Luận văn thạc sĩ HUS nghiên cứu thu hồi vách tế bào giàu beta glucan từ nấm men

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN PHÚ THU THỦY NGHIÊN CỨU THU HỒI VÁCH TẾ BÀO GIÀU β-GLUCAN TỪ NẤM MEN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN PHÚ THU THỦY NGHIÊN CỨU THU HỒI VÁCH TẾ BÀO GIÀU β-GLUCAN TỪ NẤM MEN Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán hướng dẫn: TS Đào Thị Lương TS Phạm Đức Ngọc Hà Nội - 2017 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Đào Thị Lương TS Phạm Đức Ngọc, người thầy tận tình bảo, hướng dẫn tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu khoa học thực luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy, cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tận tình giảng dạy, dìu dắt tơi thời gian học tập Trường Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán nhân viên viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học Phòng vi sinh Viện Thực Phẩm Chức Năng hết lịng giúp đỡ tơi thực thành công luận văn Cuối cùng, vô biết ơn gia đình bạn bè khích lệ, động viên, giúp đỡ chỗ dựa vững cho thời gian qua Hà Nội, tháng 11 năm 2017 Học viên Nguyễn Phú Thu Thủy LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ADN Deoxyribonucleic acid β.G β-glucan EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid kDa Kilodalton PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate TE Tris-EDTA buffer LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN .2 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ β-GLUCAN 1.1.1 Lịch sử phát 1.1.2 Cấu trúc hóa học .2 1.1.3 Nguồn β-glucantrong tự nhiên 1.1.4 Hoạt tính sinh học ứng dụng β-glucan 1.1.4.1 Ứng dụng thực phẩm 1.1.4.2 Ứng dụng dược, mỹ phẩm .6 1.1.4.3 Ứng dụng nuôi trồng thủy hải sản 1.2 NẤM MEN SACCHAROMYCES VÀ NGUỐN β-GLUCAN PHÂN LẬP TỪ VÁCH TẾ BÀO NẤM MEN 1.2.1 Nấm men Saccharomyces 1.2.2 Cấu trúc vách (thành) tế bào nấm men 1.2.3 Phân lập β-glucan từ vách tế bào nấm men 10 1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁ TẾ BÀO NẤM MEN 10 1.3.1 Phương pháp học để phá vỡ tế bào nấm men 10 1.3.2 Phương pháp sóng siêu âm 10 1.3.3 Phương pháp tự phân để phá vỡ thành tế bào nấm men 11 1.3.4 Phương pháp phá tế bào enzyme 11 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 12 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 12 1.4.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 13 1.5 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 1.5.1 Mục tiêu tổng quát 14 1.5.2 Mục tiêu cụ thể 14 Chương NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 15 2.1 NGUYÊN LIỆU 15 2.1.1 Chủng giống 15 2.1.2 Hóa chất, mơi trường 15 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 16 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.2.1 Phương pháp phân lập tuyển chọn chủng nấm men 16 2.2.1.1 Phương pháp phân lập nấm men .16 2.2.1.2 Phương pháp xác định khả sinh trưởng 17 2.2.1.3 Phương pháp định lượng β-glucan 17 2.2.1.4 Phương pháp định lượng protein: Phương pháp Lowry 19 2.2.2 Phương pháp phân loại nấm men 21 2.2.2.1 Phương pháp phân loại vi sinh vật dựa vào đọc trình tự DNA 21 2.2.2.2 Phân tích trình tự xây dựng phát sinh chủng loại 23 2.2.3 Lựa chọn môi trường nuôi cấy nấm men .23 2.2.3.1 Xác định mật độ tế bào phương pháp đổ đĩa thạch 23 2.2.3.2 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thu sinh khối nấm men 24 2.2.3.3 Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy nấm men .25 2.2.4 Kích thích tăng tổng hợp β-glucan 25 2.2.4.1 Kích thích tăng tổng hợp β-glucan: Bổ sung thêm EDTA .25 2.2.4.2 Kích thích tăng tổng hợp β-glucan: Bổ sung thêm