Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử gen K13 và đáp ứng của Plasmodium falciparum với dihydroartemisininpiperaquin phosphat ở một số vùng sốt rét lưu hành.Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử gen K13 và đáp ứng của Plasmodium falciparum với dihydroartemisininpiperaquin phosphat ở một số vùng sốt rét lưu hành.Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử gen K13 và đáp ứng của Plasmodium falciparum với dihydroartemisininpiperaquin phosphat ở một số vùng sốt rét lưu hành.Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử gen K13 và đáp ứng của Plasmodium falciparum với dihydroartemisininpiperaquin phosphat ở một số vùng sốt rét lưu hành.Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử gen K13 và đáp ứng của Plasmodium falciparum với dihydroartemisininpiperaquin phosphat ở một số vùng sốt rét lưu hành.Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử gen K13 và đáp ứng của Plasmodium falciparum với dihydroartemisininpiperaquin phosphat ở một số vùng sốt rét lưu hành.Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử gen K13 và đáp ứng của Plasmodium falciparum với dihydroartemisininpiperaquin phosphat ở một số vùng sốt rét lưu hành.Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử gen K13 và đáp ứng của Plasmodium falciparum với dihydroartemisininpiperaquin phosphat ở một số vùng sốt rét lưu hành.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học phân tử đột biến gen K13
Plasmodium falciparum tại 5 tỉnh Bình Phước, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh
2.1.1 Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu
- Mẫu máu giấy thấm được thu thập từ bệnh nhân sốt rét do P falciparum đơn thuần chưa biến chứng
Không phân biệt độ tuổi, giới tính, dân tộc;
Tự nguyện tham gia vào nghiên cứu thông qua bản chấp thuận tham gia.
KSTSR P falciparum nhiễm phối hợp với các loài khác
Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2016 đến năm 2018
Nghiên cứu tại thực địa: Được tiến hành tại 5 tỉnh gồm: Bình Phước, Gia Lai,
Khánh Hòa, Ninh Thuận và Quảng Trị
- Bình Phước: là một tỉnh nằm ở phía Đông Nam bộ, phía Bắc và Tây Bắc giáp Campuchia Đa số người dân tại Bình Phước sống dựa vào trồng cây công nghiệp như cao su, điều, cà phê, mì (sắn), khai thác lâm sản Đây cũng là tỉnh có sự giao lưu dân cư lớn, tỉnh có tốc độ tăng trưởng dân số bình quân cao thứ tư toàn quốc Bình Phước là tỉnh có tình hình SR phức tạp nhất cả nước Trong nghiên cứu này, chọn 2 xã là Bù Gia Mập và Đắk Ơ, huyện Bù Gia Mập tỉnh
Bình Phước nơi có Vườn quốc gia Bù Gia Mập và có đường biên giới giáp với Campuchia dài 60 km, phía đông tiếp giáp với huyện Tuy Đức, tỉnh Đắk Nông.
- Gia Lai là một tỉnh miền núi có diện tích lớn thứ hai Việt Nam nằm ở phía Bắc khu vực Tây Nguyên, gồm 14 huyện, 2 thị xã, 1 thành phố Đây là 1 trong hai tỉnh có tỷ lệ mắc sốt rét cao nhất so với cả nước, với tỷ lệ BNSR 5 năm (2011-2015) cao, đối tượng mắc sốt rét chủ yếu là có tham gia khai thác lâm thổ sản, săn bắt thú và có hoạt động ngủ rẫy qua đêm Trong nghiên cứu này, chọn xã Chư Rcăm huyện Krông Pa của tỉnh Gia Lai nơi có giáp ranh với một số tỉnh Bình Định, Phú Yên, Đăk Lăk Đây là xã thuộc vùng SRLH nặng, chủ yếu P. falcipparum, đồng thời là các vùng sốt rét trọng điểm của tỉnh Gia Lai với số
BNSR và số KSTSR chiếm cao.
- Khánh Hòa là một tỉnh ở vùng duyên hải cực Nam Trung Bộ, nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới xavan Song khí hậu Khánh Hòa có những nét biến dạng độc đáo với các đặc điểm riêng biệt, khí hậu ở Khánh Hòa tương đối ôn hòa hơn do mang tính chất của khí hậu đại dương Thường chỉ có 2 mùa rõ rệt là mùa mưa và mùa khô Khánh Vĩnh có địa hình chủ yếu là đồi núi và phân thành 2 khu vực chính, là huyện có tỷ lệ mắc sốt rét cao nhất của tỉnh Khánh Hòa trong đó bệnh nhân chủ yếu tập chung ở xã Sơn Thái do vậy trong nghiên cứu này chúng tôi đã chọn xã Sơn Thái là địa điểm nghiên cứu.
- Ninh thuận là một tỉnh ven biện thuộc duyên hải Nam Trung Bộ của Việt Nam Tỉnh Ninh Thuận có 7 đơn vị hành chính cấp huyện trực thuộc, bao gồm 1 thành phố và 6 huyện; 65 đơn vị hành chính cấp xã, bao gồm 47 xã, 15 phường và 3 thị trấn, là một tỉnh có nhiều xã năm trong vùng sốt rét lưu hành nặng, tỷ lệ mắc sốt rét trong 5 năm (2005-2010) khá cao chủ yếu ở 2 huyện là Bắc Ái và Ninh sơn Trong nghiên cứu này chọn xã Phước Thắng huyện Bắc Ái và xã Ma Nới huyện Ninh Sơn, là 2 xã có tỷ lệ mắc sốt rét cao nhất của tỉnh Ninh Thuận.
- Quảng Trị nằm ở phía Nam của Bắc Trung Bộ, trọn vẹn trong khu vực nhiệt đới ẩm gió mùa, là vùng chuyển tiếp giữa hai miền khí hậu là cận nhiệt đới gió mùa và nhiệt đới gió mùa Hướng Hóa là một huyện miền núi của Quảng Trị nơi đây có Cửa khẩu Quốc tế Lao Bảo nằm trên trục Quốc lộ 9A thông thương với Lào Hướng Hóa cũng là huyện có tình hình sốt rét phức tạp nhất của tỉnh do có đường biên giới dài 156 km thuộc 11 xã tiếp giáp với Lào, nơi thương xuyên có sự giao lưu giữa biên giới 2 nước, trong 11 xã của huyện có 2 xã tỷ lệ mắc sốt rét cao nhất là xã Xy và xã Thanh, đây cũng là 2 xã được chọn vào nghiên cứu.
Hình 2.1 Địa điểm nghiên cứu được thực hiện tại vùng sốt rét lưu hành nặng
Bù Gia Mập, Bình Phước
Bắc Ái; Ninh Sơn, Ninh Thuận
Krong Pa Gia LaiHướng Hóa, Quảng Trị
Nghiên cứu phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm: Tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử, Khoa sinh học phân tử, Viện Sốt rét - KST – CTTƯ.
2.1.2.1 Thiết kế phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả đột biến gen K13 của P falciparum tại phòng thí nghiệm.
2.1.2.2.Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu
- Cỡ mẫu: Vì tỷ lệ mắc sốt rét tại các vùng lưu hành của mỗi tỉnh thay đổi khác nhau, nên số mẫu thu thập trong cùng thời gian cũng khác nhau Do đó, cỡ mẫu điều tra tỷ lệ trường hợp nhiễm P falciparum phát hiện đột biến gen K13 trên các bệnh nhân sốt rét nhiễm đơn thuần P falciparum trong cộng đồng được tính toán tổng số chung theo công thức sau:
Trong đó: n: Là cỡ mẫu tối thiểu cần điều tra phát hiện đột biến gen K13. α: Xác suất sai lầm loại I với α = 0,05 độ tin cậy 95%;
Z(1-α/2) = 1,96 với Z là giá trị phân phối chuẩn; p: Là tỷ lệ số mẫu P falciparum tại các tỉnh có đột biến gen K13 qua các nghiên cứu đơn lẻ trước đây điểm đột biến gen K13 tại mỗi tỉnh Quảng Trị, Ninh Thuận, Gia Lai, Khánh Hòa và Bình Phước là khác nhau, trong đó tỷ lệ mẫu trong quần thể P falciparum có đột biến gen K13 thấp nhất là Ninh Thuận là 5% (hay p = 0,05) và tỷ lệ mẫu trong quần thể có đột biến gen K13 cao nhất là Bình Phước là 45% (hay p = 0,45), nên trong nghiên cứu này chúng tôi chọn là tỷ lệ tỷ lệ mẫu trong quần có đột biến là 25% (hay p = 0,25), d: độ chính xác tuyệt đối, chọn d = 0,05
Thay các giá trị vào công thức trên, tính được cỡ mẫu n = 288 mẫu tại 5 tỉnh. mẫu
Cụ thể nghiên cứu này thu thập được tổng cộng 292 mẫu P falciparum từ 5 tỉnh, trong đó tại từng tỉnh Bình Phước 39 mẫu, Gia Lai 108 mẫu, Khánh Hòa 52 mẫu, Ninh Thuận 44 mẫu, Quảng Trị 49 mẫu.
- Phương pháp chọn mẫu: Mẫu được thu thập không ngẫu nhiên, từ các bệnh nhân sốt rét P falciparum đơn thuần tại các điểm nghiên cứu được kỹ thuật viên thu thập vào trên giấy thấm Whatman 3MM chuyên dụng để khô và sau đó bỏ vào trong túi nilon có khóa và gói hút ẩm, bảo quản trong tủ lạnh âm cho đến khi phân tích.
- Sàng lọc những bệnh nhân đủ tiêu chuẩn đưa vào nghiên cứu
Phát hiện chủ động: Bằng cách điều tra cắt ngang xét nghiệm phát hiện bệnh nhân có KST để đưa vào nghiên cứu.
Phát hiện thụ động: Xét nghiệm KSTSR những bệnh nhân có sốt tới khám tại các cơ sở Y tế.
- Thu thập mẫu: Thu thập các mẫu máu của bệnh nhân nhiễm KST P falciparum trên giấy thấm Whatman 3MM.
- Thực hiện phân tích giải trình tự gen K13 bằng phương pháp Sanger.
- Phân tích kết quả xác định các vị trí điểm đột biến.
2.1.2.4 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu:
- Thu thập mẫu máu bệnh nhân sốt rét nhiễm P falciprum vào giấy thấm Whatman 3MM theo quy trình của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương NIMPE 03.PP/03 [5].
- Tách ADN bằng bộ kít QIAamp Blood DNA Mini Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Phản ứng PCR nhân bản gen K13 với trình tự mồi được thiết kế bởi Ariey và cs 2014 và giải trình tự gen K13 theo phương pháp Sanger [40] Quy trình thực hiện theo quy trình củaViện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương NIMPE HD 03 PP 12 Các nội dung thực hiện chính trong quy trình giải trình tự gen K13 gồm:
Bước 1: Thực hiện kỹ thuật PCR lồng nhân bội đoạn gen K13 theo phương pháp của Ariey và cs 2013 [40].
Sử dụng 2 mồi K13_PCR_F và K13_PCR_R có trình tự như sau:
Thành phần húa chất cho 1 ống phản ứng thể tớch 25àl:
Nước cất khử ion 11 àl
2,5 àl 2,5 àl dNTPs (2,5 mM) 2,5 àl
Taq DNA polymerase (hot-start,1 đơn vị/àl) 0,25 àl
ADN 5 àl Điều kiện tối ưu phản ứng PCR1: Bước 1: 95 0 C trong 15 phút, bước 2 có 30 chu kỳ: 95 0 C trong 30giây, 58 0 C trong 2 phút, 72 0 C trong 2 phút và bước cuối cùng: 72 0 C trong 10 phút.
Sử dụng 2 mồi K13_N_F và K13_N_R có trình tự như sau:
Thành phần húa chất cho 1 ống phản ứng cú thể tớch 50àl:
Nước cất khử ion 27,1 àl
5àl 5àl dNTPs (2,5 mM) 5 àl
Taq DNA polymerase (hot-start,1 đơn vị/àl) 0,4 àl
ADN 5 àl Điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR2:
Bước 1: 95 0 C trong 15 phút, bước 2 có 35 chu kỳ: 95 0 C trong 30 giây, 58 0 C trong 1 phút, 72 0 C trong 1 phút và bước cuối cùng: 72 0 C trong 10 phút.
