TỔNG QUAN
Tăng acid uric máu
1.1.1 Sinh chuyển hóa acid uric
Khi thủy phân hoàn toàn acid nucleic (acid deoxyribo nucleic, acid ribonucleic) sẽ thu được các base (purin và pyrimidin), đường 5 carbon (ribose và deoxyribose) và phosphat Base purin gồm có adenin và guanin
Các nguyên tử của nhân purin được đánh số từ 1 - 9, trong đó đáng chú ý nhất là N9 - nơi liên kết với đường 5 carbon (pentose) [8]
- Sự thoái biến các purin có thể xảy ra ở mức độ base tự do, nucleosid và nucleotid Ở người, acid uric là sản phẩm cuối cùng của quá trình thoái biến purin [14]
- Các purin nucleotid đầu tiên bị tách nhóm phosphat dưới tác dụng của 5’- nucleotidase Từ adenylat (adenosin monophosphat) sẽ tạo thành adenosin, chất này tiếp tục khử amin thủy phân thành inosin bởi adenosin deaminase Inosin tiếp tục bị thủy phân tạo thành base hypoxanthin và Dribose Hypoxanthin tiếp tục bị oxy hóa thành xanthin rồi thành acid uric, bởi xanthin oxidase
- Thoái biến của guanosin monophosphat cũng tạo nên sản phẩm cuối là acid uric Guanosin monophosphat đầu tiên bị thủy phân tạo thành nucleosid là guanosin Guanosin bị phân cắt thành guanin, tiếp theo guanin khử amin thủy phân thành xanthin và biến đổi thành acid uric nhờ xanthin oxidase
- Ở người acid uric được đào thải ra nước tiểu Nó còn là sản phẩm bài tiết ở loài nguyên sinh, chim, loài nhai lại, côn trùng và một số động vật khác
1.1.2 Vai trò của enzym XO trong sinh chuyển hóa acid uric
XO là enzym có vai trò quan trọng trong việc hình thành acid uric
Acid uric là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa các nuleooprotein có chứa nhân purin trong cơ thể Các purin được tạo ra chuyển hóa thành hypoxanthin và xanthin, dưới tác dụng của XO, các hợp chất này bị oxy hóa thành acid uric Bất kì tác động nào ảnh hưởng đến hoạt động của XO cũng ảnh hưởng đến sự tạo thành acid uric [15] Qúa trình chuyển hóa base purin trong cơ thể được miêu tả trong Hình 1.1
Hình 1.1 Sơ đồ chuyển hóa purin
Dựa vào mối liên quan mật thiết giữa nồng độ acid uric máu và enzym
XO đối với bệnh gút, cho nên ức chế enzym XO là một trong những cơ chế chính mà các thuốc điều trị gút đang hướng tới
Tăng acid uric máu là khi nồng độ acid uric vượt quá giới hạn tối đa của độ hòa tan của urat trong dung dịch có cùng nồng độ natri như huyết tương, cụ thể là: > 420 àmol/L ở nam và > 360 àmol/L ở nữ [53]
Dựa trên cơ chế bệnh sinh, tăng acid uric có thể do:
- Tăng tổng hợp acid uric máu: có thể do ăn nhiều thức ăn có chứa purin, tăng tổng hợp purin nội sinh, tăng thoái biến nucleotid hoặc phối hợp
- Giảm bài tiết acid uric qua thận: có thể do giảm lọc ở cầu thận, giảm tiết urat ở ống thận hoặc phối hợp
- Phối hợp cả 2 nguyên nhân trên
Tăng tổng hợp acid uric máu:
- Tăng acid uric máu tiên phát: không rõ nguyên nhân, thiếu enzym hypoxanthin- guanin- phosphoribosyl- transferase (một phần hay toàn bộ), tăng hoạt tính enzym 5- phosphoribosyl- 1- pyrophosphat synthase
- Tăng acid uric máu thứ phát: ăn quá nhiều thức ăn chứa purin, tăng tái tạo nucleoid, tăng thoái hóa adenosin triphosphat, bệnh dự trữ glycogen, bệnh cơ nặng
Giảm bài tiết acid uric máu:
- Giảm bài tiết acid uric máu tiên phát: không rõ nguyên nhân
- Giảm bài tiết acid uric máu thứ phát: suy thận, ức chế bài tiết urat ở ống thận, tăng tái hấp thu urat ở ống thận
