Đánh giá tác dụng ức chế Enzym Xanthin Oxidase In Vitro của cây nở ngày đất (Gomphrena Celosiodes Mart.)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC VŨ THỊ HOA ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM XANTHIN OXIDASE IN VITRO CỦA CÂY NỞ NGÀY ĐẤT (GOMPHRENA CELOSIODES MART.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC VŨ THỊ HOA ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM XANTHIN OXIDASE IN VITRO CỦA CÂY NỞ NGÀY ĐẤT (GOMPHRENA CELOSIODES MART.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2012.Y Người hướng dẫn: ThS ĐẶNG KIM THU TS BÙI THANH TÙNG Hà Nội – 2017 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, nhận giúp đỡ quý báu tập thể, thầy cô giáo, bạn bè người thân Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Đặng Kim Thu, người thầy hướng dẫn tận tình quan tâm giúp đỡ tơi suốt q trình thực khóa luận Tơi chân thành biết ơn TS Bùi Thanh Tùng tận tình hướng dẫn, giải đáp thắc mắc giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám hiệu môn Khoa Y - Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: Các thầy cô anh chị kĩ thuật viên môn Dược lý – Dược lâm sàng,bộ môn Dược Liệu, môn Y – Dược học ở, Khoa Y-Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận Lời cuối cùng, tơi xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè, người thân - người ủng hộ, chia sẻ, động viên tơi lúc khó khăn giúp tơi hồn thành khóa luận Hà Nội, tháng 5, năm 2017 Sinh viên Vũ Thị Hoa MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Tăng acid uric máu 1.1.1 Sinh chuyển hóa acid uric 1.1.2 Vai trò enzym XO sinh chuyển hóa acid uric 1.1.3 Tăng acid uric máu 10 1.2 Enzym XO chất ức chế enzym XO 11 1.2.1 Enzym XO 12 1.2.2 Các thuốc có tác dụng ức chế enzym XO 13 1.3 Nở ngày đất (Gomphrena Celosiodes Mart.) 17 1.3.1 Nở ngày đất 17 1.3.2 Đặc điểm thực vật phân bố 18 1.3.3 Thành phần hóa học 18 1.3.4 Tác dụng dược lý 19 1.4 Các phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro 19 1.4.1 Phương pháp đo quang 20 1.4.2 Phương pháp đo áp 21 1.4.3 Phương pháp đo sử dụng HPLC với detector huỳnh quang 21 1.4.4 Một số phương pháp khác 21 CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.1.1 Dược liệu nghiên cứu 22 2.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 22 2.2 Phương tiện nghiên cứu 23 2.2.1 Hóa chất thuốc thử 23 2.2.2 Thiết bị dụng cụ 24 2.3 Nội dung nghiên cứu 24 2.4 Phương pháp nghiên cứu 25 2.4.1 Nghiên cứu triển khai mơ hình đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro dược liệu 25 2.4.2 Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym XO in vitro dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết Nở ngày đất 27 2.5 Phương pháp xử lí số liệu 30 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Kết 31 3.1.1 Kết nghiên cứu triển khai mơ hình đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro dược liệu 31 3.1.2 Kết nghiên cứu tác dụng ức chế enzym XO in vitro dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết Nở ngày đất 35 3.2 Bàn luận 38 3.2.1 Về nghiên cứu triển khai mơ hình đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro dược liệu 38 3.2.2 Về nghiên cứu tác dụng ức chế enzym XO in vitro dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết Nở ngày đất 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Tên viết tắt Tên đầy đủ ABTS 2,2’-azino-bis (3-ethybenzothiazolin-6-sulphonat) AHP 2-amino-4-hydroxypteridin DMSO dimethyl sulfoxid ETDA ethylence diamine tetraacetic acid FAD dinucleotide adenine flavin FDA Cục quản lí Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) HPLC sắc kí lỏng hiệu cao (high-performance liquid chromatography) IC50 nồng độ ức chế 50% (the half maximal inhibitory concentration) IXP