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 2% và nhuộm ethidium bromide 10 mg/1ml Chụp ảnh điện di và đọc kết quả Kích thước sản phẩm PCR đặc hiệu cho đoạn gen K13 được nhân bội là 849 bp.
Bước 2: Tinh sạch sản phẩm PCR sau nhân bội bằng bộ kít Norgen theo hướng dẫn của nhà sản xuất, được mô tả trong quy trình củaViện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương NIMPE HD 03 PP 12.
Bước 3: Đo nồng độ ADN bằng máy quang phổ nanophotometer Bước 4: Thực hiện phản ứng PCR Sequencing
Theo hướng dẫn của bộ sinh phẩm Bigdye v3.1
Thành phần của phản ứng trong tổng thể tớch 20 àl gồm: Ready Reaction Premix (2,5X) 4 àl
Nước khử ion vừa đủ 20 àl
Chu kỳ nhiệt của phản ứng: 96 0 C-1 phút; 25 chu kỳ của 96 0 C-1 phút; 50 0 C-5 giây; 60 0 C-4 phút; giữ ở 4 0 C cho đến khi lấy mẫu ra khỏi máy.
Bước 5: Tinh sạch sản phẩm phản ứng Sequencing bằng phương pháp tủa cồn
+ Ly tâm nhanh ống mẫu PCR ở tốc độ 8.000 vòng/1 phút trong 15 giây.
+ Hỳt 20 àl dung dịch sản phẩm PCR Sequencing vào ống 1,5 ml.
+ Thờm 60 àl cồn Ethanol tuyệt đối lạnh.
+ Trộn nhẹ, để mẫu ở nhiệt độ phòng 15 phút.
+ Ly tâm ở tốc độ 14.000 vòng/1 phút trong 30 phút và ở 40 0 C.
+ Thờm 60àl cồn Ethanol 70 0 C lạnh.
+ Ly tâm ở tốc độ 14.000 vòng/1 phút trong 15 phút và ở 40 0 C.
+ Làm khô hoặc để khô tự nhiên.
+ Thờm 20àl Hi-di formamide, trộn nhẹ.
+ Hỳt 10 àl sản phẩm đó cú Hi-Di vào Plate 96 giếng, những giếng ko cú mẫu thì cho Hi-Di.
+ Đóng nắp cao su (Strip).
+ Đặt Plate vào máy PCR để biến tính ADN ở 95 0 C trong 2 phút.
+ Đặt ngay Plate vào khay đá khoảng 2 phút.
+ Lắp Plate vào giá đựng Plate và đặt vào máy ABI 3500.
Bước 6: Giải trình tự bằng hệ thống máy giải trình tự ABI
+ Mở phần mềm giải trình tự tại biểu tượng 3500 Series 2 trên màn hình máy tính và khai báo thông tin mẫu, thiết lập chương trình chạy và cho máy hoạt động theo Hướng dẫn kiểm soát hệ thống ABI 3500.
+ Chọn chương trình giải trình tự cho bộ sinh phẩm Bigdye terminatorV3.1Std_Seq_Assay_POP7.
+ Khi kết thúc chương trình chạy, máy báo tín hiệu kết thúc.
+ In hoặc xuất file kết quả giải trình tự.
2.1.2.5 Các chỉ số đánh giá:
- Tỷ lệ bệnh nhân theo giới, theo nhóm tuổi tham gia nghiên cứu.
- Tỷ lệ đột biến gen K13, các kiểu đột biến ở các điểm nghiêm cứu.
- Tỷ lệ đột biến gen K13, các kiểu đột biến theo nhóm tuổi, theo giới tại các điểm nghiêm cứu.
- So sánh tỷ lệ đột biến, kiểu đột biến giữa các điểm nghiên cứu
So sánh tỷ lệ đột biến, kiểu đột biến theo giới, nhóm tuổi, giữa các điểm nghiên cứu
2.1.2.6 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu:
Đánh giá đáp ứng của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum
- Các bệnh nhân được chẩn đoán là sốt rét do P falciparum chưa biến chứng có đủ các tiêu chuẩn tuyển chọn dưới đây được đưa vào đối tượng nghiên cứu thử nghiệm in vivo [101].
Bệnh nhân mắc sốt rét chưa biến chứng từ 2 tuổi đến 70 tuổi;
Không phân biệt giới tính, dân tộc;
Nhiễm đơn thuần P falciparum với mật độ từ 1000 đến dưới 100.000/àL máu.
Nhiệt độ nách ≥ 37,5°C hoặc có tiền sử sốt trong vòng 24 giờ;
Bệnh nhân có khả năng uống được thuốc;
Chưa dùng thuốc sốt rét trong thời gian 2 tuần gần đây;
Không mắc các bệnh mãn tính về gan, thận, tim mạch cũng như mắc phối hợp các bệnh nhiễm trùng cấp tính khác, không suy gan, suy thận.
Tự nguyện tham gia vào nghiên cứu thông qua bản chấp thuận tham gia.
Bệnh nhân sốt rét là phụ nữ mang thai (tét Beta HCG dương tính) hoặc phụ nữ đang có ý định mang thai trong thời gian nghiên cứu;
Không có khả năng uống được thuốc hoặc Bệnh nhân có tiền sử dị ứng với các thành phần của thuốc;
Bệnh nhân bị rối loạn tiêu hóa hoặc bất dung nạp đường uống;
Có biểu hiện suy dinh dưỡng mức độ nặng đối với trẻ dưới 60 tháng tuổi;
Bệnh nhân không đồng ý tham gia vào nghiên cứu hoặc không chịu theo lịch khám và theo dõi trong suốt 42 ngày của quy trình đề cương.
Thuốc dihydroartemisinin – piperaquin (Arterakin) với nghiên cứu in vivo. Dạng viên nén bao phin, mỗi viên arterakin chứa 40 mg dihydroartemisinin (DHA) và 320 mg piperaquin (PPQ) do xí nghiệp dược phẩm trung ương I sản xuất, thuốc đang được sử dụng trong chương trình PCSR Việt Nam hiện nay.
Số lô: 16001 Ngày sản xuất: 06/03/2016
Tiêu chuẩn chất lượng : đạt chất lượng cơ sở Cách sử dụng theo bảng dưới đây:
Bảng 2.1 Bảng liều thuốc Arterakin sử dụng cho bệnh nhân nghiên cứu [2]
Cân nặng Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3
Chú ý:Thuốc primaquine phosphate (PQ) sẽ không được sử dụng trong suốt quá trình theo dõi điều trị và đánh giá hiệu lực thuốc, đến sau ngày D42 mới chỉ định liều đơn duy nhất PQ trước khi kết thúc liệu trình theo dõi.
- Nghiên cứu được tiến hành tại: Huyện Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước; huyện
Krông Pa, tỉnh Gia Lai; huyện Khánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hòa;huyện Ninh Sơn, tỉnh Ninh Thuận; huyện Hướng Hóa, tỉnh Quảng Trị,.
Nghiên cứu thực hiện từ năm 2016 đến năm 2018
Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng không ngẫu nhiên, không đối chứng.
2.2.2.2 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu
- Cỡ mẫu cho nghiên cứu:
Dựa trên tỷ lệ thất bại lâm sàng của nghiên cứu trước đó với thuốc DHA- PPQ là dưới 10 % do vậy tỷ lệ 10% được chọn để xác định tính cỡ mẫu cho nghien cứu này.
Với khoảng tin cậy CI 95%, độ chính xác tuyệt đối 10% (d); tỷ lệ bệnh nhân mất theo dõi và rút khỏi nghiên cứu khoảng 10%
Khi đó cỡ mẫu tính được dựa vào bảng xác định cỡ mẫu của WHO, 2009 [101].
Khi giá trị p = 0,10 (10%), d = 10%, bệnh nhân mất theo dõi và rút khỏi nghiên cứu khoảng 10% thì sẽ cần cỡ mẫu tối thiểu là 35 + 4 = 39 bệnh nhân.
Do vậy cơ mẫu chung cho cả nghiên cứu 5 tỉnh sẽ là 39 bệnh nhân x 5 tỉnh 195 bệnh nhân
Bảng 2.2 Cỡ mẫu ước tính dựa vào tỷ lệ thất bại lâm sàng (p) ở quần thể [101]
Tỷ lệ thất bại lâm sàng trên quần thể (p) với độ tin cậy 95% d 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50
- Sàng lọc đối tượng đủ điều kiện để đưa vào nghiên cứu (phụ lục 2).
Điều tra, thu thập bệnh nhân từ các cơ sở y tế
Bệnh nhân có đủ tiêu chuẩn đưa vào nghiên cứu.
Bệnh nhân tự nguyện tham gia nghiên cứu và tuân thủ theo quy trình nghiên cứu.
- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng
Khi bệnh nhân đã có đủ tiêu chuẩn tham gia nghiên cứu Bệnh nhân hoặc cha mẹ bệnh nhân (nếu là trẻ em) được thông báo về nội dung nghiên cứu sau đó tự nguyện ký vào tờ cam kết nghiên cứu (phụ lục 3).
Khám lâm sàng, đo nhiệt độ.
Điều trị liều đầu (0 giờ) theo phác đồ của Bộ Y tế 2016
Điền thông tin vào mẫu báo cáo Hoàn chỉnh chi tiết tiền sử bệnh án, thông tin nhân khẩu học và địa chỉ liên hệ vào thời điểm bắt đầu.
Bệnh nhân được uống thuốc dưới sự giám sát của cán bộ y tế Nếu bệnh nhân nôn trong vòng 30 phút sau khi uống phải cho bệnh nhân uống lại. Nếu bệnh nhân nôn >2 lần /ngày, phải loại bệnh nhân khỏi nghiên cứu.
Các bệnh nhân được giữ lại trạm y tế xã tối thiểu trong 3 ngày đầu để theo dõi uống thuốc, các diễn biến lâm sàng và mật độ KST trong máu.
Theo dõi các chỉ số sinh tồn và biểu hiện lâm sàng vào các ngày D0, D1, D2, D3, D7, D14, D21, D28, D35, D42 hoặc bất cứ ngày nào khi bệnh nhân sốt.
Ghi lại các thông tin vào sổ và phiếu theo dõi (bao gồm địa chỉ cụ thể, số điện thoại )
- Nghiên cứu cận lâm sàng
Thử test nước tiểu phát hiện có thai (que thử)
Trích máu đầu ngón tay làm 3 lam máu (2 lam giọt dầy và 1 lam giọt mỏng) để xác định mật độ KST trước khi uống thuốc : 1 lam đếm mật độ KST, 1 lam gửi kiểm tra, lam giọt mỏng để xác định chủng loại KST)
Lấy 2 giọt (1 x 50l) máu vào giấy thấm Whatman 3MM để phân tíchPCR Ghi số hiệu bệnh nhân, ngày lấy Để khô tự nhiên, sau đó cho vào túi dán mép kín (mỗi bệnh nhân 1 túi) [5].
Thuốc Arterakin: Viên nén chứa 40 mg dihydroartemisinin (DHA) và 320 mg piperaquin phospate (PPQ) do Công ty Cổ phần Dược phẩm Trung ương I
(Pharbaco) sản xuất cung ứng Các bệnh nhân dùng cùng lô thuốc và thuốc được kiểm tra chất lượng tại Viện Kiểm nghiệm Trung ương trước khi thử nghiệm; Liều lượng và thời gian dùng thuốc: Theo quyết định của Bộ Y tế ban hành 2016 Tất cả các bệnh nhân được uống dưới sự giám sát của cán bộ có chuyên môn. Trong trường hợp bệnh nhân điều trị thất bại thì điều trị thay thế bằng phác đồ: Quinin sulfate 30 mg/kg phối hợp doxycyclin 3 mg/kg/ ngày (7 ngày) hoặc Quinin sulfate 30 mg/kg phối hợp clindamycin 15mg/kg/ngày (7 ngày)
2.2.2.5 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
- Kỹ thuật lấy lam máu, lam máu giọt dày và giọt mỏng, nhuộm giêm sa 5% (pH =7,2) trong vòng 40 phút Xác định loài Plasmodium spp.[6].