- Cơ chế xác định rõ: tăng huyết áp, cường chức năng tuyến cận giáp, một số thuốc làm tăng acid uric máu, bệnh thận do nhiễm độc chì
Tăng acid uric máu do nguyên nhân phối hợp:
- Lạm dụng rượu, thiếu oxy và giảm bão hòa oxy tổ chức, thiếu hụt glucose- 6- phosphat, thiếu hụt fructore- 1- phosphat- aldolase [4]
Tăng acid uric máu là nguyên nhân của nhiều bệnh lý, nó được biết đến là yếu tố nguy cơ quan trọng của bệnh gút, sự lắng đọng của các tinh thể urat ở khớp gây ra viêm khớp gút, ở thận nguy cơ dẫn đến sỏi thận và các bệnh lý thận Ngoài ra, tăng acid uric máu còn liên quan đến nhiều bệnh lý khác nhau
Một số nghiên cứu cho thấy tăng acid uric máu có liên quan đến bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu, tiền sản giật ở thai phụ, suy thận mãn tính, bệnh tim mạch nhất là bệnh mạch vành, tăng huyết áp nguyên phát ở trẻ em và người lớn, rối loạn lipit máu, xơ vữa động mạch cảnh, kháng insulin, đái tháo đường týp 2 [10]
Enzym XO và các chất ức chế enzym XO
Năm 1902, Schardinger tìm ra rằng, trong sữa có chứa một loại enzym có khả năng oxy hóa aldehyd axit, kèm theo việc giảm xanh methylen, enzym này sau đó enzym này thường được gọi là "Schardinger enzym" [48]
Năm 1922, Morgan và cộng sự tìm thấy trong sữa có chứa một loại enzym có khả năng oxy hóa xanthin và hypoxanthin, với mức giảm đồng thời của O2 đến H2O2, và enzym này được gọi là XO [29]
XO là một enzym có cấu trúc phức tạp, được xem là chìa khóa của chuyển hóa purin Là enzym xúc tác cho phản ứng chuyển hypoxanthin và xanthin thành urat Sự tăng XO liên quan đến nhiều cơ chế bệnh sinh nên hiểu biết về enzym, động học và kiểm soát enzym là thực sự cần thiết Tuy nhiên, do cấu trúc phức tạp và sự phân bố đặc biệt trong các mô, các chức năng của enzym này vẫn chưa được hiểu biết đầy đủ [29]
1.2.1 Enzym XO 1.2.1.1 Nguồn gốc, phân bố
Enzym XO được tìm thấy ở nhiều loài động vật có vú, chim, côn trùng và vi khuẩn [16] Trong các loài động vật có vú, XO được tìm thấy ở nhiều mô và cơ quan như gan, ruột, thận, tim, phổi, não, huyết tương nhưng nồng độ cao nhất là ở gan và ruột XO cũng được tìm thấy ở bề mặt các tế bào nội mô của bò, lợn nhà và cả bề mặt của tế bào nội mô gan chuột [16][29] Ở người, XO được tìm thấy trong hầu hết các tế bào của cơ thể, tuy nhiên nó có nhiều nhất trong tế bào gan và các tế bào ruột [11]
XO có khối lượng phân từ 290 kDa Bị ức chế bởi các ion kim loại nặng, ure cũng như rất nhiều purin, pyrimidin và các hợp chất dị vòng khác như purin-6-aldehyd, 2-amino-4-hydroxypteridin-6-andehyd pH tối ưu của
XO là 4,7 [7] EDTA, histidin được cho vào quá trình chiết xuất enzym để bảo vệ nó trong suốt quá trình phản ứng [42]
1.2.1.3 Cấu trúc và cơ chế hoạt động Cấu trúc
XO thuộc nhóm molypden-protein có chứa một molypden, một dinucleotid adenin flavin (FAD), các trung tâm của các loại ferredoxin trong mỗi hai tiểu đơn vị độc lập chứa hai sắt- lưu huỳnh (2Fe-2S) [11][13] Phần phụ molybden bao gồm một dẫn xuất pterin hữu cơ, 2 nguyên tử lưu huỳnh của molybdopterin, 2 nguyên tử oxi và 1 nguyên tử lưu huỳnh khác [29]
Hình 1.2 Cấu trúc enzym xanthin oxidase
XO xúc tác quá trình oxy hóa của hypoxanthin để thành xanthin và sau đó thành acid uric [18][20] Hoạt động này xảy ra tại trung tâm molybden của
