Giớithiệuvềliposome
Cơchếhìnhthànhliposome
Liposome có cấu trúc bao gồm một vỏ phospholipid với một hoặc nhiều lớpbao bọc xung quanh một nhân nước ở giữa và có kích thước hạt từ hàng chục chođếnhàngnghìnnanomet[5]. Đặctínhcủamàngphospholipidcủaliposomelàlớpképp h o s p h o l i p i d Trong đó, “đầu ưa nước” là đầu phospholipid chứa một nhóm phosphat tích điện âmvà glycerol; “đuôi kỵ nước” là đuôi phospholipid gồm 2 chuỗi axit béo dài, kỵ nướcvà tránhtương tác với nước Cáclớp kép lipid khiđược đặt trongd u n g d ị c h n ư ớ c thì các đầu ưa nước sẽ quay ra ngoài để tiếp xúc với nước và các đuôi kỵ nước sẽquayvàovớinhaubởitươngtáckỵnướctạothànhcấutrúcliposome.
Phânloạiliposome
Tùy từng thành phần lipid, phương pháp bào chế, điện tích bề mặt và kíchthước mà các liposome hình thành có các đặc tính khác nhau; thường khác nhau vềcấu trúc, kích thước và khả năng mang thuốc/ hoạt chất Phân loại liposome thườngdựa vào cấu trúc của lớp lipid kép Bên cạnh đó, phương pháp bào chế cũng là mộttrongnhữngcáchphânloạiliposome.
Dựa vào số lớp màng lipid kép và kích thước hạt, liposome được phân loạithànhcác dạngnhưtrongBảng1.1.
Dạngliposome Từviếttắt Kíchthước hạt Sốlớp mànglipidkép
Liposomechứaliposome MVV >1àm Cấutrỳcđa ngăn Đalớp OLV 0,1–1àm 5 Đalớp MLV >0,5àm 5–25 Đơnlớpkhổnglồ GUV >1àm 1 Đơnlớploạivừa MUV >100àm 1 Đơnlớp loạilớn LUV >1000àm 1 Đơnlớploạinhỏ SUV 20– 100nm 1
Với các tác nhân khác nhau được biến tính trên bề mặt mà liposome đượcphânloạithànhcácdạng sau[8]:
- Conventional liposome (liposome): liposome thế hệ đầu tiên và cơ bản nhấtđược phát triển, trong đó, thành phần lớp màng lipid chỉ chứa các lipid tích điệndương,âmhoặctrungtính.
- PEGylated liposome (liposome PEG hóa): liposome biến tính bề mặt bằngcách sử dụngcác polymerưa nước phủ bênngoài lớpmàngphospholipid képđ ể làm giảm tỷ lệ đào thải thuốc và tăng thời gian lưu thông trong máu Trong đó,polyethyleneglycol(PEG)làmộttrongsốnhữngpolymerđượcsửdụngphổbiế nđểbiếntínhcáchệnanomangthuốcmanglại hiệuquảnhấthiện nay.
- Ligand-targeted liposome (liposome hướng đích): liposome được biến tínhbề mặt bằng cách gắn các phối tử hướng đích lên lớp màng phospholipid kép hoặcđược gắn ở các đuôi của polymer bảo vệ Các phối tử này thông qua cơ chế miễndịch tương tác kháng nguyên – kháng thể hoặc phối tử – thụ thể trên màng tế bào đểnhậnbiếtvàliênkếtvớimụctiêu.
- Multifunctional liposome (liposome đa chức năng): liposome được kết hợpnhiều chức năng khác nhau trong cùng một cấu trúc liposome để phục vụ cùng lúcnhiều mụcđíchkhácnhau.
Nhượcđiểmvàưuđiểmcủaliposome
Mộtsố p h ư ơ n g p háp t ổ n g hợ pl i p o s o m e g â y các t á c đ ộn g b ấ t l ợ i đ ế n m ô i trường dosử dụngdungmôihữucơđểhòatanlipid.
Liposom có khả năng mang được các hoạt chất tan trong nước (hoạt chấtđược nang hóaở cáckhoang nước nằm chính giữa lớp phospholipidk é p ) v à c á c hoạt chất ít tan trong nước (hoạt chất được nang hóa trong lớp màng phospholipidkép) Bên cạnh đó, khả năng phóng thích và bảo vệ hoạt chất của liposome đượckiểm soát Vì vậy, đặc điểm dược động học của hoạt chất được thay đổi khi nanghóatrongliposome [9].
Liposome là một chế phẩm có tính an toàn khá cao vì cấu trúc của lớp màngphospholipidképcủaliposometươngtựnhư cấutrúcmàngsinh họccủacơthể[9].
Liposome là một trong những hệ mang thuốc hướng đích lý tưởng để tăngnồngđộthuốcởnhữngmôđặcbiệtnhưmôungthư.Đặcbiệt,liposomecòntạora hệ vận chuyển thuốcchọn lọc như liposome miễn dịch và liposome đápứ n g c á c kíchthíchnhư liposomenhạynhiệt,nhạypH…
Nguyênliệutổnghợpliposome
Phospholipid là thành phần chính của liposome Phospholipid dùng để tổnghợp liposome rất đa dạng và được chia làm hai loại chính là phospholipid tự nhiênvàphospholipidtổnghợp[10].
Phosphatidylcholine(PC):phosphatidylcholinetừlecithincủatrứng(eggphos phatidylcholine-EPC)hoặcđậunành(soyap h o s p h a t i d y l choline-SPC)
Lecithingồmchủyếulàphosphatidylcholine,phosphatidylethanolamine,phosphatidylserine và phosphatidylinositol kết hợp với các chất khác nhau nhưtriglyceride,acidbéovàcarbohydrate,táchratừnguồndầuthựcvậtthô [11].
Hình1.2.Côngthứccấutạocủalecithincónguồngốc đậunành(SPC) a Bảoquản Lecithin được bảo quản ở nơi tránh ánh sáng và tránh ẩm Liposome thườngđượcbảoquảnởnhiệtđộphòngvàkhôngbảoquảnliposmetrong trong ngănđá củatủlạnh. b Độctính Việc sử dụng lecithinc ó r ấ t í t h o ặ c k h ô n g c ó t h ô n g t i n v ề đ ộ c t í n h T r o n g một báo cáo trên chuột nhận thấy sự thay đổi sinh hóa và rối loạn thần kinh ở chuộtănchếđộănuốngkhôngquálecithinlactic5%trongthờikỳmangthai. c Ứngdụng
- Lecithin được sử dụng như một chất ổn định và chất nhũ hóa trong sản xuấtdượcphẩm,thựcphẩm,mỹphẩmvàcácngànhcôngnghiệpkhác.
- Lecithin được sử dụng để điều trị cho rối loạn thần kinh và dementias.Phosphatidylcholine là tiền chất của acetylcholine (ACH) tổng hợp và là chất quantrọngđốivớinhiềuchứcnăngnãobaogồmbộnhớ.Cholinetrongphosphatidylcholin e giúp tăng tích tụ ACH trong não do đó dẫn đến tăng dẫn truyềnthầnkinhvàcảithiệntrínhớ.
- Lecithin được sử dụng trong điều trị tăng cholesterol máu và các bệnh liênquan đến gan Cơ chế điều trị này là sự tăng cường trao cholesterol trong hệ thốngtiêuhóa[70].
Cholesterol có tác dụng làm giảm độ cứng và tính thấm của lớp vỏ liposome.Tỷ lệ giữa các phospholipid:cholesterol là rất quan trọng Tỷ lệ này quyết định đặcđiểm và sự ổn định của màng [12] Trong cấu trúc lớp màng lipid kép của liposome,phospholipidvàcholesteroltươngtác liênkếtnhauquacáccầunối acyl.
Là các phân tử có cấu trúc amphiphilic, chất hoạt độ bề mặt cho nhiều ứngdụng tiềm năng trong các lĩnh vực như sản xuất vật liệu có độ tinh khiết cao, hỗ trợvậnchuyểnthuốchoặcổnđịnhcôngthức thuốc.
Cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) là chất hoạt động bề mặt có khảnăng tạo nhũ tương tốt [13] Chất hoạt động bề mặt cation này có nhóm phân cực bịphân ly thành ion dương trong dung dịch và thường là các dẫn xuất của muối amonibậc4.
Là hỗn hợp các este từng phần của các axit béo khác nhau, Polysorbat 80(tween 80) thường là axit oleic với sorbitol và các anhydride Chất hoạt động bề mặtnày được sử dụng rộng rãi làm chất nhũ hóa, chất hòa tan và chất ổn định trong cácsản phẩm mỹ phẩm và thực phẩm, cũng như các công thức thuốc uống, thuốc khôngdùngquađườngtiêuhóavàthuốcbôingoàida.
Một số sản phẩm thuốc có chứa polysorbat bao gồm thuốc hen suyễn, khángsinh,chống dị ứng, thuốc chống động kinh, corticosteroid, thuốc bôi ngoài da, thuốcanthần,thuốc chốngungthư vàvitamin.
Phương pháptổnghợpliposome
Hydrat hóa màng mỏng lipid là một trong những phương pháp phổ biến nhấthiệnnaydùngđểtổnghợpliposome.PhươngphápnàyđượcAlecDouglasBanghamtrìnhbàyv àonăm1965vàcáchtiếnhành như sau:
- Tạo lớp màng film lipid: lipid được hòa tan trong dung môi thích hợp vàtiến hành làm bay hơi dung môi bằng cô quay chân không Trong bước này, cácphântử lipidtự sắpxếp và tạothànhcáclớplipid.
- Hydrat hóa lớp màng film lipid: dung dịch đệm, nước hoặc dung dịch mangthuốc được thêm vào để tiến hành hydrat hóa lớp màng film lipid Liposome đa lớpvàhỗndịchliposomesauhydratđượcgiảmkíchthướchạtvàtạothànhcácliposome đơn lớp bằng với kích thước hạt nhỏ bằng các phương pháp như nén quamàng,sóngsiêuâm, đồnghóaáplựccao
Thuốc được đưa vào liposome ở các giai đoạn khác nhaut ù y v à o b ả n c h ấ t của từng loại thuốc [14] Cụ thể như thuốc tan trong nước sẽ được thêm vào trongbước hydrat hóa lớp màng lipid và thuốc ít trong nước sẽ được thêm vào trong bướctạo lớp màng film Hiệu suất mang thuốc ít tan trong nước của liposome là khá cao.Ngượclại,đốivớicácloạithuốctantrongnước,hiệusuấtmangt h u ố c c ủ a liposomethuđược khôngcao.
