CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN DI TRUYỀN 05012012 1 GIỚI THIỆU CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN DI TRUYỀN TS BS VŨ PHI YÊN CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN DT 2 05012012 2 CÁC KỸ THUẬT DT TẾ BÀO Nhiễm sắc thể đồ Nguyên l. Gen, đơn vị cơ bản của di truyền, là một đoạn DNA chứa tất cả các thông tin cần thiết để tổng hợp một polypeptide (protein). Điều này tạo nên tính đa dạng và đặc thù của từng loại protein từ đó đảm bảo cấu tạo và hoạt động từng phần của cơ thể. Cấu trúc Gen Con người có khoảng 20.000 đến 23.000 gen tùy thuộc vào cách xác định gen. Các gen được lưu trữ ở các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào và ty thể. Ở người, nhân tế bào sinh dưỡng (không có khả năng sinh sản hữu tính) thường có 46 nhiễm sắc thể ghép thành 23 cặp nhiễm sắc thể. Mỗi cặp gồm một nhiễm sắc thể từ mẹ và một từ cha. Trong 1 cặp nhiễm sắc thể có 22 cặp nhiễm sắc thể thường, tương đồng về kích thước, hình dạng, vị trí và số lượng gen. Cặp nhiễm sắc thể thứ 23, còn được gọi là cặp nhiễm sắc thể giới tính (X và Y), quy định giới tính của một người, ngoài ra chúng cũng chứa các gen mang chức năng khác. Trong nhân tế bào sinh dưỡng ở giới nữ có 2 nhiễm sắc thể X (XX); ở nam giới có một nhiễm sắc thể X và một nhiễm sắc thể Y (XY). Nhiễm sắc thể X chứa nhiều gen chịu trách nhiệm về nhiều tính trạng di truyền khác nhau; nhiễm sắc thể Y nhỏ hơn, mang gen quy định giới tính nam, cũng như một ít gen khác. Vì nhiễm sắc thể X có nhiều gen hơn nhiễm sắc thể Y, nên ở nam giới ̣(XY) rất nhiều gen có trên X nhưng không tương ứng trên Y từ đó không được biểu hiện thành kiểu hình. Do vậy để duy trì sự cân bằng vật liệu di truyền giữa nam và nữ, một trong cặp nhiễm sắc thể XX ở mỗi tế bào của những phụ nữ bị vô hiệu hóa một cách ngẫu nhiên trong giai đoạn đầu đời (lyonization). Trong một số tế bào, X từ mẹ bị vô hiệu hóa, và ở những tế bào khác, X từ bố. Khi sự bất hoạt đã diễn ra trong một tế bào, tất cả thế hệ kế tiếp của tế bào đó đều có cùng một X bất hoạt. Nhiễm sắc thể đồ là bộ đầy đủ các nhiễm sắc thể trong tế bào của một người.
05/01/2012 GIỚI THIỆU CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN DI TRUYỀN TS BS VŨ PHI YÊN CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN DT 05/01/2012 CÁC KỸ THUẬT DT TẾ BÀO Nhiễm sắc thể đồ Nguyên lý Phương pháp Kết Hạn chế FISH Nhuộm toàn NST NST đồ quang phổ NST ĐỒ KARYOTYPE 05/01/2012 NHIỄM SẮC THỂ ĐỒ Kỳ Sốc nhược trương Xử lý băng Nhận biết, xếp toàn bộ NST, theo Kích thước Chỉ số tâm Cấu trúc băng PHƢƠNG PHÁP NST ĐỒ Nuôi cấy / chọn TB phân chia Thu hoạch Sốc nhược trương Cố định Xử lý băng Chụp hình phân