XO Trong sự tái oxi hóa của XO, oxy phân tử đóng vai trò như chất nhận e, sản xuất gốc superoxid và hydrogen peroxid Trong các phản ứng này, các gốc superoxid anion (O2 -) và H2O2 được hình thành [35] Các gốc superoxid anion chuyển đổi tự nhiên hoặc dưới ảnh hưởng của enzym superoxid dismutase (SOD) chuyển đổi thành hydrogen peroxid và oxy Những phản ứng này có thể được viết như sau [26]:
Hypoxanthin + O + H O Xanthin + H O Xanthin + 2O + H O Acid uric + 2O + 2H Xanthin + O + H O Acid uric + H O
1.2.2 Các thuốc có tác dụng ức chế enzym XO
Hiện nay, gút trở thành một bệnh phổ biến và đã có nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm tìm ra các loại thuốc mới ứng dụng trong điều trị
Thuốc chống viêm và thuốc hạ acid uric máu là hai loại thuốc chính trong điều trị gút hiện nay Phần lớn các chỉ định điều trị theo 3 hướng và mục đích chính sau:
- Điều trị hạ urat, đó là nền tảng của điều trị gút, vì tăng acid uric máu là thủ phạm sinh lí bệnh học chính
- Điều trị hạ urat dự phòng để giảm thiểu cơn viêm gút cấp trong giai đoạn đầu điều trị
- Điều trị cơn gút cấp bằng kháng viêm thích hợp Bệnh nhân thường chỉ được điều trị cho cơn gút cấp mà không quản lí sự tăng acid uric máu cơ bản dẫn đến lắng đọng urat liên tục mà biểu hiện như bệnh cứng khớp, tổn thương khớp và viêm mãn tính [36] Thuốc chống viêm như colchicin hay NSAIDs được dùng chủ yếu điều trị gút cấp
Tuy nhiên, ở nghiên cứu này, đề cập chính đến sử dụng thuốc hạ acid uric máu để điều trị gút Có 2 con đường để giảm nồng độ acid uric máu trong cơ thể, một là tăng đào thải, hai là giảm tổng hợp acid uric Thuốc tăng đào thải acid uric có nhược điểm là tác dụng hạ acid uric không cao và dễ gây sỏi tiết niệu [50] Hiện nay, các nhà nghiên cứu chú ý đến cơ chế tổng hợp acid uric từ xanthin và hypoxanthin dưới xúc tác của XO và nhận ra rằng ức chế
XO sẽ ức chế quá trình tổng hợp acid uric và làm giảm nồng độ acid uric máu Đã có một số thuốc ức chế XO được sử dụng khá phổ biến trong trong lâm sàng
Allopurinol (1,5-dihydro- 4H-pyrazolo [3,4-d] pyrimidin-4-one) (Hình
1.3) bước đầu đã được tổng hợp với mục tiêu để tạo ra các tác nhân chống ung thư mới vào giữa năm 1950 bởi Falco, nhưng nó đã được tìm thấy có hoạt tính ức chế XO, giảm acid uric huyết thanh [5]
Hình 1.3 Cấu trúc hóa học Allopurinol
Tác dụng và cơ chế tác dụng:
Thuốc làm giảm nồng độ acid uric máu Ngoài ra, thuốc làm tăng bài xuất các tiền chất của acid uric qua nước tiểu [2]
Allopurinol ức chế XO, ngăn chặn sự tổng hợp urat từ xanthin và hypoxanthin do đó làm giảm acid uric máu Trong quá trình ức chế enzym
XO, Allopurinol được hydro hóa thành alloxanthin (oxypurinol), chúng phối hợp chặt chẽ với các trung tâm Mo đã bị khử tạo thành phức hợp không hoạt động [17] Ở nồng độ thấp, Allopurinol là cơ chất và là chất ức chế cạnh tranh của các enzym, ở nồng độ cao hơn, nó là chất ức chế không cạnh tranh [40]
Xét về dược động học, Allopurinol được hấp thu nhanh, đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương trong vòng 30 phút đến 60 phút sau khi uống Khi sử dụng Allopurinol, purin trong nước tiểu sẽ tồn tại ở 3 dạng acid uric và hypoxanthin và xanthin Mỗi chất có độ tan riêng do đó làm tăng lượng thải trừ purin qua nước tiểu, giảm nồng độ urat và acid uric máu Allopurinol làm giảm acid uric máu dưới độ tan giới hạn nên hòa tan các hạt tophi và ngăn ngừa sự tiến triển của viêm khớp mạn do gút [2]
Nở ngày đất (Gomphrena Celosiodes Mart.)