-Kỹ thuật đếm mật độ KSTSR:
Mật độ KST được xác định bằng số lượng KST đếm được trên 200 bạch cầu đếm trờn mỏy đếm tay Mật độ KST là số lượng KST thể vụ tớnh/àl mỏu, được tính dựa trên sự phân chia số lượng KST thể vô tính trên số lượng bạch cầu đếm được và được hiệu chỉnh dựa trên số lượng bạch cầu ước tớnh (8000 bạch cầu/àl mỏu).
Số lượng KSTSR đếm được x 8000 KSTSR/mm 3 =
Số lượng bạch cầu đếm được
Khi số lượng KST thể vô tính đếm được nhỏ hơn 10 trên 200 bạch cầu trên lam máu theo dõi, số lượng KST phải được tiếp tục đếm cho đến khi số lượng bạch cầu đạt được ít nhất là 500 bạch cầu (vi trường đầy đủ mà tại đó 500 bạch cầu được đếm) Lam máu được coi là âm tính khi số lượng bạch cầu đếm được là 1000 mà không có sự hiện diện của KST thể vô tính.
Tất cả các lam máu phải được đọc bởi 2 kỹ thuật viên có kinh nghiệm theo phương pháp mù đôi để xác định thời gian sạch KST Trong trường hợp kết quả soi lam là không phù hợp nhau (khác nhau về kết quả chủng KST, MĐKST sai khác hơn 25%), lam máu phải được đọc lại bởi kỹ thuật viên thứ 3 Kết quả cuối cùng của mật độ KST được tính bằng trung bình cộng của hai kết quả gần nhau nhất.
Hình 2.2 Lấy lam máu gọt mỏng và giọt dày làm thử nghiệm in vivo
- Quy trình kỹ thuật và theo dõi bệnh nhân
Sau khi đủ tiêu chuẩn đưa vào nghiên cứu, bệnh nhân được điều trị bằng thuốc DHA-PPQ (Arterakin) qua đường uống liều lượng thuốc theo phác đồ của Bộ Y tế (2016) Đối với trẻ em, viên thuốc được nghiền nát và cho uống bằng thìa Việc uống thuốc được giám sát và bệnh nhân được giữ lại ở nơi nghiên cứu trong 60 phút sau khi uống thuốc để theo dõi dung nạp thuốc Trong trường hợp bệnh nhân nôn trong vòng 30 phút, cho bệnh nhân uống lại đủ liều, nếu nôn xảy ra trong vòng 30-60 phút: uống lại nửa liều;
Đánh giá nhạy cảm của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum
2.3.1 Đối tượng, thời gian địa điểm nghiên cứu
- Các bệnh nhân được chẩn đoán là sốt rét do P falciparum chưa biến chứng có đủ các tiêu chuẩn tuyển chọn dưới đây được đưa vào đối tượng nghiên cứu in vitro [102].
Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân để lấy mẫu máu thử nghiệm in vitro
Nhiễm KST sốt rét P falciparum đơn thuần;
Mật độ KST tể vô tính từ 2000 đến 80.000 KST/L máu;
Chưa dùng thuốc sốt rét trong vòng 2 tuần.
Đồng ý tham gia nghiên cứu qua phiếu chấp thuận.
Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân để lấy mẫu máu test in vitro
P falciparum phối hợp nhiều loại KSTSR cùng lúc;
Mật độ KSTSR thể vô tính > 2.000 hoặc < 80.000 KST/L máu;
Bệnh nhân đã sử dụng thuốc sốt rét;
Các thuốc sử dụng cho nghiên cứu được cung cấp bởi WHO.
Do kinh phí có giới hạn và nghiên cứu in vitro đòi hỏi phải được trang bị nhiều trang thiết bị y tế, cơ sỏ vật chất nên trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ tiến hành được tại 1 điểm nghiên cứu là huyện KrongPa, tỉnh Gia Lai.
Nghiên cứu thực hiện từ năm 2016 đến 2018
Nghiên cứu phân tích in vitro đánh giá hiệu lực thuốc tại labo thực địa.
2.3.2.2 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu
- Cỡ mẫu tính cho nghiên cứu in vitro là các mẫu đủ tiêu chuẩn chọn để thực hiện thử thuốc trên in vitro tại thực địa từ các bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu in vivo tại các xã có số BNSR của huyện Krông Pa, tỉnh Gia Lai Cỡ mẫu tối thiểu là 30.
- Sàng lọc đối tượng đủ điều kiện để đưa vào nghiên cứu (phụ lục 2).
Điều tra, thu thập bệnh nhân từ các cơ sở y tế
Bệnh nhân có đủ tiêu chuẩn đưa vào nghiên cứu.
Bệnh nhân tự nguyện tham gia nghiên cứu và tuân thủ theo quy trình nghiên cứu.
- Nghiên cứu cận lâm sàng
Lấy 2ml máu tĩnh mạch cho vào trong ống nghiệm có chứa EDTA/ACD.
Nuôi cấy KSTSR P falciparum theo quy trình thử thuốc 48h tại thực địa
2.3.2.4 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
Xác định độ nhạy cảm của KST SR với thuốc sốt rét (in vitro) [57],[92],[98]
- Lấy 2ml máu tĩnh mạch cho vào trong ống nghiệm có chứa EDTA/ACD.Mẫu máu được ly tâm, tách phần huyết tương thu lấy cặn hồng cầu Cặn hồng cầu được rửa 2 lần trong môi trường nuôi cấy RPMI và rửa lại trong môi trường nuôi cấy đầy đủ (RPMI 1640 LPLF) để có được hồng cầu với hematocrite là 50% (BMM).
- Đánh giá độ nhạy cảm của KST với thuốc sốt rét trong phòng thí nghiệm Quy trình được thực hiện theo hướng dẫn của WHO “Xác định sự nhạy cảm của KST sốt rét với các thuốc sốt rét trong phòng thí nghiệm tại thực địa” nhằm đánh giá sự đáp ứng của P falciparum với artemisinins”[57],[92][102]. Tóm tắt quy trình như sau:
Phiến nhựa được nhỏ thuốc tại NIMPE theo quy trình pha thuốc và nhỏ thuốc phiến nhựa của WHO [4],[102].
Nồng độ thuốc nhỏ phiến nhựa là Artesunat (từ: 0.25 – 16 nmol/ml), dihydroartemisinin (từ 0.25 – 16 nmol/ml), piperaquin (từ 12.5 – 800nmol/ml ), chloroquin (từ 25 -1600 nmol/ml), phiến nhựa được vận chuyển và bảo quản ở 4°C tại điểm nghiên cứu Phiến nhựa có DHA sẽ được chuẩn bị 2 tuần 1 lần.
Chất lượng của phiến nhựa có thuốc được đảm bảo bằng độ nhạy cảm của chủng KST nhạy và kháng với Chloroquine được nuôi cấy liên tục trong phòng thí nghiệm của NIMPE.
Các thuốc sử dụng cho nghiên cứu được cung cấp bởi WHO.
Hồng cầu của bệnh nhân (BMM) được pha loãng giảm xuống hematocrite 2% sau đó được chuyển nhanh vào các phiến nhựa có chứa thuốc, ủ trong tủ ấm từ 24 đến 48 giờ Mỗi một bệnh nhân sử dụng 1 cột của phiến nhựa 96 giếng được chia thành 8 giếng nhỏ (A- H) với nồng độ thuốc tăng dần, giếng A là giếng chứng (không có thuốc).
Dùng pipet eppendorf, nhỏ 50 l hỗn dịch máu môi trường vào mỗi giếng thử, bắt đầu từ giếng A và đi theo trình tự, cuối cùng là giếng H (có thể dùng một đầu típ) Luôn lắc tube để đảm bảo dịch treo như nhau;
Đậy nắp phiến nhựa, ghi số hiệu bệnh nhân, thời gian bắt đầu nuôi trên nắp theo đúng cột tương ứng, lắc nhẹ phiến nhựa;
Lưu ý : Nuôi thêm 3 giếng trên một phiến nhựa vô trùng, không có thuốc để thăm dò sự phát triển của KSTSR trước khi thu hoạch.
Lấy bình nến ra ngoài tủ ấm, đặt phiến nhựa vào bình nến, đặt một đĩa nhựa có miếng bông thấm nước cất vào bình (làm giảm sự bay hơi của môi trường), đốt nến, đậy nắp bình nến, khi nến gần tắt, đóng khoá;
Đặt bình nến vào tủ ấm, ủ ấm ở 37°C (± 0.5°C);
Thời gian thu hoạch: Dựa vào quan sát hình thể KSTSR lúc đưa vào nuôi cấy, KST thể tư dưỡng trẻ: ủ ấm từ 33-35 giờ, KST thể tư dưỡng ở tuổi trung bình thì ủ ấm từ 28-32 giờ, KST thể tư dưỡng già thì ủ ấm 23-25 giờ;
Thăm dò trước khi thu hoạch (nuôi thêm 3 giếng trên một phiến nhựa vô trùng không có thuốc).
- Thu hoạch, nhuộm lam và xét nghiệm lam sau nuôi cấy [92],[98]
Dùng pipet eppendorf hút bỏ dịch nổi, hồng cầu (HC) còn lại được làm thành những giọt máu dày, 2 dãy theo mô hình dưới đây:
Để các phiến nhựa nghiêng 45 0 trên 5 phút, nhẹ nhàng hút bỏ dịch nổi Lấy lam máu giọt dày cho mỗi nồng độ thuốc Mỗi lam kính có 8 giọt máu dày tương ứng với các nồng độ thuốc khác nhau theo một qui định Ghi nhãn với mã bệnh nhân, tên thuốc, thời gian thu hoạch.
Nhuộm lam: Lam máu phải được làm khô cẩn thận, để ở nhiệt độ phòng trong 10 giờ hoặc trong tủ ấm 37,50C qua đêm;
Nhuộm lam máu giọt dày được kéo từ mỗi giếng thử nghiệm và nhuộm Giemsa 5% trong 30 phút;
Xét nghiệm viên nên thăm dò nồng độ giêm sa và thời gian nhuộm thích hợp để đánh giá các thể và số lượng cho chính xác;
Đếm KSTSR: Một mẫu thử được đánh giá là thành công khi số lượng thể phân liệt ở giếng chứng phải bằng hoặc lớn hơn 10% trong tổng số 200 KST thể vô tính.
Đếm số lượng phân liệt có từ 3 nhân trở lên trong tổng số 200 KST thể vô tính (bao gồm cả thể phân liệt và thể tư dưỡng).
Hình 2.3 Thu hoạch mẫu máu sau thời gian nuôi cấy thành công in vitro
Chú ý: nếu thu hoạch từ giếng A-H thì đầu tip phải được đổi sau mỗi giếng, có thể dùng chỉ 1 đầu tip để thu hoạch mẫu máu từ giếng H-A (từ nồng độ thuốc cao nhất đến thấp nhất);
2.3.2.5 Các biến số chỉ số trong nghiên cứu
- Tỷ lệ phần trăm thể phân liệt bị ức chế ở mỗi thuốc và mỗi nồng độ thuốc so với tỷ lệ phần trăm thể phân liệt tại giếng chứng.
- Xác định nồng độ thuốc ức chế 50% (Inhibitor Concentration hay IC50), sự phát triển của KSTSR với các thuốc sốt rét dihydroartemisinin, piperaquin phosphat, artesunat, chloroquin phosphat.
- Đánh giá sự đáp ứng của P falciparum với thuốc sốt rét:
2.3.2.6 Nhập và phân tích xử lý số liệu
- Xác định nồng độ ức chế 50%(IC50), sự phát triển của KST sẽ được tính toán bằng cách sử dụng phần mềm phân tích và phương pháp báo cáo (IVART) được phát triển trực tuyến bởi WWARN.