Biếntínhbềmặtnanoliposome
PEGhóabềmặtvậtliệu
PEG hóa là phương pháp biến tính vật liệu bằng các phân tử hoặc dẫn xuấtcủa polyethylene glycol Khi được tích hợp trên bề mặt liposome, các phân tử PEGhình thành liên kết với các phân tửn ư ớ c , t ạ o t h à n h l ớ p h y d r a t h ó a b a o b ọ c b ê n ngoài vật liệu Nhờ đó, quá trình opsonin hóa cũng như sự tấn công bởi các khángthể và đại thực bào của hệ thống lưới nội mô (RES) lên liposome bị hạn do sự hấpphụcủaproteinlênbềmặt hạtnano đãbịcảntrở[3,4].
Chiến lược PEG hóa các hạt nano liposome bắt nguồn từ sự quan sát thấyrằng các hạt nano thông thường có thời gian lưu thông trong hệ tuần hoàn ngắn saukhi tiêm tĩnh mạch, cũng như dễ bị rò rỉ thuốc bên trong Cho đến những năm 1990,cácthửnghiệmđượctiếnhànhbởimộtsốnhómcácnhànghiêncứukhoahọcđãchỉ ra rằng sự PEG hóa bềmặtvật liệu giúp cải thiện đáng kể sựổ n đ ị n h v à t h ờ i gian tuần hoàn của liposome Nó có thể được ví như việc trang bị thêm khả năngtàng hình trước ra đa dò tìm cho một chiếc máy bay chiến đấu ném bom tự động.Khả năng này được minh họa rõ nhất bằng ứng dụng PEG hóa trên liposome mangdoxorubicin (có tên thương mại là Doxil ® ), hệ liposome mang thuốc này đã giúptăng thời gian lưu thông trong máu của thuốc từ vài phút lên đến vài giờ Mặc dù đãmở rộng nghiên cứu hướng đến biến tính bề mặt hạt nano bằng các loại polymerkhác có tác dụng tương tự, như polyxamer, polyvinyl alcohol, polyacrylamide… thìPEGlàvậtliệuđượcsử dụngrộngrãi vàphổbiếnnhấtchođếnngàynay[15,16].
Sự PEG hóa liposome có thể đạt được bằng nhiều phương pháp khác nhau.Trong số đó, phương pháp được sử dụng phổ biến nhất là biến tính PEG trên màngphospholipidbằngcáchsửdụngliênhợpPEG – lipid[17].Tuynhiên,biệnpháp nàylạidẫnđếnsự phóngthíchchậmcủathuốc. Đặc điểm của liposome được PEG hóa đó là sự tăng kích thước, tăng độ hòatan và tăng thời gian tuần hoàn do khả năng bảo vệ của PEG trước các yếu tố miễndịch so vớiliposomethôngthường[18].
Phương phápbiếntínhPEGlênbềmặtliposome
Có 3 phương pháp được sử dụng để biến tính PEG lên bề mặt liposome:(1)biếntínhPEGtrongquátìnhtổnghợpliposome(pre-insertion),(2)biếntínhPEG lênbềmặtliposomeđãđượctổnghợp(post-insertion)và(3)biếntínhPEGlênbềmặt liposomeđãđượctổnghợpbằngphảnứnghóahọc(post-modification)[19].
Hình 1.6.Hình ảnh so sánh giữa liposome được biến tính PEG trong quá trình tổnghợp(I)vàbiếntínhPEGlênliposomeđãđượctổnghợptừ trước(II)[19]
1.2.2.1 Biếntính PEGtrongquá tìnhtổnghợpliposome(pre-insertion)
Phương pháp biến tính PEG lên bề mặt liposome trong quá tình tổng hợpliposome là một phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trong các nghiên cứu vềliposome PEG hóa
[20] Dẫn chất lipid gắn PEG được gắn vào cấu trúc lớp mànglipid của liposome, trong đó,dẫn chất lipid được chèn vào lớp màng lipid kép vàphần PEG ưa nước hướng ra khoang nước Trong phương pháp này, dẫn chất lipidgắn PEG đươc hòa tan vào dung môi hữu cơ cùng với các thành phần khác trongtổng hợp liposome Sau đó, tiến hành hydrat hóa tạo màng film lipid tương tự nhưtrong tổng hợp liposome không biến tính PEG Đối với phương pháp này, PEG sẽphân bố ở cả hai phía của lớp màng lipid kép làm giảm lượng hoạt chất được tải vàochất mang và đây cũng là một nhược điểm chính Bên cạnh đó, PEG-phospholipiddễ bị phân hủy do xúc tác acid/bazơ trong các liposome dựa vào sự chênh lệch pH[21].Quátrìnhthủy phângâyảnhhưởngđếnquátrìnhmanghoạtchấtbêntrongcác liposome này Đặc biệt, PEG-lipid thương mại tương đối đắt tiền nhưng về cơbảnkhônghiệuquảvàkhônggópphầnvàoviệclàmtăngtínhổnđịnh,sựbềnbỉlưu thông của liposome nên không mang lại hiệu quả kinh tế cao khi thương mạihóa.KíchthướcliposomecàngnhỏthìtácđộngcủaPEGbêntrongkhoangnước đến khả năng tải hoạt chất và độ ổn định của liposome càng lớn Trong trường hợpliposomeđalớp,không gianchứahoạtchấtbịgiảmxuốngrấtnhiều[19]. Ưu điểm vượt trội của phương pháp biến tính PEG lên bề mặt liposome trongquátìnhtổnghợp là cácbước thựchiên tươngđốiđơn giản.
Phương pháp biến tính PEG lên bề mặt của liposome đã được tổng hợp từtrước được thực hiện dựa vào khả năng di chuyển của phân tử lipid từ pha lipid nàyquaphalipidkhácnhờvàonhiệtđộchuyểnphacủalipid.Đượcbáocáođầutiênbởi Uster và cộng sự (1999), dẫn chất PEG-lipid được biến tính lên bề mặt liposomeđã được tổng hợp từ trước được thực hiện bằng cách cho từ từ PEG- lipid vàoliposome ở nhiệt độ gần với nhiệt độ nóng chảy (T m ) của lipid cấu thành [22]. Quátrình này được thúc đẩy bởi sự tương tác kỵ nước của lipid màng và phần kỵ nướccủa PEG-lipid Để ngăn chặn sự tự tạo thành micelle của các phân tử lipid, nồng độcủa PEG- lipid được duy trì ở mức thấp hơn nồng độ micelle tới hạn (CMC) củachúng. Lúcnày,nhiệtđộnglựchọcđểchènPEG-lipidvàolớplipidképcủaliposome thấp hơn so với việc tạo thành micelle PEG-lipid giúp hạn chế tạo thànhliposome PEG hóa [23] Sự thành công của nghiên cứu của Uster và cộng sự đã thuhút được sự tập trung sử dụng phương pháp này trong các nghiên cứu tổng hợp cáchệ mang thuốc dựa trên liposome [22-24] Uster và cộng sự đã tiến hành nghiêncứub i ế n t í n h P E G -
D S P E l ê n l i p o s o m e đ ã đ ư ợ c t ổ n g h ợ p t ừ t r ư ớ c b ằ n g p h ư ơ n g pháp post-insertion [25]. Trong nghiên cứu của Nag và cộng sự, liposome đã đượctổng hợp từ trước được biến tính HDAS-PEG đã được chứng minh sự ổn định củaPEG trên bề mặt liposome bằng hình ảnh chụp kính hiển vi đồng tiêu (confocalmicroscopy) [26] Nghiên cứu của Awasthi và cộng sự đã cho thấy sự kéo dài thờigian tuần hoàn trong máu của liposome được biến tính PEG bằng PEG5000-DSPEtrên nghiên cứuin vivotrên thỏ [24] Quá trình PEG hóa làm tăng sự hiện diện củaliposome trong máu ở thời điểm 24 giờ sau khi tiêm lên khoảng ba lần so vớiliposomethôngthường. Ưu điểm của phương pháp post-insertion là PEG-lipid chỉ biến tính trên bềmặtbênngoàicủaliposome,dođókhônglàmhạnchếkhônggianmangthuốchoạt chất sinh học bên trong của liposome Một số nghiên cứu đã chứng minh ưu điểmnày của phương pháp post-insertion so với phương pháp pre-insertion Bằng cáchtheo dõi sự thay đổi thế zeta sau khi PEG hóa, Yoshino và cộng sự đã cho thấy rằngso với các liposome được biến tính PEG bằng phương pháp post-insertion, cácliposome được biến tính bằng phương pháp pre-insertion lấy gần như gấp đôi lượngPEG-lipid cho một sự thay đổi tương tự trong thế zeta [22] Việc gia tăng lượngPEG-lipid trong quá trình tổng hợp trong phương pháp pre-insertion là do sự hiệndiện của PEG-lipid trong lớp lipid bên trong không góp phần vào sự thay đổi thếzeta của liposome được biến tính Bên cạnhđó, kết quả sắck ý t r a o đ ổ i a n i o n c ủ a các liposome được biến tính bằng phương pháp pre-insertion cho thấy các đỉnhtươngđốirộngsovớicácliposomeđượcbiếntínhbằngphươngpháppost- insertion Điều này cho thấy rằng các liposome được biến tính bằng phương pháppre- insertion có nhiều đặc tính bề mặt không đồng nhất so với các liposome đượcbiếntínhbằngphươngpháppost-insertion[22].Trongmộtnghiêncứukhác,liposome được biến tính PEG bằng phương pháp post-insertion mang irinotecan đãchứng minh được thời gian tuần hoàn trong máu cao hơn so với các liposome đượcbiến tính bằng phương pháp pre-insertion Hơn nữa, sự phân hủy của PEG-lipidtrong máuđãbịứcchếrõrệttrongphươngpháppost-insertion [22].
Tuy nhiên,mặc dùmang lại nhiều ưu điểm như đã được nêu trên,n h ư ợ c điểm chính hạn chế việc ứng dụng của phương pháp post-insertion là khả năng biếntính PEG-lipid lên bề mặt liposome phụ thuộc nhiều vào độ dài của chuỗi PEG.Chuỗi PEG càng dài thì cho khả năng liposome đã được tổng hợp được biến tínhcàngthấp[27].