Nở ngày đất hay còn goi là Cúc bách nhật đất có tên khoa học là
Gomphrena Celosiodes Mart., họ Dền (Amranthaceae)
Theo các tài liệu [1], vị trí của chi Gomphrena trong hệ thống phân loại thực vật dược như sau:
Ngành Thực vật hạt kín Angiosperms
Lớp Thực vật hai lá mầm Eudicots
Phân lớp thực vật hai lá mầm Core eudicots
1.3.2 Đặc điểm thực vật và phân bố Đặc điểm thực vật
Cây thân thảo, sống lâu năm, cao 40-50 cm, mọc nằm hoặc đứng, phân nhánh nhiều, rễ cái to Thân có rãnh sâu, có lông nằm Lá không có cuống, có nhiều lông màu trắng nằm ở mặt dưới Cụm hoa hình trụ rộng 1 cm, dài 2-3 cm, lá bắc 5-6 mm Hoa trắng, 5 lá đài, 5 nhị dính thành ống, bầu hình trứng, quả hộp chứa nhiều hạt màu nâu [1]
Gomphrena Celosiodes Mart có nguồn gốc từ châu Mỹ, phát triển trên một số nước như Argentina, Bolivia, Brazil, Paraguay, Uruguay Được du nhập sang châu Á (Bhutan, Indonesia, Philippines, Singapore, Sri Lanka, Papua New Guinea, Taiwan, Thailand), châu Phi (Botswana, Ghana, Lesotho, Namibia, RSA, Swaziland) và Úc
Tại Việt Nam, tìm thấy Gomphrena Celosiodes Mart mọc rải rác ở khắp mọi nơi, nhưng tập trung chủ yếu là các tỉnh miền trung, Tây Nguyên và Tây Nam Bộ
Theo wikipedia Nở ngày đất chứa nhiều flavonoides glycosidea, flavones, gomphrenol giúp làm giảm các triệu chứng sốt, cảm cúm do virut gây ra, giúp ức chế các acid uric trong máu, thải trừ độc tố
Tại Ấn Độ, kết quả công trình nghiên cứu về tác dụng dược lý của
Gomphrena Celosiodes Mart của 2 nhà khoa học Neha Sharma và Rekha Vijayvergia đã chỉ ra rằng trong dịch chiết chứa nước và cồn của cây Nở ngày đất có chứa tinh bột, protein và phenol Nghiên cứu này đã chứng minh khả năng kháng khuẩn của cây Nở ngày đất trên 3 chủng vi khuẩn Escherichia coli, Pseudomonas aeroginosa và Staphylococcus aureus [49]
Tại Mỹ và Brazil, Ebana và cộng sự cũng đã có nghiên cứu chỉ ra dịch chiết nước và cồn của cây Nở ngày đất có chứa alkaloid, sapoin, tannin, glycosid, steroid, đường đơn và terpen Còn De Moura và cộng sự cho thấy,
Nở ngày đất còn có chứa nhóm flavonoid và amino acid, những hợp chất phytochemical này có khả năng thâm nhập vào các vách tế bào nấm, làm tăng tác động ức chế sử tăng trưởng của nhiều chủng loại nấm [6]
Theo tài liệu y học cổ truyền Việt Nam
Cây Nở ngày đất chỉ được dùng trong phạm vi dân gian chữa ho, cảm cúm do viruts gây ra, giúp ức chế các Acid uric trong máu, thải các độc tố ra ngoài, cây được dân gian sử dụng phổ biến và cũng chính từ bài thuốc đó mà khoa học đã tìm ra dược tính từ cây ra làm thuốc Trong dân gian, một số người đã sử dụng tinh dầu từ lá giúp tán phong, tiêu viêm tốt cho phụ nữ sau sinh Hiện nay, trên thị trường, cây Nở ngày đất được bày bán khá nhiều với công dụng điều trị gút [6]
Theo các tài liệu hiện nay
Khả năng kháng khuẩn: Nở ngày đất có tác dụng kháng một số vi khuẩn gram dương như: Aspergillus niger với dòng vô khuẩn lớn nhất trong điều kiện chuẩn là 25 ± 0,33; Sacccharomyces cerevisiae là 25 ± 0; Bacillus cereus là 44 ± 0,234; B.megaterium là 44 ± 0,33; Staphylococcus aureus 44 ±