SDS 25 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.2.4.3 Kích thích tăng tổng hợp β-glucan: Bổ sung hỗn hợp EDTA SDS 26 2.2.4.4 Lựa chọn thời gian nuôi cấy thu β-glucan 27 2.2.5 Phương pháp thu hồi vách tế bào nấm men 27 2.2.5.1 Phá tế bào nấm men kiềm nhiệt 27 2.2.5.2 Phá tế bào nấm men phương pháp enzyme 27 2.2.5.3 Chiết vách tế bào nấm men giàu β-glucan 28 2.2.6 Thử nghiệm thiết bị nuôi cấy 30 lit 28 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG NẤM MEN GIÀU β-GLUCAN CÓ NGUỒN GỐC TỰ NHIÊN 30 3.1.1 Phân lập tuyển chọn nấm men 30 3.1.2 Đặc điểm hình thái 33 3.1.3 Định danh xây dựng phát sinh chủng loại 34 3.2 LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY THU SINH KHỐI NẤM MEN GIÀU β-GLUCAN 36 3.2.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy nấm men .36 3.2.2 Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy nấm men 37 3.2.3 Ảnh hưởng SDS đến hàm lượng β-glucan vách tế bào nấm men 37 3.2.4 Ảnh hưởng EDTA đến hàm lượng β-glucan vách tế bào nấm men 39 3.2.5 Bổ sung thêm hỗn hợp SDS EDTA 40 3.2.6 Lựa chọn thời gian ni cấy thích hợp thu nấm men giàu β-glucan .42 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.3 NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP THU HỒI VÁCH TẾ BÀO NẤM MEN GIÀU Β-GLUCAN 43 3.3.1 Phá tế bào nấm men kiềm nhiệt 43 3.3.2 Phá tế bào nấm men enzyme 44 3.3.3 Thu vách nấm men giàu β-glucan 46 3.4 THU VÁCH NẤM MEN GIÀU Β-GLUCAN QUY MÔ NỒI LÊN MEN 48 KẾT LUẬN 53 KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số dạng β-glucan phân lập từ tự nhiên Bảng 1.2 Các thành phần cấu trúc vách tế bào nấm men [25] Bảng 1.3 Một số β-glucan có hoạt tính sinh học thường sử dụng 13 Bảng 2.1 Hàm lượng hỗn hợp SDS EDTA bổ sung vào môi trường 26 Bảng 2.2 Nồng độ protease thời gian xử lý enzyme để phá tế bào nấm men 28 Bảng 3.1 Nguồn gốc số chủng nấm men phân lập 30 Bảng 3.2 Hàm lượng β-glucan 64 chủng nấm men phân lập 31 Bảng 3.3 Lựa chọn môi trường nuôi cấy cho chủng nấm men nghiên cứu 36 Bảng 3.4 Mật độ chủng nấm men nuôi cấy nhiệt độ khác 37 Bảng 3.5 Hàm lượng β-glucan bổ sung SDS EDTA vào môi trường 41 Bảng 3.6 Hàm lượng protein phá tế bào nấm men sử dụng kiềm nhiệt 43 Bảng 3.7 Lựa chọn dịch rửa thích hợp cho chiết vách nấm men 47 Bảng 3.8 Hàm lượng β-glucan thu sau lần nuôi cấy thiết bị lên men 30 lít 48 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Một vài kiểu liên kết mạch phân tử β-glucan[6] Hình 1.2 Cấu trúc liên kết vách tế bào nấm men Hình 2.1 Đường chuẩn BSA 20 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc tế bào chủng S51 33 Hình 3.2 Cây phát sinh chủng loại chủng nấm men nghiên cứu 35 Hình 3.3 Đồ thị ảnh hưởng SDS đến hàm lượng β-glucan 38 Hình 3.4 Hàm lượng β-glucan bổ sung thêm EDTA vào môi trường .39 Hình 3.5 Đồ thị khảo sát thời gian thích hợp cho ni cấy nấm men BM 32 S51 .42 Hình 3.6 Phá tế bào nấm men chủng BM 32 NaOH 0,2M sau 36 ủ 50ºC44 Bảng 3.7 Hàm lượng protein phá tế bào nấm men BM32 S51 enzyme .45 Hình 3.8 Phá tế bào nấm men BM 32 protease mg/ml ủ 40oC 46 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com vết thương Trong 10 năm qua nhà khoa học bác sỹ nhiều lĩnh vực ý đến việc sử dụng 1,3 β-glucan để giải nhiều vấn đề, ví dụ bệnh nhân bị dị ứng với thuốc, nhiễm nấm ung thư Tất thách thức thường khó giải bệnh có đặc điểm trung đáp ứng miễn dịch khơng đầy đủ Vì vậy, bổ sung β-glucan tăng khả đáp ứng miễn dịch thể bệnh nhân [28] Với ứng dụng to lớn β-glucan lĩnh vực y học, thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm vấn đề nghiên cứu sản xuất β-glucan sử dụng cho người cần quan tâm Chúng lựa chọn phân