LUẬN văn THẠC sĩ đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinsterase in vitro của các phân đoạn dịch chiết hoàng liên ô rô (mahonia nepalensis DC , họ berberidaceae)

TỔNG QUAN

Bệnh Alzheimer

1.1.1 Tổng quan về bệnh Alzheimer

Tại cuộc họp lần thứ 37 của Hiệp hội các nhà tâm thần học vùng Tây Nam nước Đức vào ngày 3 tháng 11 năm 1906 tại Turbingen, ông Alois Alzheimer đã lần đầu tiên mô tả đặc điểm lâm sàng và giải phẫu thần kinh học của một căn bệnh sa sút trí tuệ (dementia) ở một bệnh nhân nữ 51 tuổi, Auguste Deter Sau khi bệnh nhân tử vong, Alois Alzheimer đã lấy mẫu sinh thiết (biopsy) não bộ và tìm ra những dấu hiệu bất thường là những mảng lão hóa β- amyloid (plaque) ở ngoài tế bào thần kinh và những đám rối (tangle) ở trong tế bào thần kinh Mảng và đám rối là những protein bất thường không tan được, lắng đọng ở các tế bào thần kinh và ảnh hưởng đến sự hoạt động của chúng Mảng và đám rối hiện nay là thước đo vàng để chẩn đoán bệnh Alzheimer Năm 1910, Kraepelin đã lấy tên ông đặt cho tên bệnh – bệnh Alzheimer trong tái bản lần thứ 8 bài viết Tâm thần học (Psychiatrie) của mình [61] Alzheimer công bố thêm ba trường hợp vào năm 1909 và một trường hợp biến thể (Josef F.) chỉ xuất hiện mảng bám (Plaque – only) vào năm 1911 Từ hai trường hợp Auguste và Josef, ông đã chỉ ra mảng bám cũng như đám xơ rối là các giai đoạn khác nhau của cùng một quá trình phát triển bệnh lý [46]

1.1.2 Dịch tễ học và các yếu tố nguy cơ

Theo ước tính trên toàn thế giới số lượng người bị sa sút trí tuệ là 24 triệu trong năm 2005, ước tính lên đến 81 triệu trường hợp vào năm 2040

[41] Bệnh Alzheimer là nguyên nhân phổ biến nhất của chứng mất trí ở hầu hết các quốc gia, chiếm khoảng hai phần ba các trường hợp Trong nước Mỹ, ước tính có khoảng 5,4 triệu người mắc bệnh Alzheimer Tỷ lệ mắc bệnh của bệnh Alzheimer tăng dần theo tuổi, 96% là từ 65 tuổi trở lên Chi phí cho việc chăm sóc sức khỏe, chăm sóc dài hạn, và các dịch vụ viện chăm sóc đặc biệt ở nước Mỹ được ước tính 200 tỷ USD mỗi năm [22] Việt Nam có khoảng hơn

9 triệu người bị sa sút trí tuệ mà dạng bệnh điển hình là Alzheimer [9] Yếu tố di truyền và không di truyền đều có liên quan với nguy cơ mắc bệnh Alzheimer

Tăng huyết áp tâm thu và tăng cholesterol máu sẽ có nguy cơ cao bị Alzheimer hơn những người bình thường [18] Hội chứng Down: người bị chứng này sẽ bị Alzheimer khi sống đến 40 tuổi và những bà mẹ sinh con bị Down sẽ có nguy cơ cao bị Alzheimer [18]

1.1.2.1 Các yếu tố nguy cơ di truyền

Yếu tố di truyền đến nay đã được xác nhận là một trong các nguyên nhân gây bệnh Alzheimer Yếu tố di truyền được thấy ở 5% các bệnh nhân Alzheimer và là bệnh Alzheimer khởi phát sớm Tuy nhiên, do tác động của môi trường dẫn đến sự khác nhau về tuổi khởi phát bệnh cũng như biểu hiện các triệu chứng trong gia đình người mang các biến dị nhiễm sắc thể gây bệnh Alzheimer Những đột biến gây bệnh liên quan đến thay thế một nucleotide trong chuỗi DNA (đa hình nucleotide đơn) bao gồm các gen xác định mã hóa các protein amyloid precursor (gen APP trên nhiễm sắc thể 21), và hai protein presenilin (presenilin 1, mã hóa bởi gen PSEN1 trên nhiễm sắc thể số 14; presenilin 2, từ gen PSEN2 trên nhiễm sắc thể số 1) Các presenilin tạo thành một phần của enzym gamma-secretase, tham gia vào sự phân tách các protein amyloid precursor Những đột biến này làm tăng cường sản xuất Aβ, tỷ lệ tương đối của Aβ42 so với Aβ40, hoặc các dạng sợi nhỏ của Aβ Những đột biến di truyền này rất hiếm gặp, chỉ chiếm khoảng 13% các trường hợp thường khởi phát sớm [25]

Các biến thể ε4 (alen) của gen mã hóa apolipoprotein E (APOE), nằm trên nhiễm sắc thể 19, cũng là yếu tố nguy cơ di truyền cho bệnh khởi phát muộn Alzheimer Nó ảnh hưởng đến nguy cơ mắc bệnh xuất hiện sớm Ở những người châu Âu, tần số của các allele ε4 là khoảng 14% Trong não, apolipoprotein E vận chuyển lipid trong thời gian sửa chữa tế bào thần kinh

[51] Vì cơ chế đó chưa rõ ràng, Aβ tăng lên trong não của những người mang alen ε4 Những người có kiểu gen ε3/ε4 có nguy cơ mắc bệnh Alzheimer cao hơn gấp khoảng ba lần khi so sánh với kiểu gen phổ biến hơn ε3/ε3 Tuy nhiên, có một sự khác biệt về giới tính, phụ nữ mang alen ε4 đối mặt với nguy cơ cao hơn nam giới mang alen ε4 [28,40] Các alen ε2 ít phổ biến hơn nên nguy cơ thấp hơn APOE thường được coi như là một gen nhạy cảm làm tăng nguy cơ, nhưng nó cũng được mô tả là một gen trội không hoàn toàn Sự gia tăng nguy cơ tương đối các alen ε4 hiện rõ nhất giữa khoảng tuổi 65 và 80, ở tuổi 65 có nguy cơ ít hơn đối với bệnh mất trí nhớ và nguy cơ xuất hiện sớm bệnh Alzheimer sau 80 tuổi [42]

1.1.2.2 Các yếu tố nguy cơ không di truyền

Tuổi là yếu tố nguy cơ quan trọng nhất đối với bệnh Alzheimer Ở người trên 60 tuổi, cả tỷ lệ mắc chung và tỷ lệ mắc mới bệnh Alzheimer ước tính tăng gấp đôi cứ sau 5-6 năm: ở nhóm tuổi 65-69 số người bị bệnh là 2%; ở nhóm tuổi 80-85 số người bị bệnh là 30-40% [67]

Giới tính cũng là một yếu tố nguy cơ quan trọng Phụ nữ có nguy cơ mắc bệnh Alzheimer cao hơn khoảng 1,5-2 lần so với nam giới Phần lớn của sự khác biệt này là do thực tế tuổi thọ của phụ nữ dài hơn Tại Hoa Kỳ, sự khác biệt là khoảng 5 năm [23,67]

Nghiên cứu gần đây đã cho thấy một mối quan hệ nghịch đảo giữa bệnh ung thư và bệnh Alzheimer [56] Có thể suy đoán rằng các quá trình sinh hóa thúc đẩy thoái hóa thần kinh và tế bào chết sẽ được chống lại bởi các quá trình và con đường tín hiệu thúc đẩy sự tăng sinh tế bào bất thường

Sự bắt đầu của bệnh thường rất từ từ nên thường khó có thể ghi nhận được chính xác thời gian khởi phát bệnh Tiến triển chậm, do vậy bệnh nhân vẫn duy trì được các năng lực xã hội cho đến giai đoạn toàn phát Thường là bệnh nhân không nhận biết được những thay đổi bệnh lý của mình ở giai đoạn này [18]

Bệnh cảnh lâm sàng là một hội chứng sa sút trí tuệ điển hình và tiến triển của bệnh có thể được chia thành 3 giai đoạn chính như sau:

Thường kéo dài 2 – 3 năm, được đặc trưng bởi các triệu chứng: suy giảm trí nhớ, giảm hiệu suất trong giải quyết các công việc thường ngày, rối loạn định hướng không gian Đồng thời có thể có các khí sắc rõ rệt dẫn đến trạng thái bất an, bồn chồn, đứng ngồi không yên, dễ bị kích thích, hoặc ngược lại dẫn đến bàng quan, sững sờ, trầm cảm từ giai đoạn sớm của bệnh