0,370 Với gram âm chúng tác dụng tốt với Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Shigella boydii, Sh Dysenteriae, Mimicus Vibro, Vibro parahaemolyticus, S.paratyphi và cả với nấm Candida albicans
Do vậy, cây Nở ngày đất có thể dùng cho viêm nhiệt mồm miệng, tưa lưỡi trẻ em, đắp mụn nhọt [6]
Khả năng chống oxy hóa: với dịch chiết thô cây nở ngày đất bằng chloroform, n-hecxan, cacbon tetrachclorid thì chiết với hecxan hiệu ứng chống oxy hóa là mạnh nhất, thanh lọc cơ thể tốt nhất [6]
Ngoài ra, cũng có nghiên cứu đã chỉ ra tác dụng kháng nấm và diệt giun sán ở cây Nở ngày đất [6]
Hiện nay, cây Nở ngày đất được bày bán khá nhiều trên thị trường với công dụng điều trị gút, tuy nhiên vẫn chưa có nghiên cứu nào chứng minh về công dụng này Vì thế nhóm nghiên cứu chúng tôi quyết đinh tiến hành đề tài nhằm đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của dịch chiết từ cây Nở ngày đất.
Các phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro
Để đánh giá tác dụng ức chế XO, cần so sánh hoạt độ của enzym trong môi trường có và không có chất khử Dựa vào các nguyên tắc sau:
Dựa vào sự giảm của các tác nhân oxi hóa
Dựa vào độ giảm cơ chất hay sự tạo thành của sản phẩm như acid uric [23][47]
1.4.1 Phương pháp đo quang 1.4.1.1 Phương pháp đo quang dựa trên định lượng acid uric
Phương pháp đo quang dựa trên lượng acid uric tạo thành từ quá trình oxy hóa xanthin dưới tác dụng xúc tác của XO theo phản ứng:
Sau đó xác định hoạt độ XO từ lượng acid tạo thành được đo ở bước sóng 290 nm ở 25 o C, pH= 7,5 hoặc pH= 8,0 Một đơn vị enzym được định nghĩa là tổng lượng enzym sản xuất ra một 1 àmoL acid uric trong mỗi phỳt ở nhiệt độ 25 o C [44]
Quy trình đo thường được áp dụng với hỗn hợp thử bao gồm dung dịch đệm và dung dịch enzym trong đệm được ủ trong 15 phút ở 37ºC Sau đó, thêm dung dịch cơ chất (xanthin) Tiếp tục ủ trong 30 phút ở nhiệt độ 37ºC
Dừng phản ứng bằng acid HCl 1N Mẫu trắng chuẩn bị tương tự nhưng enzym cho vào sau khi đã cho HCl Tiến hành đo quang để xác định độ hấp thụ của từng mẫu [44]
+ Ưu điểm: thuận tiện, nhanh và nhạy đối với enzym tinh khiết (thường dùng trong in vitro) [30]
+ Nhược điểm: không thể áp dụng phương pháp này để đo hoạt độ enzym trong tổ chức vì có sự có mặt của uricase Có thể khắc phục hạn chế này bằng cách cho vào hỗn hợp thử kali oxanat 0,1 mM, acid uric tạo thành sẽ không bị ảnh hưởng bởi uricase [30]
1.4.1.2 Phương pháp đo quang dựa trên chất ABTS (2,2’-azino-di(3- ethylbenzthiazolin-6-sulphonat)
Phương pháp đo quang sử dụng ABTS (2,2’-azino-bis (3- ethybenzothiazolin-6-sulphonat) Đây là một phương pháp mới sử dụng chất màu ABTS như một chất hấp thụ mật độ quang thông qua việc sử dụng 2 enzym uricase và peroxidase Dựa trên nguyên tắc phản ứng:
Hypoxanthin + 2H O + 2O Acid uric + 2H O Acid uric + O Allantoin + H O + CO
Từ lượng ABTSOX tạo thành đo quang ở bước sóng 410 nm xác định được hoạt độ XO
+ Ưu điểm: Phương pháp này có độ nhạy khá cao, có thể xác định được hoạt độ lên tới 20 U/mL và có thể áp dụng cho các bệnh lý huyết thanh khác
