tìm hiểu NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PELLET MESALAMIN GIẢI PHÓNG TẠI ĐẠI TRÀNG

Đánh giá giải phóng in vitro 17 1.3.2 Đánh giá in vivo 20 1.3.2.1 Đánh giá in vivo thuốc trong đường tiêu hóa bằng phương pháp hình ảnh

Đánh giá sự hấp thu dược chất in vivo 20 1.4 PELLET 26

Đánh giá sự hấp thu thuốc in vivo là thử nghiệm được thực hiện trên cơ thể sống Trong giai đoạn sàng lọc, người ta có thể sơ bộ đánh giá hấp thu in vivo trên động vật thí nghiệm Với đa số các thuốc, nồng độ hoạt chất trong máu có liên quan trực tiếp đến đáp ứng lâm sàng của thuốc hay hiệu quả điều trị của thuốc Chỉ tiêu in vivo là các thông số đáp ứng sinh học của chế phẩm Trong nghiên cứu sự hấp thu thuốc thường sử dụng các thông số dược động học như AUC, C max , T max , tốc độ hấp thu từ kết quả nghiên cứu in vivo [1], [9], [8], [44] Đối với thuốc giải phóng tại đại tràng, giá trị AUC và C max thường thấp do thuốc ít giải phóng ở dạ dày và ruột non, là nơi xảy ra quá trình hấp thu chính của dược chất, nhưng giải phóng phần lớn ở đại tràng, nơi dược chất ít được hấp thu vào máu Do đó, T max thường đạt sau khi uống thuốc ít nhất 4 giờ Trong nghiên cứu sự hấp thu dược chất in vivo, các dạng thuốc của mesalamin cần lựa chọn đối tượng thử, thiết kế nghiên cứu phù hợp Việc định lượng mesalamin trong dịch sinh học chủ yếu sử dụng phương pháp HPLC hoặc LC- MS/MS [40], [76], [72].

Nghiên cứu hấp thu in vivo tốt nhất là được đánh giá trên người tình nguyện (NTN) khỏe mạnh Với các thuốc có độc tính cao, thuốc có nồng độ trong máu thấp hoặc khi thăm dò trong quá trình nghiên cứu phát triển sản phẩm, đánh giá hấp thu in vivo có thể được tiến hành trên động vật thí nghiệm Trong các loài động vật, chó được xem là loài phù hợp hơn cả trong đánh giá hấp thu in vivo của thuốc uống vì đường tiêu hóa của chó tương đối giống của người Trong trường hợp nghiên cứu sàng lọc các chế phẩm thuốc, có thể dùng thỏ, chó làm mô hình nghiên cứu [1].

● Thiết kế nghiên cứu Đánh giá hấp thu in vivo có thể thực hiện theo mô hình thiết kế đơn liều hoặc đa liều Thời gian nghỉ giữa các lần thử thuốc liên tiếp phải đủ để thuốc dùng lần trước thải trừ hết khỏi cơ thể, thường gấp 10 lần thời gian bán thải của thuốc [8].

Trong đánh giá hấp thu in vivo, để hạn chế ảnh hưởng của yếu tố cá thể, thường thiết kế nghiên cứu chéo Tuy nhiên, trong nghiên cứu thăm dò hoặc khảo sát hấp thu in vivo, có thể đánh giá trên một vài cá thể riêng biệt tùy điều kiện thực nghiệm [9], [44], [31].

Thiết kế thời điểm lấy mẫu sao cho có thể ước lượng được C max và bao phủ đường cong nồng độ thuốc trong huyết tương theo thời gian đủ để ước lượng chính xác mức độ hấp thu Đường cong hấp thu phải thể hiện rõ pha hấp thu và pha thải trừ Trong đó, nên có ít nhất 3 điểm trước khi đạt đỉnh C max , 4 – 5 điểm xung quanh đỉnh và 7 – 8 điểm trong pha thải trừ Tổng số điểm lấy mẫu nên từ 12 – 18 Thời gian lấy mẫu phải kéo dài tới 3 – 5 lần thời gian bán thải của thuốc Mẫu sau khi lấy phải được bảo quản ở nhiệt độ ≤ - 20 o C cho tới khi phân tích [1], [8].

● Phương pháp định lượng mesalamin trong huyết tương

Quá trình thực hiện luận án cần phải định lượng nồng độ mesalamin trong huyết tương sau khi cho động vật thí nghiệm uống viên nghiên cứu Do dạng bào chế pellet mesalamin bao film giải phóng tại đại tràng lần đầu tiên được nghiên cứu ở Việt Nam Vì thế, việc xây dựng và thẩm định quy trình định lượng mesalamin trong huyết tương là yêu cầu bắt buộc Một số phương pháp định lượng mesalamin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng khối phổ được trình bày ở bảng sau:

Bảng 1.3 Một số phương pháp định lượng mesalamin trong huyết tương

Juan Qin và cộng sự

+ Phương pháp chiết: kết tủa protein bằng methanol + Chuẩn nội: Diazepam

+ Giới hạn định lượng dưới (LLOQ): 50 ɳg/ml + Đường tuyến tính: 50–30000 ng/ml

+ Thiết bị: LC-MS/MS Shimadzu + Cột: Waters Spherisorb C6 (150 x 4,6 mm, 5 μm) + Pha động: acid formic 0,2 % - methanol (20 : 80) + Thể tớch tiờm: 10 àl

+ Thuốc sử dụng: 2 viên thuốc đạn, mỗi viên chứa 167 mg mesalamin

+ Phương pháp chiết: Chiết lỏng – lỏng + Chuẩn nội: N-acetyl mesalamin D3 + Giới hạn định lượng dưới (LLOQ): 2 ɳg/ml

+ Đường tuyến tính: 2 – 1500 ng/ml đối với mesalamin và

10 – 2000 ng/ml đối với N-acetyl mesalamin

+ Thiết bị: Hệ sắc ký lỏng của Agilent, khối phổ API 4200

+ Cột: C18 (150 x 4,6 mm, 5 μm)+ Pha động: amoni acetat 10 mM-methanol (85:15)

Thuốc sử dụng: Viên mesalamin 400 mg cho 34 người tình nguyện

Yu v à + Phương pháp chiết: Kết tủa protein bằng acetonitril cộng s ự + Chuẩn nội: 4-ASA

[18] + Giới hạn định lượng dưới (LLOQ): 5 ng/ml

+ Đường tuyến tính: 5 ng/mL to 2 μg/mL cho mesalamin và Ac-5-ASA + Thiết bị: Hệ sắc ký lỏng của Shimadzu, khối phổ API 5500

+ Pha động: acid formic 0,1 % và acetonitril

+ Thuốc sử dụng: Dung dịch mesalamin (100 mg), Pentasa

(500 mg mesalamin x 2 viên nang), Apriso (375 mg mesalamin x 3 viên nang) và Lialda (1200 mg mesalamin x 1 viên)

GZ v à + Phương pháp chiết: Kết tủa protein bằng 0,3 ml methanol cộng s ự + Chuẩn nội: Dimenhydrinat

[40] + Giới hạn định lượng (LOQ): 10 ɳg/ml

4 + Đường tuyến tính: 10 – 10,000 ɳg/ml cho sulphasalazin và 10 – 1000 ɳg/ml cho sulphapyridin và mesalamin+ Thiết bị: API-3000 LC-MS/MS

+ Cột: XBP Phenyl (100mm x 2,1 mm, 5 àm)

+ Pha động: Acid formic 0,2%, amoni acetat 2mM trong nước (pha động A) và acid formic 0,2%, amoni acetat trong methanol 2mM (pha động B) tách gradient + Thể tớch tiờm: 10 àl

+ Thuốc sử dụng: Viên sulphasalazin 250 mg cho 10 người tình nguyện + Thời điểm lấy mẫu: 0; 1; 2; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 6; 7; 8; 10; 12; 15; 24; 36 và 48 giờ

+ Phương pháp chiết: Kết tủa protein bằng 1ml methanol và cộng sự + Chuẩn nội: 4-ASA và N-Ac-4-ASA

[76] + Giới hạn định lượng (LOQ): 50 ɳg/ml

+ Đường tuyến tính: 50 – 4000 ɳg/ml + Thiết bị: HPLC

+ Cột: Synergi Hydro-RP (4 àm, 150 mm x 2,0 mm) bảo vệ bởi cột (4 àm, 10 mm x 2,0 mm), cả 2 cột được cung

+ Pha động: Acid acetic 17,5 mmol/l (pH 3,3) : acetonitril tỉ lệ 85:15 + Thể tớch tiờm: 4 àl + Thuốc sử dụng: Viên mesalamin 1200 mg cho 24 người tình nguyện

+ Thời điểm lấy mẫu: 0; 1; 2; 4; 6; 8; 12; 18; 24; 32 và 48 giờ Nobilis

+ Phương pháp chiết: Kết tủa protein bằng HClO 4 và cộng sự + Chuẩn nội: N-acetyl-4-ASA và N-propionyl-4-ASA

6 [72] + Giới hạn định lượng (LOQ): 43,3 ɳg/ml

+ Đường tuyến tính: 43,3 – 4966,7 ɳg/ml

+ Cột: LiChroCART (250 mm x 4 mm) và tiền cột LiChroCART®

+ Pha động: Acetonitril – Na 2 HPO 4 0,01M đệm pH 3 với tỉ lệ 15:85 + Thể tớch tiờm: 100 àl + Thuốc sử dụng: Viên mesalamin 500 mg cho 14 người tình nguyện

● Một số nghiên cứu in vivo viên mesalamin giải phóng tại đại tràng

Amandeep Singh và cộng sự (2021) đánh giá hấp thu in vivo pellet mesalamin kiểm soát giải phóng tại đại tràng trên chuột Wistar cân nặng 190 – 260 g Chuột thí nghiệm được uống pellet nhân chứa mesalamin và pellet bao mesalamin giải phóng tại đại tràng sử dụng màng bao kiểm soát giải phóng chứa cellulose acetat phthalat Chuột được uống với liều 23 mg/kg, sau đó định lượng nồng độ mesalamin hấp thu trong máu bằng phương pháp HPLC Kết quả nghiên cứu cho thấy chuột uống pellet nhân chứa mesalamin đạt T max là 0,82 ± 0,19 giờ, nhanh hơn rất nhiều so với chuột uống pellet mesalamin bao kiểm soát giải phóng tại đại tràng với T max là 5,91 ± 0,77 Ngoài ra, nồng độ C max trên chuột uống pellet nhân là 3,15 ± 0,98 mg/ml, cao hơn nhiều so với nồng độ C max trên chuột uống pellet bao là 1,06 ± 0,37 mg/ml Diện tích dưới đường cong AUC của pellet nhân (14,05 ± 1,53 àg/ml/giờ) lớn hơn so với pellet bao (13,02 ± 1,31 àg/ml/giờ). Mesalamin ít hấp thu ở đại tràng do có đặc tính thân nước nên chỉ một lượng nhỏ được hấp thu vào máu qua màng lipid [20].

Phương pháp phân tích nồng độ mesalamin trong huyết tương cũng được C. Parmar và cộng sự (2018) áp dụng để đánh giá hấp thu in vivo viên mesalamin giải phóng tại đại tràng trên mô hình thỏ thí nghiệm, qua đó chứng minh thuốc giải phóng phần lớn ở đại tràng so với dạng bào chế nhanh hấp thu mesalamin chủ yếu ở phần trên đường tiêu hóa [27]

Ngoài ra, để đánh sự hấp thu mesalamin in vivo của dạng bào chế giải phóng tại đại tràng, A Foppoli và cộng sự (2019) đã định lượng mesalamin và chất chuyển hóa của nó N-acetyl 5-ASA (Ac5-ASA) trong huyết tương và nước tiểu người tình nguyện bằng phương pháp HPLC để đánh giá sự hấp thu và giải phóng của thuốc giải phóng tại đại tràng trong đường tiêu hóa người tình nguyện [11]

Qua tổng quan các nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới Các nghiên cứu trong luận án được định hướng như sau:

Pellet kiểm soát giải phóng tại đại tràng gồm nhân và màng bao kiểm soát giải phóng Nhân pellet chứa dược chất được bào chế theo phương pháp đùn – tạo cầu và màng bao kiểm soát giải phóng được bào chế bằng phương pháp bao tầng sôi.

Polyme kiểm soát giải phóng là Eudragit S100, zein hoặc có thể kết hợp thêm một polyme không tan trong nước như ethylcellulose nhằm mục đích làm chậm quá trình giải phóng dược chất.

Phương pháp đánh giá giải phóng in vitro, nghiên cứu định hướng thử trong

3 môi trường pH 1,2; đệm phosphat pH 7,4 và đệm phosphat pH 6,8 Phương pháp đánh giá giải phóng in vivo, nghiên cứu sử dụng phương pháp chụp X-quang để xác định vị trí pellet trong đường tiêu hóa chó thí nghiệm, định lượng hàm lượng dược chất trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ.

Khái niệm 26 1.4.2 Thành phần pellet 26 1.4.3 Phương pháp bào chế pellet 29 1.4.4 Thiết bị bào chế pellet bằng kỹ thuật đùn – tạo cầu 30 1.4.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính của pellet bằng kỹ thuật đùn – tạo cầu 30 1.4.6 Kỹ thuật bào chế pellet giải phóng tại đại tràng 31 1.4.7 Một số nghiên cứu pellet mesalamin giải phóng tại đại tràng 34 2 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

Pellet là những “hạt thuốc nhỏ” có dạng hình cầu hoặc gần cầu, thường có đường kính từ 0,25 đến 1,5 mm Bản thân pellet không phải là một dạng bào chế hoàn chỉnh mà chỉ là những chế phẩm trung gian hoặc bán thành phẩm phải được đóng gói, nang cứng hoặc dập thành viên mới tạo thành các chế phẩm hoàn chỉnh [7].

Pellet là sản phẩm trung gian để bào chế thành dạng thuốc rắn Về cơ bản, pellet có các thành phần như sau:

Tá dược tạo cầu là những chất có khả năng tạo cho các đoạn sợi hình trụ được đùn/ép ra từ máy đùn có đủ độ dẻo cần thiết để khi chuyển động liên tục trong thiết bị vo/tạo cầu có thể biến dạng thành các pellet hình cầu hoàn chỉnh Tá dược tạo cầu là các loại cellulose vi tinh thể (microcrystalline cellulose, MCC), thường được ứng dụng là Avicel PH Các tá dược khác như calci phosphat, lactose, tinh bột, tinh bột biến tính hoàn toàn không có khả năng tạo cầu [7].

Lactose, manitol, sacarose, tinh bột, cellulose vi tinh thể được sử dụng làm tá dược độn trong xây dựng công thức pellet bào chế bằng kỹ thuật đùn - tạo cầu [7].

Là thành phần bắt buộc phải có khi bào chế pellet bằng kỹ thuật đùn - tạo cầu Tá dược dính có thể được phối hợp vào thành phần của pellet dưới dạng tá dược dính lỏng hoặc được phối hợp vào thành phần pellet dưới dạng bột khô cùng dược chất và các tá dược khác, rồi thêm nước hoặc dung môi thích hợp (dung dịch ethanol, alcol isopropylic) vào khối bột kép và nhào ẩm [7].

