ẢNH HƯỞNG của VI KHUẨN LACTIC bổ SUNG vào THỨC ăn lên KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH HOẠI tử GAN tụy cấp TÍNH TRÊN tôm THẺ CHÂN TRẮNG (litopenaeus vannamei

Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 52, Phần B (2017): 122-130 DOI:10.22144/ctu.jvn.2017.132 ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN LACTIC BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN LÊN KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH TRÊN TƠM THẺ CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) Nguyễn Thị Trúc Linh1,2, Nguyê ̃n Trọng Nghĩa2, Đă ̣ng Thị Hoàng Oanh2 Trương Quô ́c Phú2 Khoa Nông nghiệp Thủy sản, Trường Đại học Trà Vinh Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ Thông tin chung: Ngày nhận bài: 08/05/2017 Ngày nhận sửa: 24/08/2017 Ngày duyệt đăng: 12/10/2017 Title: Effects of lactic acid bacteria supplemented in feed on resistance to acute hepatopancreatic necrosis disease in whiteleg shrimp (Litopenaeus vannamei) Từ khóa: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính, lactic acid bacteria, tôm thẻ chân trắng, Vibrio parahaemolyticus Keywords: Acute hepatopancreatic necrosis disease, lactic acid bacteria, Vibrio parahaemolyticus, whiteleg shrimp ABSTRACT The experiments were conducted in glass tank system, each contains 20 L of 20‰ seawater and well aerated The study was carried out to determine the effect of LAB supplemented in feed on survival rate and the resistance to V parahaemolyticus causing acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in whiteleg shrimp (Litopenaeus vannamei) The results showed that the survival rate of shrimp was very high from 82.23 to 92.23% in the treatment of LAB supplement and without challenged to V parahaemolyticus, and not significantly different to the ĐCA treatment (87.77%) The highest survival rate was obtained in the treatment of LAB5 supplement (92.23%) Furthermore, shrimp did not show any symptoms of AHPND In the V parahaemolyticus challenged-treatments (VP), shrimp showed the typical clinical signs of AHPND The mortality rate was highest in VP+LAB3 treatment (70.02%), followed by the ĐCD treatment (54.43%) and VP+LAB4 treatment (43.33%) By contrast, shrimp in the remaining treatments had the high survival rate (73.37% to 79.97%) and shrimp's hepatopancreas were less affected by AHPND by histopathological method TĨM TẮT Thí nghiệm tiến hành hệ thống bể kính, chứa 20 lít nước có độ mặn 20‰ sục khí Thí nghiệm thực để xác định ảnh hưởng vi khuẩn lactic bổ sung vào thức ăn lên tỷ lệ sống khả kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) tơm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) Kết thí nghiệm cho thấy, tỷ lệ sống tôm cao từ 82,23 đến 92,23% nghiệm thức có bổ sung LAB vào thức ăn không cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus, khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức ĐCA (87,77%) Tỉ lệ sống đạt cao nghiệm thức LAB5 (92,23%) Ngoài ra, tơm khơng có dấu hiệu bệnh hoại tử gan tụy cấp tính Ở nghiệm thức cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus (VP), tơm có dấu hiệu bệnh lý đặc trưng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính Tôm chết nhiều nghiệm thức VP+LAB3, tỉ lệ chết lên đến 70,02%, nghiệm thức ĐCD (54,43%) nghiệm thức VP+LAB4 (43,33%) Ở nghiệm thức cịn lại, tơm có tỷ lệ sống cao (73.37% - 79.97%) phần lớn mẫu gan tụy thu khơng có dấu hiệu bệnh lý đặc trưng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính phân tích mơ bệnh học Trích dẫn: Nguyễn Thị Trúc Linh, Nguyễn Trọng Nghĩa, Đặng Thị Hoàng Oanh Trương