2.3.2.7 Phương pháp khống chế nhiễu và hạn chế sai số
- Trước khi tiến hành nghiên cứu, nghiên cứu viên chính phải nhắc lại và tập huấn lại trình tự các khâu tiến hành nghiên cứu;
- Chọn đối tượng nghiên cứu chặt chẽ theo tiêu chí nghiên cứu;
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Đánh giá đáp ứng của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với
Trong tổng số 292 bệnh nhân KSTSR P falciparum thu thâp được từ 5 tỉnh nghiên cứu được đưa vào phân tích gen K13, có 201 bệnh nhân đủ tiêu chuẩn được lựa chọn đưa vào nghiên cứu đánh giá đáp ứng của KST P falciparum với thuốc DHA-PPQ với số lượng từng tỉnh như sau: Tỉnh Bình Phước 39 bệnh nhân, tỉnh Gia Lai 48 bệnh nhân, tỉnh Ninh Thuận 40 bệnh nhân, tỉnh Khánh Hòa
43 bệnh nhân và Quảng Trị 31 bệnh nhân kết quả như sau:
3.2.1 Đặc điểm chung về dân số của nhóm nghiên cứu
Bảng 3.21 Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu Đặc điểm
- Phân tích các đặc điểm dân số học của các nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu TES đánh giá hiệu lực thuốc DHA-PPQ trong điều trị bệnh nhân sốt rét nhiễm P falciparum chưa biến chứng cho thấy nam chiếm cao hơn nữ trong cơ cấu tại tất cả điểm thực hiện TES, lần lượt nam chiếm 66,7%; 95,8%; 67,4%; 95% và 58,1% tại Bình Phước, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận và Quảng Trị.
- Phần lớn bệnh nhân đều là người lớn trưởng thành (≥ 15 tuổi) tại Bình Phước, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Khánh Hòa và Quảng Trị lần lượt là 87,2%; 97,9; 58,1%, 75,0% và 74,2%.
- Tại thời điểm vào nghiên cứu và chưa dùng thuốc sốt rét, thân nhiệt trung bình của nhóm bệnh nhân tại các tỉnh nghiên cứu Bình Phước, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Khánh Hòa và Quảng Trị tham gia lần lượt là (38,7 ± 0,6) 0 C; (38,7 ± 0,9) 0 C; (38,8 ± 0,9) 0 C; (38,9 ± 0,4) 0 C và (38,8 ± 0,8) 0 C và cân nặng trung bình lần lượt là (51 ± 10,7) kg; (53,4 ± 8,2) kg; (37,6 ± 13,4) kg; (42,8 ± 13,8) kg và (40,4 ± 12,7) kg.
- Mật độ KSTSR thể vô tính P falciparum trung bình tại các tỉnh dao động từ
8030 đến 26530/L trong máu ngoại vi, không có trường hợp nào dưới 1000 hay trên 100.000/L, phù hợp tiêu chuẩn chọn bệnh.
3.2.2 Tỷ lệ, đặc điểm đột biến gen K13 của nhóm nghiên cứu in vivo
Bảng 3.22 Tỷ lệ đột biến gen K13 của các mẫu đưa vào nghiên cứu in vivo
Mẫu có đột biến gen K13 p
Tổng số 201 mẫu phân lập P falciparum thu thập, số mẫu có đột biến gen K13 chung là 94/201 (46,77%) Trong đó, tỷ lệ có đột biến gen K13 tại các tỉnh Bình Phước là cao nhất chiếm 97, 44% và thấp nhất tại Ninh Thuận chiếm 5%.
Tỷ lệ đột biến gen K13 giữa các tỉnh khác nhau có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Bảng 3.23 Đặc điểm đột biến gen K13 của bệnh nhân nghiên cứu in vivo
Xác định kháng Đột biến
Xác định kháng Đột biến
Liên quan/ ứng viên Đột biến
Chưa xác định vai trò Đột biến
Chưa xác định vai trò Đột biến
Chưa xác định vai trò Đột biến
Chưa xác định vai trò Đột biến
Chưa xác định vai trò
- Qua phân tích mẫu giấy thấm của máu bệnh nhân P falciparum trong nghiên cứu in vivo phát hiện được 7 kiểu đột biến gen (C580Y, P553L, C469F,H384Q, K503N, G638E, G639D) không phát hiện được kiểu Y511H Trong đó đột biến gen K13 liên quan đến kháng ART C580Y trên quần thể P falciparum là phổ biến nhất với tỷ lệ lần lượt 97,44%; 43,75%; 32,26%%; 5,00%; 4,65 tại Bình Phước, Gia Lai, Quảng Trị, Ninh Thuận, Khánh Hòa Đột biến P553L cũng là chỉ điểm xác định kháng ART chỉ phát hiện được ở Khánh Hòa, Gia Lai mà chưa phát hiện được ở các tỉnh khác với tỷ lệ lần lượt là 21,15% và 5,56%.
- Kiểu đột biến C469F có thể liên quan đến kháng ART, phát hiện ở Gia Lai với tỷ lệ thấp 4,17%.
Ngoài ra, còn có 4 loại đột biến K13 khác:Khánh Hòa 3 đột biến gồm có H384Q (2,32%), G638E (2,32%), G639D (2,32%) và Gia Lai 1 đột biến, K503N (4,17%), hiện chưa xác định vai trò liệu có khẳng định kháng hay liên quan hay vô nghĩa.
3.2.3 Thời gian làm sạch ký sinh trùng và cắt sốt sau điều trị DHA-PPQ
Bảng 3.24 Hiệu lực làm sạch ký sinh trùng P falciparum và cắt sốt
Nội dung phân tích Bình
Thời gian sạch KST (giờ) 52,1 ± 20,1
Thời gian cắt sốt (giờ) 30,2 ± 12,7
Sau điều trị thuốc DHA-PPQ cho thấy thời gian sạch KST trung bình của các tỉnh lần lượt là: Bình Phước 52,1 ± 20,1 giờ; Gia Lai 45,5 ± 22,2 giờ; Khánh Hòa 38,1 ± 16,6 giờ; Ninh Thuận 31,2 ± 11,1 giờ; Quảng Trị 24,6 ± 1,5 giờ.thời gian sạch KSTtrung bình giữa các tỉnh khác nhau có ý nghĩa thống kê (p 10% lần lượt là 41,0% (16/39), 14,6% (7/48), 18,6% (8/43).Ninh Thuận và Quảng Trị không có trường hợp nào còn KST ngày D3.
Bảng 3.26 So sánh ký sinh trùng ngày D3 với đột biến gen K13 tại các điểm nghiên cứu.
Tỉnh Đột biến gen K13 Tổng cộng
Có KST D3(%) Không Có KST
Trong số 201 bệnh nhân theo dõi đến ngày D3 của 5 tỉnh Bình Phước, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Quảng Trị có tất cả 31 bệnh nhân có KST ngày D3 đều có điểm đột biến gen K13 xác định kháng ART (24.C580Y, 7.P553L) lần lượt tại các tỉnh là Bình Phước 41%, Khánh Hòa 18,6% và Gia Lai14,6 % và 63/94 bệnh nhân có đột biến gen K13 nhưng không có KST ngày D3 Như vậy các tỉnh Bình Phước, Gia Lai, Khánh Hòa có tỷ lệ KST ngày D3 lớn hơn 10% kết hợp với đột biến K13 ở những vị trí xác định kháng ART > 5% được xác định là vùng kháng ART.
Bảng 3.27 Đặc điểm kiểu gen của những bệnh nhân có ký sinh trùng ngày D3
Tổng Phân loại Đột biến P553L 0
(87,5%) 8 Xác định kháng Đột biến C580Y 16
12,5% 23 Xác định kháng Đột biến C496F 0
(0 %) 0 Liên quan/ ứng viên Đột biến Khác 0
(0%) 0 Chưa xác định vai trò
Trong số 31 bệnh nhân có KST ngày D3 và có điểm đột biến gen K13 có 23 mẫu có đột biến C580Y (Bình Phước 16 mẫu, Gia Lai 6 mẫu và Khánh Hòa1mẫu), 8 mẫu có đột biến P553L (Khánh Hòa 7 mẫu và Gia Lai1 mẫu) Tất cả các đột biến này đều được phân loại là xác định kháng artemisinin.
3.2.4 Hiệu lực phác đồ thuốc DHA-PPQ đối với sốt rét P falciparum
Bảng 3.28 Hiệu lực phác đồ thuốc DHA-PPQ đối với sốt rét do P falciparum tại các tỉnh nghiên cứu
SL(%) SL(%) SL(%) SL(%) SL(%)
Thất bại điều trị sớm (ETF) 0
Thất bại LS muộn (LCF) 2
Thất bại KST muộn (LPF) 4
0 (0%) Đáp ứng LS và KST (ACPR) 27
Mất theo dõi/rút nghiên cứu 6
Trong số 201 ca bệnh tham gia nghiên cứu TES, có đến 25/201 (12,4%) ca mất theo dõi hoặc rút khỏi nghiên cứu chỉ còn 176 bệnh nhân được theo dõi đánh giá đầy đủ Kết quả chỉ ra đáp ứng lâm sàng và KSTSR đầy đủ (ACPR) tại hai tỉnh Ninh Thuận và Quảng Trị đều 100%, tại tỉnh Khánh Hòa và Gia Lai hiệu lực vẫn còn trên 95% lần lượt 96,4% và 97,4%, trong khi đó tại Bình Phước tỷ lệ ACPR này chỉ còn 81,8% (< 90%) và tỷ lệ thất bại trên 10%, kèm theo thất bại lâm sàng muộn (LCF) là 2 ca (6,1%), thất bại KST muộn (LPF) là 4 ca (12,2%). Đặc biệt, tại cả 5 tỉnh chưa có trường hợp nào thất bại điều trị sớm (ETF), riêng ở Khánh Hòa và Gia Lai có 1 trường hợp thất bại muộn.
Hình 3.9 Đường phân tích Kaplan Meier đánh giá tại Bình Phước
Phân tích đường cong Kaplan Meier tại Bình Phước cho phép ta ước tính được số bệnh nhân tham gia trong suốt quá trình điều trị và ca thất bại trong quá trình theo dõi tại những ngày D14, D21, D28 đường cong đi xuống tương ứng với những ngày xuất hiện bệnh nhân thất bại điều trị.
Hình 3.10 Đường phân tích Kaplan Meier đánh giá tại Gia Lai
Tất cả 8 bệnh nhân thất bại điều trị đều được lấy mẫu máu giấy thấm để phân tích tái phát, tái nhiễm kết quả cả 8 mầu này đều là tái phát không có mẫu nào nhiễm mới.
Hình 3.11 Hình ảnh điện di phân tích tái phát, tái nhiễm Đây là hình ảnh tái phát vì chiều dài của các marker ngày xuất hiện lại KST trùng khớp với ngày D0.
Bảng 3.29.So sánh thất bại điều trị và đáp ứng lâm sàng đầy đủ với các điểm đột biến gen K13 có liên quan đến kháng artemisinin.
Thất bại điều trị Đáp ứng lâm sàng đầy đủ Tổng
Đánh giá nhạy cảm của P falciparum với thuốc sốt rét trên in vitro
Trong số 201 bệnh nhân đưa vào theo dõi có 176 bệnh nhân theo dõi đủ 42 ngày Trong 5 tỉnh, có 3 tỉnh xuất hiện bệnh nhân thất bại điều trị muộn là Bình Phước 6 bệnh nhân, Gia Lai 1 bệnh nhân, Khánh Hòa 1 bệnh nhân, tất cả những bệnh nhân này đều có điểm đột biến gen K13 xác định hoặc liện quan đến kháng ART Đáp ứng lâm sàng đầy đủ là 168 bệnh nhân trong đó có 75 bệnh nhân có điểm đột biến gen K13 xác định hoặc liện quan đến kháng ART và 93 bệnh nhân không có đột biến gen K13.
3.3 Đánh giá nhạy cảm của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với thuốc sốt rét bằng kỹ thuật invitro tại Gia Lai
- Nghiên cứu thử nghiệm thuốc SR với các phân lập thu thập tại thực địa trên in vitro nhằm phát hiện sớm các dấu hiệu của sốt rét P falciparum kháng thuốc và đánh giá độ nhạy cảm những thuốc mới có khả năng thay thế những thuốc đã bị kháng Trong 292 ca đưa vào phân tích đột biến gen K13 thu thập được 54 phân lập P falciparum tại Gia Lai để đánh giá nhạy cảm của KSTSR với với một số thuốc sốt rét Trong đó 54 mẫu tiến hành nuôi cấy, tỷ lệ KST phát triển thành thể phân liệt ở giếng chứng trên 10% là 42/54 mẫu (77,7%).