Suy giảm trí tuệ diễn ra nhanh chóng, rõ rệt Nhân cách của người bệnh cũng bắt đầu có những biến đổi Thường gặp các triệu chứng biểu hiện tổn thương thùy đỉnh: rối loạn ngôn ngữ, rối loạn tri giác, rối loạn hành vi, thay đổi tính cách Các rối loạn ngoại tháp đặc trưng là rối loạn tư thế, dáng điệu, tăng trương lực cơ và đặc biệt các triệu chứng giống Parkinson thấy có ở gần 2/3 các bệnh nhân Alzheimer

Giai đoạn cuối cùng Bệnh nhân có thể nằm liệt giường, rối loạn đại tiểu tiện, các triệu chứng loạn thần (hoang tưởng, ảo giác,…) thường xuất hiện rõ rệt trong bệnh cảnh lâm sàng Có thể xuất hiện các rối loạn thần kinh như liệt nhẹ nửa người co cứng, bệnh nhân nằm co quắp, run tay chân, có các phản xạ nắm, mút Các cơn động kinh toàn thể (cơn lớn) gặp trong nhiều trường hợp Sút cân nhanh chóng mặc dù vẫn duy trì ăn ngon miệng

Kết quả chẩn đoán bệnh Alzheimer sẽ làm thay đổi cuộc sống của cả bệnh nhân và gia đình họ Cho tới thời điểm hiện tại, vẫn chưa có loại thuốc nào có thể chữa khỏi bệnh Alzheimer mà chỉ có thể giúp làm chậm tiến triển của bệnh và làm giảm một số triệu chứng

Acetylcholin, enzym acetylcholinsterase và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer

của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer 1.2.1 Acetylcholin

Acetylcholin (ACh) được tìm thấy ở động vật có xương sống, động vật chân khớp; và là một trong những chất chính mà nhờ đó xung điện được truyền giữa các tế bào thần kinh với nhau hoặc từ tế bào thần kinh tới cơ vân và cơ trơn ACh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1867 dưới dạng một chất tổng hợp và được phát hiện trong cơ thể người năm 1906 từ dịch chiết tuyến thượng thận [15]

Trong những năm gần đây, ACh được chứng minh có liên quan tới nhiều chức năng khác bên cạnh chức năng dẫn truyền thần kinh Trong đó, ACh được xem là có liên quan đến sự tiến triển của bệnh viêm dây thần kinh và quá trình sản sinh sợi amyloid, những đặc điểm điển hình được thấy trong tế bào não của bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer [15]

1.2.1.2 Quá trình sinh tổng hợp Acetylcholin

Acetylcholin được tổng hợp bắt đầu với phản ứng của choline với acetate (hình1.1) trong tế bào thần kinh Acetate được kích hoạt bởi coenzym

A và nó trở thành Acetyl Co-enzym A Phản ứng giữa Acetyl Co-enzym A và choline được xúc tác bởi enzym choline transferase ACh sau khi được tổng hợp, được lưu giữ ở vị trí cuối dây thần kinh, trong các túi (bóng synap) Các chất trong túi được giải phóng khi vị trí cuối dây thần kinh bị khử cực và khi đó ACh được giải phóng vào khe synap và gắn với thụ thể ACh sau khi được giải phóng có thời gian bán thải rất ngắn vì sự có mặt của AChE Đây là enzym thủy phân dây nối este trong phân tử ACh tạo ra cholin và acid acetic

Cholin sau đó được thu nhận lại vào tế bào thần kinh để tổng hợp ACh Do đó, những chất có tác dụng ức chế AChE sẽ kéo dài thời gian tồn tại và thời gian tác dụng của ACh [15]

Hình 1.1 Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp Acetylcholin [15]

Receptor acetylcholin được chia thành hai loại chính dựa trên đặc tính dược lý: receptor muscarinic và receptor nicotinic Receptor nicotinic acetylcholin (nAChRs) là tuýp phụ của receptor acetylcholin và là thành viên của siêu họ các receptor kênh ion [31] Kết hợp các pentamer của nhiều tiểu đơn vị α và β tạo thành một lượng lớn các receptor nicotinic trong não Các nAChRs đóng vai trò quan trọng trong nhiều chức năng sinh lý và bệnh lý

Một lượng lớn các nAChRs có mặt tại tế bào thần kinh trong hệ thần kinh trung ương, nơi chúng tham gia vào quá trình kết nối chức năng nhận thức với trí nhớ, điều khiển hoạt động của cơ và giảm đau [32], tăng cường sự tập trung, kích thích và nhận cảm giác quan Não được coi là trung tâm của sự hình thành bộ nhớ và lưu trữ rất giàu nAChRs Nicotin và các chất chủ vận nAChRs khác tăng cường nhận thức và trí nhớ, trong khi tổn thương ở những vùng giàu nAChRs làm suy yếu hình thành trí nhớ Tương tự như vậy đầu vào của các nAChRs để dẫn truyền thần kinh cholinergic có vai trò đáng kể của các nAChRs ở trước và sau synap như autoreceptors và hetroreceptors điều tiết sự giải phóng tại khe synap của acetylcholin và các chất dẫn truyền thần kinh khác như dopamine, norepinephrine, serotonin, glutamate và γ-amino- butyric acid Do ảnh hưởng điều biến của chúng trên hệ dẫn truyền thần kinh, các nAChRs là mục tiêu mang lại lợi ích tiềm năng cho việc quản lý các cơn đau của bệnh động kinh và các hội chứng tâm thần và thoái hóa thần kinh như bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson, Schizopherenia, lo âu, trầm cảm và điều trị cai nghiện thuốc lá [33,34]

Hình 1.2 Ba vị trí hoạt động trên bề mặt enzym của acetylcholin [31]

AChE là một enzym xúc tác cho phản ứng chuyển hóa, thủy phân của chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin, từ đó làm ngừng lại sự hoạt động của chúng tại các khe synap cholinergic ở cả thần kinh trung ương và ngoại biên

AChE là một enzym gắn vào màng sau synap bằng kiên kết cộng hóa trị với nhóm glycolipid Enzym này có số quay vòng hoạt động rất nhanh vì nó đã đạt tới sự hoàn thiện về động học xúc tác, có giá trị kcat/km là 2x10 8 M -1 S -1 Hiệu lực xúc tác cao của AChE cho phép các synap truyền đi thế năng hoạt động với tần số lớn [39]

Cấu trúc không gian ba chiều của enzym AChE được xác định lần đầu tiên vào năm 1991 Trung tâm hoạt động xúc tác phản ứng thủy phân của enzym có cấu tạo gồm 500 acid amin nằm sâu trong cấu trúc và bị ẩn ở dưới đáy của một rãnh hẹp và sâu, cách bề mặt 20 A o Khi nghiên cứu cấu trúc của enzym này người ta thấy rằng cấu trúc của trung tâm hoạt động cũng tương tự như cấu trúc của enzym xúc tác phản ứng thủy phân α/β – hydrolase [39]

Quá trình thủy phân ACh được xúc tác bởi AChE diễn ra ở đáy của hẻm enzym theo cơ chế khá phức tạp AChE là một trong những enzym thủy phân nhanh nhất Hoạt tính của nó mạnh gấp khoảng 10 lần so với serin protease hoặc butyrylcholinesterase ở cùng điều kiện nhiệt độ và pH [47]

Hai đặc tính của enzym AChE là khả năng xúc tác cho phản ứng thủy phân ACh xảy ra nhanh, và khả năng khu trú tác dụng của nó tại các synap thần kinh cholinegic Các chất dẫn truyền thần kinh được đưa đến các khe synap trong các bóng synap Khi đến màng trước synap, ACh được giải phóng vào khe synap, tại đó nó liên kết với các receptor, tiếp đó enzym AChE sẽ thủy phân ACh tạo thành choline và acid acetic Choline được bơm trở lại màng trước synap nhờ chất mang và được tái sử dụng cho quá trình tổng hợp tiếp theo Tuy nhiên khi có chất đối kháng chilinesterase liên kết với enzym sẽ làm ngăn cản quá trình thủy phân ACh và nó có thể tiếp tục thực hiện vai trò dẫn truyền thần kinh của mình Việc giữ cho chu kỳ hoạt động của ACh ổn định trong não sẽ giúp duy trì khả năng ghi nhớ và nhận thức [24]

