Trao di trc tuyn ti

Trao đổ i trự c tuyế n tạ i: www.mientayvn.com/chat_box_sinh.html Lời nói đầu Trong thể sống, khơng có q trình hóa học lại khơng có liên quan mật thiết đến q trình sinh học enzyme xúc tác Có thể nói sống gắn liền với enzyme Ngồi nhóm nhỏ phân tử RNA có hoạt tính xúc tác, enzyme có chất protein; chúng bảo đảm cho q trình chuyển hóa chất thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng, cân đối, theo chiều hướng xác định Enzyme học (Enzymology) mơn học có vị trí then chốt hóa sinh phát triển mạnh mẽ xâm nhập vào nhiều ngành khoa học, đặc biệt thu hút ý nhà sinh học sinh y học hiểu biết enzyme có liên quan mật thiết đến sinh học phân tử y học phân tử kiến thức quan trọng sinh học sinh y học Giáo trình nhằm cung cấp cho sinh viên ngành, chuyên ngành liên quan đến sinh học Đại học Huế nhũng kiến thức enzyme - chất xúc tác sinh học Cuốn sách biên soạn theo chương trình giáo dục đại học Đại học Huế phê duyệt, tập thể tác giả trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Sách dùng làm tài liệu tham khảo cho sinh viên trường khác, người chuẩn bị thi tuyển sau đại học cán nghiên cứu liên quan Các tác giả xin cảm ơn đồng nghiệp góp nhiều ý kiến bổ ích q trình biên soạn Đặc biệt tác giả xin chân thành cám ơn GS.TSKH Lê Doãn DiênGiám đốc Trung tâm Tư vấn Đầu tư Nghiên cứu phát triển Nông thôn Việt Nam (INCEDA), Chủ tịch Hội Hóa sinh Việt Nam nhận phản biện cho nhiều lời khuyên q báu nhằm hồn thiện giáo trình Với thời gian biên soạn kinh nghiệm hạn chế, sách cịn chưa thật đầy đủ chắn khơng thể tránh khỏi nhiều thiếu sót Chúng tơi mong nhận nhiều ý kiến đóng góp bạn đồng nghiệp, sinh viên bạn đọc để lần xuất sau hoàn thiện Thay mặt tác giả Chủ biên PGS.TS Đỗ Quý Hai Mục lục Trang Lời nói đầu Chương Mở đầu 1.1 Định nghĩa enzyme 1.2 Lược sử nghiên cứu enzyme 1.2.1 Giai đoạn 1.2.2 Giai đoạn 1.2.3 Giai đoạn 1.2.4 Giai đoạn 12 1.3 Phương hướng nghiên cứu enzyme 14 1.4 Những vấn đề cần đề cập nghiên cứu enzyme 16 1.5 Vấn đề nghiên cứu enzyme nước ta 17 Tài liệu tham khảo 18 Chương Phương pháp nghiên cứu enzyme 19 2.1 Những nguyên tắc chung nghiên cứu enzyme 19 2.2 Tách làm (tinh chế) enzyme 21 2.2.1 Chọn nguồn nguyên liệu 21 2.2.2 Chiết rút enzyme 26 2.2.3 Các phương pháp tách phần protein enzyme 28 2.2.4 Kết tinh protein enzyme 38 2.2.5 Đánh giá tính đồng thể protein enzyme 39 Hoạt độ enzyme 41 2.3.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme 41 2.3.2 Đơn vị hoạt độ enzyme 41 2.3 Tài liệu tham khảo 43 Chương Cách gọi tên phân loại enzyme 44 3.1 Cách gọi tên enzyme 44 3.2 Phân loại enzyme 44 3.2.1 Các lớp enzyme 44 3.2.2 Các phản ứng enzyme 46 Tài liệu tham khảo 51 Chương Cấu trúc phân tử enzyme 52 4.1 Bản chất hóa học enzyme 52 4.2 Thành phần cấu tạo enzyme 53 4.3 Cấu trúc bậc enzyme 54 4.4 Trung tâm hoạt động enzyme 56 4.5 Phương pháp thăm dò phát nhóm chức trung tâm hoạt động enzyme 57 4.5.1 Phương pháp dùng chất ức chế 58 4.5.2 Phương pháp đánh dấu chất đặc hiệu coenzyme 59 4.5.3 Xác định trị số pK nhóm hoạt động 60 4.5.4 Nghiên cứu cấu trúc phân tử 60 4.6 Các dạng phân tử enzyme 61 4.7 Phức hợp multienzyme 62 Tài liệu tham khảo 63 Chương Tính đặc hiệu enzyme 64 5.1 Khái niệm chung 64 5.2 Các hình thức đặc hiệu 64 5.2.1 Đặc hiệu kiểu phản ứng 64 5.2.2 Đặc hiệu chất 64 Tài liệu tham khảo 68 Chương Cơ chế tác dụng enzyme 69 6.1 Cơ chế phản ứng có xúc tác nói chung 69 6.2 Cơ chế xúc tác enzyme 69 Tài liệu tham khảo 73 Chương Động học Enzyme 74 7.1 Ý nghĩa việc nghiên cứu động học enzyme 74 7.2 Động học phản ứng enzyme 74 74 7.2.2 Ảnh hưởng nồng độ enzyme Ảnh hưởng nồng độ chất [S] 7.2.3 Ảnh hưởng chất kìm hãm (inhibitior) 79 7.2.4 Ảnh hưởng chất hoạt hóa (activator) 7.2.5 7.2.6 Ảnh hưởng nhiệt độ Ảnh hưởng pH 88 7.2.7 Các yếu tố khác 89 Tài liệu tham khảo 91 Chương Sinh học enzyme 92 8.1 Sự phân bố enzyme tế bào 92 8.2 Điều hòa hoạt độ số lượng enzyme tế bào 94 8.2.1 Điều hòa hoạt độ enzyme 94 8.2.2 Điều hòa sinh tổng hợp enzyme 101 Tài liệu tham khảo 108 Chương Công nghệ enzyme ứng dụng 109 9.1 Công nghệ enzyme 109 9.1.1 Enzyme với công nghệ sinh học 109 9.1.2 Công nghệ sản xuất enzyme 109 Ứng dụng 111 9.2.1 Ứng dụng y dược 111 9.2.2 Ứng dụng hóa học 112 9.2.3 Ứng dụng cơng nghiệp 113 Tài liệu tham khảo 116 7.2.1 9.2 75 87 Chương Mở đầu 1.1 Định nghĩa enzyme Trong thể sống (các tế bào) luôn xảy trình trao đổi