1.2.2.3 Biến tính PEG lên bề mặt liposome đã được tổng hợp bằng phản ứnghóahọc(post-modification)
Phương pháp biến tính PEG lên bề mặt liposome đã được tổng hợp post- modification được thực hiện dựa trên các phản ứng hóa học để tạo các liên kết đồnghóat r ị g i ữ a n h ó m p h ả n ứ n g t r ê n b ề m ặ t l i p o s o m e p o l y m e r v à p o l y m e r P h ư ơ n g pháp này chủ yếu được sử dụng để biến tính liposome cho mục đích tổng hợp hệmang thuốc hướng đích Tuy nhiên,phươngp h á p n à y c ó n h ư ợ c đ i ể m l à v ớ i b ả n chấtdễbịphânhủyvốncócủacấutrúcliposome,điềukiệndungmôivàphảnứng cũng như những khó khăn trong việc tách các chất phản ứng tự do và sản phẩm biếntính, sự hạn chế của hoạt tính dạng ưa nước, sự tập hợp và phân tách pha và các khảnăng xảy ra phản ứng phụ Vì vậy, phương pháp này ít được sử dụng trong cácnghiên cứu biến tính PEG lên bề mặt liposome Thay vào đó, các nghiên cứu đã sửdụng các điều kiện phản ứng đơn giản hơn cho phương pháp này Ví dụ, liposomebiến tính lipid polydiacetylene với nhóm alkynyl trong lớp kép của chúng đã đượcbáo cáo gần đây [28] Các nhóm alkynyl trong lớp lipid kép phản ứng với cácpolyme chức azide trong một phản ứng có đồng xúc tác Kết quả là sự chuyển hóachu trình azide- alkyne giúp gắn nhanh chóng các polyme với thành phần được kiểmsoát vào liposome Sau phản ứng, các chất phản ứng phụ được loại bỏ bằng cách xửlý với EDTA (axit etylendiamintetraacetic) và sắc ký cột Một phương pháp tiềmnăng khác để biến tính PEG lên bề mặt liposome là tạo thành oxime trong phản ứnggiữahydroxylaminevàaldehyde[29].
Vậtliệubiếntính bềmặtnanoliposome
Polyethylenglycol(PEG)
Polyethylen glycol(PEG) là polymer đượcứ n g d ụ n g r ộ n g r ã i t r o n g n h i ề u lĩnh vực Đặc biệt, PEG đã được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳphê duyệt sử dụng trong lĩnh vực Y sinh PEG có ưu điểm là khả năng tan tốt trongcả dung môi hữu cơ và nước, không có độc tính, có độ tương hợp sinh học cao, cótínhkháng protein, khônggâykích thích miễndịchvàcóđộnghọcbàitiếttốt[30].
Về mặt cấu trúc, PEG là polymer mạch thẳng hoặc phân nhánh, tạo thành từphảnứngtrùnghợpethyleneoxide.KhảnăngtantốttrongnướccủaPEGcóđượclàdocóhai nhómhydroxylởhaiđầu.
Chitosan
Chitosan là polysacharide tự nhiên mạch thẳng, tập trung nhiều trong vỏ cácloàithủysản giáp xácnhưtôm, cua,mai mực…đượcứngdụngnhiềutrong cáclĩnh vực y sinh bởi tính tương thích sinh học và phân hủy sinh học cao LD50c ủ achitosan đã được ghi nhận là 16 g/kg trọng lượng cơ thể ở thỏ và 10 g/kg trọnglượng cơ thể ở chuột. Khả năng tương hợp sinh học của chitosan được ghi nhậntrên môbiểubì,tếbàocơtim,nguyênbàosợi, sụn,tếbàoganvàtếbàosừng[31].
Chitosan bị thủy phân bởi các enzyme như chitosanase, glucosaminidase,chitobiase và N-acetyl-glucosaminidase Ở động vật có vú, các protease khác, baogồm lysozyme và pepsin cũng có khả năng phân hủy chitosan trong pH, nhiệt độ vànồng độ ion thích hợp Tỷ lệ phân hủy của chitosan là rất quan trọng vì nó ảnhhưởng đến khả năng tương thích sinh học của vật liệu Sự phân hủy cần được tươngthích với tốc độ hình thành mô mới hoặc được kiểm soát phù hợp để giải phóng cácphân tử có hoạt tính sinh học Nhược điểm của chitosan là chỉ tan trong môi trườngacid, do đó cần biến tính chitosan tạo dẫn xuất chitosan tan trong nước ở môi trườngtrungtínhđểtăngtínhứngdụngcácdẫnxuấtnàytrongysinh.
Gelatin
Bằng các phản ứng thủy phân da động vật và xương trong môi trường thíchhợp sẽ thu được gelatin bao gồm hai loại là gelatin loại A và gelatin loại B Trongđó, gelatin loại
B được điều chế bằng cách thủy phân từ da và xương động vật trongmôi trường kiềm Và gelatin loại A được điều chế từ da lợn bằng cách thủy phântrongmôitrườngacid.Dođó,tùythuộcvàođiềukiệnmôitrường,tínhchấtđiệntích của gelatin có thể thay đổi nên gelatin có điểm đẳng điện khác nhau, cho phépkhảnăngtạothành phứcpolyelectrolytevớipolymerionkhác.
Gelatinbaogồmcácacidaminenốibởiliênkếtpeptide Gelatingiảmcấpbởi enzyme tạo thành các acid amine Về mặt sinh học, gelatin có tính tương hợpsinh học, vì vậy, gelatin đã được sử dụng trong các sản phẩm y sinh theo quy địnhcủaFDA[32].
Thuốcchốngungthưpaclitaxel
Tínhchấthóalý
Hình thức:paclitaxel tồn tạiở dạng bột kếttinhmàutrắngđếntrắngxám,khôngmùi,không vị. Độ tan: thực tế không tan trong nước, tan trong methanol, ethanol,dichloromethanvàdễtantrongmethylenechloride.
1 1 - e n - 9 - o n e 4 , 10-diacetate2-benzoate13-esterwith(2R,3S)-N-benzoyl-3-phenylisoserine.
Dung dịch tiêm đậm đặc phải được pha loãng trước khi truyền tĩnh mạch.Dungdịchtiêmđậmđặc có pH từ6–7[33].
Cơchếtácđộng
Tếbàokhiđượcxửlýbằngpaclitaxelđãđượccácnghiêncứuchothấylàgặp khó khăn trong việc phân chia và sự phân ly của nhiễm sắc thể, ngược lại vớikhi sử dụng thuốc hướng đích đến tubulin khác như colchicine Điểm khác biệt giữapaclitaxel và colchicine là trong khi colchicine ức chế sự lắp ráp và tổ chức của cácviống,paclitaxelgiúpổnđịnhbảovệmạnglướicácvi ống.
Cơ chế tác động của paclitaxel là tăng trùng hợp các dimer tubulin tạo thànhcác vi ống và ổn định các vi ống bằng việc ức chế giải trùng hợp Bên cạnh đó,paclitaxelc ũ n g t ạ o c á c c ấ u t r ú c k h ô n g b ì n h t h ư ờ n g t r o n g c á c v i ố n g ở q u á t r ì n h p hân bào Các thử nghiệmin vitrovàin vivotrên các tế bào động vật có vú cho thấypaclitaxel có tác dụng gây đột biến gen Ngoài ra, paclitaxel gây chết tế bào do phávỡ động học tạo vi ống trong ung thư mô tiên phát ở buồng trứng, ung thư vú, đạitràng, cổ, ung thư phổi không tế bào nhỏ và bướu thịt Kaposi ở người nhiễm AIDS.Vì vậy, thuốc paclitaxel được lựa chọn trong điều trị bước hai cho bệnh nhân ungthư vú và buồng trứng Trong thử nghiệm lâm sàng pha II trên những bệnh nhânđược hóa trị liệu paclitaxel liều cao, tỷ lệ đáp ứng sớm là 70% và ung thư buồngtrứngk hán g t r ị l à 3 0 % T ỷ lệđ á p ứ n g c h u n g t ro ng t h ử n g h i ệ m pha I t r ê n n h ữ n g bệnhnhânđãđược điềutrịungthư vúdicănlà56% [34].
Dượcđộnghọc
Hấp thu: liều paclitaxel được truyền vào tĩnh mạch tỷ lệ thuận với nồng độthuốc trong huyết và giảm theo đồ thị có hai pha Pha thứ nhất cho thấy mức giảmnhanh thể hiện sự phân tán của thuốc đến các ngăn ngoại biên và sự bài tiết Tiếptheophakhởiđầu làviệc bàitiếttươngđốichậmcủa thuốckhỏi ngănngoạibiên.
Phânbố:khôngbịthayđổikhidùngcùngvớiranitidin,cimetidin,diphenhydramine hoặc dexamethason và cót ỷ l ệ g ắ n v ớ i p r o t e i n l à 8 9 % ( in vitro).Ở giai đoạn ổn định, thể tích phân bố thuốc là 68 – 162 mL/m 2 (5 – 6 L/kg thểtrọng) Điều này cho thấy thuốc khuếch tán nhiều ra ngoài mạch hoặc gắn với cácthành phần của mô Sự chuyển hóa và phân bố thuốc paclitaxel trong cơ thể vẫnchưađược nghiêncứu.
Chuyển hóa: được chuyển hóa bởi CYP2C8 và CYP3A4 (ít hơn) Thời gianbán thải (T ẵ) của paclitaxel là 5,8 giờ đối với truyền từ 6 đến 24 giờ; 2,33 giờ chotruyền3giờ.Tẵpaclitaxelgắnalbuminlà27giờ.
Thải trừ: ngoài thận, 2 – 13% lượng thuốc được thải ra ngoài thông qua nướctiểu dưới dạng ban đầu sau khi truyền tĩnh mạch Nghiên cứu đánh giá trên động vậtcho thấy paclitaxel được chuyển hóa tại gan,1 4 % b à i t i ế t q u a n ư ớ c t i ể u , 7 0 % b à i tiết qua phân Tổng thể độ thanh thải chung của cơ thể sau 1 giờ và 6 giờ truyền là5,8–16,3L/h/m 2 ;sau24giờtruyềnlà14,2 –17,2L/h/m 2 [34].
Dượclựchọc
Paclitaxel là tác nhân chống u bướu tân sinh tác dụng lên hệ thống vi quản.Thuốc giúp cho sự hình thành vi quản bằng cách thúc đẩy quá trình tạo cao phân tửcủa tubulin, một đơn vị nhỏ protein của vi quản trong giai đoạn gián phân, ngay cảkhikhôngcósựcómặtcủacácchấttrunggianthườngcầnthiếtchosựhìnhthànhvi quản (như guanosine triphosphate-GTP), do đó đưa đến sự tạo thành các vi quảnbền vững và không có chức năng Tuy cơ chế chính xác chưa được hoàn toàn nắmvững, paclitaxel phá hủy sự cân bằng động học trong hệ thống vi quản, chặn đứng tếbào của giai đoạn cuối pha G2 và pha M của chu kỳ tế bào, ngăn chặn sự sinh sảncủatếbàovàgâytổnhạiđếnchứcnăngcủamôthầnkinh [35].
Tác dụngphụ[36]
Toàn thân: phản ứng quá mẫn như sung huyết, ngoại ban (39%), chán ăn(25%)vàphùngoạibiên(10%).
Máu: suy tủy, giảm bạch cầu trung tính lên đến dưới 500/mm 3 (27%),giảm tiểu cầu (6%), thiếu máu với Hb < 80 g/lít (62%) trong đó 6% chuyểnthànhthiếumáudạngnặng.
Tuần hoàn: tuột huyết áp không biểu hiện triệu chứng (22%), nhịp timchậmkhôngbiểuhiệntriệuchứng(3%).
Tiêu hóa: gây buồn nôn, nôn (44%), rối loạn tiêu hóa (25%), đa tiết chấtnhờn(20%),táobón(18%),gâytắcruột(4%).