3.3.1 Đặc điểm đột biến gen K13 của ký sinh trùng P falciparum trên các mẫu đưa vào thử thuốc sốt rét
Bảng 3.30 Đặc điểm đột biến gen K13 trên các mẫu đưa vào thử thuốc
TT Kiểu gen Số lượng nT
1 Đột biến P553L 3 5,56 Xác định kháng
2 Đột biến C580Y 26 48,15 Xác định kháng
3 Đột biến C496F 3 5,56 Liên quan/ứng viên
4 Đột biến H384Q 0 0 Chưa xác định vai trò
5 Đột biến Y511H 5 9,26 Chưa xác định vai trò
6 Đột biến K503N 0 0 Chưa xác định vai trò
7 Đột biến G638E 0 0 Chưa xác định vai trò
8 Đột biến G639D 0 0 Chưa xác định vai trò
9 Kiểu hoang dại 17 31,48 Nhạy với ART
- Qua phân tích có 37/54 (68,52%) mẫu phát hiện có đột biến gen K13: Kiểu đột biến C580Y chiếm 48,15% (26/54), P553L là 5,56% (3/54) là hai đột biến xác định kháng artemisinin và Liên quan,ứng viên C496F là 5,56% (3/54)
Ngoài ra còn phát hiện vị trí đột biến Y511H là 9,26% (5/54) hiện chưa xác định vai trò.
Bảng 3.31 Đặc điểm đột biến gen K13 trên các mẫu nuôi cấy thành công
TT Kiểu gen Số lượng nB
1 Đột biến P553L 2 4,76 Xác định kháng
2 Đột biến C580Y 20 47,62 Xác định kháng
3 Đột biến C496F 3 7,14 Liên quan/ứng viên
4 Đột biến H384Q 0 0 Chưa xác định vai trò
5 Đột biến Y511H 4 9,52 Chưa xác định vai trò
6 Đột biến K503N 0 0 Chưa xác định vai trò
7 Đột biến G638E 0 0 Chưa xác định vai trò
8 Đột biến G639D 0 0 Chưa xác định vai trò
9 Kiểu hoang dại 13 30,95 Nhạy với ART
- Qua phân tích có 29/42 mẫu phát hiện nhiều đột biến: Kiểu đột biến C580Y chiếm 47,62% (20/42), P553L là 4,76% (2/42) là hai đột biến xác định kháng artemisinin và đột biến ứng viên C496F 7,14% (3/42) Đột biến gen K13 vị tríY511H là 9,52% (4/42) hiện chưa xác định vai trò liệu có khẳng định kháng hay liên quan hay vô nghĩa.
3.3.2 Đánh giá nhậy cảm của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với một số thuốc sốt rét
3.3.2.1 Đánh giá tính nhạy cảm của P falciparum với artesunat
Hình 3.12 Tỷ lệ ức chế sự phát triển P falciparum của thuốc artesunat
- Kết quả nghiên cứu cho thấy IC50 trung bình của AS đối với 42 mẫu phân lập P falciparum là IC50 là 3,06 ± 3,10 nmol/L Trong đó, giá trị IC50 thấp nhất là 0,41 nmol/L và cao nhất 14,55 nmol/L.
3.3.2.2 Đánh giá tính nhạy cảm của P falciparum với dihydroartemisinin
- Tương tự như thuốc artesunat (AS), hiện nay dẫn suất diydroartemisinin (DHA) là một trong những dẫn suất và là thành phần thuốc sốt rét quan trọng trong các viên thuốc phối hợp có thành phần (ACTs).
- Dữ liệu cho thấy tỷ lệ ức chế sự tạo thành thể phân liệt của DHA ở nồng độ
2 nmol/L là 38,6%, tương ứng ở nồng độ 4 nmol/L là 67,8%, ở nồng độ 8 nmol/
L là 87,2%, ở nồng độ 16 nmol/L đã có tác dụng ức chế trên 94% sự phát triển thành thể phân liệt của P falciparum nhưng nồng độ thuốc cao gấp 2 lần (32 nmol/L) cũng chưa đủ để toàn bộ KST phát triển thành thể phân liệt.
Hình 3.13 Tỷ ức chế sự phát triển P falciparum của thuốc Dihydroartemisinin
- Kết quả nghiên cứu cho thấy IC50 trung bình của DHA đối với 42 phân lập
P falciparum là IC50 là 2,95 ± 2,19 nmol/L Giá trị IC50 thấp nhất là 0,52 nmol/L và cao nhất là 9,94 nmol/L.
3.3.2.3 Đánh giá tính nhạy cảm của P falciparum với chloroquin
Hình 3.14 Tỷ ức chế sự phát triển P falciparum của thuốc Chloroquin
- Kết quả cho thấy ở nồng độ thuốc CQ là 100 nmol/L (nồng độ xác định kháng CQ) ức chế được 76,5% số KST P falciparum phát triển thành thể phân liệt, ở nồng độ thuốc CQ là 200 nmol/L ức chế được trên 95% KST, ở nồng độ thuốc cao nhất được thử nghiệm là 800 nmol/L ức chế được 100% KST phát triển thành thể phân liệt Giá trị IC50 trung bình thu được 67,7± 53,1 nmol/L.
- Giá trị IC50 thấp nhất là 12,3 nmol/L và cao nhất là 338,3 nmol/L Trong đó, có 21,4% (9/42) số mẫu ở bệnh nhân có IC50 >100 nmol/L (xác định kháng CQ).
3.3.2.4 Đánh giá tính nhạy cảm của P falciparum với piperaquin
Hình 3.15 Tỷ ức chế sự phát triển P falciparum của thuốc piperaquin
- Kết quả nghiên cứu trình bày ở hình trên cho thấy tỷ lệ ức chế sự tạo thành thể phân liệt của PPQ ở nồng độ 50 nmol/L là 43,7%, tương ứng ở nồng độ 100 nmol/L là 94,5%, ở nồng độ 200 nmol/L đã có tác dụng ức chế trên 95% sự phát triển thành thể phân liệt của KST P falciparum nhưng nồng độ thuốc cao gấp 2 lần (32 nmol/L) cũng chưa đủ để toàn bộ KST phát triển thành thể phân liệt.
- Giá trị IC50 trung bình thu được 43,5 ± 24,9 nmol/L, giá trị IC50 thấp nhất là 4,66 nmol/L và cao nhất là 105,8 nmol/L.
3.3.3 Mối liên quan giữa đột biến gen K13 của ký sinh trùng P falciparum với một số thuốc sốt rét trên in vitro tại Gia Lai
3.3.3.1 Mối liên quan giữa đột biến gen K13 và IC 50 của thuốc artesunat trên các mẫu nuôi cấy
Bảng 3.32 So sánh đột biến gen K13 và IC50 của thuốc artesunat trên các mẫu nuôi cấy
Kiểu gen Mẫu nuôi cấy
Có đột biến K13 liên quan đến kháng ART 25/42 3,50
Kiểu hoang dại hoặc đột biến
K13 không liên quan đến kháng ART
Qua phân tích 42 mẫu nuôi cấy thành công ta thấy có 25/42 mẫu có đột biến K13 liên quan đến kháng ART và dẫn chất, các mẫu này có chỉ số IC50 của thuốc artesunat trung bình là 3,50 nmol/L và có 17/42 mẫu Không có đột biến K13 hoặc đột biến K13 không liên quan đến kháng ART các mẫu này có chỉ số
IC50 trung bình là 2,18 nmol/L thấp hơn so với các mẫu có đột biến là 3,50 Sự khác biệt của 2 nhóm này có ý nghĩa thống kê với (p < 0,05)
3.3.3.2 Mối liên quan giữa đột biến gen K13 và IC 50 của thuốc chloroquine trên các mẫu nuôi cấy
Bảng 3.33 So sánh đột biến gen K13 và IC50 của thuốc chloroquin trên các mẫu nuôi cấy
Kiểu gen Mẫu nuôi cấy
Có đột biến K13 liên quan đến kháng ART 25/42 75,23
Kiểu hoang dại hoặc đột biến K13 không liên quan đến kháng ART 17/42 52,99
Qua phân tích 42 mẫu nuôi cấy thành công ta thấy có 25/42 mẫu có đột biến K13 liên quan đến kháng ART và dẫn chất, trong đó có 6/25 mẫu có chỉ số các mẫu này có chỉ số IC50 trung bình của thuốc chloroquine là 75,23 nmol/L trong đó có 6/25 mẫu có chỉ số IC50 >100nmol/L Có 17/42 mẫu Không có đột biến K13 hoặc đột biến K13 không liên quan đến kháng ART các mẫu này có chỉ số IC50 trung bình là 52,99 nmol/L thấp hơn so với các mẫu có đột biến trong 17 mẫu này có 3/17 mẫu có chỉ số IC50 >100nmol/L (IC50 trên 100nmol/L là nồng độ kháng CQ).
3.3.3.3 Mối liên quan giữa đột biến gen K13 và IC 50 của thuốc dihydro artemisinin trên các mẫu nuôi cấy
Bảng 3.34 So sánh đột biến gen K13 và IC50 của thuốc dihydro artemisinin trên các mẫu nuôi cấy
Kiểu gen Mẫu nuôi cấy
Có đột biến K13 liên quan đến kháng ART 25/42 3,53
0,0062 Kiểu hoang dại hoặc đột biến K13 không liên quan đến kháng ART 17/42 2,37
Qua phân tích 42 mẫu nuôi cấy thành công ta thấy có 25/42 mẫu có đột biến K13 liên quan đến kháng ART và dẫn chất, các mẫu này có chỉ số IC50 trung bình của thuốc dihydro artemisinin là 3,53 nmol/L và có 17/42 mẫuKhông có đột biến K13 hoặc đột biến K13 không liên quan đến kháng ART các mẫu này có chỉ số IC50 trung bình là 2,37 nmol/L thấp hơn so với các mẫu có đột biến Sự khác biệt của 2 nhóm này có ý nghĩa thống kê với (p < 0,05).
3.3.3.4 Mối liên quan giữa đột biến gen K13 và IC 50 của thuốc piperaquine trên các mẫu nuôi cấy
Bảng 3.35 So sánh đột biến gen K13 và IC50 của thuốc piperaquin trên các mẫu nuôi cấy
Kiểu gen Mẫu nuôi cấy
Có đột biến K13 liên quan đến kháng ART 25/42 41,81
Kiểu hoang dại hoặc đột biến K13 không liên quan đến kháng ART 17/42 44,30
Qua phân tích 42 mẫu nuôi cấy thành công ta thấy có 25/42 mẫu có đột biến K13 liên quan đến kháng ART và dẫn chất, các mẫu này có chỉ số IC50 trung bình của thuốc piperaquine là 41,81 nmol/L và có 17/42 mẫu Không có đột biến K13 hoặc đột biến K13 không liên quan đến kháng ART các mẫu này có chỉ số IC50 trung bình là 44,30 nmol/L cao hơn so với các mẫu có đột biến.
BÀN LUẬN
Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học phân tử đột biến gen K 13 của
Plasmodium falciparum tại 5 tỉnh Bình Phước, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh
Thuận, Quảng Trị có sốt rét lưu hành nặng năm 2016 - 2018
Theo Tổ chức Y tế Thế giới đến năm 2019 trên thế giới vẫn còn khoảng một nửa dân số có nguy cơ mắc sốt rét với số trường hợp mắc sốt rét khoảng 229 triệu người So với năm 2010 thì số bệnh nhân sốt rét sau 10 năm giảm khoảng 8,8% (năm 2010 có 251 triệu bệnh nhân sốt rét) Bệnh nhân mắc sốt rét chủ yếu thuộc khu vực Châu Phi, năm 2019 số bệnh nhân sốt rét ở khu vực này chiếm tới 94% tổng số bệnh nhân sốt rét toàn Có 5 loài KSTSR thuộc giống Plasmodium gồm: P falciparum, P knowlesi, P vivax, P malariae, P ovale và P ovale Sự phát triển các công cụ phân tử mới cũng như áp dụng các kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (next generation sequencing-NGS) và tiếp cận sinh học hiện đại đã cải tiến về phân tích dữ liệu dịch tễ học, chẩn đoán, điều trị, giám sát và phát triển vaccine Từ khi lần đầu tiên bộ gen của P falciparum được giải trình tự vào năm 2002, việc điều tra khía cạnh di truyền và mức độ phân tử trong các quần thể P falciparum khác nhau cùng với các nghiên cứu về protein (tập trung vào việc xác định cấu trúc ba chiều của protein, sự tương tác và chức năng của nó) và nghiên cứu về bộ phiên mã - tập hợp đầy đủ các bản sao RNA được tạo ra bởi bộ gen (transcriptomics)cho thấy tầm quan trọng của các tiếp cận phân tử này trong lộ trình loại trừ sốt rét (José Antonio Garrido-Cardenas và cs., 2019) [63].