Là thành phần thiết yếu khi bào chế pellet giải phóng ngay bằng kỹ thuật đùn

- tạo cầu, làm cho pellet rã nhanh, giải phóng dược chất nhanh Trong quá trình bào chế, lực ép khi đùn sợi đã làm giảm đáng kể mật độ và kích thước các lỗ xốp trong pellet, làm giảm mao dẫn nước vào trong pellet, trì hoãn quá trình trương nở của tá dược rã để phá vỡ cấu trúc pellet Các tá dược siêu rã hay sử dụng trong bào chế pellet giải phóng ngay là tinh bột biến tính như natri starch glycolat, natri croscarmelose, crospovidon… [7].

Tá dược trơn làm giảm lực ma sát giữa bề mặt của khối bột ẩm đang ép sợi với bề mặt lỗ sàng của máy đùn, giúp cho khối bột ẩm dễ dàng đi qua mắt sàng để tạo ra các sợi ép hình trụ không dính lại với nhau và không dính với mắt sàng; đồng thời sự có mặt của tá dược trơn làm giảm sinh nhiệt do ma sát trong quá trình đùn/ép sợi Trong quá trình vo/tạo cầu, sự có mặt của tá dược trơn làm cho các đoạn sợi hình trụ không dính vào nhau khi chuyển động trong thiết bị vo/tạo cầu; song cần lưu ý, nếu thừa tá dược trơn thì đĩa ma sát của thiết bị vo/tạo cầu vẫn quay tròn,còn các pellet không chuyển động mà tụ lại với nhau thành khối, làm giảm độ cầu của pellet thu được Có thể sử dụng talc, silic dioxyd keo (Aerosil 200), kaolin, natri lauryl sulfat…, làm tá dược trơn [7].

● Tá dược tăng khả năng giải phóng dược chất từ pellet Để đảm bảo độ hòa tan dược chất, nhất là các dược chất ít tan, từ pellet bào chế bằng kỹ thuật đùn - tạo cầu, có thể phối hợp vào pellet các chất trợ tan là các chất diện hoạt như các polysorbat, các poloxamer, natri lauryl sulfat hoặc các dung môi không bay hơi để tạo hệ rắn - lỏng (liquisolid) như propylen glycol, polyethylen glycol 200 - 400, cremophor hoặc sử dụng các tá dược có khả năng tạo vi môi trường pH như natri citrat, natri hydrocarbonat, natri phosphat, meglumin kết hợp với dược chất bản chất là các acid yếu hoặc các acid hữu cơ như acid citric, acid tartaric, acid fumaric, acid sucinic kết hợp với dược chất bản chất là các base yếu [7].

● Tá dược ổn định dược chất

Nếu thành phần dược chất đưa vào bào chế pellet kém ổn định dưới tác động của oxy, ẩm, pH không thích hợp… thì cần phối hợp vào pellet các tá dược thích hợp để ổn định dược chất [7].

Với các pellet giải phóng ngay, quy trình bào chế pellet có thể kết thúc khi thu được sản phẩm pellet đạt các tiêu chuẩn chất lượng mong muốn Nhưng để bào chế được các pellet có khả năng giải phóng dược chất biến đổi (drug modified release), tùy theo mục đích, các sản phẩm pellet sẽ tiếp tục được bao màng (film coating) sử dụng các loại tá dược bao khác nhau [7].

● Tá dược bao tan ở đại tràng

Các pellet giải phóng tại đại tràng có thể được bào chế bằng cách sử dụng các biopolyme như zein kết hợp với các polyme nhạy cảm với pH và các polyme khác, với tỷ lệ thích hợp để bao màng cho pellet [7] Zein là một protein được sản xuất dưới dạng bột từ bột gluten ngô Dựa trên khối lượng phân tử và chuỗi đồng đẳng, zein được chia ra thành α-zein (19 – 22 kDa), β-zein (14 kDa), γ-zein (16 và

27 kDa) và δ-zein (10 kDa) Trong đó, α-zein, β-zein, γ-zein lần lượt chiếm 75 – 80

%, 10 – 15 % trong tổng thành phần zein Dạng δ-zein chỉ chiếm một lượng rất nhỏ trong tổng thành phần zein Các zein thương mại chứa chủ yếu α-zein và một lượng nhỏ β-zein và γ-zein [108] Độ tan khác nhau của các loại zein này do cấu trúc chuỗi amino acid khác nhau Không giống như các gluten có chứa các amino acid tan tốt trong nước, zein chứa các amino acid phân cực và không phân cực, nên có đặc tính lưỡng cực Vì vậy, zein tan trong một số dung môi như dung dịch alcohol và kiềm; không tan trong nước và aceton [108] Cấu trúc của zein liên quan đến tính chất hóa lý và cơ chế tự lắp ráp trong các hệ thống khác nhau Không giống gluten, α-zein gồm các đơn vị lặp lại tương đồng cao và có lượng lớn cấu trúc α-helix, trong khi β -zein có ít cấu trúc α-helix, chủ yếu là các chuỗi β-sheet và cấu trúc không theo chu kỳ (β- turn và cuộn ngẫu nhiên) γ-zein chứa 33 % cấu trúc α-helix và 31 % cấu trúc β-sheet trong trạng thái vật lý của nó δ-zein không có các chuỗi lặp lại hoặc cấu trúc rõ ràng Zein hình thành cấu trúc mạng lưới protein dạng sợi khi trộn với nước ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ chuyển kính (T g ) Mạng lưới zein đầu tiên được quan sát trên hệ zein - tinh bột Trong hệ này, zein, tinh bột và nước trộn lẫn trên nhiệt độ chuyển kính T g của zein (ví dụ 30 – 40 oC), hình thành dạng nhão nhớt, bám dính và giãn nở Mạng lưới zein nhớt có thể chỉ được hình thành khi zein bị hydrat hóa và trộn lẫn ở nhiệt độ lớn hơn T g [108] Zein in thường được sử dụng kết hợp với các polyme khác trong thành phần màng bao kiểm soát giải phóng tại đại tràng Minh N.U Nguyen và cộng sự đã sử dụng kết hợp zein mang điện tích dương và polyme Kollicoat MAE 100P có độ tan phụ thuộc pH mang điện tích âm tạo thành màng bao pellet kiểm soát giải phóng tại đại tràng theo cơ chế ăn mòn màng bao, giải phóng phần lớn dược chất ở đại tràng [65] Ngoài ra, zein cũng có thể kết hợp với polyme bị phân hủy bởi các enzym của đường tiêu hóa trong bào chế thuốc giải phóng tại đại tràng Wai-Wa Tang và cộng sự đã bào chế được màng bao viên nén chứa hợp chất zein-pectin bền vững ở đoạn đầu đường tiêu hóa, bị ăn mòn và giải phóng phần lớn dược chất ở đại tràng [107].

1.4.3 Phương pháp bào chế pellet

Có nhiều phương pháp bào chế pellet như đùn – tạo cầu (extrusion and spheronization), bồi dần (layering), phun sấy (spray drying), phun đông tụ (spray congealing) Trong đó, phương pháp đùn – tạo cầu là phương pháp được áp dụng rộng rãi nhất Các công đoạn bào chế pellet bằng phương pháp đùn – tạo cầu gồm trộn bột khô, trộn bột ướt, ủ, đùn thành sợi hình trụ, vo tạo cầu và sấy khô pellet.

1.4.4 Thiết bị bào chế pellet bằng kỹ thuật đùn – tạo cầu

Các thiết bị/máy thông dụng trong bào chế thuốc bột, thuốc cốm, viên nén như các máy xay, máy nghiền, máy rây, máy trộn bột khô, máy nhào trộn bột ẩm, thiết bị sấy khô, đều dùng được trong bào chế pellet bằng kỹ thuật đùn - tạo cầu ở các giai đoạn: xay - nghiền mịn dược chất/tá dược, trộn hỗn hợp bột khô, nhào trộn khối bột ẩm và làm khô pellet Nhưng có hai giai đoạn phải sử dụng máy chuyên dụng là máy đùn/ép sợi để tạo các sợi hình trụ và máy vo/tạo cầu để chuyển các đoạn sợi hình trụ thành pellet hình cầu [7].

1.4.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính của pellet bằng kỹ thuật đùn – tạo cầu Yếu tố công thức: Để bào chế được pellet bằng kỹ thuật đùn - tạo cầu, trong công thức pellet nhất thiết phải có tá dược tạo cầu thích hợp thì mới thu được sản phẩm là các pellet hình cầu hoặc phỏng cầu Nhưng cần lưu ý là tá dược tạo cầu có ảnh hưởng lớn đến giải phóng dược chất từ pellet Vì vậy, khi xây dựng công thức bào chế pellet giải phóng ngay chỉ nên sử dụng tá dược tạo cầu với tỷ lệ thấp nhất, vừa đủ để tạo cầu, đồng thời ít ảnh hưởng nhất tới khả năng làm chậm giải phóng dược chất Thể tích tá dược dính lỏng hoặc nước dùng cho giai đoạn nhào ẩm, cần được xác định vừa đủ cho từng công thức pellet, để có được khối bột ẩm đủ dẻo, cho phép đùn/ép ra các sợi đùn chắc, mịn, bề mặt nhẵn, không dính sàng khi đùn/ép Nếu thiếu nước hoặc tá dược dính lỏng, khối ẩm không đủ dẻo, sợi đùn ra không chắc, bề mặt thô ráp, dẫn tới phát sinh nhiều tiểu phân mịn khi vo/tạo cầu và pellet thu được sẽ có kích thước rất khác nhau Nếu thừa nước hoặc tá dược dính lỏng, khối bột quá ẩm, sợi đùn ra bết dính với nhau và bết dính với bề mặt máy, với sàng máy đùn và khi vo/tạo cầu chúng rất dễ bết dính với nhau, pellet thu được sẽ có kích thước rất khác nhau [7].

Các thông số kỹ thuật: Trong giai đoạn nhào ẩm, trình tự phối hợp các thành phần trong giai đoạn nhào ẩm để tạo khối ẩm có thể ảnh hưởng đáng kể đến khả năng giải phóng dược chất từ pellet thu được Vì vậy, cần nghiên cứu lựa chọn trình tự phối hợp dược chất với các thành phần có trong công thức pellet sao cho sản phẩm thu được, đạt được yêu cầu về tốc độ và mức độ giải phóng dược chất dự định Trong giai đoạn đùn/ép, tốc độ đùn sợi có ảnh hưởng nhất định đến hiệu suất sản xuất pellet, cũng như đặc tính của pellet Tốc độ đùn sợi chậm làm giảm hiệu suất nhưng sợi đùn ra thường chắc, mịn, bề mặt nhẵn; ngược lại, tốc độ đùn sợi cao thường ra các sợi đùn có bề mặt thô, ráp, các tiểu phân trong sợi kết dính yếu sẽ sinh ra nhiều bột mịn khi vo/tạo cầu và pellet thu được có kích thước rất khác nhau [7].

NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 37

Nguyên liệu 37 2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 39 2.1.2.1 Thiết bị bào chế 39 2.1.2.2 Thiết bị và dụng cụ đánh giá 40 2.1.3 Động vật thí nghiệm 41 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 41 2.1.5 Nội dung nghiên cứu 41 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41

Nguồn gốc và tiêu chuẩn chất lượng của các nguyên liệu dùng trong nghiên cứu được ghi trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Các nguyên liệu và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Nhà sản xuất Tiêu chuẩn

Các hóa chất dùng cho bào chế

(Kích thước tiểu phân D90: 15 đến 20 àm)

8 Triethyl citrat Đức Basf SE TCNS

9 Lactose monohydrat Hà Lan Friesland

Celulose vi tinh thể PH101 Đài Loan

Dung dịch xenetix 6 mg/ml Pháp Guerbet

Các hóa chất dùng cho kiểm nghiệm

(Lô: R001T0; hàm lượng nguyên trạng:

QT181020213; hàm lượng nguyên trạng 99,49%)

7 Kali dihydrophosphat Đức Me rk TCNS

8 Natri hydroxyd Đức Me rk TCNS

23 Acetonitril dùng cho LC-MS

24 Acid formic Mỹ Fisher TCNSX

25 Natri 1-octanesulfonat Mỹ Fisher TCNSX

26 Acid phosphoric Mỹ Fisher TCNSX

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị bào chế dùng cho nghiên cứu được ghi ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Các thiết bị bào chế

T Dụng cụ - Thiết bị Công suất thiết bị Địa điểm nghiên cứu

1 Máy trộn siêu tốc LM-10 800 g – 3 kg Bidiphar Trung

3 Máy vo Caleva MBS 250 100 g - 400 g Bidiphar Anh

4 Máy bao tầng sôi Qui

5 Máy bao tầng sôi Uni-

6 Tủ sấy Binder 1 m 3 Bidiphar Đức

8 Máy đóng nang tự động

9 Bộ rây chọn kích thước hạt

10 Các dụng cụ thủy tinh Bidiphar Đức

2.1.2.2 Thiết bị và dụng cụ đánh giá

Thiết bị và dụng cụ đánh giá như ghi ở bảng 2.3

Bảng 2.3 Các thiết bị và dụng cụ đánh giá

T Dụng cụ - Thiết bị Nguồn gốc

1 Cân phân tích 4 số lẻ A&D GH200 Nhật

2 Cân sấy ẩm A&D MX50 Nhật

3 Máy đo pH Mettler Toledo pH220 Thụy sĩ

4 Máy thử hoà tan 14 cốc Erweka DT-1614 Đức

5 Máy quang phổ Agilent 8453 Mỹ

6 Máy HPLC Shimadzu LC-2030 Nhật

7 Máy LC-MS/MS Shimadzu LCMS-8040 Nhật

8 Tủ vi khí hậu Binder KBF-115 Đức

9 Tủ lạnh âm sâu Panasonic MDF-137 Nhật

10 Máy siêu âm ULTRASONIC LC60H Đức

11 Máy lắc xoáy Labnet VX100 Mỹ

12 Máy ly tâm Hermle Z200A Đức

13 Micropipet 1000 àL; 200 àL; 500 àL Đức

14 Máy chụp X-quang Serix 250 mA Đức

15 Bình định mức, pipet class A Pháp

Chó thí nghiệm: Chó ta trưởng thành, giống đực, khỏe mạnh, cân nặng 10 -

18 kg, được nuôi dưỡng trong điều kiện thí nghiệm với chế độ ăn uống đầy đủ và được kiểm soát.

Các nội dung chính của đề tài được thực hiện tại:

Bộ môn Bào chế - Trường Đại Học Dược Hà Nội

Công ty cổ phần Dược Bình Định (Bidiphar)

Phòng khám đa khoa Thành Danh ở 294 Trường Chinh, Nhơn Hưng, An Nhơn, Bình Định (Chụp X-quang chó)

2.1.5 Nội dung nghiên cứu Để hoàn thành mục tiêu nghiên cứu, luận án đã thực hiện các nội dung nghiên cứu sau:

- Thẩm định các phương pháp định lượng mesalamin áp dụng trong luận án

- Xây dựng công thức pellet nhân mesalamin bằng phương pháp đùn, tạo cầu

- Xây dựng công thức pellet mesalamin giải phóng tại đại tràng bằng phương pháp bao film

- Nâng cấp quy mô bào chế pellet mesalamin giải phóng tại đại tràng ở quy mô 2 kg pellet nhân / mẻ bao

- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá độ ổn định của pellet nghiên cứu

- Đánh giá in vivo pellet mesalamin giải phóng tại đại tràng trên chó thí nghiệm

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu tiền công thức

2.2.1.1 Nghiên cứu tính chất dược chất

● Nghiên cứu ổn định của mesalamin trong các điều kiện khác nhau

Cho 100 mg mesalamin vào bình định mức 200ml, thêm nước vừa đủ 200ml được dung dịch (1).

