal 1:62-68 [11] Hess D, Li L, Martin M, Sakano S, Hill D, Strutt B, Thyssen S, Gray DA, Bhatia M (2003) Bone marrow–derived stem cells initiate pancreatic regeneration Nature Biotechnology 21: 763 – 770 [12] Ho JH et al (2012) Multiple intravenous transplantations of mesenchymal stem cells effectively restore long-term blood glucose homeostasis by hepatic engraftment and beta-cell differentiation in streptozocin-induced diabetic mice Cell Transplant 21(5): 997-1009 [13] Iskovich S et al (2012) Elutriated stem cells derived from the adult bone marrow differentiate into insulin-producing cells in vivo and reverse chemical diabetes Stem Cells Dev 21(1): 86-96 [14] Ito T, Itakura S, Todorov I, Rawson J, Asari S, Shintaku J, Nair I, Ferreri K, Kandeel F, Mullen Y (2010) Mesenchymal stem cell and islet cotransplantation promotes graft revascularization and function Transplantation 89(12): 1438-45 21 [15] Jiang J, Au M, Lu K, Eshpeter A, Korbutt G, Fisk G, Majumdar AS (2007) Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells Stem Cells 25: 1940–1953 [16] Jurewicz, M.; Yang, S.; Augello, A.; Godwin, J.G.; Moore, R.F.; Azzi, J.; Fiorina, P.; Atkinson, M.; Sayegh, M.H & Abdi, R (2010) Congenic mesenchymal stem cell therapy reverses hyperglycemia in experimental type diabetes Diabetes 59(12): 3139-47 [17] Karaoz, E., et al (2013) Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells efficiently differentiate into insulin-producing cells in pancreatic islet microenvironment both in vitro and in vivo Cytotherapy 15(5): 557-570 [18] Li M, Abraham NG, Vanella L, Zhang Y, Inaba M, Hosaka N, Hoshino S, Shi M, Ambrosini YM, Gershwin ME, Ikehara S (2010) Successful modulation of type diabetes in db/db mice with intra-bone marrow bone marrow transplantation plus concurrent thymic transplantation J Autoimmun 35(4): 41423 [19] Moorefield EC (2012) Doctor thesis: Stem cell based regenerative pharmacology for the treatment of diabetes mellitus Wake forest University graduate school of art and sciences [20] Ngoc PK, Phuc PV, Nhung TH, Thuy DT, Nguyet NT (2011) Improving the efficacy of type diabetes therapy by transplantation of immunoisolated insulin-producing cells Hum Cell 24(2): 86-95 [21] Phuc PV, Nhung TH, Loan DT, Chung DC, Ngoc PK (2010) Differentiating of cryopreserved human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells into insulin secreting cells In vitro cellular and developmental biology – animal 47(1): 54-63 [22] Phuc PV, Ngoc VB, Lam DH, Tam NT, Viet PQ, Ngoc PK (2011) Isolation of three important types of stem cells from the same samples of banked umbilical cord blood Cell Tissue Bank 13(2): 341-51 [23] Rackham CL, Chagastelles PC, Nardi NB, Hauge-Evans AC, Jones PM, et al (2011) Co-transplantation of mesenchymal stem cells maintains islet organisation and morphology in mice Diabetologia 54, pp 1127–1135 22 [24] Tateishi, K He, J, Taranova, O, Liang, G., D'Alessio, AC, Zhang, Y (2008) Generation of insulin-secreting islet-like clusters from human skin fibroblasts J Biol Chem 14;283(46), pp 31601-7 [25] Toai TC, Thao HD, Thao NP, Gargiulo C, Ngoc PK, Van PH, Strong DM (2010) In vitro culture and differentiation of osteoblasts from human umbilical cord blood Cell Tissue Bank 11(3): 269-80 [26] Tran CT, Gargiulo C, Thao HD, Tuan HM, Filgueira L, Michael Strong D(2011) Culture and differentiation of osteoblasts on coral scaffold from human bone marrow mesenchymal stem cells Cell Tissue Bank 12(4): 247-61 [27] Tsai, P J,Wang, H S., Lin, C H., Weng, Z C., Chen, T H., Shyu, J F (2013) Intraportal injection of insulin-producing cells generated from human bone marrow mesenchymal stem cells decreases blood glucose level in diabetic rats Endocr Res [28] Voltarelli, JC, Couri, CE, Stracieri, AB, Oliveira, MC, Moraes, DA, Pieroni, F, Coutinho, M, Malmegrim, KC, Foss-Freitas, MC, Simões, BP,Foss, MC, Squiers, E, Burt, RK (2007) Autologous nonmyeloablative hematopoietic stem cell transplantation in newly diagnosed type diabetes mellitus JAMA 11;297(14):1568-76 [29] Zhang D, Jiang W, Liu M, Sui X, Yin X, Chen S, Shi Y, Deng H (2009) Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells Cell Res 19(4):429-38 [30] Zhang S, Dai H, Wan N, Moore Y, Dai Z (2011) Promoting Long-Term Survival of Insulin-Producing Cell Grafts That Differentiate from Adipose Tissue-Derived Stem Cells to Cure Type Diabetes Plos one 23 ... JE, Samuel VT, Morton GJ, Obici S, Croniger CM, Shulman GI, Wasserman DH, McGuinness OP (2010) Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis... Harman SM (2009) Treatment of Type I Diabetes in the NOD Mouse with Syngeneic Cord Blood Stem Cells The Open Stem Cell Journal 1:62-68 [11] Hess D, Li L, Martin M, Sakano S, Hill D, Strutt B, Thyssen... Oliveira, MC, Moraes, DA, Pieroni, F, Coutinho, M, Malmegrim, KC, Foss-Freitas, MC, Simões, BP,Foss, MC, Squiers, E, Burt, RK (2007) Autologous nonmyeloablative hematopoietic stem cell transplantation