ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Đỗ Thị Xuân Phương SỰ KHÁC NHAU TRONG QUÁ TRÌNH CHỮA LÀNH VẾT THƯƠNG CỦA EXOSOMES ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ BA NGUỒN TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ T.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Đỗ Thị Xuân Phương SỰ KHÁC NHAU TRONG QUÁ TRÌNH CHỮA LÀNH VẾT THƯƠNG CỦA EXOSOMES ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ BA NGUỒN TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỦY XƯƠNG, MÔ MỠ VÀ DÂY RỐN Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ quy Ngành Cơng nghệ sinh học (Chương trình đào tạo: Chuẩn) Hà Nội – 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Đỗ Thị Xuân Phương SỰ KHÁC NHAU TRONG QUÁ TRÌNH CHỮA LÀNH VẾT THƯƠNG CỦA EXOSOMES ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ BA NGUỒN TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỦY XƯƠNG, MÔ MỠ VÀ DÂY RỐN Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ quy Ngành Cơng nghệ sinh học (Chương trình đào tạo: Chuẩn) Cán hướng dẫn: TS Thân Thị Trang Uyên PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Hà Nội - 2020 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin trân trọng cảm ơn GS TS BS Nguyễn Thanh Liêm, Viện trưởng viện nghiên cứu Tế bào gốc Công nghệ gen Vinmec – Bệnh viện đa khoa Quốc tế Vinmec Time City tạo điều kiện cho thực tập, tiếp cận trang thiết bị kỹ thuật đại hàng đầu, góp phần quan trọng thành cơng khóa luận Tơi xin gửi lời chân thành cảm ơn tới PGS TS Hoàng Thị Mỹ Nhung, người dìu dắt tơi tới ngơi nhà thứ hai - môn Sinh học Tế bào Người nhiệt tình giúp đỡ, đưa lời khuyên chân thành bổ ích suốt thời gian học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Thân Thị Trang Uyên, người trực tiếp hướng dẫn tơi thực hồn thành khóa luận Người ln tận tình giúp đỡ chia sẻ kinh nghiệm, học quý báu nghiệp làm khoa học sống Tôi xin gửi lời cảm ơn đến ThS Nguyễn Đắc Tú, CN Hoàng Hương Diễm cán Viện nghiên cứu Tế bào gốc Công nghệ gen Vinmec hỗ trợ nhiệt tình cho tơi suốt q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cùng với đó, tơi xin cảm ơn Thầy, Cơ mơn Sinh học Tế bào anh chị, bạn em nhóm Ung thư thực nghiệm bên cổ vũ, động viên suốt trình học tập nghiên cứu Và cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè người thân tơi ln chỗ dựa vững chắc, nguồn động viên to lớn giúp tiếp thêm sức mạnh cho tơi vượt qua khó khăn để có thành cơng ngày hơm Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 04 tháng 05 năm 2020 Sinh viên Đỗ Thị Xuân Phương Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tế bào gốc trung mô (mesenchymal stem cells – MSCs) 1.1.1 Giới thiệu chung tế bào gốc trung mô 1.1.2 Nguồn phân lập tiềm ứng dụng MSCs 1.2 Exosomes (EXs) tiết từ tế bào gốc trung mô (MSCs) 1.2.1 Giới thiệu exosomes 1.2.2 Thành phần exsosomes 1.2.3 Ứng dụng exosomes 1.3 Quá trình lành vết thương 11 1.4 Nguyên bào sợi (Fibroblast) – Vật liệu nghiên cứu 13 1.4.1 Giới thiệu chung nguyên bào sợi người 13 1.4.2 Nuôi cấy nguyên bào sợi 14 1.4.3 Chức nguyên bào sợi 15 1.4.4 Vai trò chữa liền vết thương nguyên bào sợi 15 1.5 Mục tiêu nghiên cứu 18 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 2.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 19 2.2 Hóa chất thiết bị 20 2.2.1 Hóa chất 20 2.2.2 Thiết bị 21 2.2.3 Vật tư tiêu hao 22 2.3 Phương pháp 23 2.3.1 Phương pháp phân lập EXs 23 Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học 2.3.2 Phương pháp đo nồng độ protein tổng số 24 2.3.3 Phương pháp xác định chất thị 26 2.3.4 Phương pháp xác định hình thái, kích thước 26 2.3.5 Phương pháp đánh giá khả kích thích tăng sinh tế bào 27 2.3.6 Phương pháp đánh giá khả kích thích di cư tế bào 28 2.3.7 Phương pháp phân tích thống kê 29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Kết phân lập protein toàn phần exosomes 30 3.2 Chất thị exosomes 31 3.3 Hình thái, kích thước exosomes 32 3.4 Khả kích thích tăng sinh nguyên bào sợi người 33 3.5 Khả kích thích di cư nguyên bào sợi người 35 3.6 