tích 05/01/2012 KẾT QUẢ NST ĐỒ Khảo sát toàn bộ NST Bất thường số lượng Bất thường cấu trúc 05/01/2012 HẠN CHẾ CỦA NST ĐỒ Thời gian: 72h - tuần Độ phân giải : nhỏ Mb Thất bại Dương tính giả / Âm tính giả 10 05/01/2012 FISH FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION 11 NGUYÊN LÝ Nguyên tắc bổ sung Phản ứng LAI Đoạn mồi tƣơng ứng với vùng cần khảo sát, đánh dấu huỳnh quang Biến tính DNA nhiệt Tách rời mạch đơn DNA 12 05/01/2012 PHƢƠNG PHÁP Tổng hợp đoạn mồi Đánh dấu huỳnh quang Biến tính DNA Phản ứng lai Quan sát, chụp hình phân tích kết 13 KẾT QUẢ tín hiệu, NST Mất thêm tín hiệu Chuyển chỗ tín hiệu 14 05/01/2012 15 HẠN CHẾ Đặc hiệu thiếu tổng quát Bất thường cấu trúc 10 Kb 16 05/01/2012 NHUỘM TOÀN BỘ MỘT NST CHROMOSOME PAINTING 17 NHUỘM TOÀN BỘ NST 18 05/01/2012 19 NST ĐỒ QUANG PHỔ SPECTRAL KARYOTYPING 20 10 05/01/2012 21 22 11 05/01/2012 CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀN PHÂN TỬ 23 24 12 05/01/2012 PCR POLYMERASE CHAIN REACTION 25 NGUYÊN LÝ Theo chế tự DNA Các điều kiện cần thiết Sự tách rời hai mạch DNA gốc Đoạn mồi Sự tổng hợp mạch DNA enzyme Phóng đại đoạn DNA đặc hiệu lên nhiều lần 26 13 05/01/2012 27 PHƢƠNG PHÁP Chuẩn bị đoạn mồi Biến tính DNA, lai đoạn mồi, tổng hợp Lặp lại 20 - 35 lần Kiểm tra sản phẩm / điện di Tinh 28 14 05/01/2012 ĐIỆN DI 29 KẾT QUẢ Có SP/ khơng có SP Độ dài SP Định lượng SP Thêm đoạn, lặp đoạn phiên / pb / 3pb Sử dụng SP cho kỹ thuật khác Giải trình tự Tạo dịng 30 15 05/01/2012 HẠN CHẾ Đặc hiệu Không tổng quát Độ dài sản phẩm 31 GIẢI TRÌNH TỰ SEQUENCING 32 16 05/01/2012 NGUYÊN LÝ DNA polymerase tổng hợp DNA dideoxynucleotide ngưng phản ứng loại dideoxynucleotide A, T, G, C Nhiều sản phẩm - kích thước khác Điện di, đọc trình tự chuỗi DNA màu huỳnh quang thay cho đánh dấu phóng xạ 33 ĐIỆN DI 34 17 05/01/2012 MÀU HUỲNH QUANG 35 PHƢƠNG PHÁP Tổng hợp DNA với nucleotide thường loại dideoxynucleotide A, T, G, C huỳnh quang Điện di Đọc tín hiệu huỳnh quang trình tự chuỗi DNA 36 18 05/01/2012 KẾT QUẢ Trình tự chuỗi DNA xác 37 HẠN CHẾ Đọc đoạn DNA ngắn 500 - 650 pb 38 19 05/01/2012 TÓM TẮT 39 40 20 ... 05/01/2012 NGUYÊN LÝ DNA polymerase tổng hợp DNA dideoxynucleotide ngưng phản ứng loại dideoxynucleotide A, T, G, C Nhiều sản phẩm - kích thước khác Điện di, đọc trình tự chuỗi DNA màu huỳnh quang... đánh dấu phóng xạ 33 ĐIỆN DI 34 17 05/01/2012 MÀU HUỲNH QUANG 35 PHƢƠNG PHÁP Tổng hợp DNA với nucleotide thường loại dideoxynucleotide A, T, G, C huỳnh quang Điện di Đọc tín hiệu huỳnh quang... tính DNA, lai đoạn mồi, tổng hợp Lặp lại 20 - 35 lần Kiểm tra sản phẩm / điện di Tinh 28 14 05/01/2012 ĐIỆN DI 29 KẾT QUẢ Có SP/ khơng có SP Độ dài SP Định lượng SP Thêm đoạn,