LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

Chương1 ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÍ I LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ: Phương pháp sắc ký phát triển vào năm 1903 nhà thực vật hoc người Nga Michael C.Txvet Ông thực người có cơng tìm phương pháp, giải vấn đề tách chất có tính chất giống theo chế độc đáo, hoàn toàn khác với phương pháp tách có trước đây, nhiên phát bị lãng quên nhiều năm Năm 1941, Martin Synge phát triển sắc ký phân bố giấy đưa lý thuyết đĩa để giải thích q trình sắc ký, tác giả ứng dụng để tách ancaloit từ thuốc phục vụ cho chế tạo dược phẩm Do có công việc phát triển lý thuyết phương pháp năm 1952 hai ông nhận giải thưởng Nobel hoá học Cũng từ năm 1952 máy sắc ký đời tỏ có ưu có hiệu tách cao Cột mao quản detectơ sau cải tiến tăng độ phân giải độ nhạy phương pháp người ta phân tích chất có hàm lượng nhỏ cở ppm ppb Từ phương pháp phát triển nhanh, ứng dụng nhiều thực tế Về sắc ký lỏng kỹ thuật phát từ năm 1970 làm tăng hiệu tách sắc ký lỏng hiệu cao (high performance lipuid chromatography- HPLC): Chất nhồi cột cải tiến, máy tính thiết bị vào bổ trợ đưa vào, tăng cường khả phương pháp Ngày kỹ thuật ghép nối sắc ký phương pháp khác áp dụng Đó kỹ thuật ghép nối sắc ký khối phổ ( GC-MS, GC-MS) sắc ký cộng hưởng hạt nhân, sắc ký đa chiều, sắc ký điện mao quản (CEC) Phương pháp có độ xác độ nhạy cao, phân tích nhiều đối tượng phức tạp II CƠ SỞ LÝ THUYẾT ĐỊNH NGHĨA - PHÂN LOẠI 1.1 Định nghĩa: Sắc ký trình tách dựa phân bố liên tục cấu tử chất phân tích hai pha: pha thường đứng yên có khả hấp thụ chất phân tích gọi pha tĩnh, pha di chuyển qua pha tĩnh gọi lạ pha động; cấu tử chất phân tích có lực khác với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác tách khỏi 1.2 Phân loại phương pháp tách sắc ký 1.2.1 Phân loại theo hệ pha Phương pháp nhiều người quan tâm, phương pháp phân loại đơn giản theo hệ pha tức chất phân tích phân bố hai pha gì? hệ pha Sơ đồ phân loại phương pháp sắc ký Cơ chế 1.2.2 Phân loại theo chế tách 1.2.2.1 Sắc ký hấp thụ: Sắc khí hấp thụ phương pháp dựa sở phân bố chất phân tích pha tĩnh pha động nhờ tương tác phân tử thông qua trung tâm hấp thụ Pha tĩnh chất rắn lỏng có diện tích bề mặt lớn, bền vững mặt hoá học Chúng hấp thụ chất phân tích bề mặt chúng mức độ khác cho pha động chứa chất phân tích tiếp xúa với chúng Tuỳ thuộc lực liên kết pha tĩnh cấu tử chất phân tích có pha động, cho pha động qua pha tĩnh chúng di chuyển với tốc độ khác 1.2.2.2 Sắc ký phân bố lỏng - lỏng Sự phân biệt sắc ký phân bố lỏng-lỏng phân bố thông thường chỗ sắc ký phân bố lỏng - lỏng gọi sắc ký chiết, pha tĩnh chất lỏng pha động chất lỏng, phân bố chất phân tích hai pha lỏng giống q trình chiết, cịn phân bố nói chung phân chia chất phân tích vào hai pha không cần xét tới lỏng hay rắn Điểm khác sắc ký phân bố lỏng - lỏng sắc ký hấp