isoxanthopterin 10 NSAIDS 11 OD mật độ quang học 12 SOD superoxide dismutase 13 XO xanthin oxidase thuốc chống viêm không steroid (non steroidial anti inflammatory drugs) DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzym XO chất xanthin lên hình thành acid uric 26 Bảng 3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzym XO chất xanthin lên hình thành acid uric 31 Bảng 3.2 Khả ức chế enzym XO in vitro Allopurinol 34 Bảng 3.3 Kết định tính flavonoid dịch chiết ethanol tồn phần phân đoạn dịch chiết Nở ngày đất 35 Bảng 3.4 Khả ức chế enzym XO in vitro dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết Nở ngày đất nồng độ khác 36 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ chuyển hóa purin 10 Hình 1.2 Cấu trúc enzym xanthin oxidase 12 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học Allopurinol 14 Hình 1.4 Cấu trúc hóa học Febuxostat (TMX-67, TEI-6720) 15 Hình 1.5 Cấu trúc hóa học Quercetin 17 Hình 1.6 Cấu trúc hóa học Luteolin 17 Hình 2.1 Cây Nở ngày đất 22 Hình 2.2: Quy trình chiết xuất dược liệu 23 Hình 2.3 Sơ đồ quy trình thí nghiệm 29 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nồng độ enzym XO chất xanthin lên hiệu suất phản ứng 32 Hình 3.2 Khả ức chế enzym XO in vitro Allopurinol 34 Hình 3.3 Khả ức chế enzym XO in vitro dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết Nở ngày đất nồng độ khác 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Xanthin oxidase (XO) enzym có cấu trúc phức tạp, biết đến cách 100 năm xem enzym chìa khóa chuyển hóa purin Enzym XO xúc tác cho phản ứng oxy hóa hypoxanthin thành xanthin phản ứng oxy hóa xanthin thành acid uric Đây hai phản ứng giai đoạn cuối q trình chuyển hóa base purin thể [29] Bất kì tác động ảnh hưởng đến hoạt động xanthin oxidase ảnh hưởng đến tạo thành acid uric Acid uric sản phẩm thối giáng cuối nucleoprotein có chứa nhân purin Tăng acid uric máu xác định yếu tố nguy gút [24] Nồng độ acid uric máu cao nguy mắc gút lớn [33] Bất kì yếu tố làm tăng trình tổng hợp giảm thải trừ acid uric làm tăng nồng độ acid uric máu [24] Vì vậy, việc sử dụng chất ức chế enzym XO để cản trở hình thành acid uric thể mục tiêu mà nghiên cứu hướng tới phòng điều trị bệnh gút Trên giới có nhiều nghiên cứu phát triển thuốc điều trị tăng acid uric máu Bên cạnh việc phát triển thuốc tổng hợp hóa học, thực vật dược liệu nguồn nguyên liệu lớn quan tâm giúp trình điều trị tăng acid uric máu Cây Nở ngày đất có tên khoa học Gomphrena celosiodes Mart., họ Dền (Amranthaceae) Người ta tìm thấy hợp chất phenolic, flavonoid, saponin, sterol, terpen, tannin coumarins thành phần hóa học Nở ngày đất [12] Nhiều nghiên cứu khả chống oxy hóa, khả ức chế cao lipid peroxidation acid linoleic [12][54] Tại số vùng người dân sử dụng Nở ngày đất để điều trị bệnh gút Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu khoa học công bố tác dụng điều trị bệnh gút khả ức chế enzym XO Nở ngày đất Trên thực đó, để góp phần sàng lọc nhằm tìm kiếm dược liệu có khả ức chế XO, bước đầu trình xác định dược liệu tiềm điều trị gút, đề tài nghiên cứu: “Đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro Nở ngày đất (Gomphrena Celosiodes Mart.)” thực với hai mục tiêu sau: Triển khai mơ hình đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro dược liệu Đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết Nở ngày đất ± 2,12 % Giữ nguyên nồng độ enzym 0,025 U/mL, thay đổi nồng độ xanthin 150 mM, 250 mM, 500mM hiệu suất phản ứng tăng dần đạt 82,17 ± 1,34 %; 83,24 ± 2,01 %; 85,13 ± 2,34 % Khi nồng độ enzym 0,05 U/mL, giữ nguyên nồng độ enzym tăng nồng độ xanthin tăng dần 75 mM, 150 mM, 250 mM, 500mM hiệu suất phản ứng tăng dần đạt 72,15 ± 1,96 %; 86,46 ± 1,67 %; 87,17 ± 1,89 %; 87,24 ± 2,22 % Cũng thay đổi nồng độ xanthin thành nồng độ 75 mM, 150 mM, 250 mM, 500mM, đo nồng độ enzym 0,1 U/mL hiệu suất phản ứng tăng dần tỉ lệ thuận với độ đậm đặc xanthin 75,46 ± 1,84 %; 91,17 ± 1,85 %; 93,15 ± 1,95 %; 94,06 ± 1,87 % Ở nồng độ enzym 0,2 U/mL nồng độ xanthin 75 mM hiệu suất phản ứng 85,32 ± 2,03 %, thay đổi nồng độ xanthin thành 150 mM, 250 mM, 500 mM nồng độ enzym giữ nguyên 0,2 U/mL hiệu suất phản ứng tăng dần kết 96,28 ± 1,94 %; 96,34 ± 1,85 %; 97,05 ± 1,95 % Kết cho thấy, nồng độ enzym khơng đổi, nồng độ xanthin tăng dần hiệu suất phản ứng tăng dần Nồng độ enzym không đổi, nồng độ xanthin tăng từ 75 mM lên 150 mM có khoảng tăng hiệu suất lớn nhất, thay đổi nồng độ xanthin lên 250 mM, 500 mM hiệu suất phản ứng có mức độ tăng khơng đáng kể Dựa vào kết trên, nhóm nghiên cứu chúng tơi chọn nồng độ enzym 0,2 U/mL nồng độ xanthin 150 mM cho thí nghiệm mơ hình nghiên cứu 3.1.1.2 Kết thẩm định phương pháp thông qua đánh giá tác dụng Allopurinol Allopurinol chất có tác dụng ức chế enzym XO in vitro in vivo sử dụng lâm sàng.Trong nhiều nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro sử dụng Allopurinol làm chất đối chứng Để thẩm định phương pháp đánh giá tác dụng ức chế hoạt động enzym XO in vitro dược liệu phương pháp đo quang, nhóm nghiên cứu chúng tơi tiến hành đánh giá tác dụng chất Kết biểu diễn Bảng 3.2 Hình 3.2: 33 Bảng 3.2 Khả ức chế enzym XO in vitro Allopurinol Nồng độ (µg/mL) Phần trăm ức chế (I%) 0,5 12,5 1,25 24,4 2,5 41,5 66,7 10 92,6 12,5 98,9 Hình 3.2 Khả ức chế enzym XO in vitro Allopurinol Nhận xét: Từ Bảng 3.2 Hình 3.2: Allopurinol thể khả ức chế enzym XO phụ thuộc vào nồng độ, nồng độ khác thể ức chế rõ rệt hoạt động enzym XO, nồng độ lên cao, khả ức chế lớn Nồng độ Allopurinol 0,5 µg/mL hiệu suất ức chế đạt 12,5 %, tăng nồng độ Allopurinol lên 1,25 µg/mL, 2,5 µg/mL, µg/mL, 10 µg/mL hiệu suất ức chế tăng đạt kết 24,4 %, 41,5 %, 66,7%,92,6 % Tại nồng độ 12,5 µg/mL khả ức chế đạt 98,9 % 34 Theo kết đồ thị, tác dụng ức chế enzym XO in vitro Allopurinol thể qua giá trị IC50 3,37 ± 0,24 µg/mL 3.1.2 Kết nghiên cứu tác dụng ức chế enzym XO in vitro dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết Nở ngày đất 3.1.2.1 Kết định tính flavonoid dịch chiết ethanol tồn phần phân đoạn dịch chiết từ Nở ngày đất Định tính flavonoid dịch chiết ethanol tồn phần phân đoạn dịch chiết Kết định tính flavonoid dịch chiết dược liệu trình bày Bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết định tính flavonoid dịch chiết ethanol toàn phần phân đoạn dịch chiết Nở ngày đất Phân đoạn EtOH n-hexan EtOAc n-BuOH Phản ứng Cyanidin ++ + + ++ +++ Phản ứng với kiềm ++ + ++ +++ Phản ứng với FeCl3 ++ + ++ +++ Phản ứng diazo hóa + _ + ++ Phản ứng Ghi chú: (+) phản ứng dương tính (-) phản ứng âm tính Nhận xét: Từ kết định tính Bảng 3.3 cho thấy Nở ngày đất có chứa thành phần flavonoid Trong đó, flavonoid có dịch chiết n-BuOH cho phản ứng định tính dương tính rõ sau dịch chiết ethanol tồn phần dịch chiết EtOAc Dịch chiết n-hexan cho phản ứng định tính flavonoid không rõ ràng 35 3.1.2.2 Kết đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro dịch chiết ethanol toàn phần phân đoạn dịch chiết từ Nở ngày đất Đánh giá ảnh hưởng dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết từ Nở ngày đất lên hoạt độ enzym XO in vitro Giá trị phần trăm ức chế I (%) dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết nồng độ khác từ Nở ngày trình bày Bảng 3.4 Hình 3.3 Bảng 3.4 Khả ức chế enzym XO in vitro dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết Nở ngày đất nồng độ khác Nồng độ (µg/mL) I (%) IC50 (µg/m L) µg/mL 10 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL Chứng 0 0 - EtOH 8,69 ± 0,67 15,85 ± 1,15 