chất Sự trao đổi chất ngừng sống khơng cịn tồn Q trình trao đổi chất tập hợp quy luật nhiều phản ứng hóa học khác Các phản ứng hóa học phức tạp có liên quan chặt chẽ với điều chỉnh lẫn Enzyme hợp chất protein xúc tác cho phản ứng hóa học Chúng có khả xúc tác đặc hiệu phản ứng hóa học định đảm bảo cho phản ứng xảy theo chiều hướng định với tốc độ nhịp nhàng thể sống Chúng có hầu hết loại tế bào thể sống Chính tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme gọi chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm để phân biệt với chất xúc tác hóa học Enzyme học khoa học nghiên cứu chất xúc tác sinh học có chất protein Hay nói cách khác, enzyme học khoa học nghiên cứu tính chất chung, điều kiện, chế tác dụng tính đặc hiệu enzyme 1.2 Lược sử nghiên cứu enzyme Do enzyme học coi cột sống hóa sinh học nên phần lớn nghiên cứu hóa sinh từ trước đến liên quan nhiều đến enzyme Về phát triển học thuyết enzyme, chia thành giai đoạn: - Giai đoạn 1: trước kỷ thứ XVII - Giai đoạn 2: từ kỷ XVII đến nửa đầu kỷ XIX - Giai đoạn 3: từ kỷ XIX đến 30 năm đầu kỷ XX - Giai đoạn 4: từ năm 30 kỷ XX đến 1.2.1 Giai đoạn Trước kỷ XVII người ta biết sử dụng trình enzyme đời sống song có tính chất kinh nghiệm thực tế thông qua hoạt động vi sinh vật Đó q trình lên men rượu, muối dưa, làm tương nước chấm Ở thời kỳ người ta chưa hiểu chất enzyme trình lên men 1.2.2 Giai đoạn Ở giai đoạn nhà bác học tiến hành tìm hiểu chất trình lên men Thời kỳ khái quát tượng lên men tượng phổ biến sống enzyme yếu tố gây nên chuyển hóa chất q trình lên men Vào năm 1600 kỷ XVII, Van Helmont người cố gắng sâu tìm hiểu chất trình lên men Van Helmont nhận thấy thực chất tiêu hóa chuyển hóa hóa học thức ăn giải thích chế với so sánh với trình lên men rượu Danh từ ferment (từ chữ Latinh fermentatio - lên men) Van Helmont dùng để tác nhân gây chuyển biến chất trình lên men rượu Vào nửa cuối kỷ thứ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp Réaumur nghiên cứu chất tiêu hóa Nhà tự nhiên học cho chim quạ đen nuốt miếng thịt đặt sẵn ống kim loại có thành đục sẵn buộc vào dây thép Sau vài khơng thấy ống Hiện tượng thúc đẩy nghiên cứu thành phần dịch tiêu hóa để tìm hiểu khả tiêu hóa dịch dày Sau thí nghiệm thời gian, vào năm 1783, nhà bác học người Ý Spalanzani lặp lại thí nghiệm cách lấy dịch dày trộn với thịt thấy có tượng hịa tan xảy Vào đầu kỷ XIX, nhà nghiên cứu tách chất gây trình lên men Năm 1814 Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg phát nước chiết mầm đại mạch có khả chuyển hóa tinh bột thành đường nhiệt độ thường Đây công trình thu chế phẩm amylase dạng dung dịch lịch sử enzyme học thực xem Mười chín năm sau (năm 1833), hai nhà khoa học người Pháp Payen Pessoz chứng minh chất có hoạt động phân giải tinh bột thành đường tách dạng bột Thí nghiệm tiến hành cách cho etanol vào dịch chiết lúa đại mạch nảy mầm thấy xuất kết tủa Kết tủa hình thành có khả chuyển hóa tinh bột đun kết tủa tác dụng chuyển hóa Danh từ diastase (từ chữ Latinh diastasis - phân cắt) Payen Persoz dùng để gọi enzyme amylase lúc Tiếp người ta tìm tách nhiều enzyme khác enzyme phân giải protein dịch tiêu hóa dày Pepsin (Emberle Shwan) - nhà khoa học người Đức, năm 1836) Sau đó, lý thuyết xúc tác đời Năm 1835, nhà khoa học Berzelius có quan điểm cho tăng tốc độ phản ứng tượng xúc tác Đây quan điểm Song thật đáng tiếc nhà khoa học coi chất xúc tác hoạt động " lực sống" không theo điều khiển người Đây quan điểm tâm, siêu hình làm trì trệ phát triển khoa học ảnh hưởng sâu sắc đến sưh phát triển ngành enzyme học 1.2.3 Giai đoạn Giai đoạn từ kỷ XIX đến 30 năm đầu kỷ XX Ở giai đoạn số lượng lớn enzyme dạng hòa tan tách chiết Trong thời kỳ này, có hai trường phái đấu tranh với nhau: trường phái Pasteur - nhà bác học vĩ đại người Pháp trường phái Liebig - nhà bác học tiếng người Đức * Trường phái Pasteur: Năm 1856 Pasteur đề cập đến chất trình lên men Ông cho tách enzyme khỏi tế bào Tác dụng tính chất enzyme gắn liền với sống tế bào trình lên men rượu kết hoạt động sống tế bào nấm men kết tác dụng enzyme Ơng tiến hành thí nghiệm nhận thấy dung dịch hữu cơ, ví dụ dung dịch glucose để bình khử trùng khơng xảy q trình lên men rượu Chính suy nghĩ ấy, Pasteur chia enzyme thành loại: "enzyme có tổ chức" "enzyme khơng có tổ chức" Theo ơng, "enzyme có tổ chức" enzyme tách khỏi tế bào, tách chúng bị tác dụng