Thảo luận 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học DANH MỤC HÌNH MINH HỌA Hình Trang Hình 1: Vai trò MSCs Hình 2: Sự hình thành đặc điểm exosomes Hình 3: Các giai đoạn chữa lành vết thương cấp tính điều kiện sinh lý bình thường 13 Hình 4: Tế bào nguyên bào sợi da người passage 10 19 Hình 5: Quy trình bước tiến hành phân lập đánh giá tiềm chữa lành vết thương EXs từ ba nguồn AD-MSCs, BM-MSCs UC-MSCs 23 Hình 6: Tế bào gốc trung mơ từ mô mỡ (AD-MSC), tủy xương (BM-MSC), dây rốn (UC-MSC) passage 30 Hình 7: Kết phân tích protein đặc trưng EXs 32 Hình 8: Hình thái dạng hình cốc EXs quan sát TEM 33 Hình 9: Khả kích thích tăng sinh nguyên bào sợi exosomes từ BM-MSCs, AD-MSCs UC-MSCs sau 48h 34 Hình 10: So sánh khả kích thích di cư nguyên bào sợi nguồn ADMSCEXs, BMMSC-EXs, UCMSC-EXs 36 Hình 11: So sánh khả kích thích di cư nguyên bào sợi nồng độ mẫu ADMSC-EXs, BMMSC-EXs, UCMSC-EXs 38 Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học DANH MỤC BẢNG Bảng Trang Bảng 1: So sánh tế bào gốc trung mô (MSC) từ nguồn tủy xương (BM), mô mỡ (AD), dây rốn (UC) tổng hợp từ tài liệu Bảng 2: Tổng hợp giai đoạn trình lành vết thương 12 Bảng 3: Hóa chất sử dụng thí nghiệm 20 Bảng 4: Thiết bị sử dụng thí nghiệm 21 Bảng 5: Vật tư sử dụng thí nghiệm 22 Bảng 6: Thống kê kết phân lập EXs 31 Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ đầy đủ Từ tiếng Việt AD Adipose tissue Mô mỡ ADMSCEX Mesenchymal stem cell-derived exosomes originated from adipose tissue Exosome tiết tế bào gốc trung mơ có nguồn gốc từ mô mỡ BCA Bicinchoninic acid Axit bicinchoninic BM Bone marrow Tủy xương BMMSCEX Mesenchymal stem cell-derived exosomes originated from bone marrow Exosome tiết tế bào gốc trung mô có nguồn gốc từ tủy xương BSA Bovine serum albumin Albumin từ huyết bê CTF Cell traction forces Lực kéo tế bào DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium ECM Extracellular matrix Ma trận ngoại bào EV Extracellular vesicle Túi ngoại bào EX Exosome Exosome FBS Fetal bovine serum Huyết phơi thai bị International Society for Cellular Therapy International Society of Extracellular Vesicles The International Serum Industry Association Hiệp hội quốc tế liệu pháp tế bào Hiệp hội quốc tế túi ngoại bào Hiệp hội công nghiệp huyết quốc tế Enzyme thối hóa ma trận ngoại bào ISCT ISEV ISIA MMP Matrix metalloproteinases MSC Mesenchymal Stem Cells MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide OD Optical density PBS Phosphate-buffered saline Tế bào gốc trung mơ Mật độ quang Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học Pen/Strep Penicillin/Streptomycin TEM Transmission electron microscopy TIMP Tissue inhibitors of metalloproteinases Kính hiển vi điện tử truyền qua Ức chế mơ enzyme thối hóa ma trận ngoại bào UC Umbilical cord Dây rốn UCMSCEX Mesenchymal stem cell-derived exosomes originated from umbilical cord Exosome tiết tế bào gốc trung mơ có nguồn gốc từ dây rốn Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Chấn thương mơ mềm tượng xuất phổ biến dạng cấp tính, nhiên nhiều vết thương trở nên mạn tính khó lành Việc chữa lành vết thương kéo dài hình thành sẹo hai thách thức lớn điều trị trấn thương mô mềm Khơng ảnh hưởng đến chức mơ mà cịn ảnh hưởng đến sức khỏe tinh thần vấn đề tài bệnh nhân, đồng thời gây áp lực cho xã hội Do rút ngắn thời gian chữa lành phục hồi chấn thương mơ mềm có tính cấp thiết lâm sàng Các phương pháp thông thường để đẩy nhanh trình chữa lành vết thương bao gồm: ghép da, trị liệu laser ứng dụng cục số yếu tố tăng trưởng liệu pháp gen Tuy nhiên, phương pháp dẫn đến sẹo, bất thường sắc tố, hoại tử da hậu không mong muốn khác Ngồi ra, chất tiêm chỗ dễ dàng bị suy giảm dịch thể, liều lượng nồng độ chúng thường khác vị trí vết thương Do đó, cần phải tìm phương pháp ổn định, hiệu an toàn để thúc đẩy q trình lành vết thương mơ mềm Gần đây, tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cells – MSCs) phân lập từ nhiều nguồn khác mô mỡ, mô dây rốn, tủy xương tủy lên phương pháp điều trị đầy triển vọng chữa liền vết