Quốc Phú, 2017 Ảnh hưởng vi khuẩn lactic bổ sung vào thức ăn lên khả kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 52b: 122-130 122 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 52, Phần B (2017): 122-130 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu thí nghiệm ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn lactic (LAB) sử dụng rộng rãi chế phẩm sinh học cho người vật ni để kích thích tiêu hóa, phòng số bệnh vi khuẩn gây Ngày nay, LAB lựa chọn để bổ sung vào thức ăn cho động vật thủy sản có nhiều lợi ích như: cạnh tranh loại trừ vi khuẩn gây bệnh (Garriques and Arevalo, 1995; Moriarty, 1997; Gomez-Gil et al., 2000; Balca´zar, 2003; Balca´-zar et al., 2004; Vine et al., 2004), cung cấp nguồn dinh dưỡng enzyme cho tiêu hóa (Sakata, 1990; Garriques and Arevalo, 1995), hấp thụ trực tiếp vật chất hữu hòa tan vi khuẩn (Garriques and Arevalo, 1995; Moriarty, 1997) lợi ích khác kiểm tra như: tăng cường hệ thống miễn dịch để chống lại vi khuẩn gây bệnh (Andlid et al., 1995; Rengpipat et al., 2000; Gullian and Rodríguez, 2002; Irianto and Austin, 2002; Balcázar, 2003; Balcázar et al., 2004), chống virus (Kamei et al., 1988; Girones et al., 1989; Direkbusarakom et al., 1998) Trong nghiên cứu lồi vi khuẩn hữu ích, có số dòng vi khuẩn tiết chất ức chế, đề kháng lại với vi khuẩn khác Lactobacillus sp kháng lại vi khuẩn Vibrio sp (Trịnh Hùng Cường, 2011); L suntoryeus LII1 có khả kháng mạnh vi khuẩn Escherichia coli Bacillus cereus (Hồ Lê Huỳnh Châu ctv., 2010) Hơn nữa, trình lên men, LAB sinh acid hữu cơ, ức chế vi khuẩn gây bệnh cách tác động lên tế bào chất vi khuẩn, ảnh hưởng đến chức bảo vệ màng tế bào (Fooks et al., 1999; Caplice and Fitzgerald, 1999; Kuipers et al., 2000) Nguồn nước: nước biển có độ mặn khoảng 7285‰ chuyển từ Vĩnh Châu – Sóc Trăng lọc qua túi lọc để loại bỏ chất cặn, sau đó, nước xử lý chlorine, nồng độ 20-30 mg/L trì sục khí mạnh, liên tục (24 giờ) tiến hành kiểm tra trung hòa hàm lượng Cl tự Na2S2O3 theo tỉ lệ 7:1 (Na2S2O3:Cl) Sau xử lý, nước biển pha loãng với nước để có độ mặn 20‰ Bể thí nghiệm: hệ thống bể thí nghiệm bể kính tích 30 L, bể thí nghiệm rửa nước sau khử trùng với chlorine 30 mg/L phơi nắng khoảng trước sử dụng Nguồn tơm thí nghiệm: tôm thẻ chân trắng giai đoạn PL10 ương hệ thống tuần hồn Bộ mơn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ kích cỡ trung bình khoảng 1g/con dùng để bố trí thí nghiệm Trước bố trí, tơm kiểm tra phương pháp PCR nhằm xác định âm tính với WSSV (OIE, 2006) V parahaemolyticus (Sirikharin et al., 2014) với đoạn mồi đặc hiệu AP3 Sau bố trí vào bể thí nghiệm, tơm dưỡng ngày cho quen với điều kiện môi trường bể bắt đầu thí nghiệm Nguồn vi khuẩn V parahaemolyticus: chủng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính sử dụng thí nghiệm chủng lưu trữ Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ (Nguyễn Trọng Nghĩa ctv., 2015) điều kiện -800C Chủng vi khuẩn phục hồi môi trường nutrient broth (NB, Merck) có bổ sung 1,5% NaCl (NB+), sau ủ 280C 18 Ghi nhận màu sắc hình dạng khuẩn lạc, nhuộm Gram để kiểm tra tính vi khuẩn Khuẩn lạc vi khuẩn nuôi tăng sinh môi trường NB+ 280C 18 – 24 sau xác định mật độ vi khuẩn máy so màu quang phổ bước sóng 610 nm Hiện nay, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính vi khuẩn V parahaemolyticus gây làm thiệt hại tỷ USD/năm cho nghề nuôi tôm nước lợ (Zorriehzahra, 2015) Cho đến nay, bệnh c hưa có dấu hiệu dừng lại gây thiệt hại ngày nghiêm trọng (Tổng cục Thủy sản, 2015) Việc sử dụng vi khuẩn có khả ức chế V parahaemolyticus trộn vào thức ăn biện pháp phịng bệnh