AChE chủ yếu bị bất hoạt bởi gốc phosphate hữu cơ, carbamate và một số chất gây độc thần kinh Trong trường hợp ngộ độc thuốc trừ sâu hay hóa chất bảo vệ thực vật nhóm phospho hữu cơ, carbamat thì enzym AChE giảm, nếu ngộ độc phospho hữu cơ thì enzym giảm mạnh Do vậy, việc định lượng AChE được sử dụng để chẩn đoán và điều trị khi bị ngộc độ thần kinh trung ương Trong trường hợp này, các chất kháng cholinergic (ví dụ như atropine) có khả năng hoạt hóa lại các enzym này Khi enzym được hoạt hóa lại thì nó sẽ tiếp tục thực hiện chức năng thủy phân ACh, và các triệu chứng ngộ độc mất dần [57]

Theo giả thuyết cholinergic, các chất đối kháng cholinergic gây ra suy giảm trí nhớ và khả năng nhận thức của con người còn các chất đối kháng muscarinic thì có tác dụng ngược lại [65] Do vậy, việc ức chế AChE sẽ duy trì nồng độ và thời gian hoạt động của ACh tại các khe synap, từ đó có tác dụng duy trì khả năng ghi nhớ và khả năng học tập của con người [58] Sự giảm sút nồng độ ACh thường gặp ở các bệnh nhân Alzheimer, theo nghiên cứu của tác giả Di Giovanni S và cộng sự, trong não của bệnh nhân Alzheimer có sự thiếu hụt đến gần 90% lượng chất dẫn truyền thần kinh này

[35] Trong khi nguyên nhân gây bệnh còn chưa được các nhà khoa học làm rõ thì các chất ức chế AChE là lựa chọn hàng đầu cho các bệnh nhân Alzheimer, thông qua việc duy trì nồng độ ACh trong não, các chất này có tác dụng làm giảm các triệu chứng và ngăn chặn sự tiến triển của bệnh [54]

AChE chủ yếu có mặt trong hệ thần kinh trung ương, xúc tác thủy phân chất dẫn truyền ACh Quá trình này cần thiết để chuyển tế bào thần kinh hệ cholinergic từ trạng thái hoạt động sang tình trạng nghỉ [15,47] Ở bệnh nhân Alzheimer thấy có sự giảm trầm trọng nồng độ chất dẫn truyền thần kinh ACh Tình trạng này gây suy giảm khả năng nhận thức đối với người bệnh

Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu ức chế enzym

Ngày nay, các nhà khoa học trong và ngoài nước đã tiến hành nhiều phương pháp thử nghiệm để xác định hoạt tính của enzym AChE, bao gồm: phương pháp đo quang, phương pháp điện di, phương pháp huỳnh quang với cơ chất phát huỳnh quang, phương pháp sử dụng thang pH hay xác định hoạt độ điện hóa của enzym AChE Đối với nghiên cứu tác dụng ức chế enzym AChE in vitro, có 2 phương pháp thường được sử dụng là phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman và phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B

1.3.1 Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman

Trong số những phương pháp được sử dụng đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro, phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman được xây dựng và ứng dụng sớm nhất Hiện nay, phương pháp này vẫn được sử dụng khá phổ biến ở nhiều nghiên cứu cùng hướng, trong đó, phương pháp đo quang được sử dụng nhiều hơn phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học Phương pháp này sử dụng cơ chất là acetylthiocholin iodid (ATCI) và thuốc thử là 5,5‟ - dithiobis - nitrobenzoic acid (DTNB)

Phương pháp của Ellman dùng để xác định hoạt tính của enzym AChE dựa vào đo quang được tác giả này mô tả lần đầu tiên vào năm 1961 [36]

Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất ATCI bị thủy phân nhờ xúc tác của cholinesterase tạo thiocholin Thiocholin phản ứng với thuốc thử DTNB giải phóng ra hợp chất 5-thio-2-nitrobenzoic acid màu vàng Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 412 nm

Sau đó, nhiều nghiên cứu sàng lọc về tác dụng ức chế AChE in vitro khác tiếp tục được thực hiện Tuy nhiên, so với phương pháp gốc được công bố bởi Ellman, phương pháp được triển khai trong các nghiên cứu sau đó đều có một số thay đổi về: nguồn gốc và hoạt độ của enzym, loại đệm sử dụng, nồng độ dung dịch cơ chất và thuốc thử… cũng như tỷ lệ phối hợp của chúng vào hỗn hợp phản ứng [55,59]

1.3.1.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học

Trên cơ sở phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman, phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học đã được phát triển Ở phương pháp này, sau khi bản mỏng được triển khai, hỗn hợp gồm dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun lên bản mỏng, sau đó mới phun dung dịch enzym

Những chất gây ức chế AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền vàng [21]

Một trong những hạn chế của phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học là có thể gặp phải hiện tượng dương tính giả, hiện tượng vết màu trắng xuất hiện trên bản mỏng không phải do tác dụng ức chế enzym AChE Để khắc phục hạn chế này, bên cạnh bản mỏng thử phải tiến hành làm thí nghiệm với một bản mỏng khác (bản đối chiếu) Các bước tiến hành trên bản đối chiếu tương tự như trên bản thử chỉ khác ở giai đoạn phun thuốc thử hiện màu Đối với bản thử, hỗn hợp dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun trước, sau đó mới phun dung dịch enzym AChE Với bản đối chiếu, dung dịch thuốc thử DTNB được phun trước, sau đó hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất ATCI và dung dịch enzym AChE được phun sau Cách bố trí thử nghiệm như trên nhằm đảm bảo những vết màu trắng xuất hiện trên cả hai bản là những vết cho phản ứng dương tính giả [20]

1.3.2 Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B

So với phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman, số lượng nghiên cứu sử dụng phương pháp này để đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro khá hạn chế Phương pháp này sử dụng cơ chất là α-naphthyl acetat và thuốc thử là muối Fast Blue B (muối O-dianisidin bis(diazotized) zinc double)

Thử nghiệm đo quang sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B được công bố lần đầu tiên bởi tác giả Van Asperen K vào năm 1962 [63] Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất α-naphthyl acetat bị thủy phân bởi enzym esterase giải phóng chất α-naphthol Chất này sau đó phản ứng với thuốc thử muối Fast Blue B tạo thành sản phẩm màu diazo Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 600 nm Tuy nhiên, sau đó, không có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp này để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro và một trong số đó là nghiên cứu của tác giả

Di Giovanni S [35,53] Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu của tác giả này có một số thay đổi so với phương pháp của tác giả Van Asperen về: nguồn gốc và hoạt độ của enzym, hóa chất để bất hoạt enzym và nồng độ dung dịch cơ chất

1.3.2.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học

Muối Fast Blue B cũng được sử dụng như một thuốc thử trong phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym AChE in vitro và được phát triển bởi Marston năm 2002 Ở phương pháp này, sau khi bản mỏng được triển khai, dung dịch enzym được phun lên bản mỏng

Sau đó, hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất α-naphthyl acetat và dung dịch thuốc thử muối Fast Blue B được phun lên bản mỏng Những chất gây ức chế AChE phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học sử dụng thuốc thử Ellman, phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B cũng có thể gặp phải hiện tượng dương tính giả Để loại trừ các vết dương tính giả, một bản mỏng đối chiếu tương tự với bản mỏng thử được triển khai Sau đó, các dung dịch α-naphthol và muối Fast Blue B được phun lên bản mỏng mà không có dung dịch enzym Nếu xuất hiện vết màu trắng thì vết đó là vết dương tính giả

Ngoài việc sử dụng 2 phương pháp trên, để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro trong nghiên cứu, tác giả Tang Z M và cộng sự đã sử dụng phương pháp điện di mao quản [62] Tuy nhiên, hiện nay mới chỉ có rất ít nghiên cứu sử dụng phương pháp này được công bố, do phương pháp này đòi hỏi phải có trang thiết bị phù hợp với thao tác thử nghiệm tương đối phức tạp Ngoài ra, những hạn chế về số lượng mẫu thử được đánh giá ở mỗi lần thao tác máy cũng góp phần cản trở việc ứng dụng phương pháp điện di mao quản trong nghiên cứu sàng lọc.

Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật chi Mahonia, phân bố một số loài ở Việt Nam và đặc điểm của cây Hoàng liên ô rô (Mahonia nepalensis DC.)

loài ở Việt Nam và đặc điểm của cây Hoàng liên ô rô ( Mahonia nepalensis DC.)