Lấy 25ml dung dịch (1) cho vào bình định mức 50ml, thêm nước vừa đủ được dung dịch (1.1) Bảo quản dung dịch (1.1) ở nhiệt độ phòng, trong điều kiện tránh ánh sáng trong 48 giờ được mẫu DC/01.

Pha loãng dung dịch (1) với nước ở tỉ lệ 1:1 được dung dịch (1.2) Chiếu ánh sáng UV vào (1.2) trong 48 giờ được mẫu DC/02.

Pha loãng dung dịch (1) với nước ở tỉ lệ 1:1 được dung dịch (1.3) Đun nóng dung dịch (1.3) ở 100 o C trong 2 giờ được mẫu DC/03.

Pha loãng dung dịch (1) với dung dịch NaOH 0,2N ở tỉ lệ 1:1 được dung dịch (1.4) Bảo quản dung dịch (1.4) ở nhiệt độ phòng, trong điều kiện tránh ánh sáng trong 48 giờ được mẫu DC/04.

Pha loãng dung dịch (1) với dung dịch HCl 0,2N ở tỉ lệ 1:1 được dung dịch (1.5) Bảo quản dung dịch (1.5) ở nhiệt độ phòng, trong điều kiện tránh ánh sáng trong 48 giờ được mẫu DC/05.

Tiến hành phân tích các mẫu DC/01, DC/02, DC/03, DC/04 và DC/05 bằng phương pháp sắc ký HPLC và đánh giá cảm quan, hàm lượng mesalamin.

● Nghiên cứu độ ổn định của mesalamin trong môi trường có tác nhân oxi hóa và tác nhân chống oxi hóa như dinatri edetat, natri metabisulfit, vitamin C

Cho 100 mg mesalamin vào bình định mức 200 ml, cho dung dịch H 2 O 2 5 % vừa đủ thể tích được dung dịch (2).

Pha loãng dung dịch (2) và dung dịch H 2 O 2 5% ở tỉ lệ 1:1 được dung dịch (2.1). Bảo quản dung dịch (2.1) ở nhiệt độ phòng, ở điều kiện tránh ánh sáng trong 48 giờ được mẫu DC/06.

Cho natri metabisulfit vào dung dịch (2), hòa tan hoàn toàn được dung dịch natri metabisulfit 0,25 mg/ml (dung dịch 2.2) Bảo quản dung dịch (2.2) ở nhiệt độ phòng, trong điều kiện tránh ánh sáng trong 48 giờ được mẫu DC/07.

Cho vitamin C vào dung dịch (2), hòa tan hoàn toàn được dung dịch vitamin C0,25 mg/ml (dung dịch 2.3) Bảo quản dung dịch (2.3) ở nhiệt độ phòng, trong điều kiện tránh ánh sáng trong 48 giờ được mẫu DC/08.

Cho EDTA vào dung dịch (2), hòa tan hoàn toàn được dung dịch EDTA 0,25 mg/ml (dung dịch 2.4) Bảo quản dung dịch (2.4) ở nhiệt độ phòng, trong điều kiện tránh ánh sáng trong 48 giờ được mẫu DC/09.

Tiến hành phân tích các mẫu DC/06, DC/07, DC/08, DC/09 bằng phương pháp sắc ký HPLC và đánh giá cảm quan, hàm lượng mesalamin.

2.2.1.2 Nghiên cứu tương tác dược chất - tá dược

Trộn đều mesalamin và các tá dược theo tỉ lệ 1:1 Bột sau khi trộn được đóng vào lọ thủy tinh màu nâu, đậy nút cao su và chụp nắp nhôm Bảo quản các mẫu ở điều kiện lão hóa cấp tốc ở nhiệt độ 40 o C, độ ẩm 75 ± 5% và tiến hành phân tích đánh giá cảm quan, hàm lượng mesalamin sau 1 và 3 tháng bảo quản bằng phương pháp HPLC

Phương pháp bào chế 43 1 Bào chế pellet nhân mesalamin 43

2.2.2.1 Bào chế pellet nhân mesalamin

Pellet nhân chứa mesalamin được bào chế bằng phương pháp đùn tạo cầu theo các thành phần như ghi trong bảng 2.4: Tạo hỗn hợp bột đồng nhất của mesalamin, tá dược tạo cầu celulose vi tinh thể PH101 (MCC PH101), tá dược tạo kênh khuếch tán (lactose) hoặc tá dược rã (natri starch glycolat) và tá dược trơn (Aerosil) Nhào ẩm khối bột bằng dung dịch PVP K30 trong nước Ủ hỗn hợp ẩm trong 1 giờ, sau đó tiến hành đùn sợi qua máy đùn đường kính lỗ đùn 0,8 – 1 mm. Tốc độ đùn 80 vòng/phút Sợi ra máy đùn được tạo cầu ở tốc độ 1500 vòng/phút. Pellet sau tạo cầu được sấy khô ở 60 o C đến độ ẩm < 3 % Quy mô thí nghiệm 500 g/mẻ.

Bảng 2.4 Thành phần pellet nhân tính cho lượng pellet chứa 500 mg mesalamin

STT Thành phần Khối lượng

2 MCC PH101 Thay đổi theo nghiên cứu

3 Lactose monohydrat Thay đổi theo nghiên cứu

4 Natri starch glycolat Thay đổi theo nghiên cứu

7 Nước * Thay đổi theo nghiên cứu

* bay hơi trong quá trình bào chế pellet

● Bào chế pellet nhân chứa chất cản quang

Bào chế pellet nhân chứa chất cản quang (tính cho lượng pellet chứa 500 mg mesalamin): Nhân pellet gồm mesalamin 500 mg, bari sulfat 80 mg, MCC PH101, lactose monohydrat, DST, PVP K30, dung dịch Xenetix 6 mg/ml (0,2 ml), Aerosil

200 và nước Pellet nhân được bào chế với trình tự và các thông số kỹ thuật giống như bào chế pellet nhân nêu trên Pellet nhân chứa chất cản quang đạt yêu cầu được bao film với công thức màng bao tối ưu thu được trong nghiên cứu tối ưu hoá Quy trình bao được tiến hành theo mô tả ở mục 2.2.2.2 dưới đây.

2.2.2.2 Bào chế pellet mesalamin giải phóng tại đại tràng

Pellet nhân đạt tiêu chuẩn được bao kiểm soát giải phóng bằng dịch bao có thành phần như ghi ở bảng 2.5 Dịch bao được pha chế bằng cách hòa tan chất hóa dẻo trong khoảng 70 % lượng ethanol 80 % Hòa tan zein và các polyme kiểm soát giải phóng vào dung dịch trên Nghiền mịn bột talc, cho qua rây 180 và cho vào dung dịch polyme Bổ sung ethanol 80 % vừa đủ.

Bao film bằng thiết bị tầng sôi Qui Long hoặc Uni-Glatt với thông số:

- Thiết bị tầng sôi Uni-Glatt: Nhiệt độ khí thổi vào 60 o C (khí đã được tách ẩm); nhiệt độ khí ra 40 o C; lưu lượng khí vào 40 % công suất của máy; áp suất súng phun 1 bar; đường kính súng 1 mm; tốc độ phun dịch 2,5 ml/phút; chiều cao ống Wusrter 5 cm Mỗi mẻ bao 50 g pellet nhân.

- Thiết bị tầng sôi Qui Long: Nhiệt độ khí thổi vào 30 o C; áp suất súng phun 1 bar; đường kính súng 1 mm; tần số quạt hút 28 – 30 Hz, tốc độ bơm nhu động tương ứng 2,8 g/phút Mỗi mẻ bao 240 g pellet nhân.

Bảng 2.5 Thành phần dịch bao film pellet

1 Zein Thay đổi theo nghiên cứu

2 Eudragit S100 Thay đổi theo nghiên cứu

3 Ethyl celulose Thay đổi theo nghiên cứu

4 Pectin Thay đổi theo nghiên cứu

5 Acid stearic Thay đổi theo nghiên cứu

6 Chất hóa dẻo DBP hoặc glycerin hoặc TEC 20 % tổng polyme (kl/kl)

7 Talc 20 % tổng polyme (kl/kl)

8 Tween 80 Thay đổi theo nghiên cứu

9 EtOH 80 % Vừa đủ để dịch bao chứa 6 % polyme

Phương pháp thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa công thức màng bao pellet giải phóng tại đại tràng 45

Sau khi khảo sát các tá dược trong dịch bao ảnh hưởng đến bào chế pellet mesalamin giải phóng tại đại tràng, các thành phần sau được lựa chọn để thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa công thức dịch bao pellet.

Bảng 2.6 Thành phần dịch bao trong các công thức tối ưu

1 Zein Thay đổi theo nghiên cứu

2 Eudragit S100 Thay đổi theo nghiên cứu

3 Ethylcellulose Thay đổi theo nghiên cứu

4 Dibutyl phtalat 20 % tổng polyme (kl/kl)

5 Talc 20 % tổng polyme (kl/kl)

6 EtOH 80 % Vừa đủ để dịch bao chứa 6 % polyme

Sử dụng phần mềm MODDE 12.0 để thiết kế thí nghiệm một cách ngẫu nhiên dựa trên nguyên tắc hợp tử tại tâm Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa màng bao với các yếu tố cố định: Tỷ lệ zein : EC = 1:1; tỷ lệ % DBP so với tổng lượng polyme (zein, EC và Eudragit S100) = 20 %; tỷ lệ % talc so với tổng lượng polyme = 20 %. Các yếu tố thay đổi của biến đầu vào: Tỷ lệ % khối lượng màng bao so với khối lượng pellet nhân (X 1 ); tỷ lệ % Eudragit S100 so với tổng lượng polyme (X 2 ) và nhiệt độ ủ trong 24 giờ sau khi bao (X 3 ) Biến đầu ra Y 1 là T 10 và Y 2 là T 80 tương ứng với thời gian 10 % và 80 % thuốc giải phóng.

Sử dụng mô hình bề mặt đáp ứng (response surface methodology, RSM),thiết kế mặt tại tâm hỗn hợp trung tâm (central composite face-centered, CCF) bằngMODDE 12.0 gồm 17 thí nghiệm Pellet nhân đạt tiêu chuẩn được bao film theo 17 công thức đã thí nghiệm bằng phần mềm MODDE 12.0 theo thông số đã chọn.

Tiến hành thử hòa tan để xác định sự ảnh hưởng của biến độc lập và biến phụ thuộc là T 10 (Y 1 ) và T 80 (Y 2 ), sau đó xác định công thức màng bao tối ưu bằng phần mềm MODDE 12.0

Phương pháp đánh giá 46 1 Thẩm định các phương pháp định lượng mesalamin 46

2.2.4.1 Thẩm định các phương pháp định lượng mesalamin

Tham khảo tài liệu [100], [101] và các kết quả thực nghiệm, quy trình phân tích được xác định như sau:

900 ml dung dịch acid hydrocloric 0,1 N, đệm phosphat pH 7,4 và đệm phosphat pH 6,8 được chuẩn bị như sau:

+ Môi trường acid hydrocloric 0,1 N: pha loãng 8,5 ml acid hydrocloric với nước vừa đủ 1000 ml.

+ Môi trường đệm phosphat pH 7,4: pha loãng 250 ml dung dịch kali dihydrophosphat 0,2M và 195,5 ml dung dịch natri hydroxyd 0,2 M với nước vừa đủ 1000 ml.

+ Môi trường đệm phosphat pH 6,8: pha loãng 250 ml dung dịch kali dihydrophosphat 0,2M và 112 ml dung dịch natri hydroxyd 0,2 M với nước vừa đủ 1000 ml.

+ Mẫu trắng: môi trường hòa tan

+ Mẫu placebo: chuẩn bị như mẫu thử nhưng không chứa hoạt chất

+ Mẫu chuẩn: Cân chính xác 27,8 mg chuẩn mesalamin vào bình 100 ml, thêm 30 ml môi trường hòa tan, siêu âm hòa tan, thêm môi trường hòa tan vừa đủ thể tích Hút chính xác 2 ml dung dịch này cho vào bình định mức 20 ml, thêm môi trường hòa tan vừa đủ thể tích, trộn đều thu được dung dịch chuẩn.

+ Mẫu thử: sau thời gian hòa tan quy định, lấy một phần dịch hòa tan, lọc. Pha loãng dịch lọc thu được (nếu cần) với môi trường hòa tan.

- Tiến hành Đo độ hấp thụ của dung dịch thu được ở bước sóng cực đại 301 nm đối với môi trường hòa tan là dung dịch HCl 0,1 N pH 1,2; 330 nm đối với môi trường hòa tan pH 6,8 và 7,4.

- Phương pháp UV-VIS được thẩm định theo các chỉ tiêu sau [37]:

Chuẩn bị các mẫu sau: Mẫu trắng là pha động; mẫu placebo là mẫu pellet bao gồm nhân pellet chứa các thành phần tá dược giống công thức CT7 ở bảng

3.27 (không chứa hoạt chất mesalamin) và màng bao pellet chứa các thành phần tá dược giống công thức tối ưu ở bảng 3.37 Mẫu placebo được bào chế theo quy trình bào chế pellet bao ở mục 2.2.2; mẫu thử được chuẩn bị theo quy trình; mẫu chuẩn được chuẩn bị theo quy trình Tiến hành đo quang mẫu trắng, mẫu placebo, mẫu chuẩn và mẫu thử Phương pháp đạt tính đặc hiệu khi phổ mẫu thử phải trùng với phổ mẫu chuẩn hoặc có cực đại hấp thụ tương đương nhau; ảnh hưởng của mẫu placebo đến kết quả định lượng hòa tan phải ≤ 2,0

+ Tính tương thích hệ thống

Thực hiện trên mẫu chuẩn 100 % (từ phần thẩm định tính đặc hiệu) Đo độ hấp thụ 6 lần trên mẫu chuẩn Tính độ lệch chuẩn tương đối độ hấp thụ của mẫu chuẩn Yêu cầu: giá trị RSD của độ hấp thụ từ 6 lần đo mẫu chuẩn phải ≤ 2,0 %.

Chuẩn bị 6 mẫu tự tạo có chứa 1%, 25 %, 50 %, 75 %, 100 % và 125 % lượng mesalamin so với nồng độ định lượng hòa tan (0,0278 mg/ml) Đo độ hấp thụ của các dung dịch trên ở bước sóng cực đại, sau đó xác định phương trình hồi qui tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ Phương pháp đạt tính tuyến tính khi hệ số tương quan R ≥ 0,998.