xúc tác enzyme tế bào nấm men thực trình lên men rượu; cịn "enzyme khơng có tổ chức" enzyme thực tính xúc tác ngồi thể enzyme có dịch tiêu hóa (ví dụ Pepsin dày, amylase tuyến nước bọt, mầm thóc ) Quan điểm sai lầm Pasteur thống trị ngành enzyme học thời gian dài Năm 1878 Kuhne đề nghị dùng danh từ "ferment" (từ tiếng Latinh: fermentatio = lên men) để gọi "enzyme cớ 10 tổ chức" gọi chất chiết có tác dụng xúc tác cho phản ứng hóa học enzyme (từ chữ Hy Lạp: en = bên trong, zyme = men rượu, tức "ở nấm men" để gọi enzyme "khơng có tổ chức" Danh từ enzyme xuất phát từ * Trường phái Liebig: Chống lại quan điểm Pasteur, Liebig (trước có Berzelius) cho khơng có hoạt động tế bào vi sinh vật có q trình lên men Điều có nghĩa ông coi enzyme chất hóa học gây nên hiệu tương tự chất xúc tác, tác dụng ngồi tế bào, khơng phụ thuộc vào hoạt động sống cúa vi sinh vật Nhưng năm 1871 Liebig thất bại thực nghiệm khơng chứng minh quan điểm Các thí nghiệm tiến hành cách lấy dịch chiết từ tế bào nấm men nghiền nát tác dụng gây lên men rượu Cũng vào năm1871 Manatxein bác sĩ người Nga dùng cát thạch anh nghiền tế bào nấm men thu dịch chiết khơng chứa tế bào có khả biến đổi đường thành rượu Nhưng quan sát khơng ý tới Chính vậy, quan điểm siêu hình Pasteur hạn chế nhiều phát triển ngành enzyme học Đến năm 1897, H Büchner - nhà khoa học người Đức nhận dịch chiết nấm men cách phân huỷ tế bào hồn thiện Trong thí nghiệm này, tế bào nấm men nghiền nát hoàn toàn với bột thủy tinh, sau ép áp suất cao Dịch chiết thu không chứa tế bào có khả gây q trình lên men (chuyển hóa glucose thành rượu) Điều chứng tỏ q trình lên men rượu khơng phải kết hoạt động sống tế bào nấm men mà kết tác dụng enzyme vốn có tế bào Do đó, quan điểm sai lầm enzỵme "có tổ chức" enzyme "khơng có tổ chức" mà thực chất chất enzyme đến lúc hoàn toàn bị đánh đổ, mở thời kỳ phát triển ngành enzyme học Cũng từ khơng có phân biệt nội dung thuật ngữ "ferment" "enzyme" Có thể nói rằng, cơng trình Büchner đánh dấu bước ngoặt quan trọng lịch sử phát triển enzyme học Sau đó, nhiều loại enzyme thể sống tìm Vì việc phân loại gọi tên enzyme cách thống cần thiết Năm 1883, Duyclo, nhà bác học Pháp đề nguyên tắc phân loại enzyme theo chất (substrate) chúng biến đổi thêm đuôi tận "ase" vào Ví dụ enzyme phân giải tinh bột (amilun) amylase Tuy vậy, thực tế tồn nhiều ngoại lệ thuật ngữ, ví dụ tên gọi enzyme pepsin, trypsin, catalase trước dùng 102 phân giải (dị hóa) thường enzyme cảm ứng Sự cảm ứng thấy mơi trường khơng chứa nguồn carbon dễ đồng hóa hơn: cảm ứng bắt đầu, ta ngăn cản tượng cách cho thêm glucose vào môi trường, người ta gọi hiệu ứng glucose Như vậy, cảm ứng enzyme chế dự bị để bảo đảm cho chuyển hóa tế bào thực cách bình thường có thay đổi không thuận lợi thành phần môi trường Sự cảm ứng có tính đa hướng tính hợp đồng, đặc điểm thể chỗ: chất cảm ứng lúc gây tổng hợp cảm ứng vài enzyme Chẳng hạn chất cảm ứng β-galactosidlactose chất tương tự nó) ngồi khả gây tổng hợp cảm ứng enzyme β-galactosidase đồng thời gây tổng hợp cảm ứng hai chất xúc tác galactosidpermease (có tác dụng chuyển chất qua màng tế bào) galactosidtransferase; ba loại protein-enzyme tổng hợp cảm ứng song song, với tỷ lệ không thay đổi Nói cách khác, tổng hợp cảm ứng ba protein-enzyme thực có tính chất hợp đồng số lượng Ngoài tượng cảm ứng vừa nói trên, người ta cịn phát tượng kìm hãm tổng hợp enzyme thêm chất chuyển hóa định vào mơi trường ni cấy vi khuẩn Khi cho thêm vào môi trường nồng độ valine tương đối cao, làm ngừng tổng hợp enzyme tham gia vào trình sinh tổng hợp amino acid Nồng độ enzyme có giảm chúng bị pha lỗng bị thối hóa dần quần thể tế bào mọc Nếu thêm amino acid khác methionine, tryptophan, arginine số bazơ nitơ uracyl, cytosin, adenin, guanin gây kìm hãm chọn lọc Như enzyme làm chức tổng hợp (đồng hóa) thường bị kìm hãm, có số trường hợp enzyme phân giải (dị hóa), ví dụ phosphatase kiềm bị kìm hãm Hiện tượng kìm hãm có tính chất đa hướng, cho thêm vào mơi trường chất chuyển hóa gây kìm hãm, tổng hợp tất enzyme hệ thống tổng hợp tương ứng bị ngừng lại đồng thời mức độ kìm hãm tổng hợp tất enzyme sinh tổng hợp nó, Nacetylglutamatreductase: histidine kìm hãm tất enzyme tổng hợp từ phosphoribosyl-ATP-pyrophosphorylase: uracil cytosine kìm hãm tất hệ thống enzyme tổng hợp chúng aspartat carbamyl transferase Do ta thấy rằng, giới hạn đơn vị điều hòa di truyền thường trùng với giới hạn hệ thống enzyme Điều xác nhận lại lần quan niệm cho hệ thống enzyme đơn vị chức sư chuyển hóa 103 Hiện tượng kìm hãm xảy với nồng độ cao chất kìm hãm, nồng độ giảm xuống tổng hợp enzyme tương ứng lại phục hồi, giải kìm hãm Ta nói rằng, số lượng enzyme hệ thống kiểm tra cách thuận nghịch nồng độ sản phẩm cuối chúng, đồng thời đặc điểm điều chỉnh liên hệ ngược âm tính Sự tăng nồng độ sản phẩm kìm hãm tổng hợp enzyme Nhờ có chế này, tế bào tránh tiêu phí nguyên liệu tạo lượng tạo hình dùng cho tổng hợp enzyme, mà sản phẩm tương ứng có đủ mơi trường Hiện tượng giải kìm hãm, giống tượng cảm ứng Mặc dù bề đối lập nhau, tượng kìm hãm tượng cảm ứng có liên quan sâu sắc với Ảnh hưởng đối kháng ornithine arginine tổng hợp ornithincarbamyltransferase thuộc hệ thống arginine chứng minh rõ ràng tính đồng Sản phẩm cuối hệ thống arginine có tác dụng kìm hãm tổng hợp enzyme này, cịn chất enzyme ornithine cạnh tranh với arginine, làm giảm tác dụng arginine, tạo tượng giải kìm hãm tượng tổng hợp cảm ứng enzyme Kết số lượng enzyme tế bào định tương quan nồng độ nội bào chất sản phẩm hệ thống Trên sở hiểu biết đại chế tổng hợp protein với kết nghiên cứu tượng cảm ứng kìm hãm tổng hợp enzyme, người ta xây dựng hệ thống quan niệm chế điều hòa tổng hợp enzyme Sự tổng hợp enzyme, ta biết, thực hạt ribosome, cấu trúc đặc hiệu phân tử enzyme mã hiệu di truyền RNA thông tin (m-RNA) định Các mã hiệu di truyền m.RNA chép từ phần DNA nhiễm sắc thể tương ứng (những gen cấu trúc hay cistron) Sự truyền đạt thông tin cấu trúc từ DNA đến RNA thực nhờ vai trò DNA-RNA polymerase chịu kiểm tra "gen điều hòa" (regulator,R) Sản phẩm gen gọi chất kìm hãm, (repressor, R’), có khả khóa truyền đạt thơng tin cấu trúc từ DNA đến m.RNA Trong điều hịa tổng hợp hệ thống enzyme tồn vẹn nhóm gen cấu trúc chi phối, chất kìm hãm khơng phản ứng với gen cấu trúc nói mà phản ứng với phận có vai trị định việc truyền đạt thơng tin gọi "gen tác động (operator, O) Gen thường nằm chỗ bắt đầu nhóm "gen cấu trúc" (Structural gene, cistron,S) với "gen cấu trúc", "gen điều hòa" "khởi động” (promotor, P) tạo thành đơn vị điều hòa độc lập gọi operon Người ta cho rằng, gen tác động điểm mở đầu cho "việc đọc" thơng tin cấu trúc 104 tồn operon: chất kìm hãm kết hợp vào gen có tác dụng khóa truyền đạt thông tin operon ức chế tổng hợp toàn bộ hệ thống enzyme tương ứng Tác dụng qua lại chất kìm hãm với gen tác động tùy thuộc vào nồng độ nội bào chất chuyển hóa có liên quan Trong hệ thống enzyme cảm ứng, khơng có chất, chất kìm hãm trở thành hoạt động có tác dụng khóa gen tác động, ức chế tổng hợp enzyme, có mặt chất chất có tác dụng làm hoạt tính chất kìm hãm, làm cho khơng cịn tác dụng khóa gen tác động tổng hợp enzyme thực tức thời mạnh mẽ Người ta gọi tổng hợp cảm ứng enzyme, tượng coi hình thức đặc biệt giải kìm hãm (Hình 8.4) a Khơng có chất cảm ứng R P O S1 S2 S3 DNA o S1 S2 S3 DNA AP mRNA repressor, R' b Có chất cảm ứng R P AP mRNA mRNA A repressor, R' E1 E2 B E3 C D Cháút cm ỉïng Hình 8.4 Cơ chế điều hòa cảm ứng sinh tổng hợp enzyme 105 Ghi chú: A, B, C, D chất sản phẩm chuỗi phản ứng enzyme E1, E2, E3 xúc tác; AP: RNA polymerase Các ký hiệu khác giải thích Trong hệ thống enzyme bị kìm hãm chất kìm hãm (sản phẩm gen hịa) có khả khóa gen tác động sản phẩm cuối hệ thống phản ứng enzyme tăng lên đến mức thừa, trường hợp sản phẩm cuối có vai trị chất đồng kìm hãm (corepressor) (hình 8.5) a Khơng có chất đồng kìm hãm (corepressor) R P S1 o S2 S3 DNA AP mRNA mRNA E1 E2 B A E3 C D repressor, R' Chất đồng kìm hãm b Có chất đồng kìm hãm (corepressor) R mRNA repressor, R' P o S1 S2 S3 DNA AP Chất đồng kìm hãm Hình 8.5: Cơ chế kìm hãm sinh tổng hợp enzyme sản phẩm cuối (ghi hình 8.4) 106 Khi nồng độ sản phẩm giảm xuống thấp, chất kìm hãm trở nên hoạt tính tách khỏi gen tác động, làm cho truyền đạt thơng tin cấu trúc trở lại hoạt động bình thường, tổng hợp enzyme giải kìm hãm Người ta gọi điều hòa sinh tổng hợp enzyme theo kiểu cảm ứng kìm hãm thuộc loại điều hịa âm tính Nhiều dẫn liệu thực nghiệm cho thấy gen bảo đảm sinh tổng hợp số enzyme cảm ứng xúc tác cho trình phân giải không chịu kiểm tra theo chế cảm ứng mà chịu kiểm tra theo chế khác nhờ tác dụng AMP vòng (AMPv, cycle-AMP, c-AMP), gọi kìm "hãm phân giải" (catabolic repression) AMPv có tác dụng kích thích q