1.4.1 Vị trí phân loại thực vật

Theo hệ thống phân loại Takhiajan 1987, chi Mahonia thuộc họ Hoàng liên gai (Hoàng mộc, Mã hồ) – Berberidaceae, bộ Hoàng liên (Ranunculales), phân lớp Hoàng liên (Ranunculales), ngành Ngọc lan (Hạt kín) – (Magnoliophyta)

1.4.2 Phân bố, một số loài ở Việt Nam

 Phân bố: Trên thế giới có khoảng 19 loài Cây mọc hoang ở vùng núi cao, lạnh, trên núi đá vôi, ở độ cao 1000m trở lên [14]

M aquifolium Push; M repens (Lindl) G Don có nhiều ở vùng tây bắc

M bealei (Fort) Carr; M nepalensis DC ; M fortunei (Fort) Carr có nhiều ở Trung Quốc, Lào, Thái Lan, Ấn Độ, Việt Nam [3,12,14]

 Một số loài ở Việt Nam Ở nước ta các loài thuộc chi Mahonia như M Japonica (Thumb) DC;

M Bealei (Fort) Carr; M Nepalensis DC có tên là Hoàng liên ô rô vì lá của chúng giống lá cây Ô rô và công dụng lại gần giống vị Hoàng liên [12]

Hoàng liên ô rô còn gọi là Hoàng bá gai, Thích hoàng liên, Tồng phềnh („Hmông) [11]

1.4.3 Đặc điểm thực vật học của cây Hoàng liên ô rô

Cây Hoàng liên ô rô hay còn gọi là cây Mật gấu (Mahonia nepalensis DC., còn có tên khoa học khác là Berberis nepalensis Spreng.) được biết đến như là một loài cây dược liệu quí, có phân bố hẹp và chỉ còn lại rất ít cá thể mọc rải rác trên các vùng núi có độ cao từ 1.500 – 1.700m như Bắc Kạn, Lang Biang (Lâm Đồng), Tả Giàng Phình và Bản Khoang (Sa Pa – Lào Cai), Mùa Súa (Đồng Văn – Hà Giang),… [3,7,12,16,19]

Hoàng liên ô rô là cây bụi thân gỗ sống nhiều năm, thân chính phát triển, cành nhánh mọc ra ít, cao 3–5m (Hình 1.4 A) Rễ cái hay rễ chính mập khỏe phát triển từ rễ mầm, mọc sâu vào trong đất từ rễ chính phát triển ra các rễ bên, rễ con ít phát triển hơn Thân chính phát triển mạnh ít phân nhánh, cây cao bị đổ ngã thì phân nhánh nhiều, thân có màu vàng Cành không có gai Lá kép lông chim lẻ, phát triển từ thân hoặc cành, dài 25 – 45cm, mỗi bên có 10–

15 lá chét không cuống, phiến lá chét hình bầu dục biến dạng hơi lệch, dài 3–

9cm, rộng 2,5 – 4,5cm, cứng, dày, hình ốc tròn hoặc hơi hình tim, đỉnh nhọn hoắt thành gai, khía 3–5 răng cưa mỗi bên, nhọn sắc, ba gân chính và gân phụ nổi rõ ở mặt trên lá, mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh bạc [4]

Hoàng liên ô rô thích hợp với vùng khí hậu ôn đới, nhiệt độ trung bình thấp, khoảng (18– 25 o C), mùa mưa kéo dài từ tháng 5 đến tháng 10 và mùa khô từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau Cây tự nhiên có tốc độ phát triển chậm, sau 5–6 năm mới có thể đạt chiều cao 1 m, đường kính gốc 2–3 cm và bắt đầu ra hoa Mùa ra hoa từ cuối tháng 11 đến cuối 2 năm sau và mùa quả chín từ tháng 2 đến tháng 4, cây tái sinh bằng hạt Đây là loài cây dạng bụi, thân, cành và rễ có chứa hàm lượng Berberin cao, thường được sử dụng chữa đau bụng, rối loạn tiêu hoá, ỉa chảy, kiết lỵ; và theo kinh nghiệm của người dân ở

Sa Pa loài cây này còn được dùng làm thuốc bổ đắng có tác dụng chữa xương khớp [4]

1.4.4 Thành phần hóa thực vật

Trong rễ, thân, lá của cây Hoàng liên ô rô (Mahonia nepalensis DC.) đều có chứa alcaloid, saponin, đường khử, acid amin, sterol, lá có chứa tanin [4,7]

Hoàng liên ô rô chứa chủ yếu là các alcaloid có nhân Isoquinolin, bao gồm 2 nhóm chính là protoberberin và bisbenzylisoquinoline Trong đó, các alkaloid có khung protoberberin như Berberin (0,19%) [10], palmatine (0,80%) [10], jatrorrhizine,… là thành phần chính

Hình 1.3 Hai khung alcaloid chính có nhân Isoquinolin [10]

Năm 1944, hai alcaloid được tìm thấy đầu tiên là umbellatine và neprotine [30], sau này được xác định là Berberin (umbellatine) và jatrorrhizine (neprotine) vào năm 1957 [44](hình 1.5)

Hình 1.4 Hai alcaloid có khung protoberberin được tìm thấy đầu tiên trong cây Hoàng liên ô rô [30]

Hình 1.5 Cấu trúc phân tử của Palmatine [60]

Ngoài ra, năm 2009 đã phân lập được 2 alcaloid có khung bisbenzylisoquinoline là homoaromoline và isotetrandrine từ thân cây Hoàng liên ô rô [52] Một số alcaloid khác có khung bisbenzylisoquinoline như oxyacanthine, berbamine,… [60]

Hình 1.6 Một số alcaloid có khung bisbenzylisoquinoline trong cây Hoàng liên ô rô [52,60]

Ngoài ra, cây Hoàng liên ô rô còn chứa một số alcaloid khung aporphine như Magnoflorin,… [60]

Hình 1.7 Cấu trúc phân tử của Magnoflorine [60]

1.4.5 Tác dụng và công dụng 1.4.5.1 Theo Y học cổ truyền và kinh nghiệm dân gian

- Hoàng liên ô rô vị đắng tính mát, vào phế, vị, can, thận, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tiêu viêm, làm se [14]

- Rễ hoặc thân 4 – 15g (thuốc sắc hoặc thuốc bột) chữa kiết lỵ, ăn không tiêu, tiêu chảy, viêm ruột, viêm gan, vàng da, đau mắt [12,14], quả có tác dụng lợi tiểu [8] Dùng ngoài, dược liệu nấu nước đặc rửa chữa viêm da, dị ứng, ngứa lở [14]

- Hoàng liên ô rô còn được dùng chữa ho lao, sốt cơn, khạc máu, lưng gối yếu mỏi, chóng mặt, ù tai, mất ngủ [6]

1.4.5.2 Tác dụng của Berberin và palmatin

- Berberin có tác dụng ức chế nhiều loại vi khuẩn : Streptococcus hemolyticus, Vitro cholerae, Staphylococcus aureus, Streptococcus virideus, Shigella dysenteriae, Bacillus subtilis, Bacillus pneumoniae, Bacillus proteus, Bacillus typhi, Bacillus coli [1]

- Berberin với liều thấp làm tim hưng phấn, giãn động mạch, hạ huyết áp, làm tăng mật, hạ sốt [1]

- Berberin đem khử hóa cho tetrahydroberberin có tác dụng an thần, làm mềm cơ, hạ huyết áp nhẹ [1]

- Palmatin có tác dụng ức chế tụ cầu khuẩn (Staphylococcus), liên cầu khuẩn (Streptococcus), còn đối với các loại vi khuẩn khác (lỵ, thương hàn,…) không thấy có kết quả rõ rệt Tác dụng ức chế vi khuẩn của palmatine kém các loại kháng sinh thông thường [1]

- Palmatin được dùng để điều chế dI – tetrahydropalmatin có tác dụng an thần [1].