Nghiên cứu bộ gen đã phát hiện ra các đột biến điểm trên gen kelch13 liên quan đến quá trình làm chậm sạch KST thể vô tính sau điều trị thuốc ACTs trên các bệnh nhân Đột biến trên các domain β-propeller và BTB/POZ của protein giống kelch đã được mã hóa là PF3D7_1343700 trên nhiễm sắc thể số 13 (Cheeseman và cs., 2012; Ariey và cs., 2014) [40] Các thuốc này hiện nay được coi là các thuốc đầu tay để điều trị sốt rét kháng thuốc và giúp làm giảm tỷ lệ mắc và tử vong Tuy nhiên, kháng artemisinin ở P falciparum được cho là một vấn đề nghiêm trọng trong lộ trình LTSR Ít nhất 20 đột biến gen K13 được xác định có liên quan đến quá trình chậm làm sạch KSTSR sau điều trị và ảnh hưởng này có liên quan đến protein kelch13 (Miotto O và cs., 2015) [72].
Phần lớn các đa hình đơn nucleotid (SNPs), dù có tần số cao hay thấp đều có liên quan đến một hiện tượng tự về thời gian bán thải sạch KST Hầu hết các đột biến xuất hiện ở vùng từ acid amino 440 về phía trước trong đó kiểu C580Y phổ biến và phân bố rộng nhất, sự xuất hiện này không lệ thuộc vào các vùng địa lý khác nhau (Ajogbasile FV và cs., 2022) [42].
Mối liên quan giữa hiện tượng chậm sạch KST này với các đột biến gen K13 đã được chứng minh trên mô hình các thử nghiệm in vitro và /hoặc in vivo.
Do vậy, giám sát KSTSR là cần thiết để cảnh báo về hiệu lực artemisinin và dẫn suất bị suy giảm dưới 90% (WHO, 2016) vì những gì mà chúng ta đang chú ý về các đột biến này trước hết là vị trí địa lý và sau đó đã được xác định Trong khi các hình thức kháng artemisinin liên quan đến đột biến K13 đã xuất hiện tại Việt Nam, Thái Lan, Campuchia và Myanmar và hiếm khi thực hiện in vitro tại các ước Đông Nam Á như Lào, Bangladesh cũng như các nước châu Phi [95] Các chỉ điểm cơ bản gồm arps10 và mdr2 trên nhiễm sắc thể 14, fd trên nhiễm sắc thể số 13 và crt trên nhiễm sắc thể số 7 (Miotto O và cs., 2015), đồng thời người ta phỏng đoán mỗi chỉ điểm phân tử đóng một vai trò khác nhau dù ý nghĩa chưa được biết chính xác [72].
Hơn thập niên qua, hầu hết các nước có lưu hành sốt rét P falciparum đã thay đổi chính sách điều trị của quốc gia dùng ACTs dù nhiều nước vẫn chưa làm nghiên cứu đánh giá hiệu lực thuốc (TES) Sự phát triển kháng artemisinin là một thành phần thuốc quan trọng trong viên ACTs là một mối quan tâm y tế công cộng.
Kháng thuốc xảy ra như một hậu quả của nhiều yếu tố, kể cả khâu thực hành điều trị kém, sai, bệnh nhân tuân thủ dùng thuốc kém với toàn bộ liệu trình và dùng rộng rãi liệu pháp thuốc đơn trị liệu đường uống thời gian dài và đột biến gen trên quần thể KSTSR P falciparum tại Đông Nam Á [13], [21], [87]. Áp dụng giải trình tự toàn bộ bộ gen của dòng KST kháng artemisinin tại châu Phi [61] và các phân lập lâm sàng thu thập từ Campuchia [70], các đột biến PF3D7_1343700 trên domain vùng cánh quạt („K13-propeller‟) với kháng artemisinin trên in vitro và in vivo là có liên quan Tính đa hình vùng gen K13 góp phần như chỉ điểm phân tử hữu ích để giám sát diện rộng hơn, ngăn chặn kháng artemisinin tại khu vực GMS va ngăn chặn lan rộng ra toàn cầu [104].
Trình tự DNA của các phân lập được so sánh với trình tự gen tham khảo chủng 3D7 P falciparum mang gen kiểu hoang dại (wildtype-WT), đây là chủng chuẩn, nhạy cảm với thuốc artemisinin và dẫn suất sẵn có dữ liệu trên ngân hàng gen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) với mã số XM_001350122.1, sử dụng thuật toán ClustalW trên Bioedit V.7.0.5.3 phân tích Trên cơ sở gen K13 được nhân bản bằng kỹ thuật PCR lồng với các cặp mồi được thiết kế theo đề cương của tác giả Ariey và cộng sự (2014), phân tích giải trình tự theo phương pháp Sanger trên hệ thống máy giải trình tự ABI 3500 (Mỹ) [40].
Tổng số 292 mẫu phân lập P falciparum thu thập trên bệnh nhân sốt rét vào giấy thấm Whatman 3MM, trong số này tỷ lệ bệnh nhân nam chiếm đa số trong đó tỷ lệ cao nhất là Ninh Thuận (93,2%), thấp nhất là quảng trị (63,3%). Đa số bệnh nhân tham gia nghiên cứu ở độ tuổi ≥ 15 tuổi, tỷ lệ này cao nhất ở Gia Lai (88,9%) và thấp nhất ỏ Khánh Hòa (59,6%), đây cũng là độ tuổi tương đối trưởng thành bắt đầu tham gia vào lực lượng lao động phụ giúp gia đình Tỷ lệ này cũng phù hợp với báo cáo về tình hình mắc sốt rét tại Việt Nam chủ yếu là nam giới ở độ tuổi trên 15 tuổi có liên quan đến đi rừng, ngủ dẫy [28] Tất cả các mẫu được phân tích đầy đủ để tìm đột biến gen K13 và số mẫu có đột biến gen K13 chung là 135/292 (46,23%) Trong đó, tỷ lệ số mẫu có đột biến gen K13 tại mỗi tỉnh Bình Phước, Gia Lai, Khánh Hòa, Quảng Trị và Ninh Thuận, lần lượt là 97,44% (38/39), 62,03% (67/108), 32,75% (17/52), 20,41% (10/49) và 6,82% (3/44) Bình Phước là tỉnh có tỷ lệ đột biến gen K13 cao nhất cũng là tỉnh có tiếp giáp với Campuchia là tỉnh có báo cáo kháng thuốc ART đầu tiên[103] và số liệu này tương tự như một phân tích về các chỉ điểm phân tử đột biến gen K13 tại Bình Phước năm 2017-2018 của Trương Văn Hạnh và cộng sự (2017) [10]. Nghiên cứu này cho thấy tất cả mẫu có đột biến gen K13 tại vùng sốt rét tỉnh Bình Phước đều là loại đột biến C580Y, chiếm 97,44% (38/39) và đây cũng là loại đột biến phổ biến nhất trên quần thể P falciparum tại các nước Tiểu vùng Sông Mê Kông có kháng thuốc ghi nhận Tương tự, các mẫu thu thập tại các vùng SRLH của tỉnh Gia Lai với 28/48 mẫu biểu hiện nhiều loại đột biến, trong đó loại C580Y chiếm 43,75% (21/48) là chủ yếu, tiếp đến là P553L với 6,25% (3/48) là các loại đột biến xác định kháng artemisinin và 1 loại đột biến ứng viên hay chỉ liên quan C496F là 4,17% (2/48) Kiểu đột biến tại vị trí 1739 trên chuỗi trình tự nucleotide của gen K13, thay nucleotide G (Guanine) bằng A (Adenin). Đột biến dẫn tới sự thay đổi axit amin từ Cysteine (C) thành Tyrosine (Y) trong trình tự a.a trong chuỗi polypeptide tại vị trí 580, riêng kiểu đột biến C469F cũng là đột biến liên quan kháng artemisinine của quần thể P falciparum Đột biến này xuất hiện với tỷ lệ thấp và chỉ phát hiện được tại Gia Lai Đột biến tại vị trí
1406 trên chuỗi trình tự nucleotide của gen K13, thay nucleotide G (Guanine) thành T (Thymine), dẫn tới sự thay đổi a.a từ C (Cytosine) thành F (Phenylalanine) trong trình tự a.a trong chuỗi polypeptid tại vị trí 469 qua hình ảnh mô tả dịch mã ADN trên gen K13 ở vị trí đột biến 469 trên chuỗi polypeptide [40].
Tại Ninh Thuận, phân tích cho thấy chỉ có 3/44 ca (6,82%) chỉ phát hiện được có 1 điểm đột biến là C580Y, là đột biến xác định kháng thuốc artemisinin và cũng là tỉnh có tỷ lệ đột biến gen K13 thấp nhất trong 5 tỉnh nghiên cứu Bệnh nhân tham gia nghiên cứu chủ yếu là nam (93,2%) có độ tuổi trên 15 tuổi
(75%) Kết quả này cũng tương ứng với kết quả nghiên cứu trước đó năm 2012 [22].
Tại huyện Khánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hòa, với tổng số 52 mẫu phân tích đột biến gen K13 cho thấy ngoài hai loại đột biến xác định kháng là C580Y chiếm 5,77% (3/52) và P553L là 21,15% (11/52) Ngoài ra, phân tích các mẫu tại tỉnh Khánh Hòa còn có ba loại đột biến khác gồm kiểu hình H384Q, G638E, G639D có tỷ lệ 5,77% (3/52) hiện chưa xác định vai trò vì các đột biến này hiện các nhà khoa học chưa đánh giá trên cả in vitro cũng như đo nồng độ thuốc, nên chưa thể xác định vai trò liệu có thể khẳng định kháng hay có liên quan/ đột biến ứng viên hoặc đột biến vô nghĩa Đồng thời, tại các điểm của tỉnh Quảng Trị, có 49 mẫu thu thập phân tích đột biến gen K13 cho thấy chỉ có loại đột biến loại C580Y là 20,41% (10/49) và chưa xác định thêm kiểu đột biến K13 nào khác.
Mẫu phân lập P falciparum chỉ ra đột biến gen K13 phổ biến liên quan kháng artemisinine là C580Y trên quần thể P falciparum với tỷ lệ lần lượt 97,44%; 43,75%; 6,82%; 5,77% và 20,41% tại Bình Phước, Gia Lai, Quảng Trị, Khánh Hòa và Ninh Thuận Điểm đột biến P553L cũng là chỉ điểm xác định kháng artemisinin chỉ phát hiện ở Gia Lai, Khánh Hòa mà chưa thấy ở các tỉnh khác với tỷ lệ lần lượt là 65,56% và 21,15% Kiểu đột biến P553L cũng là đột biến có vai trò quan trọng nằm trong nhóm đột biến gen K13 khẳng định kháng artemisinine Kiểu đột biến P553L xảy ra tại vị trí 1658 trên chuỗi trình tự nucleotide gen K13, thay nucleotide C (Cytosine) thành T (Thymine), dẫn tới thay đổi acid amin từ P (Proline) thành L (Leucine) trong trình tự acid amin trong chuỗi polypeptid tại vị trí 553.