cho tơm tập trung nghiên cứu (Soccol et al., 2010) Nguyễn Thị Trúc Linh (2015) sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch xác định chủng LAB có khả ức chế vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm với vịng kháng khuẩn từ 17,5-18,5mm Trong nghiên cứu này, chủng LAB nói sử dụng để trộn vào thức ăn cho tôm điều kiện cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus nhằm để xác định khả ngăn ngừa bệnh hoại tử gan tụy cấp tính đàn tơm ni cách có hiệu quả, an tồn thân thiện với mơi trường Phục hồi, nuôi tăng sinh vi khuẩn lactic cách chuẩn bị thức ăn: Năm chủng LAB (T3.1, RP5.4.1, T4.2, RP5.5.1, RP6.5) xác định có khả kháng mạnh với vi khuẩn V parahaemolyticus sử dụng cho thí nghiệm Trong đó, chủng T3.1 phân lập từ ruột tôm thẻ chân trắng, RP6.5 phân lập từ ruột cá rô phi ao nuôi tôm thuộc huyện Thạnh Phú, tỉnh Bến Tre; chủng RP4.5.1 RP5.4.2 phân lập từ ruột cá rô phi Chủng T4.2 phân lập từ ruột tôm thẻ chân trắng ao ni tơm thâm 123 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 52, Phần B (2017): 122-130 có bổ sung chủng LAB Tơm cho ăn lần ngày vào lúc 7, 13, 17 giờ, cho ăn theo nhu cầu Bảy ngày sau bổ sung LAB nghiệm thức thí nghiệm bao gồm nghiệm thức 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, tôm gây cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus, sau thí nghiệm tiếp tục theo dõi thời gian 14 ngày Sau cảm nhiễm ngày, nước bể thí nghiệm thay 30% ngày nước thay 30% ngày canh tỉnh Trà Vinh Các chủng LAB phục hồi môi trường de Man Rogosa Sharpe (MRS, Merck) agar có bổ sung 1,5% NaCl, nhuộm Gram để xác định tính sau ni sinh khối mơi trường MRS broth có bổ sung 1,5% NaCl 48 ly tâm với tốc độ 7000 vòng phút, rửa lại lần nước muối sinh lý tiệt trùng, pha loãng nước muối sinh lý đến đạt mật độ 1010 CFU/mL, 10 mL chủng LAB trộn vào 100g thức ăn áo dầu mực bên Thức ăn cho vào túi ni lon, dán nhãn bảo quản 40C sử dụng 2.2 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp cảm nhiễm thực theo phương pháp Loc Tran et al (2013) Tôm ngâm dung dịch vi khuẩn V parahaemolyticus mật độ x 107 CFU/mL 15 phút sau vớt bố trí vào bể thí nghiệm bổ sung vi khuẩn V parahaemolyticus với mật độ vi khuẩn nước bể 106 CFU/mL Đối với nghiệm thức đối chứng âm tiến hành ngâm tôm mơi trường TSB (có bổ sung 1,5% NaCl) tiệt trùng cho vào bể khơng bổ sung vi khuẩn Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên gồm 12 nghiệm thức, nghiệm thức lặp lại lần (36 lơ thí nghiệm) Các nghiệm thức thí nghiệm gồm: ĐCA (đối chứng âm): Cho tôm ăn thức ăn không bổ sung LAB không gây cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus LAB1: Cho tơm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng T3.1 không gây cảm nhiễmvi khuẩn V parahaemolyticus LAB2: LAB1 bổ sung chủng RP5,4,1 LAB3: LAB1 bổ sung chủng T4.2 LAB4: LAB1 bổ sung chủng RP5.5.1 LAB5: LAB1 bổ sung chủng RP6.5 ĐCD (đối chứng dương): Cho tôm ăn thức ăn không bổ sung LAB gây cảm nhiễm V parahaemolyticus VP+LAB1: Cho tơm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng T3.1 gây cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus VP+LAB2: VP+LAB1 bổ sung chủng RP5,4,1 VP+LAB3: VP+LAB1 bổ sung chủng T4.2 VP+LAB4: VP+LAB1 bổ sung chủng RP5.5.1 VP+LAB5: VP+LAB1 bổ sung chủng RP6.5 Các tiêu theo dõi Mật số vi khuẩn lactic ruột tôm xác định dựa phương pháp đếm đĩa thạch (Hadi et al., 2009) Mẫu ruột tôm lấy điều kiện vô trùng, cân xác định khối lượng nghiền dung dịch nước muối sinh lý Sau đó, mẫu ruột tơm nghiền tiếp tục pha lỗng nồng độ khác trải lên đĩa môi trường MRS có bổ sung 1,5% NaCl, ủ đĩa nhiệt độ 28oC 48 Số