30,24 ± 1,32 51,05 ± 0,94 78,66 ± 1,12 47,37 ± 0,26 n-Hexan 4,24 ± 0,94 10,35 ± 0,61 23,75 ± 0,73 36,75 ± 0,87 56,23 ± 1.02 81,59 ± 0,21 EtOAc 12,77 ± 0,86 20,54 ± 0,76 39,55 ± 0,92 62,51 ± 1,21 86,57 ± 0,93 33,36 ± 0,51 n-BuOH 12,47 ± 1,17 25,57 ± 1,29 45,68 ± 1,03 68,37 ± 1,11 88,56 ± 0,74 27,39 ± 0,31 Phân đoạn 36 Hình 3.3 Khả ức chế enzym XO in vitro dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết Nở ngày đất nồng độ khác Nhận xét: Từ kết Bảng 3.4 Hình 3.3, cho thấy tác dụng ức chế XO dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết từ Nở ngày đất tăng dần theo nồng độ Dịch chiết ethanol toàn phần từ Nở ngày đất thể tác dụng ức chế enzym XO in vitro với giá trị IC50 tính 47,37 ± 0,26 µg/mL Trong phân đoạn dịch chiết từ Nở ngày đất, phân đoạn nBuOH thể tác dụng ức chế enzym XO in vitro mạnh với I% nồng độ cao 100 µg/mL 88,56 ± 0,74 %, giá trị IC50 tính 27,93 ± 0,31 µg/mL Tiếp theo phân đoạn EtOAc với giá trị I% đạt 86,57 ± 0,93 % nồng độ cao 100 µg/mL, giá trị IC50 tính 33,36 ± 0,51 µg/mL Phân đoạn n-hexan thể tác dụng ức chế enzym XO in vitro yếu với giá trị IC50 tính 81,59 ± 0,2 µg/mL Song song với mẫu thử, tiến hành tương tự với mẫu chứng dương Allopurinol cho thấy tác dụng ức chế enzym XO in vitro Allopurinol thể qua giá trị IC50 3,37 ± 0,24 µg/mL (Hình 3.2) 37 3.2 Bàn luận 3.2.1 Về nghiên cứu triển khai mơ hình đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro dược liệu 3.2.1.1 Về khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzym XO chất xanthin lên hình thành acid uric Xu hướng nghiên cứu tác dụng ức chế enzym XO dược liệu ngày phát triển, giới có nhiều phương pháp đánh giá hoạt độ enzym XO phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym XO, phương pháp đo quang dựa định việc lượng acid uric phương pháp phổ biến [52][44].Trong nước, có số nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế enzym XO sử dụng phương pháp này, vài nghiên cứu áp dụng đo quang hệ thống ELISA, có nghiên cứu áp dụng đo quang cuvet [5][9] Để hoàn thiện mơ hình đánh giá tác dụng ức chế enzym XO phương pháp đo quang dựa việc định lượng acid uric sử dụng cuvet, nhóm nghiên cứu chúng tơi tiến hành đề tài với nội dung đánh giá tác dụng ức chế enzym XO phương pháp đo quang dựa việc định lượng acid uric sử dụng cuvet Trong q trình bảo quản, chúng tơi ln giữ enzym XO nhiệt độ bảo quản 4oC Tuy nhiên, q trình pha tiến hành thí nghiệm, enzym bị hoạt hóa giảm hoạt độ Vì thế, giảm thiểu tối đa tình trạng này, q trình pha q trình làm thí nghiệm cốc đựng enzym sau thao tác ngâm nước đá để đảm bảo nhiệt độ thấp Enzym chất pha trước dùng Trong mơ hình chúng tơi, chúng tơi tiến hành khảo sát động học enzym XO sau khảo sát lựa chọn enzym nồng độ 0,2 U/mL xanthin nồng độ 150 mM cho thí nghiệm mơ hình, nồng độ enzym hoạt động xúc tác tốt, hiệu suất phản ứng tạo acid uric cao 3.2.1.2 Về thẩm định phương pháp thông qua đánh giá tác dụng Allopurinol Allopurinol thuốc sử dụng rộng rãi lâm sàng để điều trị tăng gút, có tác dụng hạ acid uric máu thơng qua chế ức chế hoạt động enzym XO, thường sử dụng làm chất đối chứng thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym XO Trong phương pháp này, Allopurinol thể ức chế enzym XO rõ rệt với giá trị IC50 3,37 ± 0,24 µg/mL Gía trị tương đối sát với khảo sát tiến hành trước đây, dùng để đối chứng trực tiếp với giá trị ức chế IC50 dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết thuốc.