Thực tập sinh học động vật potx

Bài giảng TH CNSHĐV 1 Bài 1 NHẬN DIỆN KHÁNG NGUYÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP OUTERLONY I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT 1. Các khái niệm cần nhớ Miễn dòch là khả năng của cơ thể nhận ra và loại bỏ các vật lạ (kháng nguyên - Ag: Antigen). Từ cổ xưa, người ta đã biết ứng dụng miễn dòch trong việc phòng trừ một số bệnh nhiễm khuẩn, vì thế khái niệm về miễn dòch học đã xuất hiện từ rất sớm. Tuy nhiên, cho tới cuối thế kỷ thứ XIX, miễn dòch học mới trở thành một môn khoa học riêng biệt. Trong lòch sử phát triển của môn miễn dòch học, quan niệm về đáp ứng miễn dòch thay đổi theo tiến bộ của khoa học kỹ thuật và đồng thời nó cũng có mối liên hệ mật thiết với một số ngành khoa học khác như Sinh học phân tử, Y sinh học, Dược học, Thú y, Vi sinh học… Trong cơ thể động vật bậc cao (trong đó có người), đáp ứng miễn dòch có thể tạm chia ra thành hai loại: đáp ứng miễn dòch tự nhiên và đáp ứng miễn dòch thu được. Tuy nhiên hai khái niệm này có mối quan hệ mật thiết với nhau. Nói chung, khi có một yếu tố lạ có hại- có thể gây các hiệu ứng sinh hóa (kháng nguyên) xâm nhập vào cơ thể, hệ thống miễn dòch có nhiệm vụ nhận biết và sau đó có những hoạt động có hiệu quả tiếp theo để loại bỏ. Đáp ứng miễn dòch dòch thể và đáp ứng miễn dòch tế bào là hai phương thức mà hệ thống miễn dòch sử dụng để chống lại kháng nguyên. Đối với miễn dòch dòch thể thì kháng thể hòa tan, chính xác hơn là globulin miễn dòch đảm đương chức năng này. Các globulin miễn dòch này được sản xuất từ các tế bào plasma (tương bào), biệt hóa từ lympho bào B. Theo nghóa rộng thì tất cả các chất nội dòch đều có thể giúp sinh vật chống đỡ lại yếu tố kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể. Tuy nhiên, kháng thể dòch thể được hiểu ở đây là thành phần globulin miễn dòch có trong huyết thanh miễn dòch (thành phần này có khoảng 20% trong huyết thanh). Bài giảng TH CNSHĐV 2 Hình 45 :Sơ đồ cấu trúc phân tử Ig. Về phân loại, người ta chia Ig thành các lớp phân tử sau: + Globulin miễn dòch G (IgG): chiếm khoảng 70-75% tổng số Ig của huyết thanh người. Đây là lớp kháng thể chủ yếu trong đáp ứng miễn dòch và cũng là phân tử độc quyền kháng độc tố. Lớp IgG có vai trò quan trọng nhất trong cơ chế đáp ứng miễn dòch. + Globulin miễn dòch A (IgA): chiếm khoảng 15-20% tổng số Ig trong huyết thanh. Chúng có hai loại là IgA nội dòch huyết thanh và IgA tiết ra ngoài niêm mạc. IgA là phương tiện bảo vệ tại chỗ rất hữu hiệu của cơ thể, ngăn cản sự xâm nhập của kháng nguyên (virus, vi khuẩn, tế bào lạ, các phân tử sinh hóa…) + Globulin miễn dòch M (IgM): chiếm khoảng 10% tổng lượng IgG huyết thanh, chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong những trường hợp nhiễm khuẩn sớm. + Globulin miễn dòch D (IgD): chiếm 1% tổng lượng Ig huyết thanh. Cho tới hiện nay thì chức năng chính của IgD vẫn chưa được xác đònh rõ ràng, nhưng người ta thường thấy nồng độ của chúng tăng chậm trong những trường hợp nhiễm khuẩn mãn tính nhưng không đặc hiệu cho loại nhiễm khuẩn nào. + Globulin miễn dòch E (IgE): rất ít, chúng chỉ chiếm khoảng 0,004% tổng lượng Ig huyết thanh. Vai trò của IgE là khởi động việc giải phóng các sản phẩm từ tế bào bạch cầu ưa kiềm. Bài giảng TH CNSHĐV 3 2. Phản ứng kháng nguyên- kháng thể IgG trong hệ thống miễn dòch có nhiệm vụ kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên. Đây là một trong những chức năng quan trọng nhất bên cạnh các chức năng khác như hoạt hóa bạch cầu, bổ thể, hoạt hóa cơ chế vận chuyển qua màng tế bào… Khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên có được là do cấu trúc đặc biệt của phân tử globulin miễn dòch . Hình 46:Hình cấu trúc không gian của protein kháng thể và cách bắt Ag. Phản ứng in-vitro diễn ra giữa kháng nguyên kháng thể hay còn được gọi là các phương pháp huyết học (serological assays) đã và đang được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh. Sự kết hợp giữa kháng nguyên - kháng thể chính là kết quả của hàng loạt các phản ứng tủa, phản ứng ngưng kết, phản ứng cố đònh bổ thể và phản ứng miễn dòch đánh dấu. Sản phẩm hóa lý của sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể mà cụ thể là kết quả của phản ứng trung hòa kháng nguyên có ý nghóa rất lớn và được Bài giảng TH CNSHĐV 4 II. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ - Lame 9 x 8,5cm. - Bộ dụng cụ đục lỗ thạch. - Bình tam giác. - Ống tiêm 1ml. - Buồng ẩm. - Agarose tinh khiết. - Nước muối sinh lý. - Dung dòch đệm PBS. - Dung dòch nhuộm màu Commassive brilliant blue. - Dung dòch tẩy màu. - Vaccine DPT. - Huyết thanh kháng độc tố bạch hầu. - Huyết thanh chuẩn (đã biết trước nồng độ). - Giải độc tố bạch hầu. III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM (Phương pháp khuyếch tán hai chiều do Outerlony đề xuất) - Giải hấp phụ vaccine DPT: dùng vaccine DPT để giải hấp phụ độc tố bạch hầu ra khỏi gel aluminum bằng dung dòch Na Citrat nồng độ 2% trong 24 giờ. - Tiến hành phản ứng nhận diện: dùng phản ứng khuyếch tán kép (double diffusion) do Outerlony đề xuất (được gọi tắt là phản ứng Outerlony). - Các bước tiến hành như sau: + Chưng thạch: Agarose tinh khiết 1% pha trong dung dòch đệm PBS có pH= 7,2. + Đổ thạch lên lame: dùng lame nhỏ hoặc film 2,5x8cm, khoảng 3ml thạch/ lame. + Đục lỗ thạch. Bài giảng TH CNSHĐV 5 Hình 47 : Cách bố trí các lỗ thạch trên lame. Tiến hành phản ứng Outerlony trong buồng ẩm, thực hiện nhuộm và ép tiêu bản. GỒM CÁC BƯỚC SAU:  Ngâm tiêu bản vào dung dòch sinh lý trong 12- 18 để loại bỏ các yếu tố kết hợp không đặc hiệu.  Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm commassive brilliant blue trong 10 phút.  Rửa sạch thuốc nhuộm bằng cách ngâm tiêu bản vào dung dòch tẩy màu (chú ý trong quá trình ngâm phiến phải thay dung dòch tẩy màu thường xuyên). Cẩn thận tránh làm biến dạng phiến thạch hoặc bong agarose.  Ép khô tiêu bản. IV. NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý Không để hóa chất dây vào tay, quần áo Làm thí nghiệm, sinh viên phải mang găng tay V. YÊU CẦU - Nộp lại cho cán bộ hướng dẫn mẫu kết quả Huyết thanh kháng độc tố bạch hầu 50 Iu/ml Vaccine DPT đã giải hấp phụ được pha loãng ở các nồng độ khác nhau Lame Bài giảng TH CNSHĐV 6 Bài 2 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN HUYẾT THANH TỪ MÁU NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT a. Đònh nghóa Huyết thanh là huyết tương không có fibrinogen và một số yếu tố đông máu khác. b. Vai trò của huyết thanh trong Công nghệ Sinh học động vật Là thành phần quan trọng, không thể thiếu đối với môi trường nuôi cấy mô và tế bào động vật. Huyết thanh có các đặc điểm: (1) Cung cấp các chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như các amino acid