Gan: transaminase huyết thanh tăng lên đến hơn 5 lần so với thôngthường (5%), tăng photphatase kiềm lên đến hơn 5 lần (5%) và gây tăngmạnhbilirubinhuyếtthanh(1%).
Cơ–xương:đaucơ-khớp(54%)trongđó12%làrấtnặng.
Toàn thân: tụt huyết áp, phùm ạ c h , k h ó t h ở , n ổ i m à y đ a y t o à n t h â n v à cácphảnứngquámẫn.
Tuầnhoàn: tụthuyếtápkèmhẹp động mạchvành,ngất xỉu.
Máu: giảm bạch cầu trung tính lên đến dưới 500 tiểu cầu/mm 3 và khôngkèm theo sốt (27%); kéo dài tới hơn 1 tuần hoặc lâu hơn (1%). Người bệnhbị giảm tiểu cầu có số lượng tiểu cầu dưới 50000 tiểu cầu/mm 3 ít nhất làmộtlầntrongquátrìnhđiềutrịbệnh(1%).
Thần kinh: bệnh thần kinh có thể xuất hiện phụ thuộc vào liều dùng củapaclitaxelvàcóliênquantớiviệctíchlũythuốc.
Nhữngtháchthức trongsửdụngpaclitaxel
Taxol ® cùng với các hợp chất có nguồn gốc từ paclitaxel được sử dụng phổbiến trong điều trị ung thư buồng trứng di căn, khi các biện pháp điều trị bằng platinvà các anthracyclin không hiệu quả hay bị chống chỉ định Tuy nhiên, hai nhượcđiểm chínhcủaviệcsửdụngnóvẫnchưađượcgiảiquyết:(1)việcsảnxuấtpaclitaxel khá tốn kém và (2) các cơ chế mà tế bào khối u phát triển khả năng chốnglạipaclitaxelvẫnchưađượclàmrõhoàntoàn[37].
Bêncạnhđó,tìnhtrạngkhángthuốccủanhiềubệnhnhânđượcđiềutrịbằngpaclitaxelv ẫ n đ a n g đ ư ợ c n g h i ê n c ứu N h i ề u n g h i ê n c ứ u đ ã đ ư ợ c th ực h i ệ n t ro ng việchiểuvềcơchếtácđ ộngcủaPTXnhưngcáccơchếnày vẫnchưađượclàmrõ.Theokếtluậnchođến nay, sựkháng thuốc này cóthểlàdocácconđ ường khácnhauđượckíchhoạtbởithuốc,vì vậykhiếnviệckhángthuốc trở nênkhókhănhơn. Để đạt hạn chế được các nhược điểm này, việc kết hợp hai hay nhiều loạithuốc hóa trị đang được sử dụng trong một số phác đồ điều trị căn bệnh ung thư.Trong đó, hoá trị liệu kết hợp paclitaxel và carboplatin được sử dụng phổ biến trongđiều trị ung thư phổi không phải tế bào nhỏ và ung thư buồng trứng Sự kết hợp nàycòn được gọi là PC và CarboTaxo [36] Liều dung hai thuốc hoá trị như sau: truyềnriêng rẽ paclitaxel (dung dịch không màu) truyền nhỏ giọt trong 3 giờ, tiếp theo đó,carboplatin (dung dịch không màu) cũng được truyền nhỏ giọt và trong khoảng thờigian là một giờ Tổng thời gian điều trị lên đến 4 giờ Hóa trị liệu bằng paclitaxel vàcarboplatinthường theo chu kỳ điều trị.Mỗi chu kỳ thường kéodài 3 tuần( 2 1 ngày) Người bệnh sẽ được chỉ định dùng paclitaxel và carboplatin, như đã mô tả ởtrên, chỉ trong một ngày trong những ngày đầu Tiếp đó, người bệnh được ngưng sửdụng thuốc hóa trị trong ba tuần tiếp theo Và toàn bộ thời gian này được gọi là mộtchu kỳ điều trị Sau thời gian nghỉ ngơi, việcđ i ề u t r ị đ ư ợ c l ậ p l ạ i n h ư t r ê n đ ể b ắ t đầu chu kỳ điều trị sau Việc hóa trị phối hợp này thường dùng6 – 8 chu kỳ điều trịtrongthờigian5–6tháng.
Thuốcchốngungthưcarboplatin
Tínhchấthóalý
Hìnhthức:Carboplatinởdạngtinhthểmàutrắng. Độ tan: tan trong nước và tan trong các dung môi: đệm acetate pH 4, đệmcarbonatepH9,ethanol/H 2 O10%,ethanol/H95%,HCl0,1N,NaOH0,1N,methanol,chloroform, dimethylsulfoxidevàacidacetic.
Tên hoá học: cis-diammine-1,10-cyclobutane dicarboxylate platinum
Cơchếtácđộng
Carboplatin là dẫn xuất của cisplatin nên có cơ chế hoạt động tương tự nhưcisplatinvànhưmộtchấtalkylhóanêncóbacơchếkhácnhau [38]:
• Carboplatin sẽ gắn kết với nhóm alkyl của các phân tử DNA làm phân mảnhnó do cơ chế sửa sai của enzyme Vì vậy, quá trình tổng hợp DNA và phiênmãcủaRNAkhôngthựchiệnđược.
• Carboplatin sẽ gắn kết với các nguyên tử trong DNA ngăn DNA tách ra đểtiếnhànhtổnghợpvàphiênmã.
Thực tế so với cisplatin, carboplatin đã có độ độc giảm hơn hẳn do thay thế 2nguyên tửchlorine thành gốc oxalate[39] Tuy nhiên,t h u ố c v ẫ n g â y đ ộ c t í n h v ì tính chọn lọc và hướng đích kém Thuốc làm rối loạn kênh vận chuyển cationSLC22A2 gây tích lũy platin làm suy thận,s u y t ủ y , ả n h h ư ở n g n ặ n g n ề h ệ t h ầ n kinh.Chính vì vậy, để nâng cao kết quả trị liệu ung thư bên cạnh việc sử dụng thuốckép cần thiết phải có một chất mang hiệu quả để giảm liều điều trị mà vẫn duy trìhiệulực, qua đó giảmtácdụngphụcủathuốc.
Dượcđộnghọc
Phân bố: thuốc được gắn với cisplatin nhiều hơn thuốc gắn với protein Ban,đầu lượng protein gắn thấp, trong 4 giờ đầu chỉ có 29% carboplatin gắn với protein,sau24giờthì85– 89%được gắnvàoprotein[40].
Chuyển hóa và thải trừ: trong 1 giờ sau khitruyền tĩnhm ạ c h b ằ n g m ộ t l i ề u duyn h ấ t , n ồ n g đ ộ t r o n g h u y ế t t ư ơ n g c ủ a p l a t i n u m v à p l a t i n u m t o à n p h ầ n g i ả m thành 2 pha theo động học thứ nhất Tronggiai đoạn đầu, platinum tự do có thờigian bán hủy khoảng 90 phút và thời gian bán hủy là khoảng 6 giờ trong giai đoạnsau Hầu như sự bài tiết xảy ra trong 6 giờ đầu với 50 – 70% carboplatin được bàitiết trong vòng 24 giờ, 32% của liều dùng được thải ra dưới dạng nguyên vẹn, quátrình bài trừ chủ yếu qua thận [40].Thời gian bán thải của carboplatin trong huyếttươnglà1–2giờ.
Dượclựchọc
Carboplatin là chống ung thư thuộc loại chất alkyl hóa có tác dụng gây độc tếbào.Carboplatin làm thay đổi cấu trúc và ức chế sự tổng hợp DNA bằng cách tạoliên kết chéo trong cùng 1 sợi hoặc giữa 2 sợi của phân tử DNA Tuy nhiên,carboplatin khônggâytácdụngđặchiệulên chukỳphânbào[40].
Tác dụngphụ
Carboplatint h ư ờ n g g â y s u y t ủ y x ư ơ n g ở n g ư ờ i b ệ n h b ị s u y t h ậ n h o ặ c đ ã dùng thuốc chống ung thư (cisplatin) Bên cạnh đó, các tác dụng phụ về tiêu hóa,mắt,t a i , t h ầ n k i n h v à t h ậ n c ũ n g r ấ t p h ổ b i ế n T ù y v à o l i ề u l ư ợ n g c a r b o p l a t i n v à cách dùng carboplatin đơn hay phối hợp với các loại thuốc khác mà mức độ của cáctác dụng phụ này là khác nhau Bên cạnh đó, chức năng thận, gan và cơ địa củangười bệnh cũng là một trong những yếu tố quyết định mức độ ảnh hưởng của cáctácdụngphụkhisửdụngcarboplatin [36].
Nhữngtháchthức trongsửdụngcarboplatin
Mặc dù phác đồ điều trị kết hợp liệu pháp dựa trên bạch kim (cisplatin,carboplatin) với các tác nhân gây độc tế bào khác được sử dụng nhiều trong điều trịungthưbuồngtrứng, nhưng việcsửdụnglâudàicáctácnhânnàylạigâyrađộctính tích lũy Có ba hạn chế chính khi sử dụng kết hợp carboplatin: phản ứng quámẫnvớicarboplatin,độc tínhtrênthậnvàđộctínhtrêntai [41].
Phảnứngquámẫn(HSR)vớicarboplatinđãđượcchứngminhlàởkhoảng15 – 20% phụ nữ được điều trị với thuốc này Các triệu chứng của carboplatin HSR rấtdễb ị n h ầ m l ẫ n v ớ i c á c t á c n h â n k h á c , đ ặ c b i ệ t l à k h i s ử d ụ n g c ù n g l ú c c á c l o ạ i thuố chóa trị.
Các di chứng có ý nghĩa lâm sàng khác như nhiễm độc thần kinh, suy tủy, độctính trên thận và độc tính trên tai được ghi nhận thường do hóa trị liệu bằng các loạithuốccó gốcbạchkimgâyra.
Cácnghiên cứuvềhệliposomemangthuốcchốngungthư
Năm2014,Maedehvàcộngsựđãtiếnhànhkhảosátcáccôngthứcnanoliposome mang thuốc paclitaxel với các tỷ lệ phosphatidylcholine, cholesterol,paclitaxelv à l i p o s o m e đ ư ợ c b i ế n t í n h v ớ i P E G 2 0 0 0 đ ể t ă n g c ư ờ n g t í n h ổ n đ ị n h , hiệu quả, cũng như độ hòa tan của thuốc Kết quả kích thước hạt của liposome vàliposome biến tính PEG2000 nang hóa paclitaxel là 421,4 và 369,1 nm; hiệu suấtmang thuốc lần lượt là 91,3% và 95,2% Khả năng phóng thích paclitaxel từ haicông thức trong 28 giờ lần lượt là 5,53% và 5,02% Kết quả độc tính cho thấy khithuốc được nang hóa vào liposome biến tính PEG đã làm giảm độ độc (IC50= 79,8 ±2,9 àg/mL) hơn thuốc được nang húa liposome (IC50= 86,25 ± 3,4 àg/mL) và giảmđỏngkểsovớithuốcnguyờnliệulà(IC502±6,6 àg/mL)[42].