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu và thiết bị

Thân phơi khô của cây Hoàng liên ô rô thu hái vào tháng 9 năm 2015 ở Bắc Kạn Mẫu nghiên cứu được giám định thực vật học bởi Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

2.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu Phương pháp chiết xuất dược liệu: Mẫu thân cây Hoàng liên ô rô được rửa sạch, phơi và sấy khô ở 50 o C, thái nhỏ Dược liệu (1 kg) sẽ được chiết xuất bằng ethanol 96% (3L × 3 lần) bằng phương pháp siêu âm Dịch chiết được lọc qua giấy lọc và gộp lại, cô dịch chiết bằng máy cô quay chân không thu được cao ethanol Hòa cao ethanol với khoảng 300 mL nước cất rồi chiết phân đoạn lần lượt với n-hexan, ethyl acetat và n-buthanol (mỗi dung môi 3 lần mỗi lần 300 mL)

2.1.3 Hóa chất, thiết bị 2.1.3.1 Hóa chất

- Hóa chất: Enzym acetylcholinsterase loại EC 3.1.1.7 (Sigma, Singapore), Acetylthiocholine iodide (ACTI) (Sigma, Singapore);

5,5‟-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) (Sigma, Singapore), Tris HCl và berberin clorid chuẩn (Himedia, Ấn Độ)

- Dung môi: n – hexan, ethylacetat (EtOAc), n – buthanol (n-BuOH), methanol (Shouguang, Trung Quốc)

- Cân phân tích AY 129 (Shimadzu, Nhật Bản)

- Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H, MRC, Isareal

- Máy đo quang UV Aligent technologies Cary 60 UV-Vis, Mỹ

- Máy cô quay chân không Rovapor R- 210 (Buchi- Đức)

- Pipet, bình định mức, cối xứ, giấy lọc (đường kính 11 cm), phễu lọc

Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện các mục tiêu đề ra, đề tài được thiết kế với các nội dung sau:

Thực hiện mục tiêu 1: Xây dựng phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE

- Khảo sát mức độ ảnh hưởng của nồng độ của dung dịch cơ chất ATCI đến phương pháp thử

- Khảo sát mức độ ảnh hưởng của nồng độ của dung dịch thuốc thử DTNB đến phương pháp thử

- Khảo sát mức độ ảnh hưởng của hoạt độ enzym AChE đến phương pháp thử

- Khảo sát mức độ ảnh hưởng của thời gian để phản ứng diễn ra đến phương pháp thử

Thực hiện mục tiêu 2: Đánh giá được tác dụng ức chế enzym acetylcholinsterase in vitro của Hoàng liên ô rô (Mahonia nepalensis DC, họ Berberidaceae)

- Chiết xuất cao từ dược liệu: Mẫu thân cây Hoàng liên ô rô được rửa sạch, phơi và sấy khô ở 50 o C, thái nhỏ Dược liệu (1 kg) sẽ được chiết xuất bằng ethanol 96% (3L × 3 lần) bằng phương pháp siêu âm Dịch chiết được lọc qua giấy lọc và gộp lại, cô dịch chiết bằng máy cô quay chân không thu được cặn ethanol Hòa cặn với khoảng 300 mL nước cất rồi chiết phân đoạn lần lượt với n-hexan, ethyl acetat và n-butanol (mỗi dung môi 3 lần mỗi lần 300 mL)

- Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE theo phương pháp đã xây dựng ở mục tiêu 1.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE

Phương pháp đo quang in vitro dùng để đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE được xây dựng và sử dụng trong nghiên cứu lần đầu tiên bởi tác giả Ellman vào năm 1961[39] Nguyên tắc của phương pháp như sau:

Cơ chất acetylthiocholin iodid (ATCI) bị thủy phân nhờ xúc tác của AChE tạo thiocholin Sản phẩm thiocholin phản ứng với thuốc thử acid 5-5‟- dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) tạo thành hợp chất acid 5-thio-2-nitro benzoic có màu vàng Lượng hợp chất màu được tạo thành này tỷ lệ thuận với hoạt độ của AChE Dựa vào xác định độ hấp thụ (cường độ màu) của mẫu thử ở 412 nm để đánh giá hoạt tính của AChE

Hình 2.1 Sơ đồ phản ứng tạo màu với thuốc thử Elman [39]

Mặc dù hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym AChE in vitro cùng hướng được thực hiện, nhưng đa số các nghiên cứu này đều sử dụng phương pháp đo quang của Ellman kết hợp với một số điều chỉnh trong điều kiện thực nghiệm Điều kiện của phương pháp tiến hành thường có sự thay đổi giữa các nghiên cứu về: nồng độ dung dịch cơ chất ATCI (1-75 mM) [35,50,59]; nồng độ dung dịch thuốc thử DTNB (1,5-10 mM) [35,49,50,59]; hoạt độ của enzym AChE (0,2-5,0 IU/mL) [20,35,59]; thời gian ủ trước phản ứng: khoảng 5-15 phút [49,55]; thời gian để phản ứng được xúc tác bởi enzym diễn ra: khoảng 5-30 phút [55], khoảng thời gian này phụ thuộc vào tốc độ phản ứng, nồng độ cơ chất và hoạt độ enzym

Trong các phương pháp đo quang thường chọn bước sóng hấp thụ cực đại của sản phẩm để đo độ hấp thụ quang, từ đó định lượng sản phẩm Tuy nhiên, do mỗi loại máy đo quang thường chỉ có một số loại kính lọc sắc đi kèm nên trong các nghiên cứu chỉ có thể chọn bước sóng nào gần với bước sóng hấp thụ cực đại nhất để đo Các nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro thường sử dụng một trong 3 bước sóng là 405, 412 và 420 nm để định lượng [20,55]

Những thay đổi về điều kiện phản ứng enzym được đề cập ở trên có thể do nhiều nguyên nhân khác nhau: xuất phát từ điều kiện thực tế phòng thí nghiệm (sự sẵn có về máy móc và hóa chất); sự khác nhau về tỷ lệ phối hợp giữa các thành phần trong hỗn hợp phản ứng enzym; đặc tính của mẫu nghiên cứu: các mẫu khác nhau có khả năng hòa tan trong các dung môi khác nhau

Ngoài ra, enzym và cơ chất khá nhạy cảm bởi tác động của yếu tố khách quan Điều này tạo ra sự khác nhau về hoạt tính của enzym và mức độ cơ chất bị thủy phân không bởi xúc tác enzym giữa các nghiên cứu

Do vậy, hiện nay vẫn chưa có một điều kiện tối ưu và quy trình chuẩn nào của phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman được áp dụng chung cho tất cả những nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro Do đó, việc khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp thử để lựa chọn được điều kiện thử nghiệm phù hợp với thực tế là rất cần thiết

Trong đề tài khóa luận này, những yếu tố được lựa chọn để khảo sát mức độ ảnh hưởng đến phương pháp thử gồm: nồng độ của dung dịch cơ chất ATCI; nồng độ của dung dịch thuốc thử DTNB; hoạt độ của enzym AChE; thời gian để phản ứng diễn ra Đây cũng là những yếu tố thường có sự thay đổi khá nhiều giữa các nghiên cứu trong và ngoài nước

Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro

Quy trình của thử nghiệm bước đầu được tiến hành như sau:

Thêm lần lượt từng dung dịch gồm: dung dịch đệm sodium phosphate 0,1M (pH 8,0), dung môi hoặc mẫu thử và dung dịch enzym AChE có hoạt độ thích hợp vào cuvette 1 mL Hỗn hợp các dung dịch này được trộn đều và ủ ở

Sau đó, dung dịch thuốc thử DTNB và dung dịch cơ chất ATCI lần lượt được thêm vào hỗn hợp và trộn đều Tiếp tục ủ hỗn hợp trong một khoảng thời gian nhất định ở 25 o C, sau đó, dung dịch được đo độ hấp thụ ở bước sóng

412 nm Mỗi thử nghiệm được làm lặp lại 3 lần Chất chuẩn dương sử dụng là Berberin clorid [55]

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp thử

+ Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB đến phương pháp thử: Để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB đến phương pháp thử, hai dung dịch này được khảo sát ở 3 mức nồng độ khác nhau lần lượt là 1,25; 2,5 và 5 mM (cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB được phối hợp vào hỗn hợp phản ứng ở tỷ lệ số mol là 1:1)

Bảng 2.1 Thành phần hỗn hợp phản ứng khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB đến phương pháp thử

Thành phần Đệm sodium phosphate 0,1M (pH 8,0)

+ Khảo sát ảnh hưởng của hoạt độ AChE đến phương pháp thử nghiệm và lựa chọn thời gian phản ứng: Để khảo sát ảnh hưởng của hoạt độ enzym đến phương pháp thử, dung dịch enzym ở 3 hoạt độ khác nhau lần lượt là 0,25; 0,5; 1,0 IU/mL được phối hợp vào hỗn hợp phản ứng với thành phần như được trình bày ở bảng 2.2 Sau đó, độ hấp thụ của mẫu thử được xác định ở 6 thời điểm khác nhau là: 3, 5, 7,

10, 15, 20 phút sau khi phản ứng xúc tác bởi enzym bắt đầu xảy ra

Bảng 2.2 Thành phần hỗn hợp phản ứng khảo sát ảnh hưởng của hoạt độ enzym đến phương pháp thử

Thành phần Đệm sodium phosphate 0,1M (pH 8,0)

* Trong đó, nồng độ cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB đã được xác định dựa trên kết quả khảo sát trước đó

Phần trăm ức chế hoạt độ enzym AChE (% I) được tính theo công thức:

Trong đó: %I: phần trăm hoạt tính AChE bị ức chế Ac: độ hấp thu của mẫu chứng (khụng chứa 100 àL dung dịch thử) At: độ hấp thu của mẫu thử

Ao: độ hấp thu của mẫu trắng (1 mL dung dịch đệm sodium phosphate)

2.3.2 Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinsterase in vitro của Hoàng liên ô rô (Mahonia nepalensis DC, họ Berberidaceae)

Phương pháp đánh giá được tác dụng ức chế enzym AChE in vitro được tiến hành dựa trên kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp thử ở mục 2.3.1 Tác dụng ức chế AChE in vitro của mẫu thử được xác định bằng giá trị phần trăm hoạt tính enzym bị ức chế (I%) và được tính theo CT1 Mỗi mẫu thử được thực hiện lặp lại 3 lần Giá trị ức chế enzym AChE

IC50 của các mẫu thử được tính dựa vào đồ thị log (nồng độ mẫu thử) và % ức chế xây dựng trên phần mềm Sigma Plot 12 Để có cơ sở đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro của mẫu nghiên cứu, berberin clorid được lựa chọn làm mẫu đối chứng dương Hợp chất này đã được nghiên cứu và chứng minh sở hữu tác dụng ức chế AChE in vitro khá mạnh Thực tế, berberin clorid cũng đã được sử dụng làm mẫu đối chứng dương trong một số nghiên cứu [35,50,55] Động học phản ứng ức chế enzym AChE của dịch chiết cây Hoàng liên ô rô được tiến hành theo phương pháp mô tả trước đây [29], dựa trên phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE của Ellman với sự thay đổi nồng độ mẫu thử (phân đoạn dịch chiết Hoàng liên ô rô có tác dụng ức chế enzym cao nhất) và thay đổi nồng độ cơ chất ACTI Sử dụng các đồ thị 1/[ACTI] và 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị Lineweaver – Burk) để xác định kiểu động học ức chế enzym; đồ thị động học Dixon để xác định hằng số ức chế Ki của mẫu thử dịch chiết.

Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thực nghiệm được tổng hợp và phân tích xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên máy vi tính dưới sự trợ giúp của phần mềm Microsoft Excel 2013, Sigma Plot 12

Các thuật toán sử dụng:

+ Tính trung bình: ( ⃐ ), độ lệch chuẩn (SD), trong đó độ lệch chuẩn được tính theo công thức:

Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng giá trị trung bình cộng/trừ độ lệch chuẩn, ký hiệu: ⃐ ± SD So sánh giá trị trung bình giữa các mẫu thử sử dụng phép thử t-Student Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p0,05 Tuy nhiên, mức nồng độ cơ chất và thuốc thử là 2,5 mM được chọn cho những nghiên cứu khảo sát tiếp theo để giảm lượng cơ chất và thuốc thử phải dùng trong nghiên cứu nhưng vẫn đảm bảo độ chính xác của các thử nghiệm Đồng thời, mức nồng độ bằng 2,5 mM này cũng nằm trong khoảng nồng độ của cơ chất ATCI và thuốc thử DTNB đã được sử dụng trong các nghiên cứu trước đây lần lượt là 1-75 mM và 1,5-10 mM [35,49,50,59]

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hoạt độ AChE đến phương pháp thử và lựa chọn thời điểm đo độ hấp thụ

Hoạt độ enzym AChE được khảo sát ở 3 mức hoạt độ là 0,25; 0,5 và 1,0 IU/mL Sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang theo thời gian ở 3 mức hoạt độ enzym AChE khảo sát được thể hiện ở hình 3.2

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa độ hấp thụ quang và thời gian phản ứng của các hỗn hợp ở 3 mức hoạt độ enzym AChE Kết quả ở hình 3.2 cho thấy hoạt độ enzym ảnh hưởng lớn đến tốc độ phản ứng thủy phân cơ chất Ở hoạt độ enzym 0,25 IU/mL, tốc độ phản ứng diễn ra rất chậm tương ứng với độ hấp thụ của mẫu thử là thấp nhất khi so sánh với độ hấp thụ của các mẫu thử tương tự đo ở điều kiện hoạt độ enzym cao hơn tại cùng một thời điểm Do vậy, ở điều kiện này, kết quả thử nghiệm sẽ gặp phải sai số lớn hơn đặc biệt với những mẫu thử có tác dụng ức chế AChE mạnh Ở hoạt độ enzym 0,5 IU/mL, tốc độ phản ứng diễn ra vừa phải

Thời gian để phản ứng đạt tới trạng thái bão hòa khoảng 10 phút Trong

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 Độ hấ p thụ qua ng (Abs )

Thời gian phản ứng (min) gian phản ứng là khá tuyến tính với hệ số tương quan R 2 = 0,9901 Tuy nhiên, ở hoạt độ enzym 1,0 IU/mL, tốc độ phản ứng diễn ra nhanh nhất và chỉ sau khoảng 7 phút, phản ứng đã đạt tới trạng thái bão hòa Khi tốc độ của phản ứng thủy phân được xúc tác bởi enzym AChE diễn ra quá nhanh, cùng với ảnh hưởng của những yếu tố khách quan sẽ gây sai số lớn

Vì vậy, mức hoạt độ AChE là 0,5 IU/mL được lựa chọn sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo và thời điểm đo độ hấp thụ của mẫu thử được xác định là 10 phút sau khi phản ứng bắt đầu xẩy ra Đồng thời, mức hoạt độ enzym là 0,5 IU/mL được lựa chọn sử dụng cũng nằm trong khoảng hoạt độ AChE đã được sử dụng trong các nghiên cứu trước đây là từ 0,2-5,0 IU/mL [20,35,59]

Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro

Dựa vào kết quả khảo sát, đã xác định được điều kiện cho phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro như sau:

Bảng 3.2 Thành phần của hỗn hợp phản ứng

STT Thành phần Thể tớch (àL)

Tổng thể tích hỗn hợp phản ứng 1000

Quy trình của phương pháp đánh giá tác dụng enzym AChE được tiến hành như sau:

Hỗn hợp phản ứng bao gồm 700 àL dung dịch đệm sodium phosphate 0,1M (pH 8,0); 100 àL dung dịch thử ở cỏc nồng độ khỏc nhau và 100 àL dung dịch enzym AChE 0,5 IU/mL Trộn đều và đem ủ 15 phút tại 25 o C Các phân đoạn dịch chiết được thử và chất chuẩn dương (Berberin chloride) được hũa tan trong methanol Sau đú, thờm 50 àL dung dịch DTNB 2,5 mM và 50 àL dung dịch ACTI 2,5 mM và trộn đều Tiếp tục ủ hỗn hợp trong 10 phỳt ở

25 o C Sau đó, dung dịch được đo độ hấp thụ ở bước sóng 412 nm Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần Berberin clorid được sử dụng làm chứng dương

Phần trăm ức chế hoạt độ enzym AChE (% I) được tính theo công thức CT1

Hình 3.3 Sơ đồ quy trình phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym

Quy trình phương pháp xác định đặc điểm động học ức chế enzym AChE Động học ức chế enzym AChE của phân đoạn dich chiết có tác dụng ức chế enzym AChE cao nhất được tiến hành theo phương pháp mô tả trước đây

Hỗn hợp phản ứng gồm 700 àL dung dịch đệm sodium phosphate 0,1M (pH

700 àL dd đệm sodium phosphate 0,1M (pH 8)

100 àL mẫu thử ở cỏc nồng độ khác nhau

100 àL dd enzym AChE 0,5 IU/mL

Hỗn hợp, trộn đều, ủ 15 phút (25 o C)

Trộn đều, ủ 10 phút (25 o C) Đo độ hấp thụ quang ở 412nm

(0; 2,5; 5 và 10 àg/mL) và 100 àL dung dịch enzym AChE 0,5 IU/mL Trộn đều và đem ủ 15 phỳt tại 25 o C Sau đú, thờm 50 àL dung dịch DTNB 2,5 mM và 50 àL với cỏc nồng độ khỏc nhau của cơ chất ACTI (1,25; 2,5; 5 mM) và trộn đều Tiến hành đo độ hấp thụ dung dịch thu được ở bước sóng 412 nm trong vòng 5 phút Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần Sử dụng các đồ thị 1/[ACTI] và 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị Lineweaver – Burk) để xác định kiểu động học ức chế enzym Từ đồ thị Dixon plot, hằng số ức chế Ki được xác định là điểm giao của các đường [nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH] và 1/V (1/tốc độ phản ứng) trên trục Ox.

Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinsterase in vitro của dƣợc liệu Hoàng liên ô rô (Mahonia nepalensis DC, họ Berberidaceae)

Tác dụng ức chế enzym AChE phụ thuộc vào nồng độ của phân đoạn dịch chiết Tác dụng ức chế AChE của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên ô rô và chất chuẩn dương Berberin clorid được thể hiện ở bảng 3.3 thông qua giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%) Hình 3.4 và 3.5 thể hiện mối tương quan giữa giá trị Log (nồng độ mẫu thử) và phần trăm tác dụng ức chế enzym AChE Tác dụng ức chế enzyme AChE của các phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế hoạt độ enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết cây Hoàng liên ô rô

Log (Nồng độ) (àg/mL)

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế hoạt độ enzym AChE của

Giá trị IC 50 của các phân đoạn dịch chiết cây Hoàng liên ô rô và Berberin clorid được tính dựa vào đồ thị hình 3.4 và hình 3.5; chuyển từ log [àg/mL] sang àg/mL Kết quả được thể hiện trong bảng 3.3

Bảng 3.3 Giá trị IC 50 của các phân đoạn dịch chiết từ Hoàng liên ô rô và

Mẫu thử IC 50 (àg/mL)

Từ bảng 3.3 cho thấy phân đoạn dịch chiết n-BuOH cho thấy có tác dụng ức chế enzym AChE cao nhất với IC 50 là 3,38 ± 0,07 àg/mL, so với cỏc phân đoạn khác có tác dụng ức chế enzym AChE thấp hơn là phân đoạn n- hexan với giỏ trị IC50 = 23,51 ± 1,21 àg/mL; và phõn đoạn EtOAc cú tỏc dụng

Log (Nồng độ) (àg/mL)

• Berberin clorid ức chế enzym AChE thấp nhất trong các phân đoạn với IC 50 = 126,74 ± 2,16 àg/mL

Kết quả xác định động học ức chế enzym AChE của phân đoạn dịch chiết cây Hoàng liên ô rô

Phân đoạn n-BuOH có tác dụng ức chế enzym AChE cao nhất nên phân đoạn này được lựa chọn sử dụng để xác định động học ức enzme AChE

Phương pháp xác định động học ức chế enzym dựa trên sự thay đổi nồng độ cơ chất ACTI và nồng độ dung dịch thử n-BuOH Kết quả sự tương quan giữa giá trị độ hấp thụ quang của mẫu thử với thời gian phản ứng khi thay đổi nồng độ cơ chất ACTI và nồng độ dung dịch thử n-BuOH được thể hiện tương ứng trong hình 3.6 và hình 3.8

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa giá trị độ hấp thụ quang với thời gian phản ứng của cơ chất ACTI ở các nồng độ khác nhau

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 n-BuOH 0 mcg/mL n-BuOH 2.5 mcg/mL n-BuOH 5 mcg/mL n-BuOH 10 mcg/mL Độ hấp thụ quang (A bs )

0.8 n-BuOH 0 mcg/mL n-BuOH 2.5 mcg/mL n-BuOH 5 mcg/mL n-BuOH 10 mcg/mL Độ hấp thụ quang (A bs )

0.8 n-BuOH 0 mcg/mL n-BuOH 2.5 mcg/mL n-BuOH 5 mcg/mL n-BuOH 10 mcg/mL Độ hấp thụ quang (A bs )

Thời gian (s) ACTI 5 mM Động học ức chế enzym AChE được mô tả bằng đồ thị Lineweaver- Burk, được xây dựng từ đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa giá trị độ hấp thụ quang với thời gian phản ứng của cơ chất ACTI ở các nồng độ khác nhau ở hình 3.6 Tác dụng ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết cây Hoàng liên ô rô được thể hiện trong hình 3.7 (Đồ thị Lineweaver-Burk plot)

Từ đồ thị Lineweaver-Burk ta xác định được kiểu ức chế enzym của phân đoạn dịch chiết n-BuOH là ức chế hỗn hợp [17,26]

Hình 3.7 Đồ thị Lineweaver-Burk cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH Kí hiệu:●: 0; ○: 2,5; ▼: 5; ∆: 10 àg/mL phõn đoạn dịch chiết n-BuOH Nồng độ cơ chất ACTI được sử dụng là 5; 2,5; 1,25 mM

1/ Tốc độ phản ứn g (a bs/ m in)

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa giá trị độ hấp thụ quang với thời gian phản ứng của phân đoạn dịch chiết n-BuOH ở các nồng độ khác nhau Đồ thị động học Dixon của phân đoạn dịch chiết n-BuOH được xây dựng dựa trên đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa giá trị độ hấp thụ quang với thời gian phản ứng của phân đoạn dịch chiết n-BuOH ở các nồng độ 0;

ACTI 1.25 mM ACTI 2.5 mM ACTI 5 mM Độ hấ p thụ qua ng (A bs )

Thời gian (s) n-BuOH 0 àg/mL

ACTI 1.25 mM ACTI 2.5 mM ACTI 5 mM Độ hấ p thụ qua ng (A bs )

Thời gian (s) n-BuOH 2,5 àg/mL

ACTI 1.25 mM ACTI 2.5 mM ACTI 5 mM Độ hấ p thụ qua ng (A bs )

Thời gian (s) n-BuOH 5 àg/mL

ACTI 1.25 mM ACTI 2.5 mM ACTI 5 mM Độ hấ p thụ qua ng (A bs )

Thời gian (s) n-BuOH 10 àg/mL

Hình 3.9 Đồ thị Dixon cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH để xác định hằng số ức chế Ki Kí hiệu: ●: 1,25; ○: 2,5; ▼: 5 mM ACTI Nồng độ phân đoạn n-

BuOH được sử dụng là 0; 2,5; 5; 10 àg/mL Đồ thị động học Dixon trong hình 3.9 của đoạn dịch chiết n-BuOH có tính chất đặc trưng của chất ức chế cạnh tranh [17,26,64], hằng số ức chế K i được xác định là giá trị tuyệt đối từ điểm giao của 3 đường trên trục Ox trên đồ thị là 3,416 ± 0,05 àg/mL Giỏ trị Ki nhỏ chứng tỏ dịch chiết Hoàng liờn ụ rô có tác dụng ức chế enzym AChE mạnh

Nồng độ phõn đoạn n-BuOH (àg/mL)

BÀN LUẬN

Về xây dựng phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE

Dược liệu trong tự nhiên là một nguồn đa dạng, phong phú các hợp chất sinh học và hóa học Các cấu trúc độc đáo và phức tạp của các hợp chất tự nhiên rất khó có thể tổng hợp được bằng các phương pháp tổng hợp hóa học Hiện nay, nhiều loại dược liệu đã được sử dụng trong các bài thuốc y học cổ truyền, mang lại hiệu quả cao trong điều trị bệnh Việc nghiên cứu sàng lọc các dược liệu được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian trong phục hồi trí nhớ, an thần ích trí theo hướng ức chế enzym AChE là một hướng nghiên cứu tìm kiếm thuốc mới có tác dụng cải thiện trí nhớ trong bệnh Alzheimer được nhiều nhà khoa học tiếp cận Trong quá trình nghiên cứu sàng lọc dược liệu và tìm kiếm các hợp chất mới có tác dụng ức chế enzym AChE, ngoài phương pháp đo quang in vitro được đề cập ở trên còn có hai phương pháp khác cũng được sử dụng là phương pháp ex vivo và phương pháp in vivo

Tùy vào điều kiện thí nghiệm và mục đích của từng nghiên cứu mà lựa chọn phương pháp nghiên cứu phù hợp Phương pháp in vitro được lựa trong giai đoạn nghiên cứu sàng lọc ban đầu các mẫu dịch chiết từ dược liệu, do phương pháp này có ưu điểm là cho kết quả nhanh, tiến hành đồng thời được nhiều mẫu và ít tốn kém Ở giai đoạn tiếp theo, khi lựa chọn được mẫu thử có hoạt tính in vitro mạnh, những nghiên cứu sâu hơn sử dụng phương pháp ex vivo hoặc in vivo [5] Sau khi tiến hành các nghiên cứu tiền lâm sàng nêu trên, các chất ức chế enzym AChE được đưa vào các thử nghiệm lâm sàng qua các pha

Hiện nay phần lớn các nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác dụng ức chế enzym AChE đều sử dụng phương pháp đo quang in vitro của tác giả