thiết yếu, tiền chất của nucleic acid, các nguyên tố vi lượng… (2) Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào phân chia. (3) Chứa các protein có khả năng làm bất hoạt trypsin (một enzyme được sử dụng để tách tế bào động vật) tránh hiện tượng enzyme gây tổn thương tế bào. (4) Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng. (5) Cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt bình nuôi nhờ các yếu tố làm tăng độ dính của tế bào lên giá đỡ. (6) Chống oxy hóa: huyết thanh có tính kháng oxy mạnh và ức chế độc tính của oxy. Huyết thanh còn là nguyên liệu hàng đầu trong điều chế vaccin và công nghiệp dược phẩm nói chung. c. Nguyên tắc thu nhận huyết thanh Máu tươi vừa được lấy ra trực tiếp từ cơ thể động vật thường được để yên trong vài giờ, trong suốt thời gian này fibrinogen chuyển thành fibrin gel (cục máu đông). Cục máu đông này co dần lại và làm chừa ra phần dòch lỏng hay huyết thanh của máu. Người ta thu nhận lấy phần dòch lỏng này trong điều kiện vô trùng. Bài giảng TH CNSHĐV 7 Các bước thiết yếu trong việc thu nhận huyết thanh bao gồm: - Thu nhận máu từ cơ thể. - Tạo cục máu đông trong bình chứa. - Tách huyết thanh khỏi cục máu đông bằng lọc và ly tâm. - Tinh sạch, bảo quản. II. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ 1. Hóa chất - Hóa chất bảo quản: merthiolate cần được sử dụng với nồng độ sao cho việc bổ sung chúng vào huyết thanh sẽ không làm loãng huyết thanh. - Mẫu máu (thu nhận từ thỏ). 2. Dụng cụ - thiết bò a. Dùng cho việc thu máu  Thỏ 2,5kg hoặc nặng hơn (không cho ăn trong 12 giờ trước đó để huyết thanh thu được ít lipid nhất).  Bàn cột thỏ, 4 đoạn dây cột.  Dao cạo mới.  Kéo, pince y tế.  Bông gòn + cồn 70 o .  Bộ dụng cụ lấy máu: + Kim tiêm vô trùng, 18G, 2in. + Ống dẫn nhựa hoặc cao su. + Ống nghiệm vô trùng có sẵn nắp đậy.  Đèn bóng tròn 15W (đặt bên dưới tai thỏ, làm nóng để máu không đông nhanh trong quá trình lấy máu).  Băng keo y tế.  Chai đựng máu có nắp đậy (đã hấp khử trùng).  10.Giá để ống nghiệm.  11.Găng tay, khẩu trang và quần áo bảo hộ.  12.Đồ cấp cứu cá nhân. b. Dùng cho việc thu nhận huyết thanh  Tủ lạnh.  Que gỗ vô trùng. Bài giảng TH CNSHĐV 8  Micropipette 100-1000l + tip.  Máy li tâm ống nghiệm.  Chai thủy tinh có nắp vặn để chứa huyết thanh (vô trùng).  Phễu lọc + giấy lọc (vô trùng).  Milipore filter (màng lọc) 0,22-0,45m.  Thiết bò làm lạnh sâu (-80 0 C  -20 0 C).  Giấy hoặc khăn lau sạch. III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 1. Phương pháp thu máu a. Cố đònh thỏ nằm úp trên bàn thao tác b. Cạo lông trên tai thỏ để có thể nhìn thấy rõ tónh mạch tai. c. Để lấy máu dễ dàng, cần làm giãn nở mạch bằng cách dùng đèn bóng tròn 15W làm ấm mặt trong của tai thỏ. d. Sát trùng nơi đònh lấy máu trên tai thỏ. e. Ghim kim tiêm vào tónh vạch theo chiều hướng vào gốc tai thỏ (ngược với chiều chảy của máu). f. Giữ thỏ nằm yên và thu máu vào ống nghiệm vô trùng gắn với kim tiêm qua ống dẫn. g. Phương pháp này có thể thu được đến 20ml máu thỏ (một con, một lần). Nếu máu ngưng chảy, búng nhẹ vào tónh mạch tai để có thể tiếp tục thu máu. h. Sau khi thu đủ thể tích máu cần dùng, đặt gòn hoặc gạc lên vết cắt, dùng ngón cái và ngón trỏ để ép chặt vết thương lại. i. Dùng băng keo để giữ miếng gạc đúng vò trí. j. Thu huyết thanh theo quy trình bên trên. k. Xử lý và bảo quản. 2. Thu nhận huyết thanh a. Để yên mẫu máu