thương khả biệt hóa thành tế bào vết thương nguyên bào sợi, tiết nhiều yếu tố tăng trưởng kích thích q trình chữa liền vết thương Các yếu tố tiết MSCs bao bọc túi thể tiết ngoại bào (Extracellular Vesicles – EVs) Các phân tử EVs phản ánh đặc điểm sinh lý bệnh lý tế bào tiết Vì vậy, nay, EVs đặc biệt exosomes lên biện pháp trị liệu thay tiềm tương tự MSCs an toàn MSCs Tuy nhiên, EVs phân lập từ nguồn MSCs khác có chất lượng hiệu điều trị khác khác biệt đặc điểm tiềm loại tế bào MSCs Theo hiểu biết chúng tôi, khác biệt chất lượng khả chữa liền vết thương EVs phân lập từ ba nguồn MSCs người: mô mỡ (Adipose tissue - AD), tủy xương (Bone marrow - BM) cuống rốn (Umbilical cord - UC) chưa Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học B % diện tích A Thời điểm D % diện tích C Thời điểm F % diện tích E Thời điểm Hình 10: So sánh khả kích thích di cư nguyên bào sợi nguồn ADMSC-EXs, BMMSC-EXs, UCMSC-EXs 36 Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Cơng nghệ sinh học Các EXs giải phóng từ ba nguồn tế bào gốc thêm vào môi trường ni cấy ngun bào sợi thí nghiệm vết rạch với tổng nồng độ protein EXs cuối µg (hình A, B), 10 µg (hình C, D), 20 µg (hình E, F)/ mL mơi trường ni cấy chứa FBS loại bỏ EVs, chụp ảnh thời điểm khác (độ phóng đại 10X) Hình ảnh phân tích phần mềm Image J liệu trình bày dạng phần trăm diện tích trung bình vùng tế bào bao phủ vết thương µm2 ± SD, lần lặp lại sinh học Ý nghĩa thống kê xác định ANOVA Post-hoc Tukey HSD tests; ký hiệu: *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001, ****: p < 0.0001 Bên cạnh đó, so sánh nồng độ nguồn phân lập EXs Sự khác biệt không đáng kể ba nồng độ ba nguồn thời điểm 20h Tuy nhiên sau đó, kích thích nồng độ nguồn khác Điều thú vị là, mẫu EXs từ UC-MSCs cho thấy khả kích thích di cư vượt trội nồng độ thấp μg/mL kích thích thấp nồng độ 20 μg/mL sau 24 32h (p < 0.0001) (Hình 11A) Trong EXs từ BM-MSCs AD-MSCs cho thấy nồng độ cao kích thích di cư tốt Cụ thể, sau 32h, EXs BM-MSCs nồng độ 10 20 μg/mL thể kích thích tăng sinh tương đương cao so với nồng độ μg/mL (p < 0.0001) (Hình 11B); EXs AD-MSCs thể tác động lớn nồng độ cao (20 μg/mL) (Hình 11C) Kết cho thấy, khả kích thích di cư tế bào EXs bị ảnh hưởng nồng độ chất loại tế bào tiết 37 Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Cơng nghệ sinh học Hình 11: So sánh khả kích thích di cư nguyên bào sợi nồng độ mẫu ADMSC-EXs, BMMSC-EXs, UCMSC-EXs Dữ liệu trình bày dạng phần trăm diện tích trung bình vùng tế bào bao phủ vết thương µm2 ± SD, lần lặp lại sinh học Ý nghĩa thống kê xác định ANOVA Post-hoc Tukey HSD tests; ký hiệu: *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001, ****: p < 0.0001 38 Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học 3.6 Thảo luận Nghiên cứu củng cố thêm tầm quan trọng exosomes (EXs) có nguồn gốc từ tế bào gốc trung mơ mục đích điều trị Các EXs từ AD-MSCs, BM-MSCs UC-MSCs chứng minh có liên quan đến nhiều q trình sinh học loại tế bào khác thành phần khác Ví dụ, EXs có nguồn gốc ADMSCs người chứng minh làm giảm viêm da dị ứng, điều chỉnh trình tế bào khác tăng sinh, di cư, phản ứng viêm hình thành mạch [24] Ngồi ra, EXs có nguồn gốc BMMSCs có khả tăng cường q trình tạo xương [59], làm giảm xơ hóa gan [49] thúc đẩy hình thành mạch [14] Hơn nữa, EXs tiết UC-MSCs bảo vệ tế bào khỏi trình tế bào chết theo chu trình gây áp lực oxy hóa in vitro [9] thúc đẩy chữa lành vết thương da [61] trẻ hóa da người [31] Do đó, EXs có nguồn gốc từ MSCs ứng cử viên đầy hứa hẹn để phát triển sản phẩm trị liệu hiệu Việc phân lập EXs cần cân nhắc đến tiêu chí chi phí, hiệu suất chất lượng Nghiên cứu chọn phương pháp phân lập phổ biến phương pháp siêu ly tâm Phương pháp siêu ly tâm có suất phân lập EXs thấp so với kit tách thương mại, nhiên EXs phân lập từ phương pháp siêu ly tâm biểu chất thị EXs cao protein có mức độ tinh khiết cao so với kit tách thương mại [52] Hiệu suất phân lập thu 100% (tất mẫu phân lập từ môi trường nuôi cấy MSCs thu EXs) Để minh chứng cho việc thu xác EXs hay khơng, nghiên cứu