Loại đột biến C469F cũng là đột biến liên quan kháng artemisinine của quần thể P falciparum Đột biến này xuất hiện với tỷ lệ thấp và chỉ phát hiện được tại Gia Lai Đột biến tại vị trí 1406 trên chuỗi trình tự nucleotide của genK13, thay nucleotide G (Guanine) thành T (Thymine), dẫn tới sự thay đổi acid amin từ C (Cytosine) thành F (Phenylalanine) trong trình tự acid amin trong chuỗi polypeptid tại vị trí 469 qua hình ảnh mô tả dịch mã ADN trên gen K13 ở vị trí đột biến 469 trên chuỗi polypeptide và C469F có thể liên quan đến kháng chỉ có ở Gia Lai với tỷ lệ 4,17% và kiểu đột biến P553L hiện chỉ phát hiện ở huyện Khánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hòa và các huyện Ia Pa và Krông Pa của tỉnh Gia Lai, mà chưa thấy ở các vùng SRLH của tỉnh khác.
Về cơ sở phân tử kháng thuốc, thuốc hoạt động trên các vị trí đích nội bào khác nhau Phần lớn chúng can thiệp vào các không bào tiêu hóa (digestive vacuole-DV) trong khi một số khác ảnh hưởng đến các bào quan khác như bào tương, ty thể, apicoplast và màng KSTSR Sự phân bố nội bào của KSTSR dựa vào khả năng hòa tan, khả năng thấm qua màng tế bào và ái lực liên kết với các chất vận chuyển điều hòa việc vận chuyển thuốc qua các ngăn nội bào Đối với
Plasmodium spp, hai loại chất vận chuyển làm trung gian vận chuyển xenobiotics đến DV: Chất vận chuyển liên quan đến p-glycoprotein (bao gồm
Đánh giá đáp ứng của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với thuốc dihydroartemisinin - piperaquin phosphat tại các điểm nghiên cứu
Trong số 292 ca nhiễm P falciparum đưa vào phân tích gen K13 có 201 bệnh nhân đủ tiêu chuẩn đưa vào nghiên cứu in vivo Phân tích các đặc điểm dân số học của các nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu TES đánh giá hiệu lực thuốc DHA-PPQ trong điều trị bệnh nhân sốt rét nhiễm P falciparum chưa biến chứng cho thấy nam chiếm cao hơn nữ trong cơ cấu tại tất cả điểm thực hiện TES, lần lượt nam giới chiếm ưu thế với tỷ lệ 66,7%; 95,8%; 66,4%; 95,0% và 58,1% tại Bình Phước, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Khánh Hòa và Quảng Trị Tại thời điểm vào nghiên cứu và chưa dùng thuốc sốt rét, thân nhiệt trung bình của nhóm bệnh nhân tham gia lần lượt là (38,7 ± 0,6) 0 C; (38,7 ± 0,9) 0 C; (38,8 ± 0,9) 0 C; (38,9 ± 0,4) 0 C và (38,8 ± 0,8) 0 C và cân nặng trung bình lần lượt là (51 ± 10,7) kg; (53,4 ± 8,2) kg; (37,6 ± 13,4) kg; (42,8 ± 13,8) kg và (40,4 ± 12,7) kg tại các tỉnh nghiên cứu Bình Phước, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Khánh Hòa và Quảng Trị. Đồng thời, phần lớn bệnh nhân sốt rét đều là người lớn, trưởng thành (≥ 15 tuổi) trong độ tuổi lao động tại các tỉnh Bình Phước, Gia Lai, Khánh Hòa, NinhThuận, Khánh Hòa và Quảng Trị lần lượt là 87,2%; 97,95; 58,1%, 75,0% và
74,2% Hầu hết bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu in vivo làm nghề liên quan đến đi rừng, ngủ rẫy, khai thác rừng lấy măng rừng, phong lan rừng hay mật ong, đi rẫy và ngủ rẫy và làm nông lúa rẫy, trồng rẫy lúa và bắp, đậu xanh, củ mì, hạt điều, trồng keo làm nguyên liệu giấy, mía đường, một số bệnh nhân ở Bình Phước cho biết đi lại giữa các vùng biên giới Việt Nam - Campuchia và bản thân họ cũng đang sống trong vùng có giao lưu biên giới này Bệnh nhân sốt rét có thể làm nghề nghiệp liên quan đến đi rừng hợp pháp (cán bộ kiểm lâm và bảo vệ rừng), hoặc không hợp pháp (khai thác rừng, lấy măng rừng, phong lan rừng hay mật ong, săn bắn, lấy gỗ để bán) và phù hợp với các nghiên cứu trước đây đã từng ghi nhận ở khu vực SRLH ở miền Trung-Tây Nguyên và Nam Bộ-Lâm Đồng [12], [25], [33].
Tổng số 201 bệnh nhận từ 5 tỉnh đủ tiêu chuẩn tham gia nghiên cứu TES, có đến 25/201 (12,4%) ca mất theo dõi hoặc rút khỏi, nên chỉ còn lại 176 ca P. falciparum được đánh giá, phân tích đầy đủ về hiệu lực DHA-PPQ Mật độ
KSTSR thể vô tính P falciparum trung bình tại các tỉnh dao động từ 8030 đến 26530/L trong máu ngoại vi, không có trường hợp nào dưới 1000 hay trên 100.000/L, phù hợp tiêu chuẩn chọn bệnh và tránh tiêu chuẩn loại trừ, hạn chế chuyển nặng hoặc sang ác tính trong quá trình nghiên cứu Tuy nhiên, mật độ trung bình thể vô tính từng tỉnh khác nhau, sự khác biệt giữa các tỉnh, lần lượt ở Bình Phước, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Khánh Hòa và Quảng Trị là 8030; 10770; 10087; 11736 và 26530/L, sự khác biệt giữa các tỉnh có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
Trong số 176 ca bệnh tham gia nghiên cứu TES in vivo đủ 42 ngày cho kết quả như sau: Thời gian sạch KST trung bình lần lượt là 52,1 ± 20,1 giờ; 45,5 ± 22,2 giờ; 38,1 ± 16,6 giờ; 31,2 ± 11,1 giờ; 24,6 ± 1,5 giờ Song song đó, thời gian cắt sốt cải thiện trên lâm sàng lần lượt 30,2 ± 12,7 giờ, 33,3 ± 14,9 giờ, 31,4 ± 11,5 giờ và 34,2 ±12,8 giờ tại Bình Phước, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận và Quảng Trị Phân tích chi tiết về tỷ lệ tồn tại KSTSR thể vô tính P falciparum sau điều trị thuốc phối hợp DHA-PPQ sau 72 giờ hay vào ngày D3 kể từ khi dùng liều thuốc DHA-PPQ đầu tiên cho thấy tại các điểm theo dõi liên tục của các tỉnh Bình Phước, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận và Quảng Trị lần lượt là 41% (16/39), 14,6% (7/48), 18,6% (8/43), 0% (0/40) và 0% (0/31) Tỷ lệ thể vô tính P falciparum dương tính trên 10% ở các tỉnh Bình Phước, Gia Lai, Khánh Hòa đóng vai trò như các chỉ điểm lâm sàng gián tiếp liên quan kháng thuốc artemisinine một phần và để làm rõ tình trạng kháng này cần kết hợp thêm dữ liệu của nghiên cứu in vitro và chỉ điểm phân tử Đáp ứng lâm sàng và KSTSR đầy đủ (ACPR) tại hai tỉnh Ninh Thuận và Quảng Trị đều 100%, tại tỉnh Khánh Hòa và Gia Lai hiệu lực vẫn còn trên 95% lần lượt 96,4% và 97,4%, trong khi đó tại Bình Phước tỷ lệ ACPR này chỉ còn 81,8% (< 90%) và tỷ lệ thất bại trên 10%, kèm theo thất bại lâm sàng muộn (LCF) là 2 ca (6,1%), thất bại KST muộn (LPF) là 4 ca (12,2%). Đặc biệt, tại cả 5 tỉnh chưa có trường hợp nào thất bại điều trị sớm (ETF), riêng ở Khánh Hòa có 1 trường hợp thất bại KST muộn (2,6%) Dù chưa có thất bại điều trị sớm tại cả 5 tỉnh, song tại tỉnh Bình Phước có ACPR < 90% kèm theo thất bại lâm sàng muộn (LCF) là 2 ca (6,1%), thất bại ký sinh trùng muộn (LPF) là 4 ca (12,2%) như các dấu cảnh báo giảm nhạy và gián tiếp kháng thuốc một phần trong viên phối hợp ACTs đang xuất hiện tại các tỉnh có biên giới với ba tỉnh Mondulkiri, Kratie, T‟boung Khmum của Campuchia Campuchia là nước đã và đang ghi nhận chủng P falciparum đa kháng thuốc nghiêm trọng, nay lại biểu hiện kháng artemisinin từ cuối năm 2008, nên việc chuyển dịch chủng kháng qua khâu giao lưu biên giới trên quần thể dân di biến động của hai nước là khó tránh khỏi [19].
Một số nghiên cứu khác trong khu vực Tiểu vùng Sông Mê Kông cũng như tại một số điểm theo dõi liên tục về hiệu lực thuốc ở Việt Nam đã từng chỉ ra có mối liên quan giữa sự chậm làm sạch thể vô tính P falciparum sau điều trị thuốc artesunat hoặc ACTs với các kiểu đột biến gen K13 xác định kháng[9], [16],
[69] Trong nghiên cứu này cũng đã chỉ ra môi liên quan tương tự ở ba tỉnh GiaLai và Bình Phước, Khánh Hòa Trong đó, tỷ lệ đột biến gen K13 kiểu xác định kháng artemisinin trên quần thể P falciparum có tương quan tuyến tính với tỷ lệ KSTSR thể vô tính còn tồn tại dương tính ngày D3, với hệ số tương quan r 0,411 có ý nghĩa thống kê (p < 0,001)
So sánh với các dữ liệu cập nhật về hiệu lực thuốc sốt rét từ các thử nghiệm TES in vivo của WHO cho thấy tại Campuchia, kháng một phần artemisinin (partial artemisinine resistance) lần đầu tiên báo cáo trên vào năm 2008, song các số liệu phân tích hồi cứu về chỉ điểm phân tử chỉ ra kháng một phần artemisinin đã từng xuất hiện trước năm 2001 và lan rộng kháng ACTs [62], [94], [103] Do tỷ lệ thất bại điều trị cao với artesunate-mefloquine (ASMQ) là một loại thuốc điều trị đầu tay sốt rét do P.falciparum chưa biến chứng nên sau đó đã thay đổi từ dạng đóng gói trên cùng vỉ thuốc sang thành viên cố định liều dùng tại DHA- PPQ từ năm 2008, sau đó áp dụng cả nước vào năm 2010 Không lâu sau khi chính sách điều trị này và gia tăng thất bại điều trị với DHA-PPQ qua các nghiên cứu TES ASMQ được dùng trở lại vào năm 2014, nhưng độ bao phủ cả nước chỉ đạt vào năm 2017 Trong số 12 nghiên cứu thuốc ASMQ tiến hành năm 2014-2018, tất cả báo cáo có tỷ lệ đáp ứng lâm sáng và KST đầy đủ (ACPR) trên 98%, ngay cả khi 95% số ca đều mang đột biến gen K13 loại C580Y [70], [94]. Trong khi đó, tại các vùng SRLH của Lào có ba thử nghiệm từ giai đoạn 2013-2017 thấy thất bại với artemether-lumefantrine tỷ lệ từ 10-17,2% Tuy nhiên, cỡ mẫu cho các nghiên cứu này vẫn còn nhỏ, hiệu lực DHA-PPQ cũng được giám sát đánh giá để đưa thuốc này vào trong danh mục thuốc của nước này, song tỷ lệ thất bại sau đó cũng trên 15%, nên nay đang theo dõi thử nghiệm loại artesunat-pyronaridin (Pyramax) và artesunat-mefloquin (ASMQ) [107]. Tại các điểm theo dõi liên tục hiệu lực thuốc ở Myanmar, kháng một phần với artemisinin có thể đã xuất hiện từ lâu dọc theo biên giới Thái Lan-Myanmar từ năm 2001, nhưng đến năm 2008 mới được làm rõ [69], [103] Từ năm 2009, các dữ liệu phân tích chỉ ra thời gian làm sạch KST chậm trên những ca điều trị ACTS có ý nghĩa Dù có tình trạng chậm làm sạch KSTSR xảy ra đối với tất cả ba loại ACTs (artemether-lumefantrin, ASMQ và DHA-PPQ) đã từng dùng ở
Myanmar, song hiệu lực cả ba loại thuốc trên vẫn còn cao Thái Lan dùng liệu trình 2 ngày ASMQ như một lựa chọn ưu tiên và sau đó chuyển sang liệu trình 3 ngày từ năm 2009, thất bại điều trị với ASMQ tăng trên 10% ở các tỉnh Ubonratchathani, Kanchanaburi, Ranong, Tak Số thất bại điều trị cao được tìm thấy ở Thái Lan sau khi điều trị ASMQ có thể do một phần kháng mefloquin trước đó trên phạm vi rộng, bên cạnh tình trạng kháng artemisinine một phần. Áp lực thuốc mefloquin được xem xét vài chục năm qua, đồng thời Thái Lan đã từng dùng liệu pháp mefloquin (15-25 mg/kg) đơn trị liệu hoặc phối hợp với artesunate Hiệu lực artemether-lumefantrin được đánh giá tại hai tỉnh vào năm
2012, với tỷ lệ thất bại điều trị từ 6-10% Năm 2015, thuốc DHA-PPQ được lựa chọn như một thuốc đầu tay và hiện đang đánh giá theo chương trình giám sát hiệu lực thuốc lồng ghép hay tích hợp (integrated Drug Efficacy Surveillance- iDES) [107].