Năm 2016 Jie và cộng sự đã tiến hành tổng hợp hệ liposome biến tính PEGmangđồngthờiresveratrolvàpaclitaxel.Liposometổnghợpcókíchthướchạtlà
50 nm với hiệu suất nang hóa trên 50% Kết quả đánh giá độc tính tế bào trên dòngtế bào MFC-7 cho thấy liposome tổng hợp giúp tăng khả dụng và khắc phục đượchiệntượngkhángthuốc trongđiềutrịbệnh [43].
Năm 2016, Zeng Chunying và các cộng sự của mình đã tổng hợp thành côngnano liposome nang hóa oxaliplatin theo công thức bao gồm: HSPC, cholesterol vàDSPE-PEG2000 với tỷ lệ %mol là 85:10:5, bằng phương pháp hydrat hóa màngmỏng kết hợp ép đùn qua màng polycarbonate (φ = 200 nm) và loại bỏ thuốc dưbằng phương pháp thẩm tách Kết quả cho thấy nano liposome có kích thước hạt là132,6 ± 0,9 nm với điện tích bề mặt là -5,8 ± 0,3 mV và hiệu suất mang thuốc đạt90,5%[44].
Năm 2017, Majid Hasanzadegan và cộng sự đã đánh giá độc tính tế bào củahệ nanoliposome mang carboplatin được tổng hợp bằng phương pháp bay hơi phađảo trên dòng tế bào ung thư buồng trứng và phổi Nanoliposome đươc tổng hợp từlecithin, carboplatin, PEG3350 và cholesterol Nanoliposome-PEG cho kết quả giúpgiảm độ độc của thuốc trên tế bào so với thuốc nguyên liệu Kết quả này cho thấytiềm năng của hệ nanoliposomem a n g t h u ố c t r o n g v i ệ c t h a y t h ế c á c l o ạ i t h u ố c h ó a trịtrongđiềutrịungthư phổivàung thư buồngtrứng[45].
Năm 2018, Li và cộng sự đã tổng hợp hệ liposome được biến tính folic acid(FA) mang paclitaxel Kết quả nghiên cứu cho thấy liposome biến tính FA mangpaclitaxel được tích tụ nhiều trong khối u và có tác động ngăn chặn sự phát triển củakhốiucaohơnsovớiliposomethôngthường [46].
Năm 2019, Wang và cộng sự đã đánh giá hoạt tính tiêu diệt khối uin vitrovàin vivocủa hệ liposome biến tính FA mang curcumin (CUR) Kết quả nghiên cứucho thấy DSPE- PEG2000-FA-LPs/CUR tổng hợp được có dạng hình cầu và có kíchthước là 112,3 ± 4,6 nm với chỉ số phân tán 0,19 ± 0,03 và thế zeta là -15,3 ± 1,4mV Ngoài ra, hiệu suất mang thuốc và khả năng mang thuốc của DSPE-PEG2000-FA-LPs/CUR lần lượt là 87,6% và 7,9% Liposome biến tính FA mang CUR chothấy sự phóng CUR kéo dài hơn so với CUR tự do DSPE-PEG2000-FA- LPs/CURcho thấy tác dụng chống tăng sinh vượt trội trên tế bào HeLa và có tác dụng chốngkhốiuinvivotốthơnsovớiliposomethôngthường[47].
Năm 2019, Deng và cộng sự đã phát triển hệ liposome hướng đích mangdoxorubicin biến tính bề mặt với PEG và FA (PEG-FA-Lip) Kết quả cho thấy30,1% chuột mang khối u ung thư vú (thể tích khối u ban đầu > 100 mm 3 ) đạt đượcmục tiêu loại bỏ khối u Đáng chú ý, liệu pháp này ức chế đáng kể sự di căn phổi vàkiểm soát sựp h á t t r i ể n c ủ a u n g t h ư v ú đ ã d i c ă n ( t h ể t í c h k h ố i u b a n đ ầ u > 1 0 0 mm 3 )[48].
J i n g v à c ộ n g s ự đ ã t ổ n g h ợ p h ệ l i p o s o m e g ắ n t á c n h â n hướngđíchFAmangarseni ctrioxide(ATO)bằngphươngphápreversemicroemulsion Kết quả cho thấy kích thước hạt, thế zeta và hệ số đa phân tán củaFA-LP-CaAstổnghợpđượclầnlượtlà122,67±2,18nm,12,81±0,75mVvà0,22 ±0,01.KhảnăngmangthuốccủaFA-LP-CaAslà18,49±1,14%.Kếtquảđánhgiá invitrochothấyFA-LP-CaAscótácdụngtiêudiệttếbàoHepG2rấtmạnh.Hơn nữa, các đánh giáin vivocho thấy FA-LP-CaAs có thể làm tăng đáng kể sự phân bốATOởcácvịtríkhốiuvàức chếsự pháttriểncủa khốiu[49].
Năm2020,LamprouvàcộngsựđãtổnghợpliposomebiếntínhFA(DSPC/Chol/PEG/ DSPEPEG-FA)mangthuốcdoxorubicinbằngphươngpháphydrat hóa màng mỏng lipid và giảm kích thước tiểu phân liposome bằng phươngpháp siêu âm bằng đầu dò Kết quả đánh giá độc tính trên dòng tế bào MDA-MB-231, 4T1 và MCF-7 cho thấy rằng khi tăng hàm lượng FA trên bề mặt liposome dẫnđến tăng hiệuquả tiêu diệt khối u của hệliposome biến tính
Năm 2021, Liang và cộng sự đã phát triển tinh thể nano được nang hóa trongliposome ứng dụng cho phân phối các loại thuốc chống ung thư kém tan trong nướcvới mục tiêu tạo hệ nang hóa được lượng thuốc cao và ổn định Trong nghiên cứunày,hệthốngphânphốithuốcgồmlõitinhthểnanothuốcvàvỏliposome(NC@Lipo)kếthợpcác ưuđiểmcủatinhthểnanothuốc(tảithuốccao)v à liposome (chức năng hóa bề mặt dễ dàng và độ ổn định cao) để phân phối có mụctiêu các loại thuốc kỵ nước đến các khối u CHMFL-
ABL-053 (053), một loại thuốckémtantrongnước,đãđượcsửdụnglàmthuốcmẫuđểchứngminhhiệuquảcủahệ NC@Lipo Các công thức được biến tính bề mặt với PEG (053-NC@PEG-Lipo)và biến tính bề mặt với FA (053- NC@FA-Lipo) bằng phương pháp nghiền bi kếthợp với siêu âm bằng đầu dò 053- NC@Lipo cho phép tải thuốc cao (lên đến19,51%), độ ổn định keo tốt hơn và thời gian tuần hoàn trong cơ thể lâu hơn so với053-NC So với 053 tự do, 053-NC@PEG-Lipo và 053-NC@FA-Lipo cho thấy sựtập trung ở khối u cao hơn và hiệu quả tiêu diệt khối uin vivotốt ở chuột xenograftK562 với tỷ lệ ức chế phát triển khối u (TGI) lên đến 98% Ngoài ra, 053-NC@FA-Lipo cho thấy hiệu quả hướng đích tế bào khối uin vitrovà TGIin vivocao hơn sovới053-NC@PEG-LipovàNC@Lipo[51].
Việc sử dụng các hạt nano làm hệ chất mang và nhả thuốc đúng địa chỉ cũngđược nhiều đơn vị nghiên cứu thuộc cơ quan nhà nước cũng như các doanh nghiệptưn h â n t ạ i V i ệ t N a m c h ú t r ọ n g n g h i ê n c ứ u t h e o x u h ư ớ n g c h u n g c ủ a t h ế g i ớ i Trong đó có hạt nano liposome thu hút được sự quan tâm đặc biệt đối với các nhàkhoah ọ c c ũ n g n h ư c á c t ổ c h ứ c n g h i ê n c ứ u K h á n h T h ị N h i c ù n g đ ồ n g n g h i ệ p nghiênc ứ u b à o c h ế l i p o s o m e d o x o r u b i c i n [ 52].L i p o s o m e d o x o r u b i c i n đ ư ợ c b à o chế bằng phương pháp hydrat hóa film với các tá dược là phosphatidyl cholin, kếthợp với cholesterol Hiệu suất mang thuốc của hệ liposome cho thấy đều trên 70%và phụ thuộc vàotỷ lệ phosphatidyl cholin/cholesterolvà tỷ lệ lipid/hoạt chất.Liposome thu được có cấu trúc nhiều lớp vớik í c h t h ư ớ c h ạ t k h á l ớ n ( 2 0 0 – 8 0 0 nm) Hoạt chất giải phóng chậm từ liposome ở pH 5,5 cao hơn ở pH 7,4 NguyễnThị Lập và Bùi Bá Minh đã sử dụng phương pháp liposome hoá doxorubicin bằngkỹ thuật chênh lệch nồng độ amoni sulfat
[53] Trong nghiên cứu này, tác giả sửdụng các phương pháp như tạo màng phospholipid (phương pháp của Bangham).Kết quả đã chế tạo được liposome và liposome hóa doxorubicin đạt hiệu suất cao(95,68%) Phương pháp sử dụng gradient amoni sulfat của nghiên cứu đã cho tỷ lệthuốc/phospholipid (mol/mol) của dung dịch liposome trước khi thẩm tách là 0,2 –0,3 Tỷ lệ này phù hợp cho yêu cầu về độ độ ổn định và điều trị của dạng thuốcliposome-doxorubicin Trong nghiên cứu tiếp theo, Nguyễn Thị Lập đã tiến hànhgiảm kích thước và đồng nhất hóa tiểu phân liposome doxorubicin bằng phươngpháp nén đẩy qua màng với các kích thước khác nhau [54] Liposome doxorubicincủa nghiên cứu được tổng hợp từ phospholipid lòng đỏ trứng gà đã được hydrogenhóa, cholesterol và doxorubicin hydroclorid Kết quả nghiên cứu cho thấy, hỗn dịchliposomethôđượcđẩy8lầnquamàng400nmvà10lầnquamàng80nmchohạtcó kích thước trung bình 108,8 nm và chỉ số đa phân tán là 0,072 Ngoài ra, nghiêncứu này còn cho thấy các ưu điểm của phương pháp nén đẩy qua màng so với siêuâm đầu dò trong việc giảm kích thước và đồng nhất hóa tiểu phân liposome sau tổnghợp Nguyễn Văn Lâm và đồng nghiệp đã đánh giá ảnh hưởng của phương phápđồng nhất đến kích thước và hiệu suất mang thuốc của liposome doxorubicin [55].Quytrìnhbà oc hếd ox or ub ic in đ ư ợ c n g h i ê n c ứ u cải ti ến nh ư sa u : l i p o s o m e đ ư ợ c nén thô qua màng 1000 nm hoặc 400 nm trước và sau đó là nén qua màng 100 nm ởnhiệt độ 50 – 55 o C Phương pháp nén qua màng cho thấy liposome sau tổng hợp cókích thước nhỏ và độ đồng nhất cao, tăng độ ổn định và hiệu suất mang thuốcliposome doxorubicin so với phương pháp siêu âm LêPhương Linh và đồng nghiệpđã tiến hành đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ phospholipid và hệ đệm tới các đặc tínhhóa lý của hệ liposome doxorubicin PEG hóa DSPE-PEG2000 với tỷ lệ 5% mol sovớitổngsốmollipid,môitrườngbêntronglàdungdịchđệmamoninồngđộ250 mM và môi trường phân tán liposome là đệm HEPES pH 7,5 nồng độ 20 mM đãđược sử dụng trong nghiên cứu Liposome doxorubicin PEG tạo ra cho kích thướchạt < 200 nm, hạt đồng nhất với PDI < 0,1 và hiệu suất mang thuốc > 95% Kết quảnghiên cứu cho thấy liposome mang thuốc doxorubicin sử dụng PEG để tăng thờigian tuần hoàn và giảm tốc độ thanh thải trong huyết tương Nguyễn Đại Hải vàđồng nghiệp cũng bắt đầu nghiên cứu phát triển hệ mang thuốc liposome ứng dụngtrong việc mang thuốc chống ung thư từ năm
2011 Đến nay, nhóm nghiên cứu đãtạo ra được hạt có kích thước 100 – 200 nm, có khả năng tải thuốc cao và giúp kéodàithờigianphóngthíchthuốc [56,57].