phụ chỗ: sắc ký phân bố lỏng- lỏng có đường đẳng nhiệt tuyến tính khoảng nhiệt độ lớn, phương pháp có độ nhạy cao có nhược điểm pha tĩnh không bền vững, tương trôi pha tĩnh làm cho độ lặp lại bị giảm 1.2.2.3 Sắc ký ion ( trao đổi ion) Pha tĩnh thường pha rắn có khả trao đổi ion với chất phân tích pha động.Chất có khả trao đổi cation gọi cationit, cịn chất có khả trao đổi anion gọi anionit Lực liên kết chủ yếu chất phân tích pha tĩnh chủ yếu liên kết tĩnh điện , phụ thuộc nhiều vào điện tích ion chất phân tích, pH dung dịch bán kýnh hidrat hoá ion chất phân tích Ví dụ: phản ứng trao đổi ion cationit acid mạnh Ca2+ viết sau: 2R-SO3H + Ca2+ = (R-SO3)Ca + 2H+ Phản ứng anionit bazơ mạnh với Cl- : R-N(CH3)3OH + Cl- = R-N(CH3)3Cl + OH2 1.2.2.4 Sắc ký rây phân tử (sắc ký loại cở) Pha tĩnh chất rắn có diện tích bề mặt lớn, xốp, có đường lòng chất rắn, gọi mao quản có kých thước cở phân tử Các phân tử chất phân tích thấm vào chất mức độ khác tuỳ theo kých thước chúng Các chất phân tích có kých thước lớn khơng thể vào sâu vào pha tĩnh được, bị rửa giải nhanh cịn phân tử chất phân tích có kých thước nhỏ phân bố sâu vào pha tĩnh bị rửa giải chậm Thứ tự rửa giải chất có kich thước nhỏ sau ngược lại Thời gian lưu chất tỷ lệ nghịch với kých thước phân tử chúng Tuy nhiên chất phân tích có tương tác khác với pha tĩnh Như phép sắc ký tách theo hay nhiều chế khác mà khơng xét 1.2.3 Phân loại theo cách hình thành sắc đồ 1.2.3.1 Phân tích tiền lưu Các cấu tử A, B, C có lực với pha tĩnh A < B< C Cho hỗn hợp chất phân tích liên tục qua cột, chất phân tích có lực với pha tĩnh thấp Nồng độ trước, chất có lực yếu Tuy nhiên cho liên tục chất phân tích vào nên sau A A + A+B+C Chỉ có phần chất tinh khiết A trước B C 1.2.3.2 Phân Trong sắc ký này, chúng lượng nhỏ hỗn hợp chất A B B A A tích đẩy t V phân tích A, Nồng độ Hình 1: Sắc đồ phân tích tiền lưu B, C vào cột sau cho chất ta nạp D chất đẩy liên tục qua cột Ái lực hấp thụ A → X cation Bài Định lượng NO3- bể nuôi cá phương pháp CZE với chất nội chuẩn IO 4- Dung dịch chuẩn NO3- 15,0 ppm IO4- 10,0 ppm cho diện tích pic 95,0 100,1 đơn vị Một mẫu nước pha loãng 100 lần thêm chất nội chuẩn đến nồng độ 10,0 ppm Phân tích CZE thu diện tích 29,2 105,8 NO 3- IO4- Tính nồng độ NO3- mẫu nước bể nuôi cá theo ppm GIẢI Áp dụng công thức phương pháp nội chuẩn: SA C = k A S IS CIS Trong đó: SA, SIS diện tích pic chất chuẩn chất nội chuẩn; C A, CIS nồng độ chất chuẩn chất nội chuẩn Theo đề ta có: 95 15 = k 100,1 10 → k = 0,6327 120 Thế giá trị vào tính mẫu nước ta có: 29, C = 0, 6327 A 105,8 10 → CA = 4,362 ppm → Nồng độ NO3- mẫu nước bể nuôi cá: 100CA = 436,2 ppm Bài Tách ankylpiridin CZE Việc tách thực ống mao quản có đường kính 50 μm, chiều dài tổng cộng 57 cm, chiều dài hiệu lực 50 cm Dung dịch đệm pH = 2,5 Sự tách tối ưu với điện di 15 kV Độ điện di thẩm thấu đo 6,398.10 -5 cm2.V-1.s-1 Hệ số