tiến hành đánh giá đặc tính EXs dựa vào tiêu chí biểu protein đặc trưng đặc điểm hình thái kích thước đặc trưng Hình ảnh chụp kính hiển vi điện tử truyền qua cho thấy, EXs phân lập nghiên cứu có hình thái điển hình EXs dạng hình cốc với kích thước đường kính khoảng 40 - 250nm (Hình 8) Ngồi ra, EXs có nguồn gốc từ AD-MSCs, BM-MSCs UC-MSCs biểu protein xuyên màng protein nội bào, bao gồm CD9, CD63 AGO2 coi dấu hiệu EXs (Hình 7) Điều cho thấy, nghiên cứu phân lập thành công EXs tiết tế bào gốc trung mơ có nguồn gốc từ mơ mỡ, tủy xương dây rốn Nguyên bào sợi có chức quan trọng chữa lành vết thương, bao gồm co rút đóng kín vết thương, sản xuất protein thành phần ma trận ngoại bào tu sửa mô Nguyên bào sợi vết thương mạn tính bị khiếm khuyết khả di chuyển, 39 Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học tăng sinh tiết yếu tố tăng trưởng [4, 56] Các nghiên cứu cho thấy, exosomes MSCs hấp thụ nguyên bào sợi người bình thường hay người bị bệnh tiểu đường có vết thương mạn tính giúp kích thích tăng sinh, di cư thời gian phụ thuộc vào liều lượng [26, 51] Thật thú vị, phù hợp với kết đó, nghiên cứu chúng tơi chứng minh EXs từ MSCs có tác dụng kích thích tăng sinh di cư nguyên bào sợi người khỏe mạnh Đặc biệt so sánh khác biệt EXs từ nguồn MSCs mô mỡ, tủy xương dây rốn, đồng thời so sánh nồng độ protein toàn phần exosomes đến trình tăng sinh di cư nguyên bào sợi Trong nghiên cứu, sử dụng dãy nồng độ 1, 10 20 μg/mL protein tổng số, kết cho thấy kích thích tăng sinh di cư phụ thuộc vào liều lượng nguồn EXs Kết kích thích tăng sinh sau thời gian ngày cho thấy EXs từ BM-MSCs có hiệu cao ba nồng độ EXs từ UC-MSCs thể kích thích thấp Khi so sánh nồng độ có UCMSC-EXs thể khác biệt nồng độ có ý nghĩa thống kê nồng độ thấp μg/mL thể kích thích cao nồng độ cao 20 μg/mL (p < 0.05), cịn kích thích ADMSC-EXs, BMMSC-EXs khơng phụ thuộc vào nồng độ (Hình 9) Chúng tơi đưa dự đoán rằng, EXs phân lập từ UC-MSCs chứa hoạt chất sinh học chưa nghiên cứu dẫn đến nồng độ cao ức chế hoạt tính sinh học Vì cần nghiên cứu phân tích sâu thành phần, yếu tố có EXs tác động đến trình chữa lành vết thương Tuy nhiên với nghiên cứu A.Shabbir cộng (2015) [51] EXs từ BM-MSCs với dãy nồng độ 0,1, 1, 10 μg/mL cho thấy kết nồng độ cao kích thích tăng sinh nguyên bào sợi lớn (p < 0.05) sau ngày Một nghiên cứu khác Li Hu cộng (2016) [26] EXs AD-MSCs sử dụng dãy nồng độ 25, 50, 100 μg/mL theo dõi ngày cho kết khả kích thích tăng sinh nguyên bào sợi tăng nồng độ tăng Các nghiên cứu cho kết khác nguồn EXs phân lập từ loại mô khác nhau, dải nồng độ EXs khác nhiều Do vậy, cần thiết phải tiến hành nghiên cứu thêm mối tương quan nguồn gốc MSC-EXs với dải nồng độ đến kích thích tăng sinh nguyên bào sợi Đối với khả kích thích di cư nguyên bào sợi người, theo dõi 32h ba nồng độ 1, 10 20 μg/mL Ở nồng độ thấp µg/mL, EXs từ UC-MSCs có tác động lớn đến di cư tế bào sau 24h 32h Tuy nhiên, EXs từ BM-MSCs AD40 Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học MSCs thể khả kích thích di cư tế bào cao so với EXs từ UC-MSCs nồng độ 10 20 µg/mL Và đặc biệt, EXs từ BM-MSCs cho thấy khả kích thích cao di cư tế bào hai nồng độ 10 µg 20 µg thời điểm 32h (Hình 10) So sánh nồng độ nguồn EXs cho thấy, UCMSC-EXs nồng độ thấp kích thích di cư tốt so với nồng độ cao sau 24 32h, điều tương đồng với kết kích thích tăng sinh nguyên bào sợi, cho thấy nồng độ thấp (1 μg/mL) UCMSC-EXs có tác dụng cao di cư tăng sinh tế bào so với nồng độ cao Còn EXs từ BM-MSCs AD-MSCs ngược lại với UCMSC-EXs nồng độ cao kích thích di cư tốt so với nồng độ thấp Kết tương đồng với kết A.Shabbir cộng (2015) nghiên cứu EXs từ BM-MSCs Li Hu cộng (2016) nghiên cứu EXs ADMSCs Tuy nhiên để đánh giá cách xác cần tiến hành thêm nghiên cứu sau với lượng mẫu lớn hơn, mở rộng dải nồng độ để tìm ngưỡng nồng độ kích thích để tối ưu nồng độ EXs, nghiên cứu mối tương quan dải nồng độ EXs nguồn gốc mô EXs lựa chọn loại mẫu phù hợp để phát triển thành sản phẩm ứng dụng lâm sàng 41 Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Nghiên cứu