lập nấm men dựa sản phẩm lên men truyền thống với mong muốn lựa chọn chủng nấm men hoang dại có hàm lượng β-glucan vách tế cao Hai chủng nghiên cứu phân loại dựa vào hình thái phân tích trình tự ADNr vùng ITS, chủng BM 32 xác định thuộc loài Kluyveromyces lactis chủng S51thuộc Saccharomyces cerevisiae Trong đó, chủng nấm men Saccharomyces cerevisiaelà chủng phổ biến sử dụng rộng rãi ngành cơng nghiệp lên men bia rượu Ngồi ra, nhiều nhà khoa học nước quốc tế sử dụng chủng nấm men để nghiên cứu tách chiết βglucan, nghiên cứu Hasan T cộng (2008) nghiên cứu tách chiết βglucan từ nấm men bánh mì sử dụng kiềm nhiệt [12] Hay nghiên cứu Nguyễn Ngọc Sơn đồng nghiệp trường đại học Bách Khoa Hà Nội (2013) nghiên cứu tách chiết β-glucan từ bã men bia Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu tách chiết β-glucan từ chủng Kluyveromyces lactis Trong khuôn khổ luận văn này, nghiên cứu tách chiết β-glucan từ chủng BM 32: Kluyveromyces lactisđể so sánh với chủng S51: Saccharomyces cerevisiaelà chủng sử dụng phổ biến Chúng lựa chọn mơi trường thích hợp cho ni cấy thu sinh khối nấm men chất ức chế SDS EDTA lựa chọn để kích thích sinh tổng hợp βglucan vách tế bào SDS EDTA chất ức chế vi sinh vật nồng độ định, nhiên với hàm lượng nhỏ, vi sinh vật có chế để thích nghi với điều kiện bất lợi Cụ thể, nấm men đáp ứng lại điều kiện bất lợi cách điều hòa tăng tổng hợp β-glucan có vách tế bào để đáp ứng lại với điều 50 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com kiện bất lợi [30] Chúng lựa chọn hàm lượng SDS EDTA cho chủng nấm men nghiên cứu để tăng hàm lượng β-glucan vách từ xấp xỉ 10% lên xấp xỉ 15% so với trọng lượng khô tế bào (tăng gần 50% so với ban đầu), điều tương đối phù hợp với kết nghiên cứu Narmon cộng (2013) kết luận điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến thành phần cấu thành lên vách tế bào nấm men, ông sử dụng bổ sung SDS EDTA vào môi trường nuôi cấy giúp kích thích tăng lượng β-glucan vách tế bào lên 40% so với ban đầu [30] Có nhiều cách để phá tế bào nấm men như: phương pháp nghiền hạt thủy tinh, sonic, kiềm nhiệt, enzyme Nghiên cứu Hasan T cộng (2013) phá tế bào nấm men kiềm nhiệt 60oC 72 [12] Nghiên cứu Jonh Conway cộng (2001) sử dụng phá tế bào nấm men sử dụng protease glucanase pH 5,0-6,0 mang lại hiệu phá tế bào nấm men cao so với nghiên cứu ông sử dụng phá tế bào nấm men kiềm nhiệt [8] Điều hoàn toàn hợp lý sử dụng phương pháp phá tế bào nấm men enzyme protease chitinase Sử dụng phương pháp phá tế bào enzyme phương pháp hiệu quả, khơng sử dụng đến hóa chất nên an toàn sử dụng đặc biệt hạn chế tối đa lượng chất thải môi trường tiến hành sản xuất qui mô công nghiệp Với mục đích tách chiết vách tế bào nấm men có hàm lượng β-glucan cao, chúng tơi tiếp tục sử dụng đệm citrat axit H3PO4 để rửa vách tế bào nấm men sau phá với mong muốn loại bỏ tạp chất ADN, protein Điều phù hợp với nghiên cứu Karpa (2010) hay Javen cộng (2013) sử dụng dung dịch rửa vách tế bào sau phá vách H3PO4 đệm citrat để loại bỏ mannoprotein Bên cạnh đó, nghiên cứu Atunja cộng (2012) sử dụng dung dịch rửa axit acetic [1] thu hiệu chiết vách tế bào nấm men giàu βglucan với hàm lượng cao Như vậy, sử dụng phương pháp phân lập, tối ưu hóa mơi trường kích thích sinh tổng hợp β-glucan, phân lập chủng nấm men từ tự nhiên có hàm lượng β-glucan vách tế bào cao, xây dựng phương pháp thu hồi 51 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com vách tế bào giàu β-glucan từ nấm men, nghiên cứu thu hồi qui mơ nồi lên men có khả ứng dụng sản xuất qui mô công nghiệp, ứng dụng sử dụng cho sản phẩm ngăn ngừa điều trị ung thư Liệu