phân bố ankylpyridin, D = 1,0.10-5 cm2.s-1 a) Tính độ điện di 2-etylpyridin, biết thời gian lưu 8,20 phút b) Tính số đĩa lý thuyết 2-etylpyridin c) Độ điện di 3-etylpyridin 4-etylpyridin 3,366.10 -4 cm2.V-1.s-1 3,397 10-4 cm2.V1 -1 s Tính độ phân giải chất GIẢI a) Áp dụng công thức: → µi = L.l − µ EOF V ti µtot = µi + µ EOF = = L.l V ti 57.50 - 6,398.10-5 = 3,22.10-4 (cm2.V-1.s-1) 15000.8, 2.60 b) Áp dụng cơng thức tính số đĩa lý thuyết ta có: N= ( µi + µEOF ).V (3, 22.10−4 + 6, 398.10−5 ).15000 = = 28950 2D 2.1.10−5 c) Để tính độ phân giải R trước hết tính: ∆μ = μ2 - μ1 = 3,397.10-4 - 3,366.10-4 = 0,031.10-4 (cm2.V-1.s-1) μTB = µ1 + µ2 = (3,366.10-4 + 3,397.10-4)/2 = 3,3815.10-4 (cm2.V-1.s-1) Ta có: R = 0,177.∆µ V 15000 = 0,177.0, 031.10−4 −4 ( µTB + µEOF ).D (3,3815.10 + 6,398.10−5 ).10 −5 R = 1,1 Bài Tách protein HPCEC Mao quản dài 84 cm, điện di 25000 V Một phân tử trung hòa dòng EOF mang theo phải hết 308s để di chuyển đoạn 64 cm từ chỗ nạp mẫu đến detector Chất A có thời gian lưu 343s Tính độ điện di tổng cộng độ điện di hiệu lực chất A GIẢI Độ điện di tổng cộng chất A: Cường độ điện trường E: E = V/L = 25000/84 = 298 V/cm μtot = u A 64 / 343 = = 6,26.10-4 (cm2.V-1.s-1) E 298 Tốc độ tuyến tính dòng EOF: 121 uEOF = 64 = 0,208 ( cm/s) 308 Độ điện di dòng EOF: Từ uEOF = μEOF.E → μEOF = uEOF /E = 0,208 /298 = 6,98.10-4 (cm2.V-1.s-1) Độ điện di hiệu lực: µef = µtot − µEOF = 6,26.10-4 - 6,98.10-4 = -0,72.10-4 (cm2.V-1.s-1) Vì μef < nên suy A anion Bài Phân tích sắc kí điện di mao quản với kỹ thuật CZE Mao quản có chiều dài tổng 32cm, chiều dài hiệu lực 24,5cm điện di 30 kV Dưới điều kiện thí nghiệm ghi mơi trường trung tính xuất chất có thời gian lưu phút a) Tính độ điện di hiệu lực chất có thời gian lưu 2,5 phút b) Tính hệ số khuyếch tán điều kiện cho chất đó, biết số đĩa lý thuyết N = 80 000 ĐS: a) 2,88.10-5 (cm2.V-1.s-1) b) D = 2,5.10-5 (cm2.s-1) Bài Trong phép tách HPCEC, mao quản có chiều dài tổng 1m, chiều dài hiệu lực 90cm Thế áp đặt vào hai đầu ống mao quản 30 kV Detector đặt phía trước catot với chất đệm có pH = Trong dung dịch tiêu chuẩn, chất tan có thời gian lưu tm = 10 phút a) Tính độ điện di tổng cộng chất b) Nếu phân tử nhỏ khơng mang điện có thời gian lưu phút, xác định độ điện di dòng EOF c) Tính độ điện di hiệu lực chất d) Tính số đĩa lý thuyết N chất có hệ số khuếch tan D = 2.10-5 cm2/s ĐS: -4 -1 -1 -3 -1 a) 7,5.10 (cm V s ) b) 1,5.10 (cm V s-1) c) – 7,5.10-4 (cm2.V-1.s-1) d) N = 337 500 Bài Cho cột mao quản dài 50cm áp đặt 30 000V, độ điện di tính với thời gian 10 phút 2.10-8 m2s-1V-1 Tính số đĩa lý thuyết cho ion Li+ (D = 1,0.10-9 m2s-1) cho protein có phân tử khối 105 (D = 3.10-11m2s-1) ĐS: Li+: 3.105 đĩa; Protein: 107 đĩa Bài Định lượng vitamin B1 kĩ thuật CZE MEKC sử dụng chất nội chuẩn oethoxybenzamide Khi phân tích dung dịch chứa 100,0 ppm B 100,0 ppm o- ethoxybenzamide diện