Chuẩn bị 4 mẫu tự tạo bằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn cần phân tích vào các mẫu giả dược Lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với 3 mức nồng độ 1%, 10%, 80 % và 125 % so với nồng độ định lượng Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện 3 mẫu độc lập Tiến hành phân tích mẫu theo quy trình phân tích Độ đúng của phương pháp được xác định dựa theo công thức: Độ đúng hay tỉ lệ thu hồi (%) Lượng hoạt chất thu hồi

Lượng hoạt chất thêm vào x 100%

Phương pháp đạt độ đúng khi tỉ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ từ 97,0 -

103,0 % và RSD tỉ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ ≤ 2,0 %.

+ Khoảng xác định: Được suy ra từ kết quả độ đúng và tính tuyến tính (từ giá trị nhỏ nhất đến giá trị lớn nhất của độ đúng).

+ Độ chính xác Độ chính xác của phương pháp thể hiện ở độ lặp lại và độ chính xác trung gian.

Chuẩn bị 6 mẫu thử độc lập Xác định hàm lượng hòa tan dựa vào độ hấp thụ đo được của các dung dịch chuẩn, dung dịch thử ở bước sóng cực đại, mẫu trắng là môi trường hòa tan Phương pháp đạt độ lặp lại khi giá trị RSD

(%) kết quả định lượng hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu ≤ 2,0 %

+ Độ chính xác trung gian

Tiến hành như độ lặp lại nhưng trong 2 ngày khác nhau và thiết bị phân tích khác nhau Phương pháp phân tích đạt độ chính xác trung gian khi hàm lượng mesalamin trong 6 mẫu thử trong một ngày và trong 12 mẫu thử trong hai ngày đều có RSD ≤ 2,0 %.

● Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Thẩm định phương pháp định lượng mesalamin trong hỗn hợp bột dược chất

– tá dược, pellet nhân và pellet bao giải phóng tại đại tràng bằng phương pháp

HPLC được thực hiện trên pellet bao Tham khảo tài liệu [100] và các kết quả thực nghiệm, quy trình phân tích được xác định như sau:

Hòa tan 4,3 g natri 1-octanesulfonat trong 1 lít nước, điều chỉnh đến pH 2,15 bằng acid phosphoric, lọc qua màng lọc lỗ lọc 0,45 àm, khử khớ.

Tiền cột: 2 cột L1 (4,6 mm x 3,0 cm; 10 àm) đặt giữa bơm và bộ phận tiờm mẫu Cột: L1 (4,6 mm x 3,3 cm; 3 àm) Detector UV: Tại bước súng 230 nm Tốc độ dũng: 2 ml/phỳt Thể tớch tiờm mẫu: 20 àl

Dung dịch gốc tương thích hệ thống: Cân 20 mg acid 3-aminosalicylic và 20 mg chuẩn acid salicylic vào bình định mức 200 ml, thêm 50 ml acid hydroclorid 1

N, siêu âm hòa tan, thêm nước vừa đủ thể tích.

Dung dịch tương thích hệ thống: Hút 5 ml dung dịch gốc tương thích hệ thống cho vào bình định mức 50 ml, thêm nước vừa đủ thể tích được dung dịch tương thích hệ thống.

Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 25 mg chuẩn mesalamin vào bình 25 ml, thêm 5 ml acid hydroclorid 0,25 N, siêu âm hòa tan, thêm nước vừa đủ thể tích.

Dung dịch thử gốc: Cân một lượng chế phẩm tương đương 400 mg mesalamin vào bình định mức 500 ml, thêm 50 ml acid hydroclorid 1 N, siêu âm 10 phút, thêm nước vừa đủ, lắc đều, lọc.

Mẫu thử: Hút chính xác 25 ml dung dịch thử gốc vào bình định mức 100 ml, thờm nước vừa đủ, trộn đều và lọc qua màng lọc 0,5 àm.

Mẫu placebo: Là pellet bao chỉ chứa tá dược giống mẫu placebo của mục thẩm định phương pháp UV-VIS ở trên Quy trình pha mẫu placebo giống mẫu thử.

Mẫu chuẩn: Hút chính xác 10 ml dung dịch chuẩn gốc và 5 ml dung dịch tương thích hệ thống vào bình định mức 50 ml, thêm nước vừa đủ, trộn đều và lọc qua màng lọc 0,5àm.

Tính tương thích hệ thống: tiêm dung dịch chuẩn, độ phân giải giữa mesalamine và salicylic acid hoặc 3-aminosalicylic acid không nhỏ hơn 2, hệ số đối xứng không lớn hơn 2; độ lệch chuẩn giữa các lần tiêm không lớn hơn 2,0 %.

Tiờm riờng rẽ 20 àl dung dịch chuẩn, dung dịch thử vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng của pic chính, Tính phần trăm hàm lượng mesalamin (C 7 H 7 NO 3 ) theo công thức:

+ r u /r s : Diện tích pic mesalamin dung dịch thử, dung dịch chuẩn

+ C s /C u : Nồng độ mesalamin dung dịch chuẩn, dung dịch thử (mg/ml)

- Phương pháp HPLC được thẩm định theo các chỉ tiêu sau [37]:

Phương pháp đánh giá in vivo trên chó 63 1 Đánh giá sự dịch chuyển pellet in vivo trên chó bằng phương pháp hình ảnh X-quang 63

2.2.5.1 Đánh giá sự dịch chuyển pellet in vivo trên chó bằng phương pháp hình ảnh X-quang

Tiến hành thí nghiệm trên 5 chó ta trưởng thành, giống đực, khỏe mạnh, cân nặng 10 đến 18 kg Tất cả các chó được cho ăn uống và nuôi trong khi thử nghiệm với cùng điều kiện và được theo dõi về thể trạng trước khi uống thuốc, trong quá trình thử nghiệm và khi kết thúc giai đoạn lấy mẫu Trước ngày dùng thuốc, chó ăn nhẹ trước 10 giờ đêm Ngày dùng thuốc, chó không ăn sáng và uống thuốc trong tình trạng không gây mê Chó ăn nhẹ sau 2 giờ uống thuốc Sau 4 và 10 giờ, chó ăn chính Chó uống nước tự do sau uống thuốc

● Cách cho chó uống thuốc

Chó uống thuốc bằng cách cho thuốc trực tiếp vào họng chó, sau đó cho chó uống khoảng 50 ml nước kèm theo Cho chó uống 1 viên nang đóng pellet nhân chứa chất cản quang bari sulfat, chất kích quang (dung dịch xenetix 6 mg/ml) và khoảng 125 mg mesalamin được bao film theo công thức màng bao tối ưu bằng cách cho thuốc trực tiếp vào họng chó, sau đó cho chó uống khoảng 50 ml nước kèm theo Chụp X-quang ở thời điểm 2; 4; 7; 9 và 11 giờ sau khi uống.

2.2.5.2 Đánh giá hấp thu in vivo trên chó

Số lượng chó thử nghiệm và điều kiện nuôi, ăn uống của chó được thực hiện giống mục 2.2.5.1.

● Cách cho chó uống thuốc

Chó uống thuốc bằng cách cho thuốc trực tiếp vào họng chó, sau đó cho chó uống khoảng 50 ml nước kèm theo Mỗi chó thí nghiệm được uống 4 viên nang cứng đóng pellet nhân Mỗi viên nang cứng đóng pellet nhân chứa khoảng 125 mg mesalamin Sau 1 tuần, chó sau khi uống pellet nhân được uống 4 viên nang cứng đóng pellet bao giải phóng tại đại tràng bằng công thức tối ưu Mỗi viên nang cứng đóng pellet bao chứa khoảng 125 mg mesalamin.

● Lấy máu và xử lý mẫu

Mỗi lần lấy 2 ml máu, đựng vào ống nghiệm có chất chống đông Na 2 EDTA. Mẫu máu được lấy ở các thời điểm 0; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 12; 15; 17 và 24 giờ Các mẫu máu được ly tâm với tốc độ 5000 vòng / phút trong 15 phút ở nhiệt độ phòng Tách lấy huyết tương và bảo quản ở tủ lạnh âm sâu -25 0 C cho đến khi phân tích.

● Định lượng mesalamin trong huyết tương

Bằng phương pháp ghi ở mục 2.2.4.1 thẩm định phương pháp phân tích khối phổ LC-MS/MS

Xử lý số liệu 64 2.2.7 Dự đoán hấp thu mesalamin trong đường tiêu hóa chó từ viên nang chứa

Thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa bằng phần MODDE 12.0

Sử dụng add-in DDsolver [114] trong Microsoft Excel để xác định các mô hình động học giải phóng như động học bậc 0, động học bậc 1, động học bậc 2, Higuchi, Korsmeyer-peppas, Hixson-Crowell, Hopfenberg, Baker-Lonsdale, Makoid-Banakar, Peppas-Sahlin 1, Peppas-Sahlin 2, Quadratic, Weilbull 1, Weilbull

2, Weilbull 3, Weilbull 4, Logistic 1, Logistic 2, Logistic 3 của các công thức thí nghiệm Mô hình động học giải phóng phù hợp nhất dựa trên tiêu chuẩn thông tin Akaike (AIC) và giá trị R 2 hiệu chỉnh để xác định T 10 và T 80

- p là tham số trong mô hình Công thức tính R 2 hiệu chỉnh

- n là số điểm lấy mẫu

- p là tham số của mô hình

So sánh các giá trị AIC và R 2 hiệu chỉnh khi khớp các mô hình động học Giá trị AIC nhỏ nhất hoặc/và R 2 hiệu chỉnh lớn nhất tương ứng với mô hình phù hợp nhất, từ đó tính ra T 10 và T 80 dựa trên mô hình động học đã lựa chọn.

Dự đoán tuổi thọ của thuốc bằng phần mềm minitab 17.

Các kết quả nghiên cứu được xử lý và biểu thị trong luận án dưới dạng: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (TB ± SD), n là số lần lặp lại thí nghiệm và RSD % là độ lệch chuẩn tương đối.

2.2.7 Dự đoán hấp thu mesalamin trong đường tiêu hóa chó từ viên nang chứa pellet mesalamin bao bằng phần mềm GastroPlus TM

Tiến hành khớp mô hình dược động học sinh lý bằng phần mềmGastroPlus TM xác định tỷ lệ dược chất hấp thu ở từng đoạn của đường tiêu hóa.

KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

3.1.1 Kết quả thẩm định phương pháp quang phổ tử ngoại UV-VIS

Tiến hành thẩm định phương pháp quang phổ tử ngoại – khả kiến UV-VIS như phương pháp trình bày ở mục 2.2.4.1 được kết quả như sau:

Hình 3.1 Phổ hấp thụ của (a) mẫu trắng, (b) mẫu chuẩn, thử, placebo trong môi trường pH 1,2

Hình 3.2 Phổ hấp thụ của (a) mẫu trắng, (b) mẫu chuẩn, thử, placebo trong môi trường pH 6,8

Hình 3.3 Phổ hấp thụ của (a) mẫu trắng, (b) mẫu chuẩn, thử, placebo trong môi trường pH 7,4

Kết quả so sánh phổ cho thấy phổ mẫu chuẩn trùng với phổ mẫu thử, có cực đại hấp thụ tương đương nhau trong môi trường pH 1,2; pH 6,8 và pH 7,4. Ngoài ra, ảnh hưởng của mẫu placebo trong 3 môi trường pH 1,2; pH 6,8 và pH 7,4 lần lượt là - 0,19 %, - 0,41 % và 0,53 % đạt yêu cầu ≤ 2 %

● Độ phù hợp của hệ thống

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống (n=6)

Môi trường hòa tan Độ hấp thụ

% Kết quả phân tích cho thấy RSD của độ hấp thụ từ 6 lần đo mẫu chuẩn ≤ 2,0

%, vậy quy trình phân tích đạt tính phù hợp hệ thống.

Kết quả khảo sát tính tuyến tính như sau

Nồng độ (àg/ml) ộ Đ hấp thụ(A

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ mesalamin trong môi trường (a) pH 1,2; (b) pH 6,8 và (c) pH 7,4

Kết quả cho thấy nồng độ mesalamin trong dung dịch các môi trường pH 1,2; pH 6,8 và pH 7,4 và độ hấp thụ có mối quan hệ tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sỏt 0,3 – 34,7 àg/ml với hệ số tương quan R 2 khoảng 0,99 Do đú, phương pháp đạt chỉ tiêu tính tuyến tính.

Kết quả khảo sát độ đúng như sau:

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát độ đúng

Mức nồng độ Tỷ lệ hồi phục trung bình (%)

125% (34,7 àg/ml) 100,06 0,48 pH 7,4 1% (0,3 àg/ml) 99,50 1,02

% Kết quả ở bảng trên cho thấy tỷ lệ hồi phục nằm trong khoảng 97 – 103 % và RSD tỉ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ ≤ 2,0 % đạt yêu cầu độ đúng.

Từ kết quả thẩm định độ đúng và tính tuyến tính suy ra khoảng xác định của phương phỏp: 0,3 àg/ml đến 34,7 àg/ml.

Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian như sau

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp

Môi trường hòa tan Độ lặp lại

(RSD, n = 6) Độ chính xác trung gian

Kết quả cho thấy độ chính xác đạt yêu cầu (RSD < 2 %).

3.1.2 Kết quả thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tiến hành thẩm định như đã mô tả ở mục 2.2.4.1, thu được kết quả như sau:

Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu trắng (a), mẫu placebo (b), mẫu chuẩn (c) và mẫu thử (d)

Kết quả thẩm định cho thấy thời gian lưu của pic mesalamin trên sắc ký đồ mẫu chuẩn là 13,95 phút; mẫu thử là 13,80 phút Sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử có pic có thời gian lưu tương đương thời gian lưu của pic mesalamin trong dung dịch chuẩn, đồng thời mẫu giả dược và mẫu trắng không có pic trùng với pic trên. Như vậy quy trình phân tích có tính đặc hiệu.

3.1.2.2 Tính phù hợp của hệ thống

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống

% t R : thời gian lưu; S: diện tích pic; A s : hệ số bất đối; N: số đĩa lý thuyết; R: độ phân giải

Kết quả phân tích cho thấy hệ số bất đối của pic 3-aminosalisylic, mesalamin và acid salisylic đều nằm trong khoảng 0,8 – 1,5 RSD của các thông số sắc ký cho các lần tiêm lặp lại đều < 2 % Vậy quy trình phân tích đạt tính phù hợp hệ thống.

Kết quả khảo sát tính tuyến tính như sau

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ mesalamin và diện tích pic

Kết quả cho thấy hệ số R 2 ≈ 1 chứng tỏ có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic.

Kết quả thẩm định độ đúng như sau

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp

Mức nồng độ Tỷ lệ thu hồi

Tỷ lệ thu hồi trung bình (%) RSD (%)

100,96 101,01 Kết quả cho thấy, tỷ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ trong khoảng 98 – 102 % và RSD ≤ 2 %, do đó phương pháp đạt yêu cầu độ đúng.

Từ kết quả thẩm định độ đúng và tính tuyến tính suy ra khoảng xác định của phương pháp: 0,16 mg/ml đến 0,24 mg/ml.

Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian như sau

Bảng 3.6 Độ lặp lại và độ chính xác trung gian Độ lặp lại (n =

6) Độ chính xác trung gian (n =

Kết quả cho thấy độ chính xác đạt yêu cầu (RSD < 2 %) Phương pháp đạt yêu cầu độ chính xác.

Như vậy, phương pháp HPLC đã xây dựng có khoảng tuyến tính thích hợp, độ đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác cao Có thể áp dụng phương pháp HPLC với các điều kiện trên để định lượng mesalamin trong viên.

3.1.3 Kết quả thẩm định phương pháp định lượng mesalamin trong huyết tương chó bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

3.1.3.1 Độ đặc hiệu – chọn lọc

Kết quả thẩm định độ chọn lọc – đặc hiệu của phương pháp như sau

Hình 3.6 (a) sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng; (b) sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn MES ở nồng độ LLOQ (50 ng/ml) và IS Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của mesalamin (2,3 phút) bằng 7,81 % đáp ứng của mesalamin ở nồng độ LLOQ (yêu cầu ≤ 20 %) và đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của diazepam (8,1 phút) bằng 1,31 % đáp ứng của diazepam (yêu cầu ≤ 5 %), do đó phương pháp đặc hiệu và chọn lọc theo hướng dẫn US-FDA.

3.1.3.2 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Pha dãy chuẩn có nồng độ 50 – 30000 ng/ml như bảng 3.7

Bảng 3.7 Cách pha dãy chuẩn nồng độ từ 50 – 30000 ng/ml

Kết quả khảo sát đường chuẩn và khoảng tuyến tính như phương pháp trình bày ở mục 2.2.4 như sau

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa tỷ lệ diện tích pic MES/IS với nồng độ

MES trong huyết tương (ng/ml)

Bảng 3.8 Độ đúng của các mẫu chuẩn

CC Độ chính xác so với nồng độ lý thuyết

Kết quả thẩm định cho thấy trong khoảng nồng độ 50 - 30000 ng/ml có sự tương quan tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic MES/IS và nồng độ MES với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1 Nồng độ MES xác định từ đường chuẩn so với nồng độ lý thuyết đều nằm trong giới hạn cho phép 85 – 115 % theo hướng dẫn của US- FDA.

3.1.3.3 Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Bảng 3.9 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

IS Nồ ng độ tìm thấy

(ng/ml ) Độ đú ng

) Đáp ứng của mẫu LLOQ/mẫ u trắng (S/N) Đạt / Khô ng

(a) : tính từ phương trình hồi quy (b) : % so với nồng độ thực

Kết quả cho thấy giới hạn định lượng dưới (LLOQ) đáp ứng yêu cầu US- FDA do tại cùng thời gian lưu, đáp ứng của mẫu chuẩn lớn hơn đáp ứng của mẫu huyết tương trắng > 5 lần; độ đúng trong khoảng 80% – 120% so với nồng độ thực.

3.1.3.4 Độ đúng và độ chính xác của phương pháp

Kết quả khảo sát độ đúng và độ chính xác như sau:

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày và khác ngày (n=6)

(a) : tính từ phương trình hồi quy; (b) : % so với nồng độ thực Ở các nồng độ trên, độ đúng trung bình trong ngày 1 từ 94,5 - 106,3% và khác ngày từ 97,8 - 104,3 %, đạt yêu cầu 85 - 115 % Ngoài ra, độ chính xác trung bình trong ngày 1 là 2,3 - 5,9 % và khác ngày là 3,4 - 6,3 %, đáp ứng các yêu cầu của US- FDA về độ đúng, độ chính xác ≤ 20 % đối với mẫu LLOQ và ≤ 15 % đối với các mẫu còn lại.

3.1.3.5 Độ đúng và độ chính xác của phương pháp khi pha loãng

Pha các mẫu AC1, AC2, AC3 như bảng 3.11.

Bảng 3.11 Cách chuẩn bị mẫu khảo sát độ đúng – độ chính xác khi pha loãng (AC)

Kết quả khảo sát độ đúng và độ chính xác khi pha loãng như sau:

Bảng 3.12 Kết quả độ đúng, độ chính xác của phương pháp khi pha loãng (n=6)

(a) : tính từ phương trình hồi quy; (b) : % so với nồng độ thực Ở các nồng độ trên, độ đúng trung bình từ 99,9 - 105,4% đạt yêu cầu 85 - 115

% Ngoài ra, độ chính xác trung bình từ 4,1 - 5,9 % đáp ứng các yêu cầu ≤ 15%.

3.1.3.6 Tỷ lệ thu hồi của phương pháp

● Tỷ lệ thu hồi của MES và chuẩn nội diazepam

Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi MES và IS như sau

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi của MES và IS (n=6)

STT Đáp ứng MES Đáp ứng IS

Kết quả cho thấy phương pháp xử lý mẫu cho hiệu xuất chiết mesalamin, diazepam cao, ổn định (sai khác giữa các nồng độ không quá 10%) đáp ứng yêu cầu US-FDA.

3.1.3.6 Xác định ảnh hưởng của nền mẫu

Bảng 3.14 Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của nền mẫu (n=6)

9 Kết quả phân tích cho thấy không có sự sai khác giữa các nền mẫu khác nhau (CV < 15 %), đạt yêu cầu US-FDA.

3.1.3.7 Xác định độ nhiễm chéo

Kết quả phân tích như sau

Bảng 3.15 Kết quả đánh giá độ nhiễm chéo

Mẫu trắng Mẫu LLOQ Tỉ lệ đáp ứng pic (%) Kế t luậ n

Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của MES đáp ứng của các mẫu trắng đều

< 20 % đáp ứng LLOQ và tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS đáp ứng của các mẫu trắng đều < 5% đáp ứng LLOQ Như vậy, phương pháp phân tích đáp ứng yêu cầu về độ nhiễm chéo của một phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học

3.1.3.7 Nghiên cứu độ ổn định của mẫu phân tích

Bảng 3.16 Độ ổn định của MES huyết tương trong các điều kiện khác nhau (n=6) Độ ổn định Mẫ u

Nồng độ ban đầu (ng/ ml)

Nồng độ sau bảo quản (ng/ml)

3 chu kỳ đông – rã đông LQ

5, 2 Độ ổn định thời gian ngắn

(5 giờ, nhiệt độ phòng) HQ

0, 6 Độ ổn định trong autosampler (24 giờ/4 o C)

6 Độ ổn định dài ngày

0Nồng độ mesalamin trong các mẫu LQC và HQC bảo quản sau 3 chu kỳ đông– rã đông, sau 5 giờ bảo quản ở nhiệt độ phòng, sau 24 giờ bảo quản trong autosampler và sau 30 ngày bảo quản ở nhiệt độ -25 ± 5 o C so với nồng độ ban đầu khác nhau ≤ 15

% Do đó, MES ổn định trong mẫu huyết tương ở các điều kiện trên, đáp ứng yêu cầu US-FDA.

Kết quả thẩm định độ đặc hiệu – chọn lọc, độ đúng, độ lặp lại, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, tỷ lệ thu hồi và nghiên cứu độ ổn định cho thấy, phương pháp đã được xây dựng đáp ứng các yêu cầu của một phương pháp phân tích dùng trong sinh học Phương pháp có thể áp dụng định lượng mesalamin trong huyết tương chó trong nghiên cứu hấp thu in vivo các chế phẩm chứa mesalamin.

3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TIỀN CÔNG THỨC

3.2.1 Nghiên cứu tính chất dược chất

3.2.1.1 Kết quả nghiên cứu ổn định của mesalamin trong các điều kiện khác nhau

Pha chế mẫu nghiên cứu như bảng 3.17 và bảo quản ở điều kiện như trình bày ở mục 2.2.1.

Bảng 3.17 Công thức nghiên cứu sự phân hủy mesalamin trong nước, UV, nhiệt độ, pH

Thành phần DC01 DC02 DC03 DC04 DC05

25 ml 25 ml 25 ml 25 ml 25 ml

50ml Tiến hành phân tích mẫu nghiên cứu được kết quả sau

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của nước, UV, nhiệt độ, pH tới sự phân hủy mesalamin

M ẫu Thay đổi màu sắc Hàm lượng mesalamin

DC02 (nước, chiếu UV) Không màu 93,35

DC05 (dung dịch HCl 0,2 N) Không màu 100,34

Kết quả thẩm định phương pháp quang phổ tử ngoại UV-VIS 66 3.1.2 Kết quả thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 69 3.1.2.1 Độ đặc hiệu 69

Tiến hành thẩm định phương pháp quang phổ tử ngoại – khả kiến UV-VIS như phương pháp trình bày ở mục 2.2.4.1 được kết quả như sau:

Hình 3.1 Phổ hấp thụ của (a) mẫu trắng, (b) mẫu chuẩn, thử, placebo trong môi trường pH 1,2

Hình 3.2 Phổ hấp thụ của (a) mẫu trắng, (b) mẫu chuẩn, thử, placebo trong môi trường pH 6,8

Hình 3.3 Phổ hấp thụ của (a) mẫu trắng, (b) mẫu chuẩn, thử, placebo trong môi trường pH 7,4

Kết quả so sánh phổ cho thấy phổ mẫu chuẩn trùng với phổ mẫu thử, có cực đại hấp thụ tương đương nhau trong môi trường pH 1,2; pH 6,8 và pH 7,4. Ngoài ra, ảnh hưởng của mẫu placebo trong 3 môi trường pH 1,2; pH 6,8 và pH 7,4 lần lượt là - 0,19 %, - 0,41 % và 0,53 % đạt yêu cầu ≤ 2 %

● Độ phù hợp của hệ thống

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống (n=6)

Môi trường hòa tan Độ hấp thụ

% Kết quả phân tích cho thấy RSD của độ hấp thụ từ 6 lần đo mẫu chuẩn ≤ 2,0

%, vậy quy trình phân tích đạt tính phù hợp hệ thống.

Kết quả khảo sát tính tuyến tính như sau

Nồng độ (àg/ml) ộ Đ hấp thụ(A

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ mesalamin trong môi trường (a) pH 1,2; (b) pH 6,8 và (c) pH 7,4

Kết quả cho thấy nồng độ mesalamin trong dung dịch các môi trường pH 1,2; pH 6,8 và pH 7,4 và độ hấp thụ có mối quan hệ tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sỏt 0,3 – 34,7 àg/ml với hệ số tương quan R 2 khoảng 0,99 Do đú, phương pháp đạt chỉ tiêu tính tuyến tính.

Kết quả khảo sát độ đúng như sau:

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát độ đúng

Mức nồng độ Tỷ lệ hồi phục trung bình (%)

125% (34,7 àg/ml) 100,06 0,48 pH 7,4 1% (0,3 àg/ml) 99,50 1,02

% Kết quả ở bảng trên cho thấy tỷ lệ hồi phục nằm trong khoảng 97 – 103 % và RSD tỉ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ ≤ 2,0 % đạt yêu cầu độ đúng.

Từ kết quả thẩm định độ đúng và tính tuyến tính suy ra khoảng xác định của phương phỏp: 0,3 àg/ml đến 34,7 àg/ml.

Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian như sau

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp

Môi trường hòa tan Độ lặp lại

(RSD, n = 6) Độ chính xác trung gian

Kết quả cho thấy độ chính xác đạt yêu cầu (RSD < 2 %).

3.1.2 Kết quả thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tiến hành thẩm định như đã mô tả ở mục 2.2.4.1, thu được kết quả như sau:

Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu trắng (a), mẫu placebo (b), mẫu chuẩn (c) và mẫu thử (d)

Kết quả thẩm định cho thấy thời gian lưu của pic mesalamin trên sắc ký đồ mẫu chuẩn là 13,95 phút; mẫu thử là 13,80 phút Sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử có pic có thời gian lưu tương đương thời gian lưu của pic mesalamin trong dung dịch chuẩn, đồng thời mẫu giả dược và mẫu trắng không có pic trùng với pic trên. Như vậy quy trình phân tích có tính đặc hiệu.

3.1.2.2 Tính phù hợp của hệ thống

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống

% t R : thời gian lưu; S: diện tích pic; A s : hệ số bất đối; N: số đĩa lý thuyết; R: độ phân giải

Kết quả phân tích cho thấy hệ số bất đối của pic 3-aminosalisylic, mesalamin và acid salisylic đều nằm trong khoảng 0,8 – 1,5 RSD của các thông số sắc ký cho các lần tiêm lặp lại đều < 2 % Vậy quy trình phân tích đạt tính phù hợp hệ thống.

Kết quả khảo sát tính tuyến tính như sau

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ mesalamin và diện tích pic

Kết quả cho thấy hệ số R 2 ≈ 1 chứng tỏ có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic.

Kết quả thẩm định độ đúng như sau

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp

Mức nồng độ Tỷ lệ thu hồi

Tỷ lệ thu hồi trung bình (%) RSD (%)

100,96 101,01 Kết quả cho thấy, tỷ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ trong khoảng 98 – 102 % và RSD ≤ 2 %, do đó phương pháp đạt yêu cầu độ đúng.

Từ kết quả thẩm định độ đúng và tính tuyến tính suy ra khoảng xác định của phương pháp: 0,16 mg/ml đến 0,24 mg/ml.

Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian như sau

Bảng 3.6 Độ lặp lại và độ chính xác trung gian Độ lặp lại (n =

6) Độ chính xác trung gian (n =

Kết quả cho thấy độ chính xác đạt yêu cầu (RSD < 2 %) Phương pháp đạt yêu cầu độ chính xác.

Như vậy, phương pháp HPLC đã xây dựng có khoảng tuyến tính thích hợp, độ đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác cao Có thể áp dụng phương pháp HPLC với các điều kiện trên để định lượng mesalamin trong viên.

3.1.3 Kết quả thẩm định phương pháp định lượng mesalamin trong huyết tương chó bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

3.1.3.1 Độ đặc hiệu – chọn lọc

Kết quả thẩm định độ chọn lọc – đặc hiệu của phương pháp như sau

Hình 3.6 (a) sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng; (b) sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn MES ở nồng độ LLOQ (50 ng/ml) và IS Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của mesalamin (2,3 phút) bằng 7,81 % đáp ứng của mesalamin ở nồng độ LLOQ (yêu cầu ≤ 20 %) và đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của diazepam (8,1 phút) bằng 1,31 % đáp ứng của diazepam (yêu cầu ≤ 5 %), do đó phương pháp đặc hiệu và chọn lọc theo hướng dẫn US-FDA.

3.1.3.2 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Pha dãy chuẩn có nồng độ 50 – 30000 ng/ml như bảng 3.7

Bảng 3.7 Cách pha dãy chuẩn nồng độ từ 50 – 30000 ng/ml

Kết quả khảo sát đường chuẩn và khoảng tuyến tính như phương pháp trình bày ở mục 2.2.4 như sau

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa tỷ lệ diện tích pic MES/IS với nồng độ

MES trong huyết tương (ng/ml)

Bảng 3.8 Độ đúng của các mẫu chuẩn

CC Độ chính xác so với nồng độ lý thuyết

Kết quả thẩm định cho thấy trong khoảng nồng độ 50 - 30000 ng/ml có sự tương quan tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic MES/IS và nồng độ MES với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1 Nồng độ MES xác định từ đường chuẩn so với nồng độ lý thuyết đều nằm trong giới hạn cho phép 85 – 115 % theo hướng dẫn của US- FDA.