trong 1-2 giờ ở nhiệt độ phòng nhằm tạo cục máu đông. Cẩn thận tách cục máu đông khỏi thành ống nghiệm bằng thìa thép hoặc que gỗ. Giữ ống nghiệm đựng máu trong tủ lạnh trong vòng 12-24 giờ để cục máu đông co lại. b. Gạn lấy phần huyết thanh vào các ống nghiệm sạch và li tâm với tốc độ 1000xg trong 30 phút ở 4 o C (khoảng 2500 vòng đối với Bài giảng TH CNSHĐV 9 rotor có bán kính 14cm). Cẩn thận lấy huyết thanh ra bằng cách gạn lấy phần dòch trong bên trên hoặc dùng pipette hút ra c. Thường thì huyết thanh thu được ở lần li tâm đầu tiên chứa một ít bạch cầu, để loại những tế bào này, cần li tâm lặp lại các sản phẩm đã thu ở lần ly tâm thứ nhất như mô tả trên. e. Khử trùng huyết thanh thu được bằng phương pháp lọc f. Thêm chất bảo quản, sau đó bảo quản lạnh để giữ được huyết thanh trong nhiều ngày. g. Để thuận lợi cho việc lưu giữ huyết thanh và do mỗi khi sử dụng chỉ cần một lượng nhỏ, huyết thanh cần được chia vào nhiều chai đựng có kích thước nhỏ. Đây là điều bắt buộc khi thực hiện lưu trữ huyết thanh ở trạng thái đông lạnh. IV. NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý  Trong quá trình làm cần thật nhẹ nhàng, tránh gây lắc mạnh ống đựng máu khiến vỡ tế bào hồng cầu.  Sau khi lấy máu (không quá 10ml) thì phải khử trùng vết thương trên tai thỏ ngay và băng lại.  Khử trùng toàn bộ dụng cụ.  Trước khi li tâm phải cân đối trọng cho đều các ống nghiệm V. YÊU CẦU - Huyết thanh có màu vàng nhạt đều, trong suốt, ít có hồng cầu vỡ. - Không có lớp mỡ váng bên trên. - Không có lớp cặn dưới đáy chai đựng. - Không có bọt khí hoặc vật lạ hoặc các sợi huyết lơ lửng. - Huyết thanh thu được đảm bảo vô trùng. + Dòch nuôi cấy đục so với ban đầu: có sự hiện diện của vi sinh vật trong mẫu huyết thanh. + Dòch nuôi cấy không đổi so với ban đầu: không có sự hiện diện của vi sinh vật trong mẫu huyết thanh. - Cũng có thể kiểm tra vi sinh vật bằng cách cấy mẫu để theo dõi sự phát triển của các khuẩn lạc Bài giảng TH CNSHĐV 10 Để lạnh 4 o C, 12-24h Lặp lại 2-3 lần Ly tâm 4 o C, 50.000g, 20 phút Gạn lấy phần huyết thanh cho vào chai đựng Ly tâm 1000g, 30 phút, t o =40 o C Hút dòch trong ra BẢO QUẢN Ở –20 O C Chia thành các mẫu nhỏ Lọc vô trùng Lọc qua giấy lọc nhám QUY TRÌNH THU NHẬN HUYẾT THANH. Thu máu Để yên 1-2h, t o phòng Tách cục máu đông khỏi thành chai đựng [...]... thể thực hiện được cần hai yếu tố quan trọng là thu nhận được những tế bào trứng tốt có khả năng thụ tinh và những tinh trùng tốt, khỏe 5 Các kỹ thuật cần thiết Trong bài thực tập này, sinh viên thực hiện hai kỹ thuật: thu nhận tế bào trứng từ buồng trứng heo và đánh giá một số chỉ tiêu sinh lý của tinh dòch heo Thu nhận tế bào trứng Thu nhận tế bào trứng từ buồng trứng của con vật: có thể từ con vật. .. gian tách tối ưu Các nhà khoa học thường mong muốn có thể tiến hành nghiên cứu một chức năng nhất đònh của một mô hay một tế bào trong một hệ thống đơn giản Để thực hiện điều này, người ta tìm cách tách tế bào ra khỏi mô nội quan của cơ thể và tiến hành nuôi cấy chúng trong điều kiện nhân tạo Đây là kỹ thuật cơ bản trong nuôi cấy tế bào động vật Bằng kỹ thuật tách tế bào động vật, chúng ta có thể làm chủ... Trứng + Thể cực II 3 Đặc điểm cơ bản của các tế bào sinh dục Một trong các đặc điểm của tế bào sinh dục trưởng thành ở sinh vật nói chung là bộ nhiễm sắc thể đơn bội (n) Đây là kết quả của hai lần phân chia giảm nhiễm trước khi