tích pic B1 71% diện tích pic chất nội chuẩn Phân tích 0,125g thuốc viên vitamin B cho diện tích pic B1 1,82 lần so với chất nội chuẩn Tính số mg vitamin B có thuốc này, biết thể tích dung dịch ban đầu 20 mL ĐS: 5,1 mg Bài Một cation vơ có độ điện di 4,31.10 -4 cm2.V-1.s-1 hệ số khuếch tán 9,8.10-6 cm2.s-1 phân tích kĩ thuật CZE với mao quản dài 50 cm điện di 10 kV Trong điều kiện này, dòng điện di thẩm thấu có tốc 0,85 mm/s phía catot Nếu detector đặt cách điểm nạp mẫu 40 cm cation để đến detector ? 122 ĐS: 3,9 phút TÀI LIỆU THAM KHẢO Phạm Luận (2002), Cơ sở lý thuyết Sắc kí điện di mao quản hiệu cao (HPCEC), ĐH KHTN – ĐHQG Hà Nội David Harvey (2000), Modern analytical chemistry, Mc Graw Hill Daniel Harris (2007), Quantitative Chemical Analysis, W.H Freeman and Company, New York Nicola Volpi (2005), Capillary Electrophoresis of Carbohydrates, Humana Press Robetr Weinberger (1999), Practical Capillary Electrophoresis, AP Ruth Freitag (2002), Modern Advances in Chromatography, University of California, USA Jack Cazes (2004), Encyclopedia of Chromatography Skoog, West, Holler & Crouch (2004), Fundamentals of analytical chemistry, Thomson Brooks/Cole 123 MỤC LỤC Có độ nhạy cao nhiều chất (có thể phát chất có nồng độ cỡ 100ppb) 68 Khoảng tuyến tính rộng (hơn đến hàng triệu lần) .68 Độ bền tính hiệu cao, bị ảnh hưởng tốc độ dịng khí mang thơng số thực nghiệm khác 68 Nhóm E: mẫu (nhóm A, B, C D) tồn dạng dung dịch 72 Nhóm F: mẫu có chứa số thành phần khơng bay khó bay 72 Trên sở thành phần mẫu định lựa chọn phương tiện thiết bị điều kiện làm việc 72 5.1 Chọn cột tách 72 - Rút ngắn thời gian phân tích mẫu có khoảng điểm sơi rộng 73 - Tỷ lệ chiều cao pic chiều rộng pic ln ổn định thuận lợi cho phân tích định lượng Thơng thường, mẫu hợp chất thiên nhiên phức tạp nên phương trình tuyến tính thu kết mong muốn mà phải sử dụng đa phương trình, nghĩa khoảng nhiệt độ chừng giữ đẳng nhiệt cột thời gian thích ứng lại tăng tiếp với tốc độ mong muốn Trước sau chương trình giữ nhiệt độ cố định .73 Nhiệt độ buồng điều nhiệt phải điều chỉnh với tốc độ thích ứng chương trình quy định Hiện chưa có máy sắc ký làm việc xác với tốc độ nhỏ /phút lớn /phút Thực tế cột nhồi thường dùng với tốc độ /phút, cột mao quản /phút 73 Việc làm nguội buồng điều nhiệt cần phải tiến hành nhanh chóng, thường làm nguội sâu nhiệt độ làm việc ban đầu để trình thực chương trình nhanh chóng ổn định, cửa buồng điều nhiệt nóng, nhiệt cách nhiệt lại phả 74 Nhiệt độ buồng bay mẫu cần phải đưa lên cao, độc lập với nhiệt độ buồng điều nhiệt nhằm làm bay mẫu ổn định lặp lại cho dù nhiệt độ tăng hay giảm 74 Khí mang sử dụng phải tinh khiết, không tạp chất tích tụ trước hết phần đầu cột tách Khi nhiệt độ cột tăng lên vận chuyển qua cột gây pic lạ bất ngờ 74 Giảm đường kính cột tách 75 Sử dụng khí mang với độ nhớt thấp 75 Rất phụ thuộc vào thơng số làm việc, gia