3.1.3.3 Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Bảng 3.9 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

IS Nồ ng độ tìm thấy

(ng/ml ) Độ đú ng

) Đáp ứng của mẫu LLOQ/mẫ u trắng (S/N) Đạt / Khô ng

(a) : tính từ phương trình hồi quy (b) : % so với nồng độ thực

Kết quả cho thấy giới hạn định lượng dưới (LLOQ) đáp ứng yêu cầu US- FDA do tại cùng thời gian lưu, đáp ứng của mẫu chuẩn lớn hơn đáp ứng của mẫu huyết tương trắng > 5 lần; độ đúng trong khoảng 80% – 120% so với nồng độ thực.

3.1.3.4 Độ đúng và độ chính xác của phương pháp

Kết quả khảo sát độ đúng và độ chính xác như sau:

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày và khác ngày (n=6)

(a) : tính từ phương trình hồi quy; (b) : % so với nồng độ thực Ở các nồng độ trên, độ đúng trung bình trong ngày 1 từ 94,5 - 106,3% và khác ngày từ 97,8 - 104,3 %, đạt yêu cầu 85 - 115 % Ngoài ra, độ chính xác trung bình trong ngày 1 là 2,3 - 5,9 % và khác ngày là 3,4 - 6,3 %, đáp ứng các yêu cầu của US- FDA về độ đúng, độ chính xác ≤ 20 % đối với mẫu LLOQ và ≤ 15 % đối với các mẫu còn lại.

3.1.3.5 Độ đúng và độ chính xác của phương pháp khi pha loãng

Pha các mẫu AC1, AC2, AC3 như bảng 3.11.

Bảng 3.11 Cách chuẩn bị mẫu khảo sát độ đúng – độ chính xác khi pha loãng (AC)

Kết quả khảo sát độ đúng và độ chính xác khi pha loãng như sau:

Bảng 3.12 Kết quả độ đúng, độ chính xác của phương pháp khi pha loãng (n=6)

(a) : tính từ phương trình hồi quy; (b) : % so với nồng độ thực Ở các nồng độ trên, độ đúng trung bình từ 99,9 - 105,4% đạt yêu cầu 85 - 115

% Ngoài ra, độ chính xác trung bình từ 4,1 - 5,9 % đáp ứng các yêu cầu ≤ 15%.

3.1.3.6 Tỷ lệ thu hồi của phương pháp

● Tỷ lệ thu hồi của MES và chuẩn nội diazepam

Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi MES và IS như sau

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi của MES và IS (n=6)

STT Đáp ứng MES Đáp ứng IS

Kết quả cho thấy phương pháp xử lý mẫu cho hiệu xuất chiết mesalamin, diazepam cao, ổn định (sai khác giữa các nồng độ không quá 10%) đáp ứng yêu cầu US-FDA.

3.1.3.6 Xác định ảnh hưởng của nền mẫu

Bảng 3.14 Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của nền mẫu (n=6)

9 Kết quả phân tích cho thấy không có sự sai khác giữa các nền mẫu khác nhau (CV < 15 %), đạt yêu cầu US-FDA.

3.1.3.7 Xác định độ nhiễm chéo

Kết quả phân tích như sau

Bảng 3.15 Kết quả đánh giá độ nhiễm chéo

Mẫu trắng Mẫu LLOQ Tỉ lệ đáp ứng pic (%) Kế t luậ n

Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của MES đáp ứng của các mẫu trắng đều

< 20 % đáp ứng LLOQ và tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS đáp ứng của các mẫu trắng đều < 5% đáp ứng LLOQ Như vậy, phương pháp phân tích đáp ứng yêu cầu về độ nhiễm chéo của một phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học

3.1.3.7 Nghiên cứu độ ổn định của mẫu phân tích

Bảng 3.16 Độ ổn định của MES huyết tương trong các điều kiện khác nhau (n=6) Độ ổn định Mẫ u

Nồng độ ban đầu (ng/ ml)

Nồng độ sau bảo quản (ng/ml)

3 chu kỳ đông – rã đông LQ

5, 2 Độ ổn định thời gian ngắn

(5 giờ, nhiệt độ phòng) HQ

0, 6 Độ ổn định trong autosampler (24 giờ/4 o C)

6 Độ ổn định dài ngày

0Nồng độ mesalamin trong các mẫu LQC và HQC bảo quản sau 3 chu kỳ đông– rã đông, sau 5 giờ bảo quản ở nhiệt độ phòng, sau 24 giờ bảo quản trong autosampler và sau 30 ngày bảo quản ở nhiệt độ -25 ± 5 o C so với nồng độ ban đầu khác nhau ≤ 15

% Do đó, MES ổn định trong mẫu huyết tương ở các điều kiện trên, đáp ứng yêu cầu US-FDA.

Kết quả thẩm định độ đặc hiệu – chọn lọc, độ đúng, độ lặp lại, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, tỷ lệ thu hồi và nghiên cứu độ ổn định cho thấy, phương pháp đã được xây dựng đáp ứng các yêu cầu của một phương pháp phân tích dùng trong sinh học Phương pháp có thể áp dụng định lượng mesalamin trong huyết tương chó trong nghiên cứu hấp thu in vivo các chế phẩm chứa mesalamin.

3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TIỀN CÔNG THỨC

3.2.1 Nghiên cứu tính chất dược chất

3.2.1.1 Kết quả nghiên cứu ổn định của mesalamin trong các điều kiện khác nhau

Pha chế mẫu nghiên cứu như bảng 3.17 và bảo quản ở điều kiện như trình bày ở mục 2.2.1.

Bảng 3.17 Công thức nghiên cứu sự phân hủy mesalamin trong nước, UV, nhiệt độ, pH

Thành phần DC01 DC02 DC03 DC04 DC05

25 ml 25 ml 25 ml 25 ml 25 ml

50ml Tiến hành phân tích mẫu nghiên cứu được kết quả sau

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của nước, UV, nhiệt độ, pH tới sự phân hủy mesalamin

M ẫu Thay đổi màu sắc Hàm lượng mesalamin

DC02 (nước, chiếu UV) Không màu 93,35

DC05 (dung dịch HCl 0,2 N) Không màu 100,34

Kết quả nghiên cứu cho thấy tốc độ phân hủy mesalamin phụ thuộc vào pH môi trường hòa tan Mesalamin ổn định trong môi trường acid mạnh, nhưng bị phân hủy nhanh trong môi trường kiềm mạnh biến màu nâu Hàm lượng dược chất trong dung dịch NaOH 0,1N chỉ còn 3,50 %, trong khi hàm lượng này là 100,34% trong dung dịch HCl 0,1N Ngoài ra, tác nhân nước, UV, nhiệt độ cũng làm dược chất bị phân hủy, tuy nhiên sự phân hủy trong môi trường nước và nhiệt độ cao không nhiều như các tác nhân khác.

3.2.1.2 Kết quả nghiên cứu ổn định của mesalamin trong môi trường có tác nhân oxi và tác nhân chống oxi hóa như dinatri edetat, natri metabisulfit, vitamin C

Pha chế các mẫu DC06, DC07, DC08 và DC09 như sau và tiến hành bảo quản ở trong điều kiện trình bày ở mục 2.2.1.

Bảng 3.19 Công thức nghiên cứu sự phân hủy mesalamin trong môi trường có tác nhân oxi hóa và tác nhân chống oxi hóa

Thành phần DC06 DC07 DC08 DC09

Dung dịch mesalamin 0,5 mg/ml

EDTA - - - 12,5 mg Dung dịch H 2 O 2 5% vừa đủ 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml

Tiến hành phần tích mẫu nghiên cứu được kết quả như sau

Bảng 3.20 Kết quả phân tích sự phân hủy dược chất trong các môi trường (n=2)

DC07 (dung dịch H 2 O 2 5 % -natri metabisulfit)

DC08 (dung dịch H 2 O 2 5 % - vitamin C) Nâu 97,84DC09 (dung dịch H 2 O 2 5% -EDTA) Nâu 94,79

Tác nhân oxi hóa H 2 O 2 5 % làm tăng phân hủy dược chất Sau 48 giờ, hàm lượng dược chất còn 95,82 % Các chất chống oxi hóa như natri metabisulfit và dinatri EDTA không giúp hạn chế sự phân hủy dược chất trong dung dịch H 2 O 2 5 %, tuy nhiên, mesalamin ổn định hơn trong dung dịch H 2 O 2 5 % khi có mặt tác nhân chống oxi hóa acid ascorbic (vitamin C) Trong cùng điều kiện thí nghiệm, hàm lượng mesalamin trong công thức DC07 (chứa natri metabisulfit) và DC09 (chứa dinatri EDTA) lần lượt là 94,37 % và 94,79 %, trong khi với công thức DC08 (chứa acid ascorbic) là 97,84 %.

3.2.2 Kết quả nghiên cứu tương tác dược chất - tá dược

Pha chế các mẫu nghiên cứu như bảng 3.21 và bảo quản ở điều kiện đã trình bày ở mục 2.2.1.

Bảng 3.21 Các mẫu nghiên cứu tương tác dược chất, tá dược

2 Celulose vi tinh thể PH101 1 g - - - -

Tiến hành phân tích các mẫu nghiên cứu được kết quả như sau

Bảng 3.22 Kết quả nghiên cứu tương tác dược chất-tá dược

(%) Ban đầu (*) 1 tháng lão hóa cấp tốc

3 tháng lão hóa cấp tốc

(*) Hàm lượng ban đầu là hàm lượng nguyên liệu trong CoA của NSX nguyên liệu

Xây dựng công thức pellet nhân bằng phương pháp đùn - tạo cầu 82 3.3.2 Xây dựng công thức pellet mesalamin bao giải phóng tại đại tràng 83 3.3.2.1 Nghiên cứu màng bao chỉ chứa zein trong pellet bao giải phóng tại đại tràng 83

Dựa vào nghiên cứu tiền công thức, các tá dược MCC PH 101, PVP K30 và Aerosil được sử dụng trong thành phần pellet nhân Để khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng tạo cầu pellet, bào chế các mẫu pellet theo công thức như bảng 3.23 với tổng khối lượng pellet nhân chứa 500 mg mesalamin là 1105 mg.

Bảng 3.23 Công thức khảo sát ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng tạo cầu của pellet nhân (Tính cho lượng pellet có chứa 500mg mesalamin)

THÀNH PHẦN CT1 CT2 CT3 CT4

(*) Bay hơi trong quá trình pha chế

Tiến hành bào chế pellet nhân CT1, CT2, CT3 và CT4 với lượng dược chất, tá dược cho cỡ mẻ 500 g như phụ lục 2.1 và đánh giá hình thức pellet, hiệu suất sau bào chế Nhận thấy, CT1 và CT2 pellet có hình trụ tròn ở hai đầu, không đều. Ngược lại CT3 và CT4 pellet hình cầu, đều, tuy nhiên hiệu suất tạo pellet của CT4 đạt 85%, trong khi CT3 đạt 92,4% Do đó, CT3 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

Tiến hành thử hòa tan CT3 ở điều kiện thử hòa tan cho pellet nhân (900 ml môi trường đệm phosphat pH 6,8) ở mục 2.2.4.3, thu được kết quả như sau

Hình 3.8 % dược chất giải phóng từ pellet nhân sử dụng CT3 (n = 6)

Dược chất giải phóng nhanh trong môi trường hòa tan Sau 4 giờ có hơn 90

% dược chất giải phóng từ pellet nhân và sau 5 giờ dược chất giải phóng hoàn toàn. Pellet vẫn giữ nguyên hình dạng khi giải phóng hoàn toàn dược chất.

3.3.2 Xây dựng công thức pellet mesalamin bao giải phóng tại đại tràng

Tiêu chuẩn đánh giá thuốc giải phóng tại đại tràng dựa theo T10 và T80 tương ứng với thời gian 10 % và 80 % lượng dược chất được giải phóng Trong đó T 10 được xem là quan trọng nhất vì đây chính là thời gian tiềm tàng (Tlag) của hệ, đặc trưng cho thuốc giải phóng tại đại tràng [30] Tham khảo % dược chất giải phóng từ vi cầu indomethacin giải phóng tại đại tràng của Sajeev Chandran và cộng sự, mục tiêu bào chế được pellet mesalamin có một lớp bao film giải phóng tại đại tràng có

T 10 từ 4 - 6 giờ và T 80 nhỏ hơn 16 giờ [85].

3.3.2.1 Nghiên cứu màng bao chỉ chứa zein trong pellet bao giải phóng tại đại tràng

Theo các tài liệu tham khảo trước đó, zein là nguyên liệu tiềm năng và triển vọng trong bào chế viên bao kiểm soát giải phóng Tuy nhiên, hiện nay chưa có nghiên cứu nào sử dụng đơn thành phần zein làm tá dược kiểm soát giải phóng trong bào chế pellet giải phóng tại đại tràng Do vậy, nhóm nghiên cứu tiến hành bao pellet mesalamin chỉ sử dụng zein với mong muốn pellet bao sẽ giải phóng tại đại tràng theo cơ chế ăn mòn.

Tiến hành bao pellet sử dụng zein với tỉ lệ các thành phần trong công thức trình bày trong bảng 3.24 cho pellet nhân được bào chế bằng CT3

Bảng 3.24 Công thức dịch bao chỉ chứa zein cho 50 g mẻ pellet nhân mesalamin

200 ml Pellet sau khi bao được đánh giá thử hòa tan in vitro ở điều kiện 1 (2 giờ đầu trong môi trường HCl 0,1 N pH 1,2 và các giờ tiếp theo ở môi trường đệm phosphat pH 6,8) ở mục 2.2.4.4 được kết quả như sau

Hình 3.9 Kết quả thử hòa tan pellet bao film chứa zein (n = 6)

Với bề dày màng bao 20%, dược chất trong pellet bao giải phóng nhanh trong 2 giờ đầu (khoảng 80% dược chất giải phóng sau 2 giờ), do đó, không thể bào chế pellet bao giải phóng tại đại tràng mà chỉ sử dụng zein làm tá dược kiểm soát giải phóng.

3.3.2.2 Nghiên cứu phối hợp zein với các tá dược kiểm soát giải phóng khác trong thành phần lớp bao

Qua kết quả được trình bày trong mục 3.3.2.1, luận án quyết định tiến hành phối hợp zein với 1 tá dược kiểm soát giải phóng khác để tăng khả năng trì hoãn giải phóng cho pellet bao với mong muốn: zein là một protein khi được ion hóa mang điện tích dương, phối hợp với 1 tá dược khi ion hóa mang điện tích âm sẽ làm cho màng bao chắc chắn hơn.

● Nghiên cứu ảnh hưởng của loại tá dược kiểm soát giải phóng kết hợp với zein

Tiến hành bao pellet nhân CT3 sử dụng zein kết hợp với một tá dược kiểm soát giải phóng khác với tỉ lệ các thành phần trong công thức trình bày trong bảng 3.25.