1.4.2 Phương pháp đo áp Để xác định hoạt độ enzym có thể đánh giá sự khử của các chất nhận electron là oxy, xanh methylen và cytochrom C Phương pháp dựa trên nguyên tắc đo tỉ lệ oxy tiêu thụ với cơ chất xanthin, oxy ở 37 o C [23]
Quy trình đo được áp dụng với hỗn hợp gồm một lượng gan đã được làm đồng nhất và ướp lạnh, đệm phosphat pH 8,6, dung dịch natri xanthat, dung dịch KOH Oxy tiêu thụ được đo áp ở 37 o C [23]
1.4.3 Phương pháp đo sử dụng HPLC với detector huỳnh quang
Nguyên tắc dựa trên phản ứng oxy hóa 2-amino-4-hydroxypteridin (AHP) thành isoxanthopterin (IXP) dưới sự xúc tác của XO Lượng IXP tạo ra được đo bởi hệ thống HPLC sẽ tỉ lệ với hoạt độ XO [47]
Trên thực nghiệm, có thể tiến hành phương pháp này như sau: hỗn hợp phản ứng gồm đệm phosphat, dung dịch AHP, dung dịch 2,6- diclorophenonlindophenol natri, enzym và nước đủ thể tích, hỗn hợp được ủ trong 10 phút ở 37 o C, dừng phản ứng bằng HClO4 và làm lạnh trong 10 phút
Phổ huỳnh quang kích thích và phát xạ của IXP được đo ở 343 nm, 410 nm
+ Ưu điểm đơn giản và nhạy (nhạy hơn phương pháp huỳnh quang thông thường khoảng 100 lần) Mặt khác, hỗn hợp phản ứng được phân tích trực tiếp bởi HPLC không cần phải tách IXP như trong phương pháp phóng xạ [47]
1.4.4 Một số phương pháp khác
Xác định hoạt động enzym bằng cách định lượng H 2 O 2 được tạo ra trong quá trình hydroxyl hóa xanthin bởi XO Flavin được khử phản ứng với
O2 tạo thành H2O2 Đo oxy tiêu thụ: Phản ứng xanthin/XO được nghiên cứu bằng cách đo thời gian liên tục của oxy sử dụng bằng 1 điện cực chọn lọc [16].
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Nguyên liệu là cây Nở ngày đất được thu hái tại Quảng Ngãi vào tháng
7 năm 2016, rửa sạch, sấy khô ở 50 o C đến khối lượng không đổi và bảo quản trong túi nilon
Mẫu nghiên cứu được Bộ môn Dược liệu & Dược học cổ truyền, Khoa
Y Dược giám định tên khoa học là Gomphrena Celosiodes Mart., họ Dền (Amranthaceae) Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Bộ môn Dược liệu & Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội
Hình 2.1 Cây Nở ngày đất
2.1.2 Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu
Chuẩn bị dịch chiết toàn phần ethanol
Cây Nở ngày đất (0,5 kg) sau khi rửa sạch, phơi khô được tiến hành chiết xuất bằng dung môi ethanol 80% (3 lít x 3 lần) sử dụng thiết bị siêu âm ở 40 o C trong vòng 2 giờ Gộp các dịch chiết ethanol sau đó lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không thu được cao chiết tổng ethanol (30 g)
Chuẩn bị các phân đoạn dịch chiết
Cao chiết được phân tán vào nước cất tỷ lệ 1:1 và chiết phân bố lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, ethyl acetat và n- Butanol (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 300 mL) Các phân đoạn được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được thu được phân đoạn tương ứng là n- hexan, EtOAc và n-BuOH
Quy trình chiết xuất dược liệu được thể hiện ở Hình 2.2
Chiết EtOH 80% (3lít x 3 lần), 40 o C/ 3h Lọc dịch chiết, cô chân không
Chiết lần lượt n-hexan, EtOAc, BuOH, cô chân không
Hình 2.2: Quy trình chiết xuất dược liệu.