cấu trúc β-glucan vách tế bào chủng nấm men BM 32 S51 có giống hay khác nhau, hay tác động β-glucan thu hồi từ chủng nấm men đến người nào? Điều cần tiếp tục nghiên cứu bàn luận để khẳng định nghiên cứu 52 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KẾT LUẬN Đã phân lập 112 chủng nấm men, có 64 chủng nấm men có khả phát triển tốt, lựa chọn chủng nấm men BM 32 S51 có thành phần β-glucan tế bào cao Hai chủng nghiên cứu phân loại dựa vào hình thái phân tích trình tự ADNr vùng ITS, chủngBM 32 xác định thuộc loàiKluyveromyces lactis chủngS51thuộcSaccharomyces cerevisiae Lựa chọn điều kiện ni thích hợp cho thu nấm men giàu β-glucan mơi trường MT4có bổ sung SDS- 80pg/l; EDTA- 60 pg/l chủng BM 32 SDS- 80pg/l; EDTA- 30 pg/l chủng S51, nuôi cấy 30oC thời gian 36-40 Hiệu phá vách nấm men cao sử dụng enzyme protease mg/ml chitinase-0,1 mg/ml, ủ 40oC, thời gian 6- Hiệu suất thu hồi vách nấm men giàu β-glucan tốt sử dụng dung dịch rửa đệm citrat pH 7,0 Nghiên cứu thu hồi vách nấm men quy mô thiết bị lên men 30 lít, khối lượng vách nấm men thu trung bình 15,5 g với hàm lượng β-glucan 44,6% KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu cấu trúc β-glucan vách tế bào nấm men giàu βglucan Nghiên cứu sản xuấtvách tế bào nấm men quy mô công nghiệp 53 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Atunr, B., Frand Gb, and Saurir Ba (2009), Chemistry, Biochemistry, and Biology of (1-3)-β-Glucans and Related Polysaccharides, The Netherlands: Academic Press, Amsterdam Aguilar-Uscanga, B and J.M Francois (2003), “A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation”, Letters in applied microbiology, 37(3), pp 268-274 Aleem, E (2012), “β -Glucans and their Applications in Cancer Therapy: Focus on human studies”, Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 13(5) Arvindekar, A.U and N.B Patil (2002), “Glycogen a covalently linked component of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae”, Yeast, 19(2), pp 131-139 Babincova, M., Z Bacova, E Machova, and G Kogan (2002), “Antioxidant properties of carboxymethyl glucan: comparative analysis”, Journal of medicinal food, 5(2), pp 79-83 C., S.P., A.M.R M., and M.G R (2014), “Β-glucans: what types exist and what are their health benefits?”, Revista chilena de nutrición, 41(3), pp 439446 Chan, G.C., W.K Chan, and D.M Sze (2009), “The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells”, Journal of hematology & oncology, 2, pp 25 Conway, J., H Gaudreau, and C.P Champagne (2001), “The effect of the addition of proteases and glucanases during yeast autolysis on the production and properties of yeast extracts”, Canadian journal of microbiology, 47(1), pp 18-24 Czop, J.K and K.F Austen (1985), “A beta-glucan inhibitable receptor on human monocytes: its identity with the phagocytic receptor for particulate activators of the alternative complement pathway”, Journal of immunology, 134(4), pp 2588-2593 54 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 10 Fisher, M and L.X Yang (2002), “Anticancer effects and mechanisms of polysaccharide-K (PSK): implications of cancer immunotherapy”, Anticancer research, 22(3), pp 1737-1754 11 Gilchrist, J.E., J.E Campbell, C.B Donnelly, J.T Peeler, and J.M Delaney (1973), “Spiral plate method for bacterial determination”, Applied microbiology, 25(2), pp 244-252 12 Hasan Tangüler, H.E (2009), “The Effect of Different Temperatures on Autolysis of Baker’s Yeast for the Production of Yeast Extract”, Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 33(2009), pp 149-154 13 Hunter, K.W., Jr., R.A Gault, and M.D Berner (2002), “Preparation of microparticulate β-glucan from Saccharomyces cerevisiae for use in immune potentiation”, Letters in applied microbiology, 35(4), pp 267-271 14 Inomata, T., G.B Goodman, C.J Fryer, D.J Chaplin, B Palcic, G.K Lam, A Nishioka, and Y Ogawa (1996), “Immune reaction induced by X-rays and pions and its stimulation by schizophyllan (SPG)”, The British journal of cancer Supplement, 27, pp S122-125 15 Javmen, A., S Grigiškis, and R Gliebutė (2012), “β-glucanextraction from Saccharomyces cerevisiae yeast using Actinomyces rutgersensis 88 yeast lyzing enzymatic complex”, Biologija, 58(2), pp 51-59 16 Jones, D., A.H Gordon, and J.S Bacon (1974), “Co-operative action by endo- and exo-beta-(1 leads to 3)-glucanases from parasitic fungi in the degradation of cell-wall glucans of Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary”, The Biochemical journal, 140(1), pp 47-55 17 Kano, Y., H Kakuta, and J Hashimoto (1996), “Inhibitory effect of metastasis by combined administration with interleukin-2 and sizofiran, a single glucan immunohistochemical study”, Biotherapy, 9(4), pp 263-269 18 Kim, S.P., M.Y Kang, J.H Kim, S.H Nam, and M Friedman (2011), “Composition and mechanism of antitumor effects of Hericium erinaceus 55 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com mushroom extracts in tumor-bearing mice”, Journal of agricultural and food chemistry, 59(18), pp 9861-9869 19 Kim, Y.T., E.H Kim, C Cheong, D.L Williams, C.W Kim, and S.T Lim (2000), “Structural characterization of beta-D-(1 > 3, > 6)-linked glucans using NMR spectroscopy”, Carbohydrate research, 328(3), pp 331341 20 Kimura, M (1980), “A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences”, Journal of molecular evolution, 16(2), pp 111-120 21 Kodama, N., K Komuta, and H Nanba (2002), “Can maitake MD-fraction aid cancer patients?”, Alternative medicine review : a journal of clinical therapeutic, 7(3), pp 236-239 22 Krpan, V.Z., V.P Tominac, P Galović, V Galović, J.F Grčić, and S Srečec (2010), “Application of Different Drying Methods on β-glucanIsolated from Spent Brewer’s Yeast Using Alkaline Procedure”, Agriculturae Conspectus Scientificus, 75(1), pp 45-50 23 Krpan, V.Z., V.P Tominac, I Gospodaric, L Sajli, S Đakovic, and J.F Grcic (2010), “Characterization of Β-glucans Isolated from Brewer’s Yeast and Dried by Different Method”, Food Technology Biotechnology, 48(2), pp 189-197 24 Leblanc, B.W., J.E Albina, and J.S Reichner (2006), “The effect of PGGbeta-glucan on neutrophil chemotaxis in vivo”, Journal of leukocyte biology, 79(4), pp 667-675 25 Lipke, P.N and R Ovalle (1998), “Cell wall architecture in yeast: new structure and new challenges”, Journal of bacteriology, 180(15), pp 37353740 26 Liu, X.L., N Lin, D Zan, J.J Yuan, and D.L Cai (2011), “Effect of zymosan on antioxidant and immune function of S180 tumor-bearing mice”, Cell biochemistry and biophysics, 60(3), pp 225-229 56 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 27 Lowry, O.H., N.J Rosebrough, A.L Farr, and R.J Randall (1951), “Protein measurement with the Folin phenol reagent”, The Journal of biological chemistry, 193(1), pp 265-275 28 Mariani, C.L., D Rajon, F.J Bova, and W.J Streit (2007), “Nonspecific immunotherapy with intratumoral lipopolysaccharide and zymosan A but not GM-CSF leads to an effective anti-tumor response in subcutaneous RG-2 gliomas”, Journal of neuro-oncology, 85(3), pp 231-240 29 Mccleary, B.V and A Draga (2016), “Measurement of beta-Glucan in Mushrooms and Mycelial Products”, Journal of AOAC International, 99(2), pp 364-373 30 Naruemon, M., S