Các nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy hệ liposome đã được kết hợpvớithuốcđiềutrịungthư nhằmgiảmtácdụngphụvàtănghiệuquảđiềutrị.
Khácv ớ i c á c n g h i ê n c ứ u s ử d ụ n g h ệ l i p o s o m e k ế t h ợ p v ớ i c á c l o ạ i t h u ố c điều trị ung thư đã được công bố, đề tài nghiên cứu đã tổng hợp một số vật liệu đểbiến tính bề mặt liposome (mPEG- cholesterol, mPEG-chitosan và mPEG-gelatin)nhằm làm tăng độ ổn định trong huyết thanh, tăng hiệu quả mang thuốc của hệliposome tổng hợp được và giảm khả năng gây độc tế bào của thuốc điều trị ung thư(paclitaxel,carboplatin).
Nộidung nghiên cứu
Hóa chất,thiếtbịvàdụngcụnghiêncứu
Hóa chất
9 Chitosan(100000-300000Da) Sigma-aldrich Mỹ
10 GelatintypeẴ300gBloom) Sigma-aldrich Mỹ
21 Potassiumphosphate monobasic Sigma-aldrich Mỹ
28 Nướckhửion ViệnCông nghệHóa học ViệtNam
29 Nướccất2lần ViệnCông nghệHóa học ViệtNam
Thiếtbịvàdụngcụ
TT Têndụngcụ,thiếtbị Nhàsảnxuất Xuấtxứ
3 Falcon(15mL,50mL) Isolab Đức
11 Máyquangphổhồngngoạibiến đổiFT-IR PerkinElmer Mỹ
15 Hệthốngxétnghiệm miễndịchbán tựđộngHumaReader HS Human Đức
3,5kDa;6–8kDa,12-14kDa) Spectrum Mỹ
Phươngphápnghiêncứu
Phương phápkhảosát cácyếutốlênquátrìnhtổnghợpnanoliposometừlecithincó nguồngốcđậunành
- Phương pháp tổng hợp nanoliposome được nghiên cứu chọn là phươngpháp hydrat hóa màng mỏng lipid với sự thay đổi các yếu tố trong công thức tổnghợpcủanhómnghiêncứu[58].
Cân và hòa tan lecithin có nguồn gốc đậu nành, cholesterol, CTAB trong hỗnhợp dung môi CHCl3:MeOH Lecithin, cholesterol và CTAB được bảo quản trongđiều kiện 2 – 8 o C, vì vậy các chất này nên được để cân bằng với nhiệt độ phòngtrướckhitiếnhànhcân.
Cho dung dịch lipid trong CHCl3:MeOH vào bình cầu của hệ thống cô quay.Tiến hành cô quay áp suất thấp bằng máy cô quay Büchi Rotavapor R-114 để loạidung môi hữu cơ Áp suất được điều chỉnh để dung môi bay hơi từ từ, không quánhanh tạo lớp màng lipid mỏng và trong suốt bám xung quanh thành bình Sau khidung môibayhơi hết,tiếptụccôquayquađêmđểdungmôibayhơihoàntoàn.
Trong điều kiện hóa chất thực tế có ở phòng thí nghiệm kết hợp với thamkhảo tài liệu, nghiên cứu lựa chọn chất hoạt động bề mặt tween 80 để khảo sát bổsung vào pha nước trong quá trình hydrat hóa [58] Tiến hành hydrat hóa ở nhiệt độđượclựa chọntrongkhoảng2giờ.
Phương pháp hydrat hóa màng mỏng lipid thường tạo ra các hạt liposome đalớp và có kích thước hạt lớn, do đó liposome sau bào chế cần được làm giảm kíchthướchạt.
2.3.1.2 Khảosát cácyếutốlênquátrình tổng hợpnanoliposome a Khảosátnhiệtđộchuyểnphacủalecithin cónguồngốcđậunành
- Nhiệt độ cô quay và nhiệt độ hydrat hóa lớp màng lipid được xác địnhthông qua nhiệt độ bắt đầu nóng chảy (T m ) và nhiệt độ chảy hoàn toàn (Tf) củalecithincónguồngốcđậunànhbằng phântích nhiệtquét visaiDSC.
- Đánh giá kết quả: nhiệt độ cô quay và nhiệt độ hydrat hóa được lựa chọncaohơnT m vànhỏhơnTf. b Khảosát phươngphápgiảmkíchthướchạt
- Liposome sau tổng hợp được tiến hành làm giảm kích thước hạt bằng cácphươngphápkhảosát:
Nénqua màng100nm(sửminiextruder-AvantiPolarLipids):10lần.
Kếthợpsiêuâmvànénquamàng: siêuâm30 phút,nénquamàng10 lần.
- Đánhgiákếtquả:dựavàokếtquảđánhgiácảmquan,kíchthướchạt,hệsố đa phân tán của hệ liposome sau tổng hợp và sau 1 tuần bảo quản ở nhiệt độ 2 –8 o C để lựa chọn phương pháp giảm kích thước cho hệ liposome Phương pháp giảmkích thước hạt được lựa chọn là phương pháp cho hệ liposome sau bảo quản ổn định(không xuất hiện các hiện tượng kém bền: kết bông, nổi kem, lắng cặn, tách lớp…)vàkíchthướchạttrungbìnhnhỏhơn200nm. c Khảosát tỷlệthành phầntạoliposome
- Khảo sát tỷ lệ lecithin:cholesterol: liposome được tổng hợp với các tỷ lệ lầnlượtlà10:0,9:1,8:2,7:3,6:4,5:4và4:6(khối lượng/khốilượng).
- Khảo sát tỷ lệ CTAB: tiến hành tổng hợp liposome theo phương pháp hydrathóa lớp màng lipid với tỷ lệ lecithin:cholesterol được chọn và tỷ lệ CTAB khảo sát lầnlượtlà0%,1%,2%,3%và4%khốilượng lipid [58].
- Khảo sát tỷ lệ chất hoạt động bề mặt (tween 80): tiến hành tổng hợp liposometheo phương pháp hydrat hóa lớp màng lipid với tỷ lệ lecithin:cholesterol và tỷ lệCTAB được chọn Tỷ lệ tween 80 được khảo sát lần lượt là 0%, 0,5%, 1,0%, 1,5% và2,0%(khốilượng/thểtích).
- Đánh giá kết quả: dựa vào kết quả đánh giá cảm quan, kích thước hạt, hệ sốđa phân tán của hệ liposome sau tổng hợp và sau 1 tuần bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8 o Cđể lựa chọn tỷ lệ các thành phần tạo liposome Tỷ lệ thành phần tạo liposome đượclựa chọn là tỷ lệ cho hệ liposome sau bảo quản ổn định (không xuất hiện các hiệntượng kém bền: kết bông, nổi kem, lắng cặn, tách lớp…) và kích thước hạt trungbìnhnhỏhơn200nm.
Phươngp h á p t ổ n g h ợ p m P E G - c h o l e s t e r o l , m P E G -
Vật liệu mPEG-cholesterol, mPEG-chitosan được tổng hợp bằng cách sửdụngp- nitrophenyl chloroformate (NPC) để hoạt hóa mPEG và được phát triển từphươngpháptổnghợpmPEG-gelatincủanhómnghiêncứu[59].
2.3.2.1 Tổnghợpvậtliệu mPEG-cholesterol(mPEG-Chol) -NPC được sử dụng để hoạt hóa mPEG và ethylenediamine (EDA) được sửdụngđểbiếntínhvàgắnnhómaminevàomPEG.Cholesterylchloroformate(CCF) cón h ó m a c y l c h l o r i d e ( - C C O C l ) đ ư ợ c s ử d ụ n g đ ể p h ả n ứ n g v ớ i n h ó m a m i n e ( -
NH2)củamPEG-NH2t ạ othànhvật liệumPEG-Chol.
-Quytrình tổnghợpvậtliệu mPEG-Cholđượcthựchiệnqua3giaiđoạn:
TổnghợpmPEG-NPC: mPEG-NPCđượctổnghợptheocơchếthếthânhạchtrêncarbonyl.Tươngtự như phản ứng ester hóa, liên kết CO trong cấu trúc của NPC có tính chất khôngno và bị phân cực mạnh về phía oxy, làm xuất hiện mật độ điện tích dương trênnguyên tử carbon, tạo ra trung tâm thiếu điện tử Trong khi đó, trên nguyên tử oxycủa nhóm -OH của phân tử mPEG còn hai đôi điện tử tự do, nên nguyên tử oxy cóvai trò như một tác nhân ái nhân Trung tâm thiếu điện tử trên nguyên tử carbon củaphân tử NPC gặp tác nhân ái nhân của phân tử mPEG sẽ tương tác với nhau tạo sảnphẩmmPEG-NPC Phảnứngdiễnrathuậnlợiởnhiệtđộ60–65ºC.
Cân mPEG cho vào bình cầu 250 mL làm nóng chảy ở nhiệt độ 65 o C trongmôit r ư ờ n g c h â n k h ô n g k h o ả n g 2 g i ờ đ ể m P E G t a n c h ả y h oàn t o à n S a u đ ó c h o NPC được vào bình cầu, khuấy ở nhiệt độ 65oC, môi trường khí N2trong 5 giờ.Giảm nhiệt độ xuống 40 o C, cho
10 mL THF vào khuấy ở nhiệt độ phòng trong vòng16giờđểthudungdịchmPEG-NPC.