Phương tiện nghiên cứu
2.2.1 Hóa chất và thuốc thử
- Thuốc đối chứng: Allopurinol (300mg ) của hãng Sigma
Nở ngày đất ( Gomphrena Celosiodes Mart.) (0,5 kg)
- Enzym Xanthin oxidase (từ sữa bò, 1 U/mg protein, 7,6 mg protein/mL) của hãng Sigma
- Dimethyl sulfoxid (DMSO) của hãng Meck
- Hóa chất pha đệm phosphat: Na 2 HPO4.12H2O, NaH2PO4.2H2O
- Các hóa chất, dung môi khác đạt tiêu chuẩn phân tích theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV
2.2.2 Thiết bị và dụng cụ
- Máy đo quang UV Aligent technologies Cary 60 UV-VIS, Mỹ
- Máy đo pH HANNA HI8314, Mỹ
- Cân phân tích AY 220 của hãng Shimadzu, Nhật Bản
- Máy cô quay của hãng Shimadzu, Nhật Bản
- Máy khuấy từ của hãng Shimadzu, Nhật Bản
- Máy ly tâm của hãng Shimadzu, Nhật Bản
- Micro pipet một đầu kờnh 2-20àL, 10-100àL, 100-1000àL
- Micro pipet đa kờnh 30-100àL
- Các dụng cụ khác sử dụng trong thực nghiệm: ống nghiệm, đầu côn, micro tube các loại, pipet, bình thủy tinh, cốc có mỏ, đũa thủy tinh
Nội dung nghiên cứu
Để đạt được những mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra, đề tài nghiên cứu được thiết kế với các nội dung sau:
Thực hiện mục tiêu 1: Triển khai mô hình đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro của dược liệu
- Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzym XO và cơ chất xanthin lên sự hình thành acid uric để lựa chọn nồng độ enzym và cơ chất thích hợp
- Nội dung 2: Thẩm định phương pháp thông qua đánh giá tác dụng của Allopurinol
Thực hiện mục tiêu 2: Đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiếtcủa cây Nở ngày đất
- Nội dung 1: Định tính flavonoid trong dịch chiết ethanol toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ cây Nở ngày đất
- Nội dung 2: Đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ cây Nở ngày đất.
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Nghiên cứu triển khai mô hình đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của dược liệu Nguyên tắc:
Nguyên tắc của phương pháp dựa trên sự tạo thành acid uric từ xanthin nhờ xúc tác của enzym XO Thí nghiệm được tiến hành dựa trên phương pháp của M Umamaheswari và của Đái Thị Xuân Trang có điều chỉnh để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm [9][52] Nguyên tắc định lượng dựa trên phản ứng sau:
Hoạt độ XO được xác định thông qua lượng acid uric tạo thành được đo ở bước sóng 295 nm ở 37 o C, pH 7,5 hoặc 8,0 Một đơn vị enzym được định nghĩa là tổng lượng enzym sản xuất ra 1 àmoL acid uric trong mỗi phỳt ở nhiệt độ 37ºC
2.4.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzym XO và cơ chất xanthin lên sự hình thành acid uric
Thử nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzym XO và cơ chất xanthin lên sự hình thành acid uric được tiến hành tại bộ môn Dược lý- Dược lâm sàng, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội
100mL xanthin 1000 mM được pha trong 10 giọt NaOH 1M, sau đó đem pha loãng trong dung dịch đệm phosphat (50 mM, pH 7,5) để được các nồng độ khác nhau Enzym XO được pha loãng thành các nồng độ 0,2; 0,1;
0,05; 0,025 và 0 U/ml trong dung dịch đệm phosphat (50 mM, pH 7,5) sau đó thêm vào phản ứng (nồng độ 0 U/mL được dùng để đối chứng) Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37°C trong 30 phút Lượng acid uric tạo ra được xác định bằng cách đo ở bước sóng 295 nm Thí nghiệm được bố trí theo bảng 2.1
Bảng 2.1 Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzym XO và cơ chất xanthin lên sự hình thành acid uric
2.4.1.2 Thẩm định phương pháp thông qua đánh giá tác dụng của Allopurinol