Bảng 3.25 Công thức dịch bao khảo sát ảnh hưởng của loại tá dược KSGP kết hợp với zein cho 50 g mẻ pellet nhân mesalamin

T Thành phần CT9 CT10 CT

Tiến hành thử hòa tan ở điều kiện 1 (2 giờ đầu trong môi trường HCl 0,1 N pH 1,2 và các giờ tiếp theo ở môi trường đệm phosphat pH 6,8) ở mục 2.2.4.4 thu được kết quả sau

Hình 3.10 Kết quả thử độ hòa tan của các mẫu pellet bào chế theo công thức màng bao chứa zein kết hợp với một polyme kiểm soát giải phóng khác (n = 6)

Kết quả thử nghiệm cho thấy:

Về mức độ thuận tiện trong quá trình bao, hầu hết các công thức đều được tiến hành bao dễ dàng theo các thông số đã nêu trong mục 2.2.2 Pellet bao thu được đều màu và ít bị dính vào nhau.

Từ đồ thị ta thấy, với cùng bề dày màng bao là 20 %, khả năng kiểm soát giải phóng dược chất của các công thức được chia thành 2 loại:

Loại 1 bao gồm các công thức màng bao: CT9, CT10: Dược chất giải phóng nhanh và gần như hoàn toàn trong 2 giờ đầu.

Loại 2: CT11, công thức này có khả năng kiểm soát giải phóng dược chất tốt hơn các công thức ở loại 1 và cho thấy sự phù hợp hơn trong bào chế màng bao giải phóng tại đại tràng: trì hoãn giải phóng tốt hơn trong các giờ đầu (T lag đạt 4 - 5 giờ) và có dấu hiệu giải phóng nhanh trong các giờ tiếp theo Vì vậy Eudragit S100 được lựa chọn làm tá dược kiểm soát giải phóng kết hợp với zein để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.

● Nghiên cứu loại chất hóa dẻo trong công thức bào chế Đối với phương pháp bao màng, lựa chọn chất hóa dẻo là một trong những yếu tố quan trọng bởi chất hóa dẻo là thành phần làm tăng tính mềm dẻo, giảm hiện tượng nứt vỡ, cải thiện khả năng bám dính của màng vào nhân và cải thiện tính thấm của màng, do đó ảnh hưởng tới khả năng kiểm soát giải phóng dược chất của màng bao Vì vậy, để lựa chọn được loại chất hóa dẻo phù hợp, cần tiến hành khảo sát ảnh hưởng của chất hóa dẻo tới khả năng kiểm soát giải phóng dược chất của pellet bao.

Tiến hành bao pellet nhân CT3 sử dụng các loại chất hoá dẻo như sau

Bảng 3.26 Công thức dịch bao cho 50g mẻ pellet nhân mesalamin

Tiến hành thử hòa tan ở điều kiện 1 (2 giờ đầu trong môi trường HCl 0,1 N pH 1,2 và các giờ tiếp theo ở môi trường đệm phosphat pH 6,8) ở mục 2.2.4.4, thu được kết quả như biểu diễn bằng đồ thị hình sau

Hình 3.11 Kết quả thử độ hòa tan của các mẫu pellet sử dụng chất hóa dẻo khác nhau (n = 6)

Kết quả thử nghiệm cho thấy :

Về mức độ thuận tiện trong quá trình bao: Màng bao CT11 và CT13 sử dụng chất hóa dẻo DBP và TEC cho pellet bao đều màu, buồng bao ít bụi và pellet ít bị dính Trong khi đó màng bao CT12 sử dụng glycerin làm cho pellet bị dính lại với nhau nhiều và dính trên buồng bao Nguyên nhân có thể do glycerin là chất lỏng có độ dính và độ nhớt cao nên khi sử dụng để phun vào pellet dễ làm cho các hạt dính lại với nhau.

TỐI ƯU HÓA CÔNG THỨC MÀNG BAO PELLET MESALAMIN GIẢI PHÓNG TẠI ĐẠI TRÀNG 95 1 Thiết kế thử nghiệm tối ưu hóa 95 2 Xác định công thức màng bao pellet tối ưu 99 3.5 NGHIÊN CỨU NÂNG CẤP QUY TRÌNH BÀO CHẾ PELLET

3.4 TỐI ƯU HÓA CÔNG THỨC MÀNG BAO PELLET MESALAMIN GIẢI PHÓNG TẠI ĐẠI TRÀNG

3.4.1 Thiết kế thử nghiệm tối ưu hóa

Dựa vào các nghiên cứu sơ bộ trước đó và tài liệu tham khảo, tiến hành thiết kế thử nghiệm tối ưu hóa với khoảng biến thiên của các biến đầu vào và yêu cầu của biến đầu ra như sau:

Bảng 3.30 Khoảng thiết kế của biến đầu vào

Biến độc lập Khoảng biến thiên Ghi

% 34 % Dựa trên khảo sát sơ bộ, lựa chọn khoảng biến thiên như đã trình bày

Ghi chú: X 1 : bề dày màng bao; X 2 : tỉ lệ % Eudragit S100 so với tổng lượng polyme; X 3 : Nhiệt độ ủ trong 24 giờ sau bao.

Mức 26% là 1455,3 mg, mức 30% là 1501,5 mg và mức 34 % là 1547,7 mg (tính cho lượng pellet chứa 500 mg mesalamin) Khối lượng pellet nhân 1155 mg

Bảng 3.31 Yêu cầu của biến đầu ra

Thuốc ở đoạn đường tiêu hóa trước đại tràng

Thời gian thuốc ở đại tràngThiết kế thí nghiệm theo mô hình mặt hợp tử tại tâm thu được 17 công thức.Trong đó có 3 công thức tại tâm để đánh giá mức độ lặp lại của thí nghiệm Tiến hành bào chế và thử hòa tan 17 công thức màng bao ở điều kiện 2 được trình bày ở mục 2.2.4.4 và tiến hành khớp mô hình động học Mô hình động học phù hợp nhất được trình bày ở phụ lục 2.9 sẽ được sử dụng để tính T 10 và T 80 Kết quả thu được như sau

Bảng 3.32 Giá trị T 10 và T 80 của các công thức thí nghiệm

Phân tích số liệu thu được kết quả phân tích phương sai ANOVA cho biến đầu ra ở bảng 3.33.

Bảng 3.33 Phân tích phương sai ANOVA cho T 10

T 10 Bậc tự do Tổng bình phương

Bảng 3.34 Phân tích phương sai ANOVA cho T 80

T 80 Bậc tự do Tổng bình phương

Kết quả cho thấy T 10 có giá trị R 2 , R 2 hiệu chỉnh lớn hơn T 80 Trong khi, Q 2 thể hiện khả năng dự đoán của mô hình Tương tự R 2 , Q 2 của T 10 cao hơn T 80 Ngoài ra, giá trị P của tất cả các biến đầu ra < 0,05 và P (khuyết) > 0,05 Do đó, các biến đầu ra T 10 , T 80 phù hợp với mô hình phân tích.

Kết quả phân tích hệ số hồi quy cho các biến đầu ra như sau:

Bảng 3.35 Phân tích hệ số hồi quy của T 10

T 10 Hệ số Độ lệch chuẩn P Khoảng tin cậy

Bảng 3.36 Phân tích hệ số hồi quy của T 80

T 80 Hệ số Độ lệch chuẩn P Khoảng tin cậy

(b) Hình 3.18 (a) Ảnh hưởng của biến đầu vào đến T 10 , (b) Ảnh hưởng của biến đầu vào đến T 80

Giá trị P < 0,05 thể hiện sự phụ thuộc có ý nghĩa thống kê của các biến độc lập và các biến phụ thuộc Đối với biến đầu ra T 10 và T 80 , giá trị P của X 1 và X 2 0,05 chứng tỏ X 1 , X 2 ảnh hưởng có giá trị thống kê đối với

T 10 và T 80 , nhưng biến X 3 lại ảnh hưởng không nhiều đến T 10 và T 80 Hình 3.19 thể hiện xu hướng ảnh hưởng của biến X 1 , X 2 đến T 10 và T 80 Hình 3.19 (a) cho thấy, T 10 có xu hướng tăng tỷ lệ thuận với X 1 nhưng không tỷ lệ thuận với X 2 Hình 3.19 (b) cho thấy ở một số giá trị X 2 , T 80 tăng tỷ lệ thuận với X 1

3.4.2 Xác định công thức màng bao pellet tối ưu

Tối ưu hóa công thức bào chế: Phân tích tối ưu từ MODDE 12.0 với điều kiện T 10 tiến tới 6 giờ, T 80 tiến tới 8 giờ Kết quả không gian thiết kế như hình 3.20.

Hình 3.19 Không gian thiết kế tối ưu

Giá trị tối ưu dự đoán từ mô hình: X 1 = 34 %, X 2 = 30 %, X 3 = 62 0 C Bao 240 g pellet nhân bằng công thức màng bao tối ưu như ghi ở bảng 3.37.

Bảng 3.37 Công thức màng bao tối ưu cho 240 g pellet nhân bằng phần mềm MODDE 12.0

Tiến hành thử hòa tan được kết quả như sau

% me sal am in giả i

Hình 3.20 % mesalamin giải phóng của công thức tối ưu (n = 3)

Bảng 3.38 So sánh kết quả T 10 , T 80 mô hình dự đoán và số liệu thực nghiệm

CT tối ưu 4,3 giờ 8,7 giờ

8,9 giờ Kết quả thực nghiệm công thức tối ưu có giá trị T 10 và T 80 sai khác lần lượt 4,44% và 2,25% (< 5 %) so với giá trị dự đoán của mô hình Mô hình dự đoán phù hợp với kết quả thực nghiệm Công thức tối ưu đáp ứng yêu cầu nghiên cứu.

3.5 NGHIÊN CỨU NÂNG CẤP QUY TRÌNH BÀO CHẾ PELLET MESALAMIN GIẢI PHÓNG TẠI ĐẠI TRÀNG Ở QUY MÔ 2 KG PELLET NHÂN / MẺ BAO

Do nguyên liệu hạn chế, nên trong nghiên cứu này chỉ mới có thể xây dựng quy trình bào chế pellet nhân ở quy mô 2,2 kg pellet nhân / mẻ và 2,0 kg pellet nhân / mẻ bao Tỷ lệ các thành phần trong công thức pellet nhân và màng bao được giữ nguyên theo công thức đã chọn Quy trình bào chế được thực hiện theo phương pháp mô tả ở mục 2.2.2, quá trình trộn khô và trộn ướt sử dụng máy trộn siêu tốc. Quá trình xát hạt sử dụng máy xát hạt Quá trình đùn sử dụng máy đùn Cavela và quá trình vo tạo cầu sử dụng máy tạo cầu Cavela Quá trình bao pellet sử dụng thiết bị bao tầng sôi Qui Long Quá trình đóng nang sử dụng thiết bị đóng nang tự động Jiangnan

3.5.1 Mô tả quy trình bào chế pellet mesalamin giải phóng tại đại tràng

Bảng 3.39 Công thức cho mẻ 2,2 kg pellet nhân

Tính cho lượng pellet chứa 500 mg mesalamin (mg)

Tính cho quy mô 2,2 kg pellet nhân / mẻ (g)

Bảng 3.40 Công thức dịch bao cho mẻ 2,0 kg pellet nhân / mẻ bao

Thành phần Tính cho quy mô 2 kg pellet nhân / mẻ bao

3.5.1.2 Tóm tắt quy trình bào chế

Quy trình bào chế gồm các giai đoạn chính:

● Sơ đồ quy trình pha chế

Hình 3.21 Sơ đồ quy trình pha chế

● Bào chế pellet nhân mesalamin

Trộn bột khô: Trộn đều hỗn hợp mesalamin, MCC PH101, lactose monohydrat, DST và Aerosil 200 bằng thiết bị trộn siêu tốc với tốc độ cánh chính

25 Hz trong 10 phút  hỗn hợp (1)

Trộn bột ướt: Pha tá dược dính PVP K30 / nước: Cân và cho lượng PVP K30 vào lượng nước trong công thức, khuấy đến khi PVP K30 tan hoàn toàn trong nước được dung dịch (2) Cho dung dịch (2) vào hỗn hợp (1) và trộn ướt bằng máy trộn siêu tốc với tốc độ cánh chính 25 Hz trong 10 phút được hỗn hợp bột ướt (3)

Xát khối ẩm qua rây: Cho hỗn hợp bột ướt (3) qua rây 5 mm được hỗn hợp bột ướt (4)Ủ: Ủ bột ướt (4) trong 1 giờ Đùn: Đùn bột ẩm sau ủ qua máy đùn Caleva với đường kính lỗ đùn 0.8 – 1 mm và tốc độ đùn 80 vòng/phút

Vo tạo cầu: Sợi sau khi qua máy đùn được vo tạo cầu bằng máy tạo cầu Caleva ở tốc độ cao 1500 vòng/phút trong 90 giây thu được pellet nhân mesalamin.

Sấy pellet và chọn pellet: Sấy pellet sau khi tạo cầu ở 60 o C đến độ ẩm < 3%. Pellet sau khi đạt độ ẩm được rây qua rây 0,8 mm và 1 mm để chọn pellet có kích thước trong khoảng 0,8 – 1 mm để bao film.

● Bào chế pellet bao mesalamin giải phóng tại đại tràng

Cho DBP vào 70% lượng ethanol 80 % được dung dịch (1).

Cho zein, Eudragit S100 và EC vào dung dịch (1), hòa tan hoàn toàn được dung dịch (2).

Nghiền bột talc và rây qua rây số 180 Sau đó cho bột talc vào dung dịch (2), khuấy đều được hỗn dịch (3)

Thêm dung môi ethanol 80 % vừa đủ vào hỗn dịch (3), khuấy liên tục trong 1 giờ bằng máy khuấy từ Lọc qua rây số 180.

Bao film: Pellet nhân được bao bằng máy bao tầng sôi Qui Long có công suất bao từ 200 g – 2 kg Các thông số bao như sau:

Nhiệt độ khí thổi vào: 30 o C

Tần số quạt hút: 28 – 30 Hz

Tốc độ bơm nhu động tương ứng: 2,8 g dịch/phút Đường kính miệng vòi phun: 1 mm Áp suất súng phun: 1 bar

Khối lượng pellet nhân: 2 kg Ủ pellet sau khi bao ở 62 o C trong 24 giờ Pellet bao film được bảo quản ở nhiệt độ phòng trước khi đóng nang

● Đóng nang, đóng lọ Đóng 387 mg pellet bao chứa khoảng 125 mg mesalamin vào nang số 0 bằng máy đóng nang tự động Jiangnan công suất đóng nang 10000 – 15000 viên/giờ. Đóng nang thuốc vào lọ thủy tinh màu nâu

3.5.2 Kiểm soát quy trình bào chế viên mesalamin giải phóng tại đại tràng

3.5.2.1 Đánh giá nguy cơ gây mất ổn định trong quy trình bào chế

Xem xét từng giai đoạn của quy trình bào chế để đánh giá các yếu tố nguy cơ ảnh hưởng và có thể làm cho quy trình bào chế không ổn định Từ đó đề xuất biện pháp xử lý để hạn chế các nguy cơ này.