phân lập thành công exosomes từ tế bào gốc trung mơ có nguồn gốc từ mơ mỡ, tủy xương dây rốn EXs có biểu protein xuyên màng (CD9, CD63), protein nội bào (AGO2) Hình thái exosomes có dạng hình cốc, kích thước đường kính từ 40-250 nm Exosomes từ ba nguồn AD-MSCs, BM-MSCs, UC-MSCs thúc đẩy tăng sinh nguyên bào sợi người, BMMSC-EXs cho thấy tác động lớn cịn UCMSC-EXs biểu kích thích thấp Ở nồng độ thấp μg/mL kích thích tăng sinh tốt nồng độ cao 20 μg/mL EXs từ UC-MSCs EXs từ UC-MSCs cho thấy kích thích di cư cao nồng độ thấp μg/mL, nồng độ cao 10, 20 μg/mL ADMSC-EXs BMMSC-EXs cho thấy tác động lớn so với UCMSC-EXs Trong đó, UCMSC-EXs nồng độ thấp kích thích di cư tốt nồng độ cao, cịn ADMSC-EXs BMMSC-EXs ngược lại, nồng độ cao kích thích di cư tốt nồng độ thấp Kiến nghị: Nghiên cứu yếu tố tác động đến trình chữa liền vết thương có exosomes Tiến hành thêm nghiên cứu với cỡ mẫu lớn mở rộng dải nồng độ Tiến hành nghiên cứu tìm hiểu mối tương quan nồng độ EXs nguồn gốc mơ EXs Tiến hành thí nghiệm mơ hình in vivo trước thử nghiệm lâm sàng 42 Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Anh: Akers J.C., D Gonda, R Kim, B.S Carter, and C.C Chen (2013), “Biogenesis of extracellular vesicles (EV): exosomes, microvesicles, retrovirus-like vesicles, and apoptotic bodies”, Journal of neuro-oncology, 113 (1), pp 1-11 Birk D.E and R.L Trelstad (1986), “Extracellular compartments in tendon morphogenesis: collagen fibril, bundle, and macroaggregate formation”, The Journal of cell biology, 103 (1), pp 231-240 Blazquez R., F.M Sanchez-Margallo, O De La Rosa, W Dalemans, V Álvarez, R Tarazona, and J.G Casado (2014), “Immunomodulatory potential of human adipose mesenchymal stem cells derived exosomes on in vitro stimulated T cells”, Frontiers in immunology, 5, pp 556 Brem H., M.S Golinko, O Stojadinovic, A Kodra, R.F Diegelmann, S Vukelic, H Entero, D.L Coppock, and M Tomic-Canic (2008), “Primary cultured fibroblasts derived from patients with chronic wounds: a methodology to produce human cell lines and test putative growth factor therapy such as GMCSF”, Journal of translational medicine, (1), pp 75 Bruno S., C Grange, F Collino, M.C Deregibus, V Cantaluppi, L Biancone, C Tetta, and G Camussi (2012), “Microvesicles derived from mesenchymal stem cells enhance survival in a lethal model of acute kidney injury”, PloS one, (3) Caplan A.I and J.E Dennis (2006), “Mesenchymal stem cells as trophic mediators”, Journal of cellular biochemistry, 98 (5), pp 1076-1084 Chen J., Z Liu, M.M Hong, H Zhang, C Chen, M Xiao, J Wang, F Yao, M Ba, and J Liu (2014), “Proangiogenic compositions of microvesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells”, PloS one, (12), pp e115316 Chong H.C., J.S.K Chan, C.Q Goh, N.V Gounko, B Luo, X Wang, S Foo, M.T.C Wong, C Choong, and S Kersten (2014), “Angiopoietin-like stimulates 43 Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học STAT3-mediated iNOS expression and enhances angiogenesis to accelerate wound healing in diabetic mice”, Molecular Therapy, 22 (9), pp 1593-1604 Cozac V.V., U Gschwandtner, F Hatz, M Hardmeier, S Rüegg, and P Fuhr (2016), “Quantitative EEG and cognitive decline in Parkinson’s disease”, Parkinson’s Disease, 2016 10 De Gassart A., C Géminard, B Février, G Raposo, and M Vidal (2003), “Lipid raft-associated protein sorting in exosomes”, Blood, 102 (13), pp 4336-4344 11 De Jong O.G., B.W Van Balkom, R.M Schiffelers, C.V Bouten, and M.C Verhaar (2014), “Extracellular vesicles: potential roles in regenerative medicine”, Frontiers in immunology, 5, pp 608 12 Del Fattore A., R Luciano, L Pascucci, B.M Goffredo, E Giorda, M Scapaticci, A Fierabracci, and M Muraca (2015), “Immunoregulatory effects of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles on T lymphocytes”, Cell transplantation, 24 (12), pp 2615-2627 13 Desjardins-Park H.E., D.S Foster, and M.T Longaker, Fibroblasts and wound healing: an update 2018, Future Medicine 14 Ding J., X Wang, B Chen, J Zhang, and J Xu (2019), “Exosomes Derived from Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Stimulated by Deferoxamine Accelerate Cutaneous Wound Healing by Promoting Angiogenesis”, BioMed research international, 2019 15 Dominici M., K Le Blanc, I Mueller, I Slaper-Cortenbach, F Marini, D Krause, R Deans, A Keating, D Prockop, and E Horwitz (2006), “Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells The International Society for Cellular Therapy position statement”, Cytotherapy, (4), pp 315-317 16 Friedenstein A., R Chailakhjan, and K Lalykina (1970), “The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea‐pig bone marrow and spleen cells”, Cell Proliferation, (4), pp 393-403 17 Gnecchi M., H He, O.D Liang, L.G Melo, F Morello, H Mu, N Noiseux, L Zhang, R.E Pratt, and J.S Ingwall (2005), “Paracrine action accounts for marked 44 Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học protection of ischemic heart by Akt-modified mesenchymal stem cells”, Nature medicine, 11 (4), pp 367-368 18 Goolaerts A., N Pellan-Randrianarison, J Larghero, V Vanneaux, Y Uzunhan, T Gille, N Dard, C Planès, M.A Matthay, and C Clerici (2014), “Conditioned media from mesenchymal stromal cells restore sodium transport and preserve epithelial permeability in an in vitro model of acute alveolar injury”, American Journal of Physiology-Lung Cellular Molecular Physiology, 306 (11), pp L975L985 19 Guido S and R.T Tranquillo (1993), “A methodology for the systematic and quantitative study of cell contact guidance in oriented collagen gels Correlation of fibroblast orientation and gel birefringence”, Journal of cell science, 105 (2), pp 317-331 20 Guo X., Y Bai, L Zhang, B Zhang, N Zagidullin, K Carvalho, Z Du, and B Cai (2018), “Cardiomyocyte differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow: new regulators and its implications”, Stem cell research therapy, (1), pp 44 21 Harding C and P Stahl (1983), “Transferrin recycling in reticulocytes: pH and iron are important determinants of ligand binding and processing”, Biochemical biophysical research communications, 113 (2), pp 650-658 22 Haynesworth S.E., M.A Baber, and A.I Caplan (1996), “Cytokine expression by human marrow‐derived mesenchymal progenitor cells in vitro: Effects of dexamethasone and IL‐1α”, Journal of cellular physiology, 166 (3), pp 585-592 23 Hinz B., S.H Phan, V.J Thannickal, A Galli, M.-L Bochaton-Piallat, and G Gabbiani (2007), “The myofibroblast: one function, multiple origins”, The American journal of pathology, 170 (6), pp 1807-1816 24 Hong P., H Yang, Y Wu, K Li, and Z Tang (2019), “The functions and clinical application potential of exosomes derived from adipose mesenchymal stem cells: a comprehensive review”, Stem cell research therapy, 10 (1), pp 242 25 Hsieh P and L.B Chen (1983), “Behavior of cells seeded in isolated fibronectin matrices”, The Journal of cell biology, 96 (5), pp 1208-1217 45 Khóa luận tốt nghiệp 26 Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học Hu L., J Wang, X Zhou, Z Xiong, J Zhao, R Yu, F Huang, H Zhang, and L Chen (2016), “Exosomes derived from human adipose mensenchymal stem cells accelerates cutaneous wound healing via optimizing the characteristics of fibroblasts”, Scientific reports, 6, pp 32993 27 Janas T., M.M Janas, K Sapoń, and T Janas (2015), “Mechanisms of RNA loading into exosomes”, FEBS letters, 589 (13), pp 1391-1398 28 Kern S., H Eichler, J Stoeve, H Klüter, and K Bieback (2006), “Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue”, Stem cells 24 (5), pp 1294-1301 29 Keshtkar S., N Azarpira, and M.H Ghahremani (2018), “Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine”, Stem cell research therapy, (1), pp 63 30 Kim W.-J., R.R Mohan, and S Wilson (1999), “Effect of PDGF, IL-1alpha, and BMP2/4 on corneal fibroblast chemotaxis: expression of the platelet-derived growth factor system in the cornea”, Investigative ophthalmology visual science, 40 (7), pp 1364-1372 31 Kim Y.-J., S Mi Yoo, H.H Park, H.J Lim, Y.-L Kim, S Lee, K.-W Seo, and K.