Ellman, nhưng điểu kiện thử nghiệm thường có sự khác nhau giữa các nghiên cứu sao cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Sau khi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro, chúng tôi đã xác định được một số điều kiện tối ưu cho phương pháp này gồm: nồng độ dung dịch cơ chất ATCI là 2,5 mM; nồng độ dung dịch thuốc thử DTNB là 2,5 mM; hoạt độ AChE là 0,5 IU/mL; thời điểm đo độ hấp thụ của mẫu thử là sau khi phản ứng xẩy ra 10 phút

Khi tiến hành phương pháp in vitro, bên cạnh việc xác định các điều kiện thử nghiệm phù hợp, việc lựa chọn chất chuẩn dương có vai trò quan trọng trong nghiên cứu, giúp định lượng tương đối tác dụng của các mẫu nghiên cứu khi so sánh với cùng một chất chuẩn Với nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro, các chất chuẩn dương thường sử dụng là galanthamin, tacrin và berberin clorid [35,50,55] Mặc dù berberin clorid chưa từng được sử dụng trên lâm sàng để điều trị bệnh Alzheimer, nhưng berberin clorid vẫn được lựa chọn làm chất chuẩn dương trong một số nghiên cứu in vitro do có tác dụng ức chế AChE in vitro mạnh, đồng thời sẵn có và giá thành rẻ hơn nhiều so với 2 chất còn lại Vì vậy, việc lựa chọn berberin clorid làm chất chuẩn dương của nghiên cứu này là phù hợp với những nghiên cứu trước đây về sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro cũng như phù hợp với điều kiện thực tiễn ở Việt Nam hiện nay.

Về đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinsterase in vitro của dƣợc liệu Hoàng liên ô rô (Mahonia nepalensis DC, họ Berberidaceae)

dƣợc liệu Hoàng liên ô rô ( Mahonia nepalensis DC, họ Berberidaceae)

Bệnh Alzheimer là chứng mất trí nhớ phổ biến nhất trên thế giới liên quan đến lão hóa Ở nhiều nước, các loại thuốc thảo dược truyền thống được sử dụng để ngăn ngừa hoặc điều trị các rối loạn thoái hóa thần kinh, và một số đã được phát triển thành thực phẩm chức năng và thuốc dùng trên lâm sàng

Các triệu chứng xuất hiện do lắng đọng các mảng β-amyloid và các đám rối thần kinh [18] Bệnh lý học của bệnh Alzheimer liên quan đến sự thiếu hụt Acetylcholin trong não Để điều trị, người ta nâng cao chức năng cholinergic bằng việc sử dụng chất ức chế AChE nhằm cải thiện một phần bệnh tật

AChE nằm ở synap hệ thần kinh trung ương và vai trò chính là thủy phân ACh, thành choline và acid acetic Ức chế enzym AChE là một trong các đích quan trọng để điều trị các chứng rối loạn thần kinh và để tìm kiếm các hợp chất mới trong điều trị Alzheimer [48] ACh là một trong những chất dẫn truyền thần kinh quan trọng nhất trong hệ thống thần kinh trung ương và ngoại biên, do vậy khả năng ức chế enzym AChE đóng vai trò như một marker sinh học chỉ điểm liên quan đến các rối loạn thần kinh

Tác dụng ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên ô rô được nghiên cứu ở 25 o C bằng phương pháp Ellman Phương pháp này sử dụng cơ chất là acetylthiocholine iodide Khi acetylthiocholine iodide bị thủy phân do enzym AChE tạo ra thiocholin và chất này phản ứng với 5-5‟- dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) tạo ra sản phẩm màu vàng Kết quả cho thấy tác dụng ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ Phân đoạn dịch chiết n-BuOH và dịch chiết tổng EtOH cho thấy có tỏc dụng ức chế cao nhất với giỏ trị IC50 tương ứng là 3,38 ± 0.07 àg/mL và 12,08 ± 0,33 àg/mL Tiếp theo là phõn đoạn n-hexan cú giỏ trị IC50 là 23,51 ± 1,21 àg/mL Phõn đoạn EtOAc cú tỏc dụng ức chế enzym AChE thấp nhất với

IC 50 là 126,74 ± 2,16 àg/mL, so với IC 50 của chất chuẩn dương berberin clorid là 0,282 ± 0,03 àg/mL Từ cỏc kết quả này cho thấy, cỏc chất cú tỏc dụng ức chế enzym AChE tập trung nhiều trong phân đoạn dịch chiết n-BuOH, so với các phân đoạn khác n-Hexan và EtOAc Do vậy, trong phân đoạn dịch chiết n-BuOH có khả năng chứa nhiều các hợp chất sinh học có tác dụng ức chế enzym AChE Động học ức chế enzym AChE của dịch chiết từ cây Hoàng liên ô rô chưa được nghiên cứu trước đây Ngoài ra, do phân đoạn dịch chiết n-BuOH có giá trị IC50 thấp nhất trong các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên ô rô (tác dụng ức chế enzym AChE cao nhất) nên chúng tôi sử dụng phân đoạn dịch chiết này để nghiên cứu động học ức chế enzym AChE Đồ thị Lineweaver–

Burk mô tả động học ức chế enzym của phân đoạn dịch chiết n-BuOH Đồ thị động học Lineweaver–Burk trong hình 3.7 có tính chất trung gian giữa 2 kiểu ức chế cạnh tranh và không cạnh tranh, cho thấy kiểu ức chế của phân đoạn dịch chiết n-BuOH là kiểu ức chế hỗn hợp [17,26] (trong đồ thị Lineweaver–

Burk thì hệ số góc =Km/Vmax, điểm giao trục Ox = -1/Km) Đồ thị động học Dixon trong hình 3.9 có tính chất đặc trưng của chất ức chế cạnh tranh [17,26,64] Hằng số ức chế Ki được xác định là giá trị tuyệt đối từ điểm giao của 3 đường trên trục Ox trên đồ thị Dixon, được vẽ theo

1/(tốc độ phản ứng) theo nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH Giá trị Ki được xỏc định theo đồ thị Dixon trong hỡnh 3.9 là 3,416 ± 0,05 àg/mL Ki là hằng số ức chế enzym cho phép đánh giá độ mạnh yếu của chất ức chế K i còn gọi là hằng số phân ly của phức hợp Enzym – Chất ức chế (E – I) không hoạt động và biểu hiện tác dụng ức chế Nếu phức hợp E – I có khuynh hướng dễ tách ra (Ki cao) enzym sẽ tự do hoạt động bình thường, do vậy hiệu quả ức chế sẽ yếu Nếu hằng số Ki nhỏ, chất ức chế bị liên kết chặt với enzym nên lượng enzym hoạt động sẽ nhỏ, do vậy tác dụng ức chế mạnh [26,64] Phân đoạn n-BuOH của dịch chiết cây Hoàng liên ô rô có giá trị hằng số K i nhỏ chứng tỏ có tác dụng ức chế enzym AChE mạnh

Kiểu ức chế hỗn hợp là kiểu ức chế đặc trưng của dược liệu, nguyên nhân là do trong thành phần dịch chiết có chứa một loạt các hợp chất có nhiều cơ chế tác dụng khác nhau [27] Cơ chế ức chế cho thấy các hợp chất có hoạt tính trong phân đoạn dịch chiết n-BuOH có thể cạnh tranh với ACTI để gắn vào trung tâm hoạt động – vị trí liên kết với cơ chất của enzym AChE hoặc kết hợp với enzym AChE hoặc kết hợp với phức hợp AChE-ACTI Trong trường hợp ACTI ở nồng độ cao, các hợp chất có hoạt tính trong phân đoạn dịch chiết có thể liên kết vào một vùng nhất định (không phải trung tâm hoạt động) của enzym AChE, làm biến đổi cấu hình phân tử enzym khiến enzym không liên kết được với cơ chất Điều này được khẳng định khi quan sát trên đồ thị thấy giá trị K max tăng và V max giảm khi nồng độ phân đoạn dịch chiết n- BuOH tăng

Phân đoạn n-BuOH của dịch chiết cây Hoàng liên ô rô có chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học, có tác dụng ức chế enzym AChE cao nhất trong các phân đoạn dịch chiết Tuy nhiên, kết quả này có thể là do tác dụng hiệp đồng của nhiều hợp chất trong phân đoạn dịch chiết này Vì vậy, cần tiếp tục phân lập các thành phần mang hoạt tính và làm sáng tỏ cơ chế tác dụng của chúng Nghiên cứu của chúng tôi là nghiên cứu đầu tiên đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE của dịch chiết cây Hoàng liên ô rô Do đó, việc tiếp tục nghiên cứu sâu hơn để phân lập và xác định thành phần các hợp chất có hoạt tính trong dịch chiết cây Hoàng liên ô rô là rất cần thiết và quan trọng.