Thử nghiệm Thẩm định phương pháp thông qua đánh giá tác dụng của Allopurinol được tiến hành tại bộ môn Dược lý- Dược lâm sàng, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội
50g Allopurinol được pha loãng trong dung dịch đệm phosphat (50 mM, pH 7,5) để được cỏc nồng độ khỏc nhau là: 0,05 àg/mL, 1,25 àg/mL, 2,5 àg/mL, 5 àg/mL, 10 àg/mL, 12,5 àg/mL
100 àL dung dịch mẫu Allopurinol, 300 àL dung dịch đệm phosphat 50
Mm cú pH = 7.5, 100 àL dung dịch enzym XO (0,2 U/mL trong dung dịch đệm phosphat (pha ngay trước khi tiến hành phản ứng), 100 àL nước cất Hỗn hợp này được ủ ở 37 o C trong 15 phỳt, sau đú thờm 200 àL xanthin (0,15 mM) trong dung dịch đệm rồi ủ tiếp 30 phút Dừng phản ứng bằng cách thêm 200 àL HCl 0,5M Hỗn hợp phản ứng được đem đo độ hấp thụ bằng mỏy đo quang phổ ở bước sóng 295 nm Mẫu chứng được tiến hành tương tự nhưng dung dịch thử Allopurinol được thay bằng dung dịch đệm
2.4.2 Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym XO in vitro của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết của cây Nở ngày đất
2.4.2.1 Định tính flavonoid của dịch chiết ethanol toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ cây Nở ngày đất
Dịch chiết ethanol toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ cây Nở ngày đất được tiến hành các phản ứng hóa học đặc trưng để xác định sự có mặt của flavonoid
Phản ứng Cyanidin: cho vào ống nghiệm nhỏ 1mL dịch chiết Thêm một ít bột Magie kim loại (khoảng 10 mg) Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3-5) giọt Để yên vài phút rồi quan sát
Phản ứng với kiềm: cho vào ống nghiệm nhỏ 1 mL dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% Thấy tủa, thêm 1 mL nước cất, tủa bị tan và màu dung dịch đậm hơn Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút, sẽ thấy màu của dịch chiết được tăng lên
Phản ứng với FeCl 3 : cho vào ống nghiệm nhỏ 1 mL dịch chiết Thêm vài giọt dung dịch FeCl 3 5% thấy xuất hiện tủa xanh đen
Phản ứng diazo hóa: cho vào ống nghiệm nhỏ 1 mL dịch chiết Thêm vào đó 2 mL dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy đến sôi rồi để nguội Cho vài giọt thuốc thử diazo thấy xuất hiện đỏ gạch
2.4.2.2 Đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của dịch chiết ethanol toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ cây Nở ngày đất
Chuẩn bị hóa chất cần thiết
- Enzym: XO với các dung dịch có hoạt độ khác nhau trong đệm phosphat
- Cơ chất: dung dịch xanthin 150àM trong đệm phosphat
- Hóa chất dừng phản ứng: dung dịch HCl 0,5N
- Dung dịch Allopurinol 0,5 àg/mL
- Mẫu thử: cao dược liệu được hòa tan trong DMSO Sau đó được pha với đệm đến cỏc nồng độ 5 àg/mL, 10 àg/mL, 25 àg/mL, 50 àg/mL, 100 àg/mL dựng cho thớ nghiệm
Thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của cây Nở ngày đất được tiến hành tại Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuẩn bị mẫu thử: Cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết của cây
Nở ngày đất được pha trong DMSO tạo thành dung dịch gốc có nồng độ 10 mg/mL Sau đó dung dịch gốc này được pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat thành cỏc nồng độ 5 àg/mL, 10 àg/mL, 25 àg/mL, 50 àg/mL, 100 àg/mL
Phương pháp xử lí số liệu
Các số liệu nghiên cứu được lưu trữ và xử lý thống kê sử dụng phần mềm Microsoft Office Excel 2007 và phần mềm SigmaPlot 10.0 (Systat Software Inc, Mỹ)
Số liệu được biểu diễn dưới dạng X ± SD (X: giá trị trung bình; SD: độ lệch chuẩn)
Giá trị IC 50 được tính dựa vào đồ thị và phương trình biểu diễn nồng độ và giá trị ức chế enzym XO của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ cây Nở ngày đất.