-S Kang (2017), “Exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells stimulates rejuvenation of human skin”, Biochemical biophysical research communications, 493 (2), pp 1102-1108 32 Kinzebach S and K Bieback (2012), “Expansion of mesenchymal stem/stromal cells under xenogenic-free culture conditions”, in Mesenchymal Stem CellsBasics and Clinical Application I, Springer, pp 33-57 33 Kopen G.C., D.J Prockop, and D.G Phinney (1999), “Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 96 (19), pp 10711-10716 34 Lee C., S.A Mitsialis, M Aslam, S.H Vitali, E Vergadi, G Konstantinou, K Sdrimas, A Fernandez-Gonzalez, and S Kourembanas (2012), “Exosomes 46 Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học mediate the cytoprotective action of mesenchymal stromal cells on hypoxiainduced pulmonary hypertension”, Circulation, 126 (22), pp 2601-2611 35 Lee R.H., A.A Pulin, M.J Seo, D.J Kota, J Ylostalo, B.L Larson, L SemprunPrieto, P Delafontaine, and D.J Prockop (2009), “Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6”, Cell stem cell, (1), pp 54-63 36 Lehrich B.M., Y Liang, P Khosravi, H.J Federoff, and M.S Fiandaca (2018), “Fetal bovine serum-derived extracellular vesicles persist within vesicle-depleted culture media”, International journal of molecular sciences, 19 (11), pp 3538 37 Li B and J.H.-C Wang (2011), “Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing: force generation and measurement”, Journal of tissue viability, 20 (4), pp 108-120 38 Li T., M Xia, Y Gao, Y Chen, and Y Xu (2015), “Human umbilical cord mesenchymal stem cells: an overview of their potential in cell-based therapy”, Expert opinion on biological therapy, 15 (9), pp 1293-1306 39 Mcanulty R (1995), “Pathogenesis of lung fibrosis and potential new therapeutic strategies”, Exp Nephrol., 3, pp 96-107 40 Mcanulty R.J (2007), “Fibroblasts and myofibroblasts: their source, function and role in disease”, The international journal of biochemistry cell biology, 39 (4), pp 666-671 41 Monaco J.L and W.T Lawrence (2003), “Acute wound healing an overview”, Clinics in plastic surgery, 30 (1), pp 1-12 42 Nancarrow-Lei R., P Mafi, R Mafi, W Khan, and Therapy (2017), “A systemic review of adult mesenchymal stem cell sources and their multilineage differentiation potential relevant to musculoskeletal tissue repair and regeneration”, Current stem cell research therapy, 12 (8), pp 601-610 43 Pan B.-T and R.M Johnstone (1983), “Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytes in vitro: selective externalization of the receptor”, Cell 33 (3), pp 967-978 47 Khóa luận tốt nghiệp 44 Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học Pastar I., O Stojadinovic, N.C Yin, H Ramirez, A.G Nusbaum, A Sawaya, S.B Patel, L Khalid, R.R Isseroff, and M Tomic-Canic (2014), “Epithelialization in wound healing: a comprehensive review”, Advances in wound care, (7), pp 445-464 45 Phinney D.G and M.F Pittenger (2017), “Concise review: MSC‐derived exosomes for cell‐free therapy”, Stem cells, 35 (4), pp 851-858 46 Rani S and T Ritter (2016), “The Exosome‐A Naturally Secreted Nanoparticle and its Application to Wound Healing”, Advanced materials, 28 (27), pp 55425552 47 Rani S., A.E Ryan, M.D Griffin, and T Ritter (2015), “Mesenchymal stem cellderived extracellular vesicles: toward cell-free therapeutic applications”, Molecular Therapy, 23 (5), pp 812-823 48 Reinke J and H Sorg (2012), “Wound repair and regeneration”, European surgical research, 49 (1), pp 35-43 49 Rong X., J Liu, X Yao, T Jiang, Y Wang, and F Xie (2019), “Human bone marrow mesenchymal stem cells-derived exosomes alleviate liver fibrosis through the Wnt/β-catenin pathway”, Stem cell research therapy, 10 (1), pp 98 50 Rozario T and D.W Desimone (2010), “The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view”, Developmental biology, 341 (1), pp 126140 51 Shabbir A., A Cox, L Rodriguez-Menocal, M Salgado, and E.V Badiavas (2015), “Mesenchymal stem cell exosomes induce proliferation and migration of normal and chronic wound fibroblasts, and enhance angiogenesis in vitro”, Stem cells development, 24 (14), pp 1635-1647 52 Tang Y.