trình chép mã operon phân giải Hiện tượng nghiên cứu nhiều operon lactose Theo nhiều tác giả, tác dụng kích thích AMPv trình chép mã thực nhờ protein đặc biệt làm trung gian gọi protein nhận AMPv hay cịn gọi protein hoạt hóa gen phân giải (catabolite gene activator protein CAP) Khi AMPv kết hợp với CAP tạo thành phức hợp có tác dụng hoạt hóa promotor làm cho RNA-polymerase dễ dàng kết hợp với để bắt đầu trình chép mã, AMPv có tác dụng làm tăng cường q trình chép Kiểu điều hòa operon phân giải theo chế gọi kiểu điều hịa dương tính Như vậy, operon lactose chịu điều hòa di truyền kép: điều hịa âm tính thực nhờ chất cảm ứng thơng qua repressor (tính chất âm thể chỗ điều hịa xảy khơng có chất cảm ứng, repressor kết hợp với operator ngăn cản trình chép); điều hịa dương tính thực đường điều hòa xác định tổng hợp CAP cần thiết để đảm bảo trình chép Trong điều hịa âm tính, chất ức chế kiên kết với phân tử DNA phải bị loại trước phiên mã xảy Trong điều hịa dương tính, phân tử chất tác động phải liên kết với DNA Một hệ thống điều hịa hai cách dương tính âm tính, trường hợp đó, hệ thống "mở" chất điều hịa dương tính gắn với DNA chất điều hịa âm tính khơng liên kết với DNA Trong hệ thống điều hịa âm tính, chất ức chế có mặt tế bào cản trở phiên mã Một chất đối lập với chất ức chế phiên mã gọi chất cảm ứng cho phép mở đầu phiên mã Trong hệ thống điều hòa dương tính, phân tử chất tác động (có thể protein, phân tử nhỏ hay phức hợp phân tử) hoạt hóa điểm mở đầu Sự điều hịa dương tính 107 âm tính khong loại trừ lẫn nhau, hệ thống, chế điều hịa dương tính âm tính sử dụng; hai loại chất điều hòa đáp ứng điều kiện khác có tế bào Sự điều hịa dương tính âm tính áp dụng cho hệ thống phân giải cho chu trình tổng hợp Trên chế điều chỉnh tế bào vi khuẩn: thể bậc cao, chế có điểm khác có phần phức tạp Một số cơng trình thực nghiệm rõ rằng, tế bào thể bậc cao, protein kết hợp với DNA nhiễm sắc thể có vai trị điều chỉnh Trên thực tế phịng thí nghiệm người ta thấy histon đóng vai trị chất ức chế việc chép thơng tin di truyền Có thể loại trừ ức chế cách phosphoryl hóa histon tác dụng hai loại protein-kinase, loại điều chỉnh loại khơng điều chỉnh AMP vịng Người ta kể đến vai trò protein acid chromatin, chất hoạt hóa chép Các hormon steroid có vai trị điều hịa hệ gen, ví dụ cortison làm tăng cường tổng hợp số enzyme cách tăng tổng hợp mRNA tương ứng Sự điều chỉnh xảy trình dịch mã Sự điều chỉnh tác động đến biến đổi mRNA (như cộng thêm poly A, loại bỏ mảnh không mang mã di truyền) đến kết hợp mRNA ribosom giai đoạn khác dịch mã di truyền từ mRNA sang phân tử enzyme Cớ chế phân tử tác dụng điều hòa kể ngày bổ sung chi tiết Ta rút kết luận là: tế bào có chế điều chỉnh phức tạp có hiệu quả, đảm bảo cho liên hệ thông tin chặt chẽ máy di truyền tế bào q trình chuyển hóa vật chất tế bào Nhờ chế mà nồng độ nội bào phân tử nhỏ kiểm tra tổng hợp phân tử enzyme Nói cách khác, phân tử nhỏ (cơ chất chất chuyển hóa) điều khiển số lượng chất lượng hệ thống enzyme tế bào điều khiển đặc tính biến đổi chuyển hóa riêng chúng 108 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Hữu Chấn, 1983 Enzyme xúc tác Sinh học Nxb Y học, Hà Nội Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng, 2000 Hóa sinh học Nxb Giáo dục, Hà Nội Đỗ Ngọc Liên, Phạm Thị Trân Châu, 1972 Enzyme I, II Đại học Tổng hợp, Hà Nội Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên, 1998 Giáo trình sinh hóa đại Nxb Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Xuân Thắng, Đào Kim Chi, Phạm Quang Tùng, Nguyễn Văn Đồng, 2004 Hóa sinh học Nxb Y học, Hà Nội Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng, 1982 Enzyme vi sinh vật Nxb KH&KT, Hà Nội Lê Ngọc Tú (chủ biên), Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẫn, Lê Doãn Diên, 2000 Hóa sinh Cơng nghiệp, Nxb KH&KT, Hà Nội Tài liệu tiếng nước Bermeyer H U, Bermeyer J and Grasel M (editors) 1983 Methods of enzymatic analysis Vol II Verlag chemie Weinheim Lehringer A L., 2004 Principle of Biochemistry, 4th Edition W.H Freeman, 2004 Pelmont J., 1993 Enzymes Presses universitaires de grenobe Stryer L., 1981 Biochemistry W.H.Freeman and company San Francisco Biochemical information, 1973 Boehringer Mannheim GmbH Biochemica 109 Chương Công nghệ enzyme ứng dụng 9.1 Công nghệ enzyme 9.1.1 Enzyme với công nghệ sinh học Enzyme xem kỹ thuật quan trọng công nghệ sinh học có chức sau: - Enzyme chất xúc tác cho biến đổi vật chất công nghệ sinh học - Enzyme nhiều hoạt chất sinh học khác sản phẩm công nghệ sinh học Chúng dùng làm cơng cụ công nghệ sinh học, hay sử dụng lãnh vực khác - Enzyme xem thuốc thử có tính chun hóa cao mà khơng có enzyme q trình cơng nghệ sinh học khơng thể tối ưu hóa 9.1.2 Cơng nghệ sản xuất enzyme Trong sản xuất chế phẩm enzyme, cần ý đến yếu tố: 9.1.2.1 Nguồn enzyme Có thể thu nhận enzyme từ động vật trypsin, chimotrypsin, từ thực vật papain đu đủ, amylase đại mạch Nhưng enzyme vi sinh vật nguồn phổ biến giá thành có ý nghĩa kinh tế 9.1.2.2 Cách thu nhận + Chọn đối tượng: Phải dựa vào đặc rưng sinh học đối tượng.Đối với vi sinh vật cần ý đến khâu chọn giống , vấn đề di truyền giống , khả nâng sinh trưởng phát triễn giống , đặc tính sinh lí hóa sinh giống + Các phương pháp nuôi cấy: - Môi trường nuôi cấy: Tùy chủng để chọn mơi trường thích hợp, thành phần dinh dưởng phải phù hợp với sinh trưởng phát triễn, đặc biệt yếu tố cần thiết cho trình sinh tổng hợp protein Cần nắm vững chế điều hịa để có thay đổi thích nghi 110 - Phương pháp nuôi cấy bề mặt; nuôi cấy giá thể rắn với hàm lượng nước thấp khoảng 15-20% Ngoài thành phần dinh dưởng protein, tinh bột, khống …có thể trộn chất làm xốp để thống khí Tùy chủng để khống chế nhiệt độ , pH môi trường , độ ẩm, thời gian nuôi cấy…cho đạt hiệu sinh tổng hợp enzyme cao - Phương pháp ni cấy chìm: ni cấy môi trường dịch thể, hàm lượng chất khô tối đa từ 25-30%, thường từ 10-15% Ngồi protein, tinh bột, khống…cịn bổ sung kích thích tố Cũng trên, tùy chủng để khống chế nhiệt độ , pH môi trường, độ ẩm, thời gian nuôi cấy… cho đạt hiệu sinh tổng hợp enzyme cao Với hai phương pháp trên, loại có ưu khuyết điểm riêng Ni cấy bề mặt thường cho hiệu suất cao, dễ gở bỏ phần bị nhiễm , nhược điểm tốn mặt nhiều, khó tự động hóa Phương pháp ni cấy chìm dễ tự động hóa, phải loại bỏ hồn tịan bị nhiễm + Thu nhận chế phẩm enzyme: Đối với canh trường bề mặt hay đối tượng thực vật, đồng hóa cần, sau dùng dung dịch đệm hay nước cất để chiết rút enzyme khỏi canh trường bề mặt ta có dịch chiết enzyme Đối với canh trường bề sâu cần lọc bỏ sinh khối có dịch chiết tương tự Sau dùng tác nhân kết tủa thuận nghịch aceton, ethanol, muối trung tính để có chế phẩm enzyme dạng Từ chế phẩm này, kỹ thuật điện di, lọc gel… ta tách phần để có enzyme tinh khiết hơn.Tùy mục đích sử dụng để ta tạo chế phẩm thích hợp Để nâng cao giá trị sử dụng, người ta thường tạo chế phẩm enzyme gọi enzyme không tan Enzyme không tan Hầu hết enzyme thể dạng liên kết với màng chất qua màng để enzyme chuyển hóa thành sản phẩm Trong cơng nghiệp thường sử dung enzyme dạng hịa tan, thường sử dụng lần lí để người ta tạo enzyme khơng tan Để tạo enzyme khơng tan có nhiều phương pháp khác phương pháp hấp phụ vật lí, phương pháp đưa enzyme vào khn gel, phương pháp cộng hóa trị enzyme chất mang 111 Phương pháp hấp phụ vật lí: phương pháp hấp phụ lên bề mặt chất mang Chất mang cám, than hoạt tính, bột thủy tinh…Nhược điểm phương pháp enzyme dễ hòa tan trở lại, độ liên kết lỏng lẻo, chịu tác động lực ion lớn dễ bị nhả Phương pháp đưa enzyme vào khuôn gel: enzyme dễ định vị gel, mạng lưới chất trùng hợp nhỏ enzyme giữ chặt Đây cách dùng phổ biến Phương pháp cộng hóa trị enzyme chất mang: dựa vào lực enzyme chất mang để tạo phức enzyme - chất mang liên kết cộng hóa trị Đây phương pháp dùng phổ biến 9.2 Ứng dụng Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme loại phát triễn mạnh mẽ qui mô cơng nghiệp Thực tế có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán thị trường giới, chế phẩm khai thác tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp ứng dụng Các chế phẩm enzyme phổ biến amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucoseoxydase… Chế phẩm enzyme không ứng dụng y học mà ứng dụng nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau, nông nghiệp, hóa học… "ý nghĩa việc sử dụng enzyme lãnh vực thực tế không so với ý nghĩa việc sử dụng lượng nguyên tử" 9.2.1 Ứng dụng y dược Enzyme có vị trí quan trọng y học Đặc biệt phương pháp định lượng định tính enzyme hóa học lâm sàng phịng thí nghiệm chẩn đốn Do đó, y học xuất lãnh vực gọi chẩn đốn enzyme, có nhiệm vụ: - Phân tích xác định nồng độ chất glucose, ure, cholesterol… với hổ trợ enzyme - Xác định hoạt tính xúc tác enzyme mẫu