[5][9][52] 38 3.2.2 Về nghiên cứu tác dụng ức chế enzym XO in vitro dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết Nở ngày đất 3.2.2.1 Về định tính flavonoid dịch chiết ethanol tồn phần phân đoạn dịch chiết từ Nở ngày đất Nghiên cứu có mặt flavonoid dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết từ Nở ngày đất thông qua kết định tính phản ứng hóa học đặc trưng để xác định có mặt flavonoid Có thể nhận rằng, hàm lượng flavonoid tương đối cao dịch chiết ethanol toàn phần phân đoạn dịch chiết từ Nở ngày đất, đặc biệt flavonoid xác định có mặt nồng độ cao phân đoạn n-BuOH thể phản ứng mãnh liệt phản ứng hóa học đặc trưng tiến hành thí nghiệm Đã có nghiên cứu rằng, flavonoid có mặt rộng rãi nhiều thực phẩm đồ uống có nguồn gốc thực vật [31] Một số flavonoid biết đến chất chống oxy hóa mạnh chúng thể hoạt tính oxy hóa gốc tự ion hóa ion kim loại [19][22] Ngồi hoạt tính chống oxy hóa, có báo cáo flavonoid cịn có tác dụng ức chế enzym khác cyclooxygenase lipoxygenase [27] Một số flavonoid chứng minh thể tác dụng ức chế enzym XO sản xuất hydrogen peroxide anion superoxide q trình oxy hóa hypoxanthin thành xanthin, sau xanthin thành acid uric [41][43] Các nghiên cứu ức chế hoạt động enzym XO in vitro cho thấy số chất có tác dụng ức chế enzym p-aminophenol dạng oxy hoá, pyrogallol, bromoacetophenone, 6-pteridylaldehyde hydroxymethylpterin Việc kiểm tra cấu trúc hợp chất cho thấy chúng có đặc điểm chung giữ nhóm hydroxyl carbonyl Trong nghiên cứu mình, Beiler Martin hợp chất flavonoid, giàu nhóm hydroxyl có khả tạo thành hợp chất quinonoid hệ thống sinh học, có tác dụng chất ức chế xanthin oxidase Hoạt tính enzym XO bị ức chế nhóm flavonoid hợp chất có liên quan.[57] Các flavonoid có cấu trúc phẳng liên kết đôi C2=C3 hoạt động ức chế enzym XO mạnh so với flavonoid bị methyl hóa hay hydroxyl hóa [58] 3.2.2.2 Về đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro dịch chiết ethanol toàn phần phân đoạn dịch chiết từ Nở ngày đất Khả ức chế enzym XO in vitro dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết từ Nở ngày đất xác định dựa vào giá trị IC50 Trong nghiên cứu này, dịch chiết ethanol toàn phần phân đoạn n-hexan, phân đoạn EtOAc, phân đoạn n-BuOH từ Nở ngày đất thể tác dụng ức chế enzym XO in vitro với IC50 47,37 ± 0,26 µg/mL; 81,59 ± 0,2 µg/mL; 33,36 ± 0,5 µg/mL; 27,93 ± 0,3 39 µg/mL Điều chứng tỏ, cao chiết ethanol phân đoạn cao chiết n-hexan, cao chiết EtOAc cao chiết n-BuOH chứa chất có hoạt tính ức chế enzym XO Trong đó, hàm lượng chất có hoạt tính ức chế enzym XO có mặt nhiều phân đoạn cao chiết n-BuOH phân đoạn EtOAc Điển hình hợp chất flavonoid, đánh giá có khả ức chế hoạt động enzym XO hoạt tính chống oxy hóa cao Kong cộng (2002) có nghiên cứu rằng, việc ức chế hoạt động enzym XO không giảm nồng độ acid uric máu, mà giảm sản xuất gốc tự [38] Sự ức chế hoạt động enzym XO xem chế chống oxy hóa hợp chất polyphenol Nhiều nghiên cứu enzym XO chứng minh rằng, hoạt động enzym XO nguyên nhân dẫn tới tạo nhiều gốc tự Nên việc bổ sung chất ức chế enzym XO vừa có tác dụng ức chế tạo thành acid uric ngăn ngừa bệnh gút, vừa có tác dụng ngăn chặn lại stress oxy hóa nguyên nhân gây tổn thương tế bào mô thể [21][32].Vì vậy, nhóm nghiên cứu chúng tơi tiến hành đánh giá khả ức chế enzym XO Nở ngày đất dược liệu rẻ tiền, dễ kiếm kết nghiên cứu mở hướng cho việc sử dụng Nở ngày đất làm nguồn dược liệu tiềm để nghiên cứu chất ức chế XO, chất từ phân đoạn n-BuOH phân đoạn EtOAc 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Về nghiên cứu triển khai mơ hình đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro dược liệu Đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzym XO chất xanthin lên hình thành acid uric Khảo sát lựa chọn nồng độ enzym nồng độ chất xanthin thích hợp cho mơ hình,trong đó: nồng độ enzym 0,2 U/mL nồng độ xanthin 150 mM cho thí nghiệm mơ hình nghiên cứu Đã triển khai mơ hình đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro dược liệu phương pháp đo quang bước sóng 295 nm Bằng phương