Romanee, P Cheunjit, H Xiao, L.A Mclandsborough, and M Pawadee Influence of additives on Saccharomyces cerevisiae βglucanproduction International Food Research Journal 2013 [cited 20 4]; 1953-1959] 31 Ohno, N., N.N Miura, M Nakajima, and T Yadomae (2000), “Antitumor 1,3-beta-glucan from cultured fruit body of Sparassis crispa”, Biological & pharmaceutical bulletin, 23(7), pp 866-872 32 Patchen, M.L., M.M D'alesandro, I Brook, W.F Blakely, and T.J Macvittie (1987), “Glucan: mechanisms involved in its "radioprotective" effect”, Journal of leukocyte biology, 42(2), pp 95-105 33 Pfannebecker, J., C Schiffer-Hetz, J Frohlich, and B Becker (2016), “Culture medium optimization for osmotolerant yeasts by use of a parallel fermenter system and rapid microbiological testing”, Journal of microbiological methods, 130, pp 14-22 34 Pillemer, L and E.E Ecker (1941), “Anticomplementary factor in fresh yeast”, Journal of Biological Chemistry, 137, pp 139-142 35 Pillemer, L., M.D Schoenberg, L Blum, and L Wurz (1955), “Properdin system and immunity II Interaction of the properdin system with polysaccharides”, Science, 122(3169), pp 545-549 57 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 36 Qi, C., Y Cai, L Gunn, C Ding, B Li, G Kloecker, K Qian, J Vasilakos, S Saijo, Y Iwakura, J.R Yannelli, and J Yan (2011), “Differential pathways regulating innate and adaptive antitumor immune responses by particulate and soluble yeast-derived beta-glucans”, Blood, 117(25), pp 6825-6836 37 Riggi, S.J and N.R Di Luzio (1961), “Identification of a reticuloendothelial stimulating agent in zymosan”, The American journal of physiology, 200, pp 297-300 38 Saitou, N and M Nei (1987), “The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees”, Molecular biology and evolution, 4(4), pp 406-425 39 Sakurai, T., N Ohno, I Suzuki, and T Yadomae (1995), “Effect of soluble fungal (1 >3)-beta-D-glucan obtained from Sclerotinia sclerotiorum on alveolar macrophage activation”, Immunopharmacology, 30(2), pp 157-166 40 Sasaki, T and N Takasuka (1976), “Further study of the structure of lentinan, an anti-tumor polysaccharide from Lentinus edodes”, Carbohydrate research, 47(1), pp 99-104 41 Shokri, H., F Asadi, and A.R Khosravi (2008), “Isolation of beta-glucan from the cell wall of Saccharomyces cerevisiae”, Natural product research, 22(5), pp 414-421 42 Stier, H., V Ebbeskotte, and J Gruenwald (2014), “Immune-modulatory effects of dietary Yeast Beta-1,3/1,6-D-glucan”, Nutrition journal, 13, pp 38 43 Suphantharika, M., P Khunrae, P Thanardkit, and C Verduyn (2003), “Preparation of spent brewer's yeast beta-glucans with a potential application as an immunostimulant for black tiger shrimp, Penaeus monodon”, Bioresource technology, 88(1), pp 55-60 44 Takita, M., M Onda, A Tokunaga, T Shirakawa, K Ikeda, Y Hiramoto, T Teramoto, T Oguri, I Fujita, T Okuda, T Mizutani, T Kiyama, T Yoshiyuki, and N Matsukura (1998), “[Successful treatment of hepatic 58 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com metastasis of gastric cancer with 5'-DFUR and Lentinan]”, Gan to kagaku ryoho Cancer & chemotherapy, 25(1), pp 129-133 45 Tanguler, H and H Erten (2008), “Utilisation of spent brewer's yeast for yeast extract production by autolysis: The effect of temperature”, Food and Bioproducts Processing, 86, pp 317-321 46 Teas, J (1983), “The dietary intake of Laminaria, a brown seaweed, and breast cancer prevention”, Nutrition and cancer, 4(3), pp 217-222 47 Thompson, J.D., D.G Higgins, and T.J Gibson (1994), “CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice”, Nucleic