sinh vật - Xác định nồng độ chất với hổ trợ thuốc thử enzyme đánh dấu Dùng enzyme để định lượng chất, phục vụ cơng việc xét nghiệm chẩn đốn bệnh, ví dụ dùng để kiểm tra glucose nước tiểu nhạy 112 Urease để định lượng ure… Dùng enzyme làm thuốc ví dụ protease làm thuốc tắc nghẽn tim mạch, tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm, làm thuốc tăng tiêu hóa protein, thành phần loại thuốc dùng da liễu mỹ phẩm… Trong y học protease dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi sinh vật sản xuất kháng sinh, chất kháng độc… Ngoài người ta cịn dùng enzyme protease để đặc tinh chế huyết kháng độc để chửa bệnh Amylase sử dụng phối hợp với coenzyme A, cytocrom C, ATP, carboxylase để chế thuốc điều trị bệnh tim mạch, bệnh thần kinh, phối hợp với enzyme thủy phân để chữa bệnh thiếu enzyme tiêu hóa 9.2.2 Ứng dụng hóa học Cho đến nay, việc ứng dụng enzyme hóa học enzyme có cảm ứng cao nhiệt độ, pH thay đổi khác môi trường Một ứng dụng chế phẩm enzyme đáng ý thời gian gần dùng chất mang để gắn phức enzyme xúc tác cho phản ứng nhiều bước Ví dụ tổng hợp glutathion, acid béo, alcaloid, sản xuất hormone…Cũng cách tạo phức, người ta gắn vi sinh vật để sử dụng công nghệ xử lý nước thải, sản xuất alcohol, amino acid… Trong nghiên cứu cấu trúc hóa học, người ta sử dụng enzyme, ví dụ dùng protease để nghiên cứu cấu trúc protein, dùng endonuclease để nghiên cứu cấu trúc nucleic acid … Dùng làm thuốc thử hóa phân tích 9.2.3 Ứng dụng cơng nghiệp Việc sử dụng enzyme công nghiệp đa dạng, phong phú đạt nhiều kết to lớn Thử nhìn thống kê sơ sau lãnh vực dùng protease ta thấy đa dạng: công nghiệp thịt, công nghiệp chế biến cá,công nghiệp chế biến sữa, cơng nghiệp bánh mì, bánh kẹo, công nghiệp bia, công nghiệp sản xuất sữa khô bột trứng, công nghiệp hương phẩm mỹ phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp da, công nghiệp phim ảnh, công nghiệp y học…Với amylase, dùng sản xuất bánh mì, cơng nghiệp bánh kẹo, cơng nghiệp rượu, sản xuất bia, sản xuất mật,glucose, sản xuất sản phẩm rau, chế biến thức ăn cho 113 trẻ con, sản xuất mặt hàng từ quả, sản xuất nước ngọt, cơng nghiệp dệt, cơng nghiệp giấy…Trong phạm vi giáo trình đề cập đến việc ứng dụng chế phẩm enzyme số lãnh vực 9.2.3.1 Ứng dụng công nghiệp thực phẩm Protease với công nghiệp thực phẩm: Việc sử dụng chế biến làm mềm thịt ứng dụng có tính truyền thống Nhân dân ta từ lâu dùng thơm để nấu canh thịt bò; dùng rau sống chuối chát, vả kết hợp thức ăn nhiều thịt; đu đủ chống táo bón…mà thực chất sử dụng papain, bromelain, fixin Người Nga dùng protease từ hạt đậu tương mầm để làm mềm thịt Ngoài khả phân giải để làm mềm thịt, tạo thức ăn dễ tiêu hóa, cơng nghệ sản xuất loại dịch thủy phân giàu protein áp dụng cách có hiệu tính protease Enzyme công cụ để chế biến phế liệu công nghiệp thực phẩm thành thức ăn cho người vật ni Người ta cịn khai thác tính đơng tụ renin, pepsin vào công nghiệp thực phẩm sản xuất phomat Pectinase với công nghiệp thực phẩm: Pectinase dùng số ngành công nghiệp thực phẩm sau: - Sản xuất rượu vang - Sản xuất nước nước uống khơng có rượu - Sản xuất mặt hàng từ quả: cô đặc, mứt - Sản xuất nước giải khát - Sản xuất cà phê Chế phẩm pectinase sử dụng sản xuất nước từ nguyên liệu nghiền hay để làm nước ép Bởi có pectin khối nghiền có trạng thái keo, ép dịch khơng thóat Nhờ pectinase mà nước suốt, dễ lọc, hiệu suất tăng Pectinase cịn góp phần chiết rút chất màu, tanin chất hịa tan khác, làm tăng chất lượng thành phẩm Những nghiên cứu ép nho có xử lý pectinase làm tăng hiệu suất mà làm tăng màu sắc 114 Trong sản xuất mứt nhừ, mứt đơng… nhờ pectinase mà dịch có nồng độ đậm đặc Cellulase với công nghiệp thực phẩm: Cellulose thành phần tế bào thực vật, có mặt loại rau nguyên liệu,phế liệu ngành trồng trọt lâm nghiệp Nhưng người động vật khơng có khả phân giải cellulose Nó có giá trị làm tăng tiêu hóa, với lượng lớn trở nên vơ ích hay cản trở tiêu hóa Chế phẩm cellulase thường dùng để: - Tăng chất lượng thực phẩm thức ăn gia súc - Tăng hiệu suất trích ly chất từ nguyên liệu thực vật Ứng dụng trước tiên cellulase chế biến thực phẩm dùng để tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất vị làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật Đặc biệt thức ăn cho trẻ nói chung chất lượng thực phẩm tăng lên Một số nước dùng cellulase để xử lý loại rau bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo lương thực gạo Người ta xử lý chè, loại tảo biển… Trong sản xuất bia, tác dụng cellulase hay phức hệ citase có cellulase, thành tế bào hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động protease đường hóa Trong sản xuất agar-agar, tác dụng chế phẩm cellulase làm tăng chất lượng agar-agar so với phương pháp dùng acid để phá thành tế bào Đặt biệt việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu phế liệu thực vật đem thủy phân, dùng làm thức ăn gia súc công nghệ lên men Những ứng dụng cellulase cơng nghiệp thực phẩm có kết tốt Tuy nhiên hạn chế lớn khó thu chế phẩm có cellulase hoạt độ cao Amylase với công nghiệp thực phẩm: Chế phẩm amylase dùng phổ biến số lãnh vực công nghiệp thực phẩm sản xuất bánh mì, glucose, rượu , bia Trong sản xuất bánh mì, chế phẩm amylase làm thay đổi hồn tịan chất lượng bánh mì hương vị, màu sắc, độ xốp Chế phẩm amylase cho chất lượng bánh mì tốt dạng phức hợp với protease 115 Trong sản xuất bánh kẹo người ta thường dùng maltose sản phẩm thủy phân tinh bột amylase glucose glucoamylase Chính glucoamylase, yếu tố làm tăng hiệu suất sản xuất rượu Trong sản xuất bia, viêc sử dụng amylase có hạt nẩy mầm thay malt góp phần đáng kể việc giảm giá thành 9.2.3.2 Ứng dụng công nghiệp dệt Trong công nghiệp dệt, chế phẩm amylase dùng để rũ hồ vải trước tẩy trắng nhuộm Amylase có tác dụng làm vải mềm, có khả nhúng ướt, tẩy trắng bắt màu tôt Rũ hồ enzyme nhanh, khơng hại vải, độ mao dẫn tốt mà cịn đảm bảo vệ sinh, tăng suất lao động Trong sản xuất tơ tằm, người ta dùng protease để làm sợi tơ Với công đoạn xử lý enzyme sau xử lý dung dịch xà phịng giúp lụa có tính đàn hồi tốt, bắt màu đồng dễ trang trí lụa 9.2.3.3 Ứng dụng công nghiệp thuộc da Trong công nghiệp da, enzyme protease dùng để làm mềm da, làm da, rút ngắn thời gian, tránh ô nhiễm môi trường Việc xử lý tiến hành cách ngâm da dung dịch enzyme, hay phết dịch enzyme lên bề mặt da Enzyme tách chất nhờn làm đứt số liên kết phân tử collagen làm cho da mềm Thực tế cho thấy xử lý da chế phẩm protease từ vi sinh vật rút ngắn thời gian làm mềm tách lông xuống nhiều lần Điều quan trọng chất lượng lông tốt cắt So với phương pháp hóa học việc xử lý enzyme có số lượng lơng tăng 20-30% Lơng khơng cần xử lý thêm sau ngâm dịch enzyme 9.2.4 Ứng dụng nơng nghiệp Có thể sử dụng loại chế phẩm enzyme khác để chuyển hóa phế liệu, đặc biệt phế liệu nông nghiệp cải tạo đất phục vụ nông nghiệp Ở Nhật năm sản xuất hàng vạn chế phẩm cellulase loại để dùng nơng nghiệp Có chế phẩm chứa cellulase, hemicellulase, protease amylase Công nghệ phổ biến nhiều quốc gia Ở nước ta việc dùng enzyme vi sinh vật góp phần sản xuất phân hữu khai thác để thay cho phân hóa học 116 Tóm lại, nói rằng, việc nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme ngày trọng lĩnh vực khác Trong 20 năm cuối kỷ XX năm dầu kỷ XXI enzyme khác ứng dụng Ở Việt Nam bước đầu có nhiều nghiên cứu ứng dụng enzyme chế biến nông sản, thực phẩm, lĩnh vực sản xuất bia, rượu, chế biến tinh bột (Viện công nghiệp thực phẩm, Viện công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà Nội…) Việc nghiên cứu enzyme phục vụ nông nghiệp, công nghiệp quan tâm có kết đáng khích lệ Ví dụ, chế phẩm enzyme đời phục vụ nơng nghiệp E2001 có tác dụng tăng độ phì nhiêu đất, tăng suất trồng Đã có nghiên cứu ứng dụng protease sản xuất rượu bia, rút ngắn thời kỳ lên men sản xuất nước mắm ngắn ngày công nghệ enzyme protease Enzyme amylase nghiên cứu ứng dụng rộng rãi sản xuất đường bột, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose – fructose quy mô công nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đỗ Quý Hai 2004 Chuyên đề enzyme, Tài liệu lưu hành nội Trường ĐHKH Huế Trần Thanh Phong 2004 Chuyên đề enzyme, Tài liệu lưu hành nội Trường ĐHKH Huế Trần Thanh Phong 2005 Chun đề Cơng nghệ hóa sinh, Tài liệu lưu hành nội Trường ĐHKH Huế Nguyễn Xuân Thành (chủ biên), Lê Văn Hưng, Phạm Văn Toản 2003 Công nghệ vi sinh vật sản xuất nông nghiệp xử lý môi trường, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Lê Ngọc Tú (chủ biên), Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẫn, Lê Doãn Diên, 2000 Hóa sinh Cơng nghiệp, Nxb KH&KT, Hà Nội Tài liệu tiếng nước Copeland R A 2000 Enzymes,copyright by Wiley-VCH, Inc Lehninger A L 2004 Principles of Biochemistry, 4th Edition W.H Freeman