pháp nhóm nghiên cứu xác định IC50 Allopurinol 3,37 ± 0,24 µg/mL Về nghiên cứu tác dụng ức chế enzym XO in vitro dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết Nở ngày đất Đã chứng minh có mặt flavonoid dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết từ Nở ngày đất, so sánh nồng độ flavonoid dịch chiết Đã đánh giá tác dụng ức chế enzym XO dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết từ Nở ngày đất Kết nghiên cứu xác định dịch chiết ethanol toàn phần từ Nở ngày đất ức chế enzym XO in vitro với giá trị IC50 47,37 ± 0,26 µg/mL Phân đoạn dịch chiết n-BuOH thể tác dụng ức chế enzym XO in vitro với giá trị IC50 tính 27,93 ± 0,31 µg/mL Tiếp theo phân đoạn EtOAc với giá trị IC50 tính 33,36 ± 0,51 µg/mL Phân đoạn n-hexan thể tác dụng ức chế enzym XO in vitro yếu với giá trị IC50 tính 81,59 ± 0,2 µg/mL ĐỀ XUẤT Từ kết thu được, nhóm nghiên cứu chúng tơi xin đề xuất : - Tiếp tục triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế hoạt động enzym XO phương pháp đo quang bước sóng 295 nm - Khảo sát khả ức chế enzym XO cao chiết từ Nở ngày mức độ in vivo - Nghiên cứu thành phần hóa học tách phân đoạn với dung môi khác cao chiết từ Nở ngày đất nhằm khảo sát hợp chất có hoạt tính sinh học ức chế enzym XO 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Đình Bích; Trần Văn Ơn, Thực vật học, Thực vật học, (2007) Bộ Y tế, Dược lý học tập 2, Hà Nội: Nhà xuất Y học, 2007 Cần Tào Duy Cần, “Thuốc bệnh 24 chuyên khoa,” Thuốc trị bệnh gout – tăng acid uric huyết, Hà Nội., Nhà xuất Y học, 2006 Đoàn Văn Đệ, “Bệnh Gút,” Bệnh học nội khoa tập II, Nhà xuất quân đội nhân dân, 2008, pp 43-53 Nguyễn Thị Huệ, “Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro đĩa 96 giếng áp dụng với số thuốc có tiềm khai thác đồng bào Pako-Vân Kiều,” Khoá luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội, 2013 Nguyễn Thị Liễu, Nghiên cứu chiết tách xác định thành phần hóa học số dịch chiết Nở ngày đất, Đại học Sư Phạm Đà Nẵng, 2016 Nguyễn Văn Mùi, “Xác định hoạt độ enzym,” Hà Nội, NXB Khoa học Kỹ thuật, (2002) Đoàn Trọng Phụ, “Acid nucleic sinh tổng hợp protein,” Hóa sinh y học, Nhà xuất quân đội nhân dân Hà Nội, 2010, pp 217-219 Đái Thị Xuân Trang, “Khảo sát khả ức chế enzym xanthin oxidase từ sa kê Artocarpus altilis (Park.),” Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ, 2014, pp 94-101 10.Trịnh Kiên Trung, Nghiên cứu nồng độ acid uric máu, bệnh gút hội chứng chuyển hóa người từ 40 tuổi trở lên thành phố Cần Thơ, Hà Nội: Học viện Quân y, 2015 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 11.Al-Khalidi U.S.A ; Chaglassian T H, "The species distribution of xanthine oxidase," vol 97, pp 318-320, 1965 12.Aydermy T; Öztürk R; Bozkaya A L, "Effects of antioxidant vitamins A, C, E and trace elements Cu, Se on CuZnSOD, GSH- Px, CAT and LPO levels in chicken erythrocytes," Cell.Biochemistry.Function, vol 18, pp 109-115, 2000 13.Becker M A; Schumacher H A; Espinoza L R; Wells A F; MacDonald P;Lloyd E et al, "The uratelowering efficacy and safety of febuxostat in the treatment of the hyperuricemia of gout: the CONFIRMS trial.," Arthritis Res Ther [PMID: 20370912], vol 12, 2013 14.Becker M A; Schumacher H R; Wortmann R L; MacDonald P A; Eustace D; Palo W A; Streit J; Joseph-Ridge N, "Febuxostat compared with allopurinol in patients with hyperuricamia and gout," N Engl J Med, vol 353 (23), pp 2450-2461, 2005 15.Berboucha M; Ayouni K; Atmani D; Atmani D, "Kinetic study on the inhibition of xanthine oxidase by extracts from two selected Algerian plants traditionally used for the treatment of inflammatory diseases," vol 13, 2010 16.Borges F; Fernades E; Roleira F, "Progress towards the discovery of xanthine oxidase inhibitors," Curr