Tổnghợp mPEG-NH2:Khi có sự hiện diện của tác nhân thân hạch như nhóm amine (-NH2), phảnứng thay thế nhóm nitrophenolate sẽ xảy ra và hình thành liên kết urethane cùng sảnphẩmphụp- nitrophenol.
DungdịchmPEG-NPCđượcnhỏtừtừvàodungdịchEDA.Phảnứngdiễnra trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng Hỗn hợp thu được đem kết tủa trong 500 mLdiethyl ether và lọc hút chân không Hòa tan tủa trong nước và thẩm thẩm tách bằngmàng 3,5 kDa trong 72 giờ Tiến hành đông khô thu sản phẩm thu mPEG-
Cholesteryl chloroformate (CCF) có nhóm acyl chloride (-COCl) được sửdụng để phản ứng với nhóm amine (-NH2) củamPEG-NH2tạothành vật liệumPEG-Chol.
Cân mPEG-NH2và CCF cho vào cốc 100 mL Sau đó, 50 mL chloroformđượccho vào và phảnứngdiễnra ở nhiệtđộphòngtrong24giờ.
NPCđượcsửdụngđể hoạthóam PE G trướckhitiếnhànhphản ứ n g vớidungdịchchitosa ntạothànhvậtliệumPEG-CS.
-Quytrình tổnghợpvậtliệumPEG-Chol đượcthựchiệnqua3giaiđoạn:
Tương tự giai đoạn 1 của quy trình tổng hợp vật liệu mPEG-Chol (Mục2.3.2.1)
Chitosan (100000-300000 Da) được hòa tanv à o n ư ớ c c ấ t , k h u ấ y ở t ố c đ ộ 300 vòng/phút Tiến hành nhỏ từng giọt dung dịch HCl 1M vào dung dịch chitosansao cho pH dung dịch bằng 5 Khuấy ở tốc độ 300 vòng/phút cho đến khi chitosantanhoàntoànđểthuđược dung dịchchitosan.
Nhỏ từng giọt dung dịch mPEG đã hoạt hóa vào dung dịch chitosan, khuấy300 vòng/ phút trong 24 giờ Dung dịch mPEG-CS được thẩm tách bằng màng(MWCO: 12-14 kDa) trong 4 ngày bằng nước cất Tiến hành đông cô dung dịchmPEG-CSthusảnphẩm.
NPCđượcsửdụngđể hoạthóam PE G trướckhitiếnhànhphản ứ n g vớidungdịchgelatint ạothànhvậtliệumPEG-Gel.
Tương tự giai đoạn 1 của quy trình tổng hợp vật liệu mPEG-Chol (Mục2.3.2.1)
Gelatin loại A (~300 g Bloom) được hòa tan vào nước cất, khuấy ở tốc độ300vòng/phútđểthuđược dung dịchgelatin.
Nhỏt ừ n g g i ọ t d u n g d ị c h m P E G đ ã h o ạ t h ó a v à o d u n g d ị c h g e l a t i n , k h u ấ y 300 v ò n g / p h ú t t r o n g 1 2 g i ờ ở n h i ệ t đ ộ p h ò n g D u n g d ị c h m P E G - G e l đ ư ợ c t h ẩ m tách bằng màng (MWCO: 12 – 14k D a ) t r o n g 3 n g à y b ằ n g n ư ớ c c ấ t T i ế n h à n h đôngkhôthusảnphẩm.
PhươngphápPEGhóabềmặtnanoliposomebằngmPEG-Chol,mPEG- CSvàmPEG-Gel
Ch ol, mPEG-CSvàmPEG-Gel
2.3.3.1 Biếntínhbềmặtnanoliposomebằng mPEG-Chol a QuytrìnhbiếntínhbềmặtnanoliposomebằngmPEG-Chol
Quytrìnhtổnghợpliposome(Mục2.3.1)vớicácyếutốkhảosátđạtyêucầuvềkíchthướchạtđ ượcsửdụngđểbiếntínhbềmặtbằngvậtliệumPEG-Chol. b Khảos á t c á c y ế u t ố l ê n q u á t r ì n h b i ế n t í n h b ề m ặ t n a n o l i p o s o m e b ằ n g mPEG-Chol
- Khảosát khốilượngphântửmPEG: mPEGvới5khốilượngphântử(mPEG550,mPEG1100,mPEG5000,mPEG10000 và mPEG20000) được nghiên cứu tiến hành khảo sát để chọn ra loạimPEGcókhốilượngphântửphùhợpchotổnghợpvật liệumPEG-Chol. Đánh giá kết quả: dựa vào kết quả kích thước hạt, hệ số đa phân tán và thếzeta của nanoliposome sau tổng hợp để lựa chọn mPEG với khối lượng phân tử phùhợpchotổnghợpvậtliệumPEG-Chol.
- KhảosátnồngđộmPEG-Chol: mPEG-Chol 2%, 4%, 6%, 8% và 10% được khảo sát để chọn ra nồng độmPEG- Cholchohiệusuấtmangthuốcvàkhảnăngmangthuốccủananoliposomelàcaonhất. Đánh giá kết quả: dựa vào kết quả hiệu suất mang thuốc và khả năng mangthuốccủa hệnanoliposome đểchọnnồng độmPEG-Chol.
2.3.3.2 PhủbềmặtnanoliposomebằngmPEG-CS a Quytrìnhphủbềmặtnanoliposomebằng mPEG-CS
Quy trình phủ bề mặt nanoliposome bằng mPEG-CS được thực hiện tương tựquytrìnhbiếntính bềmặt nanoliposomebằngmPEG-Chol. b Khảosátcácyếutốlênquátrình phủbềmặtnanoliposomebằngmPEG-CS mPEG-CS 2%, 4%, 6%, 8% và 10% được khảo sát để chọn ra nồng độmPEG-CS cho hiệu suất mang thuốc và khả năng mang thuốc của nanoliposome làcaonhất. Đánh giá kết quả: dựa vào kết quả hiệu suất mang thuốc và khả năng mangthuốccủa hệnanoliposomeđểchọnnồng độmPEG-CS.
2.3.3.3 PhủbềmặtnanoliposomebằngmPEG-Gel a Quytrìnhphủbềmặtnanoliposomebằng mPEG-Gel
GelđượcthựchiệntươngtựquytrìnhbiếntínhbềmặtnanoliposomebằngmPEG-Chol. b Khảo sát các yếu tố lên quá trình phủ bề mặt nanoliposome bằng mPEG- GelmPEG-
Gel2 % , 4 % , 6 % , 8 % v à 1 0 % đ ư ợ c k h ả o s á t đ ể c h ọ n r a n ồ n g đ ộ mPEG-Gelchohiệusuấtmangthuốcvàkhảnăngmangthuốccủananoliposomelàcaonhất. Đánhgiákếtquả:dựavàokếtquảhiệusuấtmangthuốcvàkhảnăngmangthuốccủa hệnanoliposomeđểchọnnồngđộmPEG-Gel.
Phương phápnanghóathuốcvàonanoliposomeđãbiếntính
2.3.4.1 Phươngphápn an g hóathuốcp a c l i t a x e l vàonanoliposome đã biếntính
Cân và hòa tan lecithin có nguồn gốc đậu nành, cholesterol, CTAB, vật liệutổng hợp (mPEG-Chol/mPEG-CS/mPEG-Gel) và thuốc paclitaxel trong hỗn hợpdung môiCHCl3:MeOH.
Cânv à h ò a t a n l e c i t h i n có n gu ồn g ốc đậ un à n h, c h o l es t e r o l , C T A B v à vậ t liệut ổnghợp(mPEG-Chol/mPEG-CS/mPEG-Gel)tronghỗnhợpdungmôiCHCl 3 :MeOH.
Hòa tan thuốc carboplatin vào dung dịch hydrat hóa đã được chọn.Tiếnhànhhydrathóa ở nhiệtđộđượclựachọntrongkhoảng2giờ.
Phương phápđánhgiátínhchấtvậtliệu
2.3.5.1 Phương pháp đánh giá cảm quan, kích thước hạt, hệ số đa phân tánvàthế zeta
- Cảm quan: nanoliposome ổn định (không xuất hiện các hiện tượng kémbền:kếtbông,nổikem,lắngcặn,táchlớp…).
- Kích thước, hệ số đa phân tán và thế zeta: được xác định bằng thiết bịHoriba Nano SZ100 tại Trung tâm phân tích Sinh-Hóa-Lý tại Viện Khoa học VậtliệuỨngdụngTp.HồChíMinh.
Trong đó, hệ số phân tán (PDI) là một thông số quan trọng cho biết về sựphân bố kích thước hạt trong một mẫu nhất định PDI nằm trong khoảng từ 0,0 (đốivớimẫuhoàntoànđồngnhấtvềkíchthướchạt)đến1,0(đốivớimẫucóđộphântáncao vớinhiềukíchthước hạt).PDI< 0,05chothấymẫuđơnphântáncaovàPDI > 0,7 cho thấy rằng mẫu có phân bố kích thước hạt rất rộng và không thích hợpđể phân tích bằng kỹ thuật tán xạ ánh sáng động (DLS)
PDI=(SD 2 d)Trongđó: SDlàđộlệchchuẩnvàd làđườngkínhhạt
Cấu trúc nanoliposome được xác định bằng kính hiển vi điện tử truyền qua(Tranmission Electron Microscope-TEM), điện thế gia tốc 100kV tại Phòng thínghiệmtrọngđiểmpolyme vàcompozit –Đại họcBáchkhoaTp.HồChíMinh.
2.3.5.3 Phương pháp xác định cấu trúc vật liệu mPEG-Chol, mPEG-CS vàmPEG-Gel
Cấu trúc sản phẩm thu được xác định bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR và phổ hồng ngoại biến đổi FT-IR Thiết bị NMR (Bruker) được đặt tại ViệnHóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội Máy quang phổFT-IR (PerkinElmer) được đặt tại viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hàn lâmKhoahọcvàCôngnghệ,Tp.HồChíMinh.
Tính ổn định trong huyết thanh là một trong những thông số chính để đánhgiá khả năng ứng dụngin vivocủa vật liệu mang thuốc Hệ nanoliposome và nanoliposomebiến tính PEGmangthuốcđượcủtrongm ô i t r ư ờ n g c h ứ a 5 0 % h u y ế t thanh thai bò (Fetal Bovine Serum, FBS) trong 24 giờ và được đo độ hấp thu tại cácmốcthờigiankhảosát.