trị đặc trưng cho mối chất ứng với pha tĩnh nhiệt độ định Sự phụ thuộc vào nhiệt độ chúng nhỏ nguyên tắc khoảng – đơn vị thay đổi 10oC 76 Độ lặp lại việc xác định số lưu hai phịng thí nghiệm khác lệch đơn vị chí với điều kiện thuận lợi lệch 0,05 đơn vị 76 Giới thiệu phương pháp HPCEC 89 1.1 Sự đời phát triển 89 1.2 Phân loại kiểu HPCEC 91 1.3 Đặc điểm sắc kí điện di mao quản hiệu cao 91 Một số đại lượng HPCEC 92 2.1 Tốc độ điện di, độ điện di, thời gian điện di .92 2.1 Tốc độ điện di 92 2.1.2 Độ điện di .93 2.1.3 Thời gian điện di 93 2.2 Hệ số phân bố hệ số dung tích .94 2.2.1 Hệ số phân bố Ki 94 2.2.2 Hệ số dung tích ki’ .94 2.3 Chiều cao đĩa, số đĩa số đĩa hiệu lực mao quản 95 2.4 Tốc độ tuyến tính 96 2.5 Độ phân giải .97 124 2.6 Hiệu ứng nhiệt gradient nhiệt độ 98 2.6.1 Hiệu ứng nhiệt Jun ảnh hưởng .98 2.6.2 Kiểm tra khống chế hiệu ứng nhiệt 99 2.7 Sự tương tác chất phân tích với thành mao quản 99 2.7.1 Khái niệm tương tác 99 2.7.2 Kiểm tra khống chế tương tác có hại .99 Cơ sở lý thuyết sắc kí điện di mao quản .100 3.1 Nguyên tắc sắc kí điện di mao quản 100 3.2 Thế điện di lực điện di 101 3.3 Dung dịch đệm pha động HPCEC .101 3.3.1 Khái niệm pha động HPCEC .101 3.3.2 Chất đệm giá trị pH đệm HPCEC 102 3.3.3 Chất điện giải pha động HPCEC 103 3.4 Mao quản pha tĩnh HPCEC 103 3.4.1 Mao quản HPCEC 103 3.4.2 Pha tĩnh HPCEC .104 3.5 Lớp điện kép thành mao quản 105 3.6 Dòng điện di thẩm thấu 106 3.6.1 Khái niệm dòng điện di thẩm thấu 106 3.6.2 Nguồn gốc dòng điện di thẩm thấu 106 3.6.3 Đặc điểm dòng điện di thẩm thấu 108 3.6.4 Kiểm tra khống chế dòng điện di thẩm thấu 110 Tối ưu hóa phép phân tích sắc kí điện di mao quản 111 4.1 Chuẩn bị mẫu, nạp mẫu 111 4.1.1 Chuẩn bị mẫu 111 4.1.2 Nạp mẫu .112 4.2 Chọn điều kiện tối ưu 112 4.2.1 Chọn mao quản pha tĩnh 112 4.2.2 Chọn pha động 112 4.2.3 Chọn điện di 112 4.2.4 Chọn đetector .112 4.3 Chọn phương pháp phân tích thích hợp 113 Máy sắc kí điện di mao quản hiệu cao .115 5.1 Cấu tạo, trang bị .115 5.2 Hoạt động máy HPCEC .117 Các phương pháp định tính, định lượng HPCEC .118 6.1 Phân tích định tính 118 6.2 Phân tích định lượng 118 6.2.1 Phương trình 118 6.2.2 Phương pháp đường chuẩn 118 6.2.3 Phương pháp thêm chuẩn 119 BÀI TẬP .120 TÀI LIỆU THAM KHẢO 123 125 126 ... detector UV – Vis 5µl mẫu chuẩn có chứa 170 ppm vitaminC, 130 ppm niacin, 120ppm niacinamide, 150ppm pyridoxine, 60ppmm thiamine, 15 ppm axit folic 10ppm riboflavin phân tích HPLC, tín hiệu 0,22,... dự ki? ??n dạng đồ thị ba chiều hai chiều Detector dùng dãy diot quang tuyến tính dùng để giải vấn đề sau: đánh giá pic, xác định pic chưa biết ki? ??m tra pic So với detector hấp thụ tử ngoại- khả ki? ??n... việc làm bay nhanh mao quản kim loại có mặt muối amoni axetat Phương pháp có nhiều triển vọng hệ rửa hữu - nước đưa với tốc độ 1-2 ml/phút Hiện có số ki? ??u ghép LC-MS ki? ??u có giá trị riêng Các yếu