Tại châu Phi, hiệu lực thuốc ACTs hiện đang được giám sát tại các nước có SRLH Một số báo cáo cho thấy hiện tượng chậm làm sạch KSTSR trong các thử nghiệm TES với thuốc ACTs Tuy nhiên, số liệu này chưa được đánh giá theo thời gian Artemether-lumefantrine và artesunat-amodiaquin là hai loại thuốc ưu tiên điều trị trong chính sách tại các quốc gia châu Phi, cũng như bổ sung thêm thuốc DHA-PPQ vào danh mục gần đây Từ năm 2010-2016, hiệu lực trung bình của thuốc DHA-PPQ, artesunat-amodiaquin, artemether-lumefantrin lần lượt 98,7%; 98,3% và 97,9% [107].
Sự hiện diện tình trạng tăng số bản sao Plasmepsin 2/3 tại một số nước như Comoros, Mali, Mozambique, Uganda như một mối quan tâm quan trọng, dù đột biến này chưa phải là ưu thế như một chỉ điểm hợp lệ liên quan kháng PPQ trên các chủng P falciparum tại châu Phi Song song đó, tại Nam Mỹ có một số nghiên cứu tiến hành cho thấy hiệu lực ACTs còn cao Chloroquin vẫn là thuốc ưu tiên trong điều trị tại Mesoamerica, Hispaniola Tại Guatemala, Haiti,Honduras và Nicaragua, các chỉ điểm phân tử Pfcrt (liên quan đến kháng CQ) đã được tiến hành song song với thử nghiệm TES từ năm 2010-2015, hơn 1000 mẫu được phân tích và hiếm đột biến tìm thấy, hai TES thực hiện tại Haiti ghi nhận thất bại điều trị, song các phân tích phân tử chưa làm để loại trừ tái nhiễm và không có đột biến Pfcrt tìm thấy trên những ca thất bại này [101], [103].
Tại Trung Đông và Ấn Độ, tỷ lệ thất bại artesunat-sulfadoxin/pyrimethamin cao tìm thấy ở Somalia và Sudan Điều này đã nhanh chóng thay đổi chính sách điều trị bằng thuốc artemether-lumefantrin nhờ vào cả thử nghiệm in vivo và chỉ điểm phân tử 3 hoặc 4 đột biến Pfdhps và Pfdhfr Tại Afghanistan, Iran, Pakistan và Yemen, tỷ lệ thất bại với thuốc artesunat-sulfadoxin/pyrimethamin thấp hơn 10% Tại Ấn Độ, ba nghiên cứu thực hiện năm 2012 ghi nhận thất bại trên10% với artesunat-sulfadoxin/pyrimethamin và chưa phát hiện thấy tình trạng kháng một phần artemisinin Điều này dẫn đến thay đổi chính sách điều trị với artemether-lumefantrin tại vùng Đông Bắc của nước này [107].
Nhìn chung, dù đáp ứng chậm với artemisinin tại một số vùng GMS, song thuốc ACTs vẫn còn hiệu lực trong điều trị sốt rét do P falciparum Phần lớn bệnh nhân có hiện tượng chậm làm sạch KST đều được chữa khỏi vì vai trò của thuốc đi kèm vẫn còn hiệu quả Giám sát thường quy cần phải tiếp tục để đảm bảo rằng các thuốc ACTs đang được khuyến cáo còn hiệu quả và kịp thời thay đổi chính sách thuốc khi đến ngưỡng quy định Đánh giá đột biến gen K13 hỗ trợ quan trọng trong truy vết kháng artemisinin một phần khi chúng đang dần nổi lên Trong bối cảnh đa kháng thuốc tại GMS, việc loại trừ P falciparum là vấn đề đặt ra ưu tiên Vai trò kháng artemisinin trong phát triển hoặc chọn lọc kháng thuốc một phần cần đánh giá hơn nữa trong thời gian đến [107].
Tại Việt Nam, tiến trình chậm sạch KSTSR sau dùng thuốc DHA-PPQ lần đầu tiên phát hiện tại huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước năm 2009 Giám sát thường quy hiệu lực thuốc DHA-PPQ cũng đã cho thấy các ổ bệnh khác cũng tương tự như tại huyện Phú Thiện, tỉnh Gia Lai (2010), huyện Tuy Đức va Cư Jut, tỉnh Đăk Nông (2011), huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam (2012), huyện Khánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hòa (2014) và huyện Ninh Sơn, tỉnh Ninh Thuận
Đánh giá nhạy cảm của ký sinh trùng P falciparum với một số thuốc sốt rét trên thử nghiệm in vitro tại Gia Lai
Nghiên cứu thử nghiệm in vitro đánh giá tính nhạy với thuốc của phân lập
P falciparum thu thập tại thực địa nhằm phát hiện sớm các dấu hiệu của ký sinh trùng sốt rét P falciparum kháng thuốc và đánh giá độ nhạy cảm với thuốc mới có khả năng thay thế những thuốc đã bị kháng trong tương lai [91], [100] Đánh giá đáp ứng trên in vitro trên 54 trong số 108 mẫu phân lập P falciparum thu được tại Gia Lai năm 2016-2017 đưa vào phân tích đột biến gen K13 với một số thuốc sốt rét Trong số 54 mẫu đưa vào nuôi cấy tỷ lệ mẫu có đột biến gen K13 chiếm 68,52%, trong đó kiểu đột biến C580Y chiếm đa số với tỷ lệ 48,15% (26/54), kiểu đột biến P553L chiếm tỷ lệ 5,56% (3/54) đây là 2 điểm đột biến xác định kháng artemisinin và dẫn chất Trong 54 mẫu đó tỷ lệ P falciparum phát triển thành thể phân liệt ở các giếng (well) chứng là 42 mẫu chiếm 77,7% (42/54 ca có > 10% thể phân liệt ở giếng chứng), tỷ lệ đột biến gen K13 trong nhưng mẫu nuôi cấy thành công là 30,95%, tỷ lệ đột biến này giống với nhóm đưa vào nuôi cấy sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Về tính nhạy cảm của các phân lập P falciparum với thuốc artesunat (AS),kết quả nghiên cứu chỉ ra tỷ lệ ức chế sự tạo thành thể phân liệt của AS ở mức nồng độ 2 nmol/L là 47,1%, tiếp theo tương ứng ở nồng độ 4 nmol/L là 72,6%, ở nồng độ 8 nmol/L là 91,1%, ở nồng độ 16 nmol/L đã có tác dụng ức chế trên
95% sự phát triển thành thể phân liệt của P falciparum, nhưng nồng độ thuốc cao gấp 2 lần (32 nmol/L) cũng chưa đủ để toàn bộ KSTSR phát triển thành thể phân liệt Trong nhiều năm qua, AS là một trong những thuốc đầu tiên được đưa vào để điều trị P falciparum ở Việt Nam, mới đầu với liều AS 3 ngày sau đó tăng lên 5 ngày, 7 ngày [11], đến nay do tình trạng KST kháng AS cũng như ART nên AS khoong được dùng dưới dạng đơn chất mà phải dùng trong phối hợp thuốc điều trị chống kháng rất tốt đối với chủng P falciparum đa kháng tại Việt Nam Hiện tại, phác đồ điều trị của Bộ Y tế khuyến cáo AS phối hợp với pyronaridin (viên Pyramax) để chống kháng đối với P falciparum kháng DHA- PPQ đã giảm hiệu quả [3] Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ ức chế IC50 trung bình của AS đối với 42 mẫu phân lập P falciparum là IC50 là 3,06 ± 3,10 nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là 0,41 nmol/L và giá trị cao nhất là 14,55 nmol/L Kết quả này cao hơn so với kết quả nghiên cứu 2004 tại Bù Gia Mập Bình Phước IC50 trung bình của AS là 1,3 ± 0,6 nmol/L [27] Kết quả này cũng cao hơn nhiều so với nghiên đa trung tâm cứu tại phía tây Campuchia giai đoạn 2001-2007 trên 495 mẫu thử với thuốc AS kết quả cụ thể từng năm như sau, năm
2001 IC50 trung bình 1,1 nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là 0,1 nmol/L và giá trị cao nhất là 9,9 (nt); năm 2002 IC50 trung bình 1,0 nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là 0,2 nmol/L và giá trị cao nhất là 6,4 (n2); năm 2003 IC50 trung bình 1,2 nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là 0,2 nmol/L và giá trị cao nhất là 11,1 (n0); năm 2004 IC50 trung bình 1,8 nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là 0,3 nmol/L và giá trị cao nhất là 7,1 (nH); năm 2005 IC50 trung bình 1,6 nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là 0,7 nmol/L và giá trị cao nhất là 7,2 (nQ); năm 2006 IC50 trung bình 0,6 nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là 0,1 nmol/L và giá trị cao nhất là 1,6 (n'); năm 2007 IC50 trung bình 1,7 nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là 0,4 nmol/L và giá trị cao nhất là 6,7 (nc) [83] So với nghiên cứu tại Gabon Châu Phi cũng cao hơn IC50 trung bình 2,08 nmol/L (n4) [55] So với nghiên cứu tại Pháp tổng cộng 181 bệnh nhân
P falciparum được thu thập từ tháng 4 năm 2008 đến tháng 4 năm 2010 từ các bệnh nhân nhập viện tại Pháp với bệnh sốt rét nhập khẩu từ các nước lưu hành bệnh sốt rét (Angola, Benin, Burkina Faso, Cameroon, Comoros, Congo, Bờ Biển Ngà, Gabon, Gambia , Ghana, Guinea, Ấn Độ, Madagascar, Mali, Mozambique, Niger, Cộng hòa Trung Phi, Senegal, Thái Lan, Togo, Zambia)
[41], IC50 trung bình 1,1 nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là 0,1 nmol/L và giá trị cao nhất là 20,6 (n9), kết quả này thấp hơn nhiều so với kết quả nghiên cứu cuả chúng tôi Nghiên cứu tại thái lan trên những bệnh nhân P. falciparum được thu thập từ 2016-2017 giá trị IC50 trung bình là 3,06 ± 3,10 nmol/L, trong đó giá trị IC50 thấp nhất là 0,6 nmol/L và giá trị cao nhất là 9,7 (n6) [67] kết quả này cũng tương tự như kết quả tại Gia Lai năm 2016-2017. Trong số 42 mẫu phân tích ivitro có 59,5% (25/42) mẫu có đột biến gen K13 xác định, liên quan đến kháng ART, 40,5 % ( 17/42) mẫu không có đột biến hoặc đột biến không liên quan đến kháng ART IC50 trung bình của 2 nhóm này lần lượt là 3,50 nmol/L và 2,18 nmol/L, nồng độ IC50 trung bình của 2 nhóm này khác nhau có ý nghĩa thống kê (p