-T., Y.-Y Huang, L Zheng, S.-H Qin, X.-P Xu, T.-X An, Y Xu, Y.-S Wu, X.-M Hu, and B.-H Ping (2017), “Comparison of isolation methods of exosomes and exosomal RNA from cell culture medium and serum”, International journal of molecular medicine, 40 (3), pp 834-844 53 Théry C (2011), “Exosomes: secreted communications”, F biology reports, 48 vesicles and intercellular Khóa luận tốt nghiệp 54 Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học Toma C., W.R Wagner, S Bowry, A Schwartz, and F Villanueva (2009), “Fate of culture-expanded mesenchymal stem cells in the microvasculature: in vivo observations of cell kinetics”, Circulation research, 104 (3), pp 398-402 55 Trebaul A., E Chan, and K Midwood, Regulation of fibroblast migration by tenascin-C 2007, Portland Press Ltd 56 Wall I.B., R Moseley, D.M Baird, D Kipling, P Giles, I Laffafian, P.E Price, D.W Thomas, and P Stephens (2008), “Fibroblast dysfunction is a key factor in the non-healing of chronic venous leg ulcers”, Journal of Investigative Dermatology, 128 (10), pp 2526-2540 57 Wiig H., K Rubin, and R Reed (2003), “New and active role of the interstitium in control of interstitial fluid pressure: potential therapeutic consequences”, Acta Anaesthesiologica Scandinavica, 47 (2), pp 111-121 58 Xu J and R Clark (1996), “Extracellular matrix alters PDGF regulation of fibroblast integrins”, The Journal of cell biology, 132 (1), pp 239-249 59 Xu S and Z Wang (2017), “Bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes enhance osteoclastogenesis during alveolar bone deterioration in rats”, RSC advances, (34), pp 21153-21163 60 Yan Y., W Jiang, Y Tan, S Zou, H Zhang, F Mao, A Gong, H Qian, and W Xu (2017), “hucMSC exosome-derived GPX1 is required for the recovery of hepatic oxidant injury”, Molecular Therapy, 25 (2), pp 465-479 61 Zhang B., M Wang, A Gong, X Zhang, X Wu, Y Zhu, H Shi, L Wu, W Zhu, and H Qian (2015), “HucMSC‐exosome mediated‐Wnt4 signaling is required for cutaneous wound healing”, Stem cells, 33 (7), pp 2158-2168 62 Zhang B., X Wu, X Zhang, Y Sun, Y Yan, H Shi, Y Zhu, L Wu, Z Pan, and W Zhu (2015), “Human umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes enhance angiogenesis through the Wnt4/β‐catenin pathway”, Stem cells translational medicine, (5), pp 513-522 63 Zhang H.-Y and S.H Phan (1999), “Inhibition of myofibroblast apoptosis by transforming growth factor β1”, American journal of respiratory cell molecular biology, 21 (6), pp 658-665 49 Khóa luận tốt nghiệp 64 Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học Zhang Z., J Yang, W Yan, Y Li, Z Shen, and T Asahara (2016), “Pretreatment of cardiac stem cells with exosomes derived from mesenchymal stem cells enhances myocardial repair”, Journal of the American Heart Association, (1), pp e002856 65 Zhou Y., A Day, S Haykal, A Keating, and T.K Waddell (2013), “Mesenchymal stromal cells augment CD4+ and CD8+ T-cell proliferation through a CCL2 pathway”, Cytotherapy, 15 (10), pp 1195-1207 66 Zhou Z., Y Chen, H Zhang, S Min, B Yu, B He, and A.J Jin (2013), “Comparison of mesenchymal stromal cells from human bone marrow and adipose tissue for the treatment of spinal cord injury”, Cytotherapy, 15 (4), pp 434-448 Trang web: 67 https://www.novusbio.com/research-areas/cell-biology/Exosome-research-tools 68 https://www.novusbio.com/research-areas/cellular-markers/fibroblast-cellmarkers.html 50 ... công ngày hôm Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 04 tháng 05 năm 2020 Sinh viên Đỗ Thị Xuân Phương Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học MỤC LỤC MỞ ĐẦU ... tiêu hao 22 2.3 Phương pháp 23 2.3.1 Phương pháp phân lập EXs 23 Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học 2.3.2 Phương pháp đo nồng độ protein... nguyên bào sợi người 35 3.6 Thảo luận 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 Khóa luận tốt nghiệp Đỗ Thị Xuân Phương – K61 Công nghệ sinh học DANH