acids research, 22(22), pp 4673-4680 48 Vannucci, L., J Krizan, P Sima, D Stakheev, F Caja, L Rajsiglova, V Horak, and M Saieh (2013), “Immunostimulatory properties and antitumor activities of glucans (Review)”, International journal of oncology, 43(2), pp 357-364 49 Vetvicka, V and J Vetvickova (2015), “Glucan supplementation enhances the immune response against an influenza challenge in mice”, Annals of translational medicine, 3(2), pp 22 50 Xiao, G., A Miyazato, Y Abe, T Zhang, K Nakamura, K Inden, M Tanaka, D Tanno, T Miyasaka, K Ishii, K Takeda, S Akira, S Saijo, Y Iwakura, Y Adachi, N Ohno, N Yamamoto, H Kunishima, Y Hirakata, M Kaku, and K Kawakami (2010), “Activation of myeloid dendritic cells by deoxynucleic acids from Cordyceps sinensis via a Toll-like receptor 9dependent pathway”, Cellular immunology, 263(2), pp 241-250 51 Zhang, L., M Zhang, Q Zhou, J Chen, and F Zeng (2000), “Solution properties of antitumor sulfated derivative of alpha-(1 >3)-D-glucan from Ganoderma lucidum”, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 64(10), pp 2172-2178 59 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 52 Zimmerman, J.W., J Lindermuth, P.A Fish, G.P Palace, T.T Stevenson, and D.E Demong (1998), “A novel carbohydrate-glycosphingolipid interaction between a beta-(1-3)-glucan immunomodulator, PGG-glucan, and lactosylceramide of human leukocytes”, The Journal of biological chemistry, 273(34), pp 22014-22020 60 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Kết trình tự gen ADNr ITS chủng nấm men BM 32 CTGGTATAATGGTATGAGTAGATTACTGGGGGGGATCGCTGAATATGGC CTGCGCTTAATTGCGCGGCTAATTCTTGATTTTCTGCTATCAGTTTTCTTT CTCTCATCCTAAACACAATGGAGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGG AGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAACACAAACAACATTTTGCATTAT GAAAAACTATTTATCAAGAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGA TCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATT GTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACATTGCGC CCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAA ACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATACTCGTTTTTCGGGTTAACTTGAAA GTGGCTAGCCGTTGCCTTCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTAT GGACTCGACTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTA AGCTAGGGTCAATGAGCTTATAGGTGTTATAAAGACTCGCTGGTGTTTG TCTCCTTGAGGCATACGGCTTAATCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAA ATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAAGCGGGAG GAA Kết trình tự gen ADNr ITS chủng nấm men S51 CTTGAATTTTTTTATTTTCTGGAAATTGGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAG CATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAATACAAGAGAGGGAGAGTCCAGCC GGGCCTGCGCTTAAGTGTTCTGAAAGAGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCT TGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGTTTAATTA AAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTT TTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAACA ATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTG GAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGC ATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAA TTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCC LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com AGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGG TAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATT GGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATG CAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACCTGCGGCTAATCTTTTTTTAT ACTGAGCGTATTGGGAACGTTATCGATAAGAAGAAGAGCGTCTAGGCG GAACAAATGTTCTTAAAAGTTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCC GCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGGAGGAAA Khối lượng 112 chủng nấm men phân lập sau sấy STT Tên chủng Nguồn KL PT STT Tên chủng Nguồn KL PT HD1 BMHD 0,69 + 57 S20 BMP 0,76 + HD2 BMHD 0,71 + 58 S21 BMTO 0,54 - HD5 BMHD 0,75 + 59 S25 BMTO 0,61 - HD9 BMHD 0,75 + 60 S26 BMTO 0,77 + HD10 BMHD 0,69 + 61 S28 BMTO 0,43 - HD23 BMHD 0,83 + 62 S32 BMTO 0,47 - HD25 BMHD 0,75 + 63 S34 BMTO 0,83 + HD27 BMHD 0,78 + 64 S35 BMTO 0,38 - HD30 BMHD 0,81 + 65 S36 BMTO 0,51 + 10 HD31 BMHD 0,57 - 66 S41 BMTO 0,69 + 11 HD37 BMHD 0,69 + 67 S42 BMTO 0,79 + 12 HD42 BMHD 0,74 + 68 S43 BMTO 0,81 + 13 HD47 BMHD 0,78 + 69 S45 BMTO 0,62 - 14 HD49 BMHD 0,62 - 70 S46 BMTO 0,43 - 15 HD55 BMHD 0,68 + 71 S47 BMTO 0,47 - 16 HD56 BMHD 0,44 - 72 S48 MRN 0,78 + LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com STT Tên chủng Nguồn KL PT STT Tên chủng Nguồn KL PT 17 HD57 BMHD 0,51 - 73 S49 MRN 0,85 + 18 HD60 BMHD 0,43 - 74 S50 MRN 0,56 - 19 QA2.3 BMQA 0,68 + 75 HD2.3 MRSĐ 0,85 + 20 QA2.8 BMQA 0,69 + 76 HD2.18 MRSĐ 0,67 - 21 QA2.19 BMQA 0,57 - 77 HD2.26 MRSĐ 0,65 - 22 QA2.23 BMQA 0,76 + 78 HD2.42 MRSĐ 0,77 + 23 QA3.1 BMQA 0,65 - 79 HD2.49 MRSĐ 0,79 + 24 QA3.2 BMQA 0,88 + 80 HD2.52 MRSĐ 0,67 - 25 QA3.3 BMQA 0,85 + 81 HD3.1 MRSĐ 0,62 - 26 QA3.5 BMQA 0,78 + 82 HD3.8 MRSĐ 0,77 + 27 QA3.9 BMQA 0,83 + 83 HD3.9 MRSĐ 0,65 - 28 QA3.11 BMQA 0,67 - 84 HD3.12 MRSĐ 0,7 + 29 BM 13 BMQA 0,68 + 85 HD3.15 MRSĐ 0,53 - 30 BM 17 BMQA 0,78 + 86 HD4.10 MBM 0,43 - 31 BM 18 BMQA 0,87 + 87 HD4.11 MBM 0,74 + 32 BM 21 BMQA 0,83 + 88 HD4.12 MBM 0,44 - 33 BM 32 BMQA 0,78 + 89 HD4.13 MBM 0,74 + 34 BM 33 BMQA 0,75 + 90 HD4.14 MBM 0,61 - 35 BM 37 BMQA 0,68 + 91 HD4.15 MBM 0,71 + 36 BM 38 BMQA 0,84 + 92 HD4.16 MBM 0,8 + 37 Q1.1 BMPX 0,72 + 93 HD4.17 MBM 0,54 - 38 Q1.2 BMPX 0,69 + 94 HD4.18 MBM 0,48 - 39 Q1.5 BMPX 0,71 + 95 HD4.19 MBM 0,64 - 40 Q2.2 BMPX 0,68 + 96 S53 HXC 0,63 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com STT Tên chủng Nguồn KL PT STT Tên chủng Nguồn KL PT 41 Q2.3 BMPX 0,88 + 97 S55 HXC 0,53 - 42 Q2.8 BMPX 0,67 - 98 S57 HXC 0,78 + 43 Q3.4 BMPX 0,71 + 99 S60 HXC 0,69 + 44 Q3.5 BMPX 0,59 - 100 S62 HXC 0,69 + 45 Q3.6 BMPX 0,87 + 101 D2 đu đủ 0,43 - 46 Q3.7 BMPX 0,82 + 102 D4 đu đủ 0,68 + 47 Q3.8 BMPX 0,64 - 103 D5 đu đủ 0,7 + 48 S2 BMP 0,67 - 104 D8 đu đủ 0,56 - 49 S6 BMP 0,66 - 105 N3 Nho chín 0,67 - 50 S5 BMP 0,64 - 106 N4 Nho chín 0,71 + 51 S6 BMP 0,79 + 107 N6 Nho chín 0,78 + 52 S8 BMP 0,57 - 108 N8 Nho chín 0,64 - 53 S12 BMP 0,71 - 109 N9 Nho chín 0,67 - 54 S15 BMP 0,62 - 110 S51 Xoài 0,7 + 55 S16 BMP 0,67 - 111 S53 Xoài 0,69 + 56 S17 BMP 0,65 - 112 S54 Xoài 0,52 - Ghi chú: (+): Phát triển tốt (-) Phát triển - BMHD: Bánh men Hoài Đức - BMQA: Bánh men Quốc Oai - BMPX: Bánh men Phú Xuyên - BMP: Bánh men Phùng - BMTO: Bánh men Thanh Oai - MRN: Men rượu Nhổn - MRSĐ: Men rượu Sơn Đồng - HXC: Hồng xiêm chín LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... Cấu trúc vách (thành) tế bào nấm men Vách tế bào nấm men loại nấm khác đóng vai trị trì hình dạng tính tồn vẹn cấu trúc tế bào trình sinh trưởng phân chia tế bào Vách tế bào nấm men chiếm từ 15... chọn chủng nấm men có nguồn gốc từ nhiên, giàu β -glucan - Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thu β -glucan từ sinh khối nấm men - Nghiên cứu phương pháp thu hồi vách tế bào nấm men giàu β -glucan LUAN VAN... hợp thu nấm men giàu β -glucan .42 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.3 NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP THU HỒI VÁCH TẾ BÀO NẤM MEN GIÀU Β -GLUCAN 43 3.3.1 Phá tế bào nấm