thụ tinh Các tế bào sinh dục trưởng thành không thể hiện đầy đủ các cơ quan nội bào như các tế bào soma Kích thước các tế bào sinh dục trưởng thành thường lớn hơn các tế bào khác... bỏ phần đuôi Trong lónh vực thụ tinh nhân tạo trên người và động vật, việc thu nhận được số lượng lớn các tế bào sinh dục gồm tế bào trứng và tinh trùng là một yêu cầu thiết yếu Các tế bào sinh dục thu nhận được phải đảm bảo các yêu cầu về chất lượng nhằm đạt kết quả tốt cho thụ tinh in-vitro 24 giảng TH CNSHĐV Trứng có thể thu nhận từ động vật được kích hoạt bằng kích dục tố gây sự rụng trứng gồm có... (Pregnant-Mare’s-Serum-Gonadotrophin) và hCG (Human Chorionic Gonadotrophin) hoặc từ buồng trứng động vật giết mổ Trứng thu nhận từ các động vật được kích hoạt bằng kích dục tố là những trứng đã thành thục (trứng chín), tức sẵn sàng cho sự thụ tinh nếu gặp tinh trùng Người ta thu trứng bằng phương pháp nội soi đối với những động vật lớn Trong trường hợp thí nghiệm ở chuột, không thể tiến hành nội soi, người ta có... nhiều tế bào ban đầu khác nhau Để thực hiện quá trình nuôi cấy sơ cấp tế bào động vật, bước đầu tiên là tách chúng thành các tế bào riêng rẽ từ những mảnh mô và cho chúng bám vào giá thể phù hợp Việc tách tế bào có thể thực hiện bằng biện pháp cơ học hay bằng enzym để tạo thành một dòch huyền phù tế bào Hầu hết các loại tế bào động vật bình thường (trừ tế bào máu) đều cần bám vào một giá thể để sống và... dòch vào đóa petri-thu trứng 2 Đánh giá tinh dòch Trong phần thực tập này, sinh viên khảo sát hai chỉ tiêu để đánh giá vi thể tinh dòch động vật: xác đònh nồng độ tinh trùng bằng phòng đếm hồng cầu và xác đònh tỷ lệ tinh trùng sống bằng nhuộm màu tinh trùng a Nồng độ tinh trùng (C) là số tinh trùng hiện diện xác suất trong 1ml tinh dòch Thực hiện việc đếm tinh trùng heo bằng phương pháp đếm hồng cầu... nhiểm khuẩn, do sai sót trong thao tác chưa đảm bảo vô trùng 22 giảng TH CNSHĐV Bài 5 TẾ BÀO SINH DỤC CỦA ĐỘNG VẬT HỮU NHŨ I ĐẠI CƯƠNG 1 Hệ sinh dục đực a Cấu tạo - Tinh hoàn (testis): có cấu trúc dạng cặp được bọc trong một túi (bìu) Bên trong tinh hoàn có nhiều ngăn, trong mỗi ngăn đều là tổ chức mô biệt hóa và sinh sản tinh trùng - Mào tinh (epididymis): được nối với tinh hoàn, đây là các đường dẫn... chín và rụng từ các ống dẫn trứng Trứng thu nhận từ buồng trứng động vật giết mổ (heo, bò…) là các trứng chưa chín, do đó cần đưa trứng vào môi trường nuôi chín Trong môi trường này người ta cần bổ sung các yếu tố dinh dưỡng và các loại hormon…để kích thích sự chín của trứng Sự chín của trứng có nghóa là có sự thay đổi hình thái học, sinh hóa học ở tế bào chất, nhân tế bào và các bộ phận khác, sao cho... hồng cầu + Pha loãng tinh trùng trong ống trộn bạch cầu bằng dung dòch pha loãng (được chuẩn bò trước) + Đếm số lượng tinh trùng trong 400 ô nhỏ (của 25 ô lớn) của phòng đếm (Sinh viên xem lại cách tính trong giáo trình Thực tập Sinh học đại cương) Trong phần này, tinh dòch được pha loãng 20 lần bằng ống trộn bạch cầu Công thức tính như sau: C = 10000xDxN C: Nồng độ tinh trùng trong tinh dòch 30 giảng . với một số ngành khoa học khác như Sinh học phân tử, Y sinh học, Dược học, Thú y, Vi sinh học Trong cơ thể động vật bậc cao (trong đó có người), đáp. thanh trong Công nghệ Sinh học động vật Là thành phần quan trọng, không thể thiếu đối với môi trường nuôi cấy mô và tế bào động vật. Huyết thanh có các