khuẩn lạc phát triển đĩa thạch đếm xác định mật số vi khuẩn công thức Mật số vi khuẩn (CFU/g) = [(số khuẩn lạc x độ pha lỗng)/V (mẫu)]/m Trong đó: V (mẫu) thể tích dung dịch mẫu nhỏ môi trường MRS, m khối lượng ruột tôm Tần suất thu mẫu bao gồm lần thu mẫu thứ sau cho ăn vi khuẩn lactic ngày (trước cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus), bốn lần thu mẫu (sau cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus) với nhịp thu mẫu ngày/lần thu mẫu ngẫu nhiên con/bể Tỷ lệ sống tôm: Tỉ lệ sống xác định sau 14 ngày cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus Tỷ lệ sống (%) tính cơng thức (TLS%) = (số tơm thu / số tơm thả) * 100% Thí nghiệm tiến hành bể kính chứa 20L nước có độ mặn 20‰, sục khí liên tục thời gian thí nghiệm Mỗi bể thí nghiệm bố trí 30 tơm khỏe với lần lặp lại cho nghiệm thức thí nghiệm, kích cỡ trung bình 1g/con Ở nghiệm thức ĐCA ĐCD, tôm cho ăn thức ăn viên CP chứa 40% đạm Ở nghiệm thức lại, tôm cho ăn thức ăn loại Dấu hiệu bệnh lý khả kháng bệnh tôm: Sau cảm nhiễm, phát tơm có dấu hiệu bệnh lý lờ đờ, bỏ ăn, màu sắc nhợt nhạt, tiến hành thu mẫu, cố định phân tích mơ bệnh học Ngoài ra, mẫu thu định kỳ sau ngày cảm nhiễm kết thúc thí nghiệm cách thu ngẫu nhiên tôm bể để tiến hành phân 124 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 52, Phần B (2017): 122-130 LAB ruột tơm thẻ thí nghiệm Ngược lại, nghiệm thức có bổ sung LAB vào thức ăn khơng có cảm nhiễm V parahaemolyticus có diện LAB ruột tôm thẻ với mật số cao 95x105 CFU/g nghiệm thức bổ sung LAB2 thấp 0,17x105 CFU/g nghiệm thức bổ sung chủng LAB3 Nhìn chung, mật số LAB ruột tơm thẻ có khác biệt có ý nghĩa thống kê lẫn lần thu mẫu nghiệm thức có khác biệt có ý nghĩa lẫn nghiệm thức lần thu mẫu Mật số LAB có xu hướng tăng cao lần thu mẫu từ thứ trở đi, cao nghiệm thức LAB2 với mật số 95x105 CFU/g, nghiệm thức LAB4: 73x105 CFU/g lần thu mẫu thứ Nghiệm thức LAB1 LAB5 mật số LAB đạt cao lần thu mẫu cuối (9,3 8,8x105 CFU/mL) Chỉ riêng nghiệm thức LAB3, mật số đạt cao lần thu mẫu thứ (11x105CFU/g) thấp lần thu mẫu cuối (0,17x105 CFU/g) tích mơ bệnh học, đồng thời theo dõi ghi nhận dấu hiệu bệnh lý, thời gian tơm chết Phương pháp phân tích mơ bệnh học: mẫu gan tụy tơm thí nghiệm thu tơm có dấu hiệu lờ đờ, bỏ ăn, ruột rỗng sau ngày cảm nhiễm với V parahaemolyticus Ngoài ra, mẫu cịn thu (3 con/bể) kết thúc thí nghiệm Mẫu mô cố định dung dịch Davidson’s AFA (theo tỉ lệ phần cơ/10 phần dung dịch Davidson’s) khoảng 48 sau chuyển sang cồn 70o (Lightner, 1996) Sau cố định, mẫu tôm cắt tỉa định hướng Trước tiến hành đúc khối mẫu khử nước qua dung dịch 70%, 80%, 95%, 100% ethyl alcohol xylen Sau mẫu cắt thành băng dài, cho vào nước nhiệt độ 45-50oC làm cho parafin căng dán lên lam Tiêu sau nhuộm với thuốc nhuộm Haematoxylin Eosin (H&E), quan sát chụp ảnh kính hiển vi vật kính 10X, 40X 100X PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Các nghiệm thức có cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus bổ sung LAB vào thức ăn mật số LAB tồn ruột tơm có khác biệt có ý nghĩa thống kê lẫn qua kỳ thu mẫu Đối với nghiệm thức VP+LAB3, mật số LAB ruột tôm giảm mạnh tôm chết hoàn toàn lần thu mẫu cuối Ở nghiệm thức VP+LAB1, mật số LAB ruột tôm thẻ cao lần thu mẫu thứ 1, 2,và thứ Các lần thu mẫu cịn lại có khuynh hướng giảm mật số LAB ruột tơm trì mức cao (Bảng 1) Số liệu thu thập xử lý phần mềm Excel SPSS 22.0 Số liệu tính tốn giá trị trung bình, độ lệch chuẩn phần mềm Excel, so sánh khác biệt nghiệm thức theo phương pháp phân tích ANOVA nhân tố nhân tố với phép thử Duncan thông qua phần mềm SPSS 22.0 mức ý nghĩa (p