Bảng 3.41 Đánh giá nguy cơ ảnh hưởng đến độ ổn định của quy trình bào chế

Nguy cơ dự kiến Tần suất Ảnh hưởn g

Giai đoạn bào chế pellet nhân

Hàm lượng không đồng đều Th ấp L ớ n

Kiểm soát thời gian trộn, tốc độ trộn, lượng bột đem trộn

Hàm lượng không đồng đều.

Khó Kiểm soát thời gian trộn, tốc độ trộn ộ n b ột ư ớt Độ ẩm không đồng nhất Th ấp

Khó Kiểm soát tốc độ cho tá dược dính

Tạo hạt trong quá trình rây Thấp Ít Dễ Kiểm soát cỡ rây, tốc độ xát hạt. Đù n

Sợi bột bị khô Thấp L ớ n

Dễ Kiểm soát tốc độ đùn.

Pellet không thành hình cầu

Kiểm soát tốc độ, thời gian, khối lượng mỗi lần vo tạo cầu.

Sấ y – ch ọn pel let Độ ẩm không đạt Thấp Tru ng bìn h

Dễ Kiểm soát nhiệt độ sấy, thời gian sấy Độ ẩm không đồng nhất

Dễ Kiểm soát khối lượng sấy

Giai đoạn bào chế pellet bao film

Hình thức pellet không đạt do bị dính lại

Dễ Kiểm soát lượng dịch phun

Pellet bị dính nhiều ở túi lọc

Kiểm tra tốc độ quạt hút Kiểm soát lượng dịch phun

Bề dày pellet không đều Thấp L ớ n

Khó Kiểm tra đĩa phân phối khí

Bề dày thay đổi nhiều giữa các lần bao khác nhau

Cố định số lượng mỗi mẻ bao Cố định các thông số bao Cố định vị trí lắp vòi phun dịch.

Vệ sinh sạch đĩa phân phối khí Kiểm soát khí nén cấp vào không được có nước. Đón g nan g

Khối lượng các viên nang không đồng đều

Khó Kiểm soát tốc độ đóng nang

3.5.2.2 Lựa chọn các thông số kiểm soát

Qua đánh giá nguy cơ như trên, tiến hành thẩm định trên 3 lô nghiên cứu với các thông số như sau:

Bảng 3.42 Các thông số trọng yếu cần kiểm soát

Giai đoạn Thông số Chỉ tiêu kiểm soát

Yêu cầu Phươ ng pháp

Hàm lượng mesalamin đạt từ 90

– 110% so với hàm lượng lý thuyết

HPLC Độ phân tán hàm lượng

- Tốc độ trộn Độ ẩm khối bột 30 – 35 % Cân sấy ẩm

Hàm lượng mesalamin đạt từ 90

– 110 % so với hàm lượng lý thuyết

- Tốc độ vo Hình thức pellet Hình cầu, đều, không bị dính lại Cảm quan

- Nhiệt độ sấy Độ ẩm pellet < 3 % Cân sấy ẩm

- Nhiệt độ khí thổi vào

- Tốc độ phun dịch bao

- Đường kính miệng vòi phun

Hình thức Pellet màu vàng, hình cầu

Hàm lượng mesalamin đạt từ 90

– 110 % so với hàm lượng lý thuyết

HPLC Độ phân tán hàm lượng

CV < 3 % Thống kê Đóng nang

Hình thức Nang kín, đều Cảm quan Độ đồng đều khối lượng đóng nang

AV ≤ 15% Độ hòa tan Đạt yêu cầu thuốc giải phóng tại đại tràng

Thử hòa tan và định lượng bằng phương pháp UV- VIS

Bảng 3.43 Quá trình lấy mẫu kiểm soát

2 T K 3 Độ phân tán hàm lượng

Dùng dụng cụ để lấy mẫu ở giữa khối bột. Mẫu sau khi lấy cho vào 2 lớp túi nilon, buộc kín và ghi nhãn Trộn bột ướt

Kết thúc giai đoạn trộn bột ướt

T U 1 T U 2 T U 3 Độ ẩm 5 g/mẫu Dùng dụng cụ để lấy mẫu ở giữa khối bột. Mẫu sau khi lấy cho vào 2 lớp túi nilon, buộc kín và ghi nhãn

Sau khi vo tạo hạt

Hình thức 2 g/mẫu Dùng dụng cụ lấy mẫu, xem xong rồi trả lại

Sau khi sấy và chọn pellet

S 2 S Độ ẩm 2 g/mẫu Dùng dụng cụ lấy mẫu Mẫu sau khi lấy cho vào 2 lớp túi nilon buộc kín và ghi nhãn

Dùng dụng cụ lấy mẫu Mẫu sau khi lấy cho vào 2 lớp túi nilon buộc kín và ghi nhãn

Hàm lượng Độ phân tán hàm lượng Đóng nang Đầu, giữa, cuối quá Đầ u, gi ữa , cu ối Đ N 1 Đ N 2 Đ N 3

Lấy mẫu bằng tay, sau đó cho vào 2 lớp túi nilon Độ đồng đều khối trình đóng nang công đoạn lượng đóng nang buộc kín và ghi nhãn Độ hòa tan

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH VIÊN

Các mẫu pellet mesalamin giải phóng tại đại tràng được bào chế quy mô mỗi mẻ 2 kg pellet nhân / mẻ bao theo phương pháp ghi tại mục 2.2.2 Tiến hành bào chế 3 lô Dựa vào kết quả kiểm nghiệm tiêu chuẩn chất lượng, đề xuất tiêu chuẩn cơ sở cho pellet nhân, pellet bao và viên nang mesalamin GPTĐT.

Bảng 3.46 Đề xuất tiêu chuẩn chất lượng của pellet nhân

1 Hình thức Pellet hình cầu, màu nâu

2 Định tính Phải thể hiện phép thử định tính mesalamin

3 Độ hòa tan - Môi trường pH 6,8:

+ Sau 1 giờ: ≥ 80 % mesalamin giải phóng

4 Định lượng Hàm lượng mesalamin (C 7 H 7 NO 3 ) từ 90 – 110 %

Bảng 3.47 Đề xuất tiêu chuẩn chất lượng của pellet bao

1 Hình thức Pellet hình cầu, màu vàng

2 Định tính Phải thể hiện phép thử định tính mesalamin

3 Độ hòa tan - Môi trường pH 1,2:

+ Sau 2 giờ: < 10 % mesalamin giải phóng

- Môi trường đệm phosphat pH 7,4:

+ Sau 2 giờ ở môi trường đệm phosphat pH 7,4: ≤

+ Sau 6 giờ ở môi trường đệm phosphat pH 6,8: ≥

4 Định lượng Hàm lượng mesalamin (C 7 H 7 NO 3 ) từ 90 – 110 %

Bảng 3.48 Đề xuất tiêu chuẩn chất lượng viên nang mesalamin 125 mg GPTĐT

1 Hình thức Viên nang số 0 chứa pellet hình cầu, màu vàng bên trong

2 Độ đồng đều khối lượng viên Giá trị chấp nhận (AV) ≤ 15%

3 Định tính Phải thể hiện phép thử định tính mesalamin

4 Độ hòa tan - Môi trường pH 1,2:

+ Sau 2 giờ: < 10 % mesalamin giải phóng

- Môi trường đệm phosphat pH 7,4:

+ Sau 2 giờ ở môi trường đệm phosphat pH 7,4: ≤

+ Sau 6 giờ ở môi trường đệm phosphat pH 6,8: ≥

5 Định lượng Hàm lượng mesalamin (C 7 H 7 NO 3 ) trong viên phải đạt từ 90 – 110 % so với lượng ghi trên nhãn

3.6.2 Đánh giá độ ổn định

Các mẫu viên nang mesalamin giải phóng tại đại tràng của 3 lô sản phẩm khác nhau bào chế theo phương pháp ghi ở mục 2.2.2 Mỗi viên nang đóng pellet bao chứa 125 mg mesalamin Viên đóng lọ thủy tinh nâu, mỗi lọ đóng 20 viên và bảo quản ở điều kiện phòng thí nghiệm trong 12 tháng và điều kiện lão hóa cấp tốc (nhiệt độ 40 ± 2 o C, độ ẩm 75 ± 5%) trong 6 tháng (theo hướng dẫn của Asean).

Do hạn chế về thời gian, mới chỉ theo dõi độ ổn định ở điều kiện thường trong thời gian 12 tháng Độ ổn định của thuốc đang được tiếp tục theo dõi và lấy mẫu kiểm tra cho tới thời gian quy định.

Kết quả khảo sát các chỉ tiêu chất lượng của thuốc được trình bày dưới đây.

So với mẫu viên mới bào chế, các viên bào chế được bảo quản ở điều kiện thường trong 12 tháng và điều kiện lão hóa cấp tốc trong 6 tháng đều không có sự thay đổi về hình thức.

Bảng 3.49 Hàm lượng (%) của 3 lô viên mesalamin giải phóng tại đại tràng ở điều kiện dài hạn sau 12 tháng (n = 6)

Bảng 3.50 Hàm lượng (%) của 3 lô viên mesalamin giải phóng tại đại tràng ở điều kiện lão hóa cấp tốc sau 6 tháng (n = 6)

Kết quả khảo sát hàm lượng của viên mesalamin giải phóng tại đại tràng trong các điều kiện bảo quản cho thấy: sau 6 tháng bảo quản ở điều kiện lão hóa cấp tốc và 12 tháng bảo quản ở điều kiện thường, sự thay đổi hàm lượng ở các mẫu thử nghiệm nằm trong giới hạn cho phép Các mẫu viên sẽ tiếp tục được theo dõi, lấy mẫu định lượng ở điều kiện thực để có thể có kết luận về độ ổn định của viên nghiên cứu.

3.6.2.3 Theo dõi độ hòa tan

Kết quả khảo sát độ hòa tan dược chất từ viên mesalamin giải phóng tại đại tràng trong các điều kiện bảo quản với khoảng thời gian xác định cho thấy độ hòa tan thay đổi không đáng kể so với ban đầu.

Bảng 3.51 % dược chất giải phóng của 3 lô viên mesalamin giải phóng tại đại tràng được bảo quản ở điều kiện thực sau 12 tháng (n = 6)

% mesalamin giải phóng theo thời gian (TB ± SD) pH 1,2 pH 7,4 pH 6,8

Bảng 3.52 % dược chất giải phóng của 3 lô viên mesalamin giải phóng tại đại tràng được bảo quản ở điều kiện lão hóa cấp tốc sau 6 tháng (n = 6)

% mesalamin giải phóng theo thời gian (TB ± SD) pH 1,2 pH 7,4 pH 6,8

2 giờ 1 giờ 2 giờ 3 giờ 2 giờ

3.6.2.4 Tuổi thọ dự đoán bằng phương pháp ngoại suy theo phần mềm Minitab 17

Phân tích dữ liệu độ ổn định với các chỉ tiêu định lượng, độ hòa tan với dữ liệu dài hạn 12 tháng theo phần mềm Minitab 17 được kết quả như sau:

Hình 3.23 Ước lượng tuổi thọ với mức chất lượng hàm lượng 90 – 110 %

Hình 3.23 biểu diễn đường hồi quy của hàm lượng mesalamin có mức chất lượng trên và dưới lần lượt là 110% và 90% so với hàm lượng trên nhãn Đường biểu diễn giới hạn tin cậy dưới 95% cắt đường biểu diễn cận dưới của mức chất lượng ở thời điểm 32 tháng, trong khi đó đường biểu diễn giới hạn tin cậy trên không cắt đường biểu diễn cận trên của mức chất lượng tại các thời điểm trở về sau. Hàm lượng dược chất thay đổi ở điều kiện lão hóa và điều kiện thực 3 – 4 %, do vậy tuổi thọ đề xuất 18 tháng có thể được hỗ trợ bởi phân tích thống kê dữ liệu hàm lượng.

Hình 3.24 Ước lượng tuổi thọ với mức chất lượng độ hòa tan sau 2 giờ ở pH 1,2

Hình 3.24 biểu diễn đường hồi quy của độ hòa tan mesalamin sau 2 giờ ở pH1,2 với mức chất lượng là không lớn hơn 5,0 % Đường biểu diễn giới hạn tin cậy trên không cắt đường biểu diễn cận trên của mức chất lượng tại các thời điểm trở về sau Vì vậy, tuổi thọ đề xuất 18 tháng có thể được hỗ trợ bởi phân tích thống kê dữ liệu độ hòa tan.

Hình 3.25 Ước lượng tuổi thọ với mức chất lượng độ hòa tan sau 2 giờ ở điều kiện 30 ºC, độ ẩm 75 %

Hình 3.25 biểu diễn đường hồi quy của độ hòa tan mesalamin sau 2 giờ ở pH 7,4 với mức chất lượng là không lớn hơn 10,0% Đường biểu diễn giới hạn tin cậy trên không cắt đường biểu diễn cận trên của mức chất lượng tại các thời điểm trở về sau Vì vậy, tuổi thọ đề xuất 18 tháng có thể được hỗ trợ bởi phân tích thống kê dữ liệu độ hòa tan.

Hình 3.26 Ước lượng tuổi thọ với mức chất lượng độ hòa tan sau 6 giờ trong môi trường pH 6,8 ở điều kiện 30 ºC, độ ẩm 75 %

Hình 3.26 biểu diễn đường hồi quy của độ hòa tan mesalamin sau 6 giờ trong môi trường pH 6,8 với mức chất lượng là không nhỏ hơn 80% Đường biểu diễn giới hạn tin cậy 95 % về phía dưới của giá trị trung bình cắt đường biểu diễn mức chất lượng ở thời điểm 26 tháng Vì vậy, tuổi thọ đề xuất 18 tháng có thể được hỗ trợ bởi phân tích thống kê dữ liệu độ hòa tan

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng viên nang mesalamin ổn định trong thời gian bảo quản trên các chỉ tiêu đã nghiên cứu Từ kết quả ngoại suy theo phần mềm Minitab 17 tuổi thọ đề xuất là 18 tháng.

Các mẫu viên sẽ tiếp tục được theo dõi, lấy mẫu thử độ hòa tan ở điều kiện dài hạn để có kết luận về độ ổn định của viên nghiên cứu

3.7 SỰ DỊCH CHUYỂN PELLET IN VIVO TRONG ĐƯỜNG TIÊU HÓA CHÓ BẰNG CHỤP X-QUANG

Tiến hành thử nghiệm như trình bày ở mục 2.2.5.1 để xác định sự dịch chuyển pellet in vivo trong đường tiêu hóa chó Kết quả hình ảnh x-quang của chó 1 được trình bày ở hình 3.26 và của 4 chó còn lại được trình bày ở phụ lục 5.

Hình 3.27 Hình ảnh X-quang của chó 1 ở thời điểm (a) sau 2 giờ 20 ở vị trí nằm ngửa, (b) sau 2 giờ 20 ở vị trí nằm nghiêng, (c) sau 4 giờ ở vị trí nằm ngửa, (d) sau 4 giờ ở vị trí nằm nghiêng,(e) sau 7 giờ ở vị trí nằm ngửa, (f) sau 9 giờ ở vị trí nằm ngửa, (g) sau 9 giờ ở vị trí nằm nghiêng, (h) sau 11 giờ 30 ở vị trí nằm ngửa và (i) sau 11 giờ 30 ở vị trí nằm nghiêng