Med Chem, vol 9(2), pp 195-217, 2002 17.Brunton L L; Lazo J S; Parker K L, "Goodman & Gilman’s," The Pharmacological basis of therapeutics, pp The Mc.Graw-Hill Companies., 11th 2006 18.Candan F, "Effect of Rhus coriariA L (Anacardiaceae) on superoxide radical scavenging and xanthine oxidase activity,," Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, vol 18 (1), p 59–62, 2003 11 19.Cker A; Van.S A B E; Berg D; Den J; Van L; Tromp M N J; Griffioen H; Bennekom D; Van P; Vijgh W; Bast A, "Structural aspects of antioxidant activity of flavonoids," Free Radic Biol Med, vol 20, pp 331-342, 1996 20.Cos P; Ying L; Calomme M et al, "Structure-activity relationship and classification of flavonoids as inhibitors of xanthine oxidase and superoxide scavengers," Journal of Natural Products, vol 61, pp 71-1 76, 1998 21.Cotelle N, "Role of flavonoids in oxidative stress," in Cur Top Med Chem, 2001 22.Cotelle N; Bernier J L; Henichart P; Catteau J P; Gaydou E; Wallet J C, "Scavenger andtioxidant properties of ten synthetic flavones," Free Radic Biol Med, vol 13, pp 211-219, 1992 23.Dhungat.S B; Sreenivasan A, "The use of pyrophosphate buffer for the manometric assay of xanthine oxidase," J Chem Biol, vol 208 (2), pp 845-852, 1954 24.DiPiro J T; Talbert R L; Yee G C; Wells B G; Posey L M, "Gout and hyperuricemia," no Pharmacotherapy: A Pathophysiologic Approach 7th ed, 2008 25.Edwards N L, "Febuxostat: a new treatment for hyperuricemia in gout," Rheumatology, vol 18, pp 15-19, 2009 26.Flemmig.J; Kuchta K; Arnhold J; Rauwald H W, "Olea europaea leaf (Ph.Eur.) extract as well as several of its isolated phenolics inhibit the gout-related enzyme xanthine oxidase,," Phytomedicine, vol 18 (7), p 561–566, 2011 27.Formica J V; Regelson W, "Review of the biology of quercetin and related bioflavonoids," Food Chem Toxic, vol 33, pp 1061-1080, 1995 28.Hair P I; McCormack P L; Keating G M, "Febuxostat," Adis Drugs Profile, vol 68 (13), pp 1865-1874, 2008 29.Harrison R, "Structure and function of xanthine oxidoreductase: where are we now," Free Radical Biology & Medicine, vol 33 (6), p 774 –797, 2002 30.Hashimoto S, "A new spectrophotometric assay method of xanthine oxidase in crude tissue homogenate," Analytical Biochemistry, vol 62, pp 426-435, 1974 31.Herrmanm K, "Flavonols and flavones in food plants: a review," J Food Technol, vol 11, pp 433-448, 1976 32.Hoorn D E.Van; Nijveldt R J; Leeuwen P A Van; Hofman Z; ’Rabet M L, "Accurate prediction of xanthine oxidase inhibition based on the structure of flavonoids," in Eur J Pharm.451, 2002 33.John Imbodem; David Hellmann; John Stone, "Gout," in Current Rheumatology diagnosis and treatment, Mc Graw Hill Press,Ebook, 2007 34.Katzung B G; Masters S B; Trevor A J, in Basic and clinical Pharmacology 11th ed, The McGraw-Hill Companies, 2009 35.Kelley E E; Khoo N K H; Hundley N J; Malik U Z; Freeman B A; Tarpey M M, Free Radical Biology and Medicine, Vols 48, no 4, no Hydrogen peroxide is the major oxidant product of xanthine oxidase, p 493–498, 2010 36.Khanna D; Fitzgerald J D; Khanna P P; Bae S; Singh M K ; Neogi T, "American College of Rheumatology guidelines for management of gout Part 1: systematic nonpharmacologic and pharmacologic therapeutic approaches to hyperuricemia.," Arthritis Care Res (Hoboken).