Phương pháp đo độ đục được sử dụng để đánh giá độ ổn định trong huyếtthanh của các hệ nanoliposome tổng hợp [62,63] Sự thay đổi độ đục được xác địnhbằngmáy đọc hệ thống xét nghiệm miễn dịch bán tự động HumanReader HS(Human, Germany) tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa họcvàCôngnghệ,Tp.HồChíMinh.
2.3.5.5 Phương pháp xác định hiệu suất nang hóa (DLE) và khả năng mangthuốc (DLC) a Phươngphápđịnh lượngpaclitaxelbằng HPLC -Điềukiện:
Hệthống:HPLC FlexarperkinElmer, Mỹ.Cộtphântích:C18(4,6m mx12,5cm;5àm) Đầudũ:PlexarPDAPlus
Bướcsóngpháthiện:214nm Phatĩ nh :C ột Zo rb ac E c l i p s e X P D C 1 8 ( 2 5 0 x 4 , 6 ) , k í c h t h ư ớ c hạt n h ồ i 5 μm.m.Phađộng:Acetonitrile:Nước(95:5)
Dung môi pha mẫu: Acetonitrile Nhiệt độ cột: 45 o C Tốc độ dòng: 1,8mL/ phỳt.Thểtớchtiờmmẫu:20àl
- Định lượng paclitaxel được nang hóa vào nanoliposome: nanoliposomenang hóa paclitaxel được pha loãng trong nước cất Mẫu được ly tâm với tốc độ16000 vòng/phúttrong30 phút.Paclitaxel tựdo không tan trong nước ở dạngk ế t tủađượcđịnhlượngbằngHPLC. b PhươngphápđịnhlượngcarboplatinbằngICP-MS
Hệthống: PerkinElmerNexion2000,Mỹ Chế độ và điều kiện phân tích: Standard Mode (Nebulizer Gas Flow 1,02;Plasma Gas Flow 15; Auxillary Gas Flow 1,2; tốc độ bơm nhu động 60rpm);Analyte:Pt.
Sử dụng bộ tiêm mẫu tự động Autosampler, hao hụt thể tích trung bình 3mL/mẫu/lầnđo.
- Định lượng carboplatin được nang hóa vào nanoliposome: carboplatin tự dosẽđượcloạiđibằngthẩmtáchquamàngtrong4giờbằngnướccất Thuốcna nghóavàthuốc tự dosẽđượcxác địnhbằngICP-MS. c PhươngphápxácđịnhDLEvàDLC
Khảnăngmangthuốc:DLE%= mT-NH x100% m T-NH +m CM
• mT-NH:Khối lượngthuốcđượcnanghóa(mg)
• mCM:Khối lượngchất mang d Phươngphápđánhgiákhảnăngphóng thíchthuốcQuytrìnhphóngthíchpaclitaxelđượcthựchiệnbằngcáchc h o nanoliposome biến tínhPEG mang thuốc (100 mg) và thuốc nguyên liệu (cân lượngthuốc bằng đúng lượng thuốc có trong 100 mg nanoliposome biến tính PEG mangthuốc) hòa tan trong 1 mL nước cất Mỗi mẫu cho vào 3 màng thẩm tách celluloseMWCO3,5kDa.Tiếnhànhthẩmtáchtrong20mLPBS(pH7,4)ở37 o C.Saumỗi khoảng thời gian nhất định lấy mỗi mẫu 1 mL và thêm vào lại tương ứng 1 mL PBS(pH 7,4) cho đủ 20 mL ban đầu Hàm lượng thuốc (àg/mL) cú trong cỏc mẫu theothờigianđượcxácđịnhbằngHPLCđốivớipaclitaxelvàICP-MSđốivớicarboplatin. b.Môhìnhđộng họcphóngthích thuốc Bốn mô hình động học phóng thích thuốc (bậc không, bậc một, Higuchi vàKorsmeyer-Peppas) được sử dụng để phân tích các dạng phóng thích thuốcin vitrocủa thuốc nguyên liệu và thuốc được nang hóa trong nanliposome biến tính PEG[64,65] Mô hình động học bậc không được sử dụng để kiểm tra mối quan hệ giữathời gian và phần trăm tích lũy phóng thích thuốc Mô hình động học bậc nhất đượcsử dụng để xác định mối quan hệ giữa thời gian và log phần trăm tích lũy thuốc cònlại Mô hình Higuchi được sử dụng để đánh giá mối quan hệ giữa căn bậc hai củathời gian vàphầntrăm tíchlũy phóngthíchthuốc.Môh ì n h K o r s m e y e r - P e p p a s được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa thời gian và log tích lũy phóng thíchthuốc Đồ thị của các mô hình này được tạo dựa trên các phương trình tương ứngbằngcách sử dụngMicrosoftExcel.
C=k0t Đốivớ im ô h ì n h b ậ c k h ô n g , t h u ố c đ ư ợ c p h ó n g t h í c h vớ i m ộ t l ư ợ n g t h u ố c như nhau tại mỗi mốc thời gian khảo sát Những ví dụ phóng thích thuốc tuân theomô hình bậc không: thẩm thấu qua da, cấy ghép tại chỗ, dùng qua đường uống, viênnénchứa thuốccóđộtanthấp,huyềnphù…
- Môhình bậc mộtmôtảsựgiảiphóngthuốcphụthuộc vàonồngđộ: kft log(100-C)= - ⁄
2,303 Hệphóng thích thuốctuânmôhình bậcmột:phóng thíchthuốccókiểmsoát,khuếchtán có kiểmsoát,phóngthíchliêntục…
C=kH√tMôhìnhHiguchimôtảviệcphóngthíchthuốclàmộtquátrìnhkhuếchtándựatrênđịn hluậtFick.NhữngvídụphóngthíchthuốctuântheomôhìnhHiguchi: thuốctantrongnước(pentoxyphylline),thuốckém tantrongnước(morphine),semisolids
- Môhình Korsmeyer-Peppas môtảsựphóng thíchthuốckhỏihệthống:
C=kKt n Đối với mô hình Korsmeyer-Peppas, giá trị n được sử dụng để đặc trưng chocáccơchếphóngthíchthuốckhácnhau [66]:
n=1:sựphóngthíchthuốctuân theo môhình bậc 0hoặccase-II
n>1:sự phóngthích thuốc tuântheosuper case-II Trong đó, C là phần trăm thuốc tích lũy được giải phóng tại thời điểm tk 0l à hằngsốcủamôhìnhđộnghọcbậc không kfl àhằngsố củamôhìnhđộnghọcbậcmộtkHl àhằngsốHiguc hi kKl àhằngsốKorsmeyer-Peppas nlàsốmũ môtảcơchếkhuếchtáncủathuốcrakhỏihệchất mang
Phương phápđánhgiáđộctínhcủavật liệu
- Chuẩn bị tế bào: dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và dòng tế bào L929 doATCC (Hoa Kỳ) cung cấp được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy Dulbecco’sModified Eagle’s (DMEM) có bổ sung 10% (v/v) huyết thanh bào thai bò (FBS) và1%(v/v)penicillin-streptomycinvàủở37oC,5%CO 2
Tế bào được nuôi cấy trên đĩa 96 giếng với mật độ 1 x 10 4 tế bào/giếng,ủcác tế bào trong 24 giờ ở nhiệt độ 37°C Loại bỏ môi trường nuôi cấy rakhỏi các giếng, ủ tế bào với mẫu vật liệu trong 48 giờ (nồng độ đánh giáđộ độc tế bào được tính dựa trên nồng độ của thuốc), tiếp tục loại bỏ môitrường nuôi cấy và rửa lại hai lần bằng PBS Thêm vào mỗi giếng 20 μm.lMTT (5 mg/mL) và 200 μm.l môi trường nuôi cấy, ủ các tế bào trong 3 giờ.Sau đó, 200 μm.l DMSO được thêm vào mỗi giếng để hòa tan hoàn toàn cặnlắng.Tếbàođượcủvớimôitrường đượcdùnglàmmẫu đốichứng.
Các đĩa tế bào được đo độ hấp thu (Abs) bằng máy HumanReader HS(Human, Germany)ở b ư ớ c s ó n g 5 7 0 n m P h ầ n t r ă m t ế b à o s ố n g đ ư ợ c tínhtheocôngthứcsau:
Tếbàosống(%)=([Abs]mẫu–[Abs]mẫutrắng)/ ([Abs]đốichứng–[Abs]mẫutrắng)x100%
Phươngphápxửlýsốliệu
Mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần và lấy kết quả theo giá trị trung bình Các số liệuđược xử lý thống kê để xác định giá trị trung bình𝑥và độ lệch chuẩn (Standarddeviation,SD).
Trongđó:𝑥:trung bình của mẫu
Kết quả khảo sát các yếu tố lên quá trình tổng hợp nanoliposome từ lecithincónguồn gốcđậunành
Kết quảkhảosát nhiệtđộchuyểnphacủalecithin cónguồngốc đậunành 4 7 3.1.2 Kếtquảkhảosát phươngpháp giảmkíchthướchạt
Phương pháp tổng hợp nanoliposome được chọn là phương pháp hydrat hóamàng mỏng lipid Lipid sử dụng trong nghiên cứu là lecithin có nguồn gốc đậu nànhvà cholesterol.Kếtquả phântíchbằngnhiệtquétvi sai( D S C ) c h o t h ấ y k h o ả n g nhiệt độ chuyển pha của lecithin có nguồn gốc đậu nành là từ 30 o C đến 60 o C (Phụlục 1) Kết hợp quan sát từ thực nghiệm, nghiên cứu chọn nhiệt độ cô quay là 45 o Cvà nhiệt độ hydrat hóa là 60 o C để tiến hành khảo sát phương pháp giảm kích thướcvàtỷlệcácthànhphầntổnghợpliposome.
Sautổnghợp Sau1tuầnbảoquảnở2 –8 o C Cảm quan
Hệ phân tán liposome sau khi siêu âm có kích thước hạt trung bình 196,5 ±4,9nmvớihệsốđaphântáncao(0,622±0,024),kếtquảchothấyhiệuquảcủaviệc giảm kích thước bằng siêu âm là thấp và mẫu thu được không đồng nhất Bêncạnh đó,sau 1tuần bảo quản,mẫu chothấy hiện tượngl ắ n g c ặ n d o h ệ l i p o s o m e tổnghợpkhôngbềndẫnđếnbịkết tụ.
Liposome sau khi nén qua màng có kích thước hạt trung bình 145,1 ± 8,6 nmvới hệ số đa phân tán là 0,446 ± 0,008 Tuy nhiên, kết quả khảo sát sau 1 tuần bảoquảnchothấyhệliposometổnghợpđượcbịkếttụ.
Trongkhiđó,kíchthướchạtcủahệphântánliposomethuđượckhigiảmkíchthước bằng siêu âm kết hợp nén qua màng là 133,2 ± 1,2 nm và hệ số đa phân tánthấp (0,390 ± 0,020) Kết quả cho thấy phương pháp giảm kích thước này cho hệliposomesautổnghợpcókíchthướchạt