[PMID: 23024028], vol 64, pp 1431-1446, 2012 37.Kittleson M M; Hare J M, "Xanthine oxidase inhibitors: an emerging class of drugs for heart failure," Eur Heart J, vol 26(5), pp 1458-1460, 2005 38.Kong L D; Zhou J; Wen Y L.; Cheng J M, "Aesculin possesses potent hypouricemic action in rodents but is devoid of xanthine oxidase/dehydrogenase inhibitory activity," Planta Med, vol 68, pp 175178, 2002 39.Maijkic-Singh N; Bavac L; Kalimanovska V;Jelic Z; Spasic S, "Spectrophotometric assay of xanthine oxidase with 2,2’-azino-di(3ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) (ABTS) as chromogen," Clin Chim Acts, vol 162(1), pp 29-36, 1987 40.Massey V, "On the mechanism of inactivation of xanthine oxidase by allopurinol and other pyrazolo[3,4- d] pyrimidines," J Biol.Chem, vol 245, pp 2837-2844, 1970 41.Mc Cord J M, "Oxygen-derived free radicals in post-ischemic tissue ịjnury," N Engl J Med, vol 312, pp 159-163, 1985 42.Muraoka S, "Biochim Biophys," Studies on xanthine oxidase: II Mechanism of substrate inhibition and its reversal by histamine, vol 73(1), pp 27-38, 1963 43.Nishino T; Nakanishi S; Okamoto K; Mizushima J; Hori H; Iwasaki T; Ichimori K; Nakazawa H, "Conversion of xanthine dehydrogenase into oxidase and its role in reperfusion injury," Biochem Soc Trans, vol 25, pp 783-786, 1997 44.Noro T; Oda Y; Miyase T; Ueno A; Fukushima S, "Inhibitors of xanthine oxidase from the flowers and buds of Daphne genkwa," Chem.Pharm.Bull, vol 33 (11), pp 3984-3987, 1983 45.Pacher P; Nivorozhkin A; Szabo C, "therapeutic effects of xanthine oxidase inhibitiors: Renaissance half a century after the discovery of allopurinol," Pharmacol Rev, vol 58, pp 87-114., 2006 46.Sánchez-Lozada L G, "Treatment with the xanthine oxidase inhibitor febuxostat lowers uric acid and alleviates systemic and glomerularh ypertension in experimental hyperuricaemia," Nephrol Dial Transplant, 2008, pp 23, 1179 - 1185 47.Sasaoka T; Kaneda N; Nagatsu T, "Highly sensitive assay for xanthine oxidase activity by high- performance liquid chromatography with fluorescence detection," Journal of Chromatography, vol 424 (2), pp 392-397, 1998 48.Schardinger.F, "Ueber das Verhalten der Kuhmilchgegen Methylenblau und seine Verwendungzur Unterscheidung von ungekochterund gekochter Milch," Zeitschrift fur Untersuchung ă der Nahrungs- und Genussmittel, vol 5, 1902, pp 1113 – 1121 49.Sharma Neha; Rekha Vijayvergia V, "The chemical composition of Gomphrena closioside," Internationl Journal of Pharma and Bio Sciences, 2011 50.Tierney L; Mc Phee S J; Papodakis M A, ““Các bệnh xương khớp”,” Chẩn đoán điều trị y học đại tập 1, Hà Nội, Nhà xuất Y học, 2008 51.Tuhina Neogi M D, "GOUT," in Annals of Internal Medicine, American College of Physicians, 2016 52.Umamaheswari M, AsokKumar K; SoMasundaram A; Sivashanmugam T; Subhadradevi V; Ravi T K, "Xanthine oxidase inhibitory activity of some Indian medical plants," Journal of Ethnopharmacology, vol 109, no 3, pp 547-551, 2007 53.Yang T; Chu C H; Bai C H et al, "Uric acid level as a risk marker for metabolic syndrome: A Chinese cohort study," in Atherosclerosis, 2012, pp 525-531 (220) 54.Yildirim A; Mavi A; Oktay M, "Comparison ofantioxidant and antimicrobial activities of Tilia (TiliaargenteaDesf Ex DC), Sage (SaviatrilobaL.), and Black Tea (Camellia sinensis) extracts," J Agric Food Chem, vol 48(10), pp 5030-5034, 2000 55.James M Pauff and Russ Hille, " Inhibition Studies of Bovine Xanthine Oxidase by Luteolin, Silibinin, Quercetin, and Curcumin," J Natural Products, vol 72(4), pp 725-731, 2009 56.Yan J; Zhang G; Hu Y; Ma Y, " Effect of luteolin on xanthine oxidase: inhibition kinetics and interaction mechanism merging with docking simulation," Food Chemistry, vol 141 (4), pp 3766-3773, 2013 57.Beiler J M and Gustav J Martin, "The inhibition of xanthin oxidase by flavonoids and related compounds," J Biol Chem, vol 192, pp831-834, 1951 58.Suyun Lin; Guowen Zhang; Yijing Liao; Junhui Pan and Deming Gong, "Dietary Flavonoids as Xanthine Oxidase Inhibitors: Structure Affinity and Structure–Activity Relationships," J Agric Food Chem, vol 63 (35), pp 7784–7794, 2015