(TIỂU LUẬN) báo cáo học PHẦN ENZYME TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM tìm HIỂU QUY TRÌNH THU NHẬN ENZYME AMYLASE từ lúa

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT – CÔNG NGHỆ CẦN THƠ KHOA CÔNG NGHỆ SINH HÓA – THỰC PHẨM  BÁO CÁO HỌC PHẦN ENZYME TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TÌM HIỂU QUY TRÌNH THU NHẬN ENZYME AMYLASE TỪ LÚA GVGD: Ths LÊ TRÍ Cần Thơ, 2022 MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU 1 1 GIỚI THIỆU CHUNG 2 1.1 Cây lúa 2 1.1.1 Cấu trúc hạt lúa .2 1.1.2 Thành phần dinh dưỡng 3 1.2 Enzyme amylase 3 1.2.1 Định nghĩa .3 1.2.2 Phân loại 4 1.2.3 Đặc tính và cơ chế hoạt động 5 1.2.4 Cơ chất của enzyme amylase 10 2 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN 12 2.1 Sơ đồ quy trình 12 2.2 Tinh sạch enzyme amylase bằng phương pháp sắc ký .13 3 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME AMYLASE .13 3.1 Quá trình thuỷ phân tinh bột 13 3.2 Enzyme amylase trong công nghiệp rượu – bia .13 3.3 Enzyme amylase trong sản xuất bánh mì 14 3.4 Enzyme amylase trong một số ngành công nghiệp khác 14 4 VAI TRÒ VÀ HIỆU QUẢ .15 TÀI LIỆU THAM KHẢO 16 LỜI MỞ ĐẦU Ở Viêt Nam cây trồng nông nghiệp chính là lúa (Oryza sativa) thuộc họ cây thân thảo (Graminae) cũng là một loại cây lương thực quan trọng đối với hơn 1/2 dân số thế giới và được trồng phổ biến nhiều ở vùng đồng bằng sông Cửu Long vì tiềm lực ý nghĩa kinh tế lớn với gian sinh trưởng trung bình từ 75-250 ngày tùy theo chủng loại Ở nước ta thì phân ra thành hai loại đó là lúa nếp và lúa tẻ Việt Nam là nước xuất khẩu lúa đứng hàng thứ hai trên thế giới Ngày nay, cùng với sự phát triển vượt bật của khoa học công nghệ, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được áp dụng hầu hết trong nhiều lĩnh vực như: công nghiệp thực phẩm, chăn nuôi, y dược và phục vụ cho việc dưỡng nhan của đa số phái đẹp trên thế giới Một trong số đó phải kể đến enzyme amylase bởi lợi ích mà amylase mang lại trong ngành thực phẩm Alpha-amylase, dạng amylase với các vị trí liên kết carbohydrate thứ cấp, là một loại enzyme quan trọng trong suốt thời kỳ sinh trưởng và vòng đời của hạt kín Trong lúa, isozyme alpha-amylase rất quan trọng đối với sự hình thành của hạt tinh bột dự trữ trong quá trình trưởng thành và thúc đẩy tinh bột dự trữ để nuôi dưỡng cây con đang phát triển Vì vậy, đề tài “Tìm hiểu quá trình trích ly enzyme amylase từ mầm lúa (Oryza sativa) ” được thực hiện nhằm xác định một số hoạt tính và cũng như điều kiện trích ly mầm lúa thu nhận enzyme amylase Qua đó, giúp mở rộng hơn nhiều hướng đi mới, góp phần làm gia tăng tiềm lực kinh tế cây lúa nói chung và nâng cao chất lượng nông sản Việt Nam nói riêng 1 1 GIỚI THIỆU CHUNG 1.1 Cây lúa Cây lúa (Oryza sativa) thuộc họ cây thân thảo (Graminae) cũng là một loại cây lương thực quan trọng đối với hơn 1/2 dân số thế giới và được trồng phổ biến nhiều ở vùng đồng bằng sông Cửu Long vì tiềm lực ý nghĩa kinh tế lớn với gian sinh trưởng trung bình từ 75-250 ngày tùy theo chủng loại Cây lúa là loại lương thực vô cùng phổ biến và giữ vai trò quan trọng trong đời sống con người Việt Nam Nó gắn bó với người dân ta từ lâu đời, là thực phẩm quan trọng không thể thiếu trong bữa ăn hằng ngày và cũng là cây lương thực xuất khẩu hàng đầu của nước nhà 1.1.1 Cấu trúc hạt lúa Vỏ trấu: bao gồm hợp chất cellulose và silic cấu tạo thành thường rất cứng với mục đích bảo vệ hạt chống sự phá hoại của côn trùng sâu bọ hay các mầm bệnh khác và điều kiện thời tiết bất lợi Màu sắc vỏ trấu (vàng nhạt → vàng nâu) sẽ có thay đổi theo mỗi giống lúa Vỏ hạt: ở trong cùng là nội biểu bì đến tầng trung quả và lớp bên ngoài là lớp biểu bì, vỏ hạt có màu đỏ và trắng đục và bọc xung quanh hạt Nội nhũ: trong hạt lúa đây là phần chiếm lớn nhất, chủ yếu là glucid 90%, protein, vitamin Hình 1.1 Cấu trúc hạt lúa (nguồn: internet) Phôi: có chứa một tử diệp nằm ở góc hạt và được ép sát vào bên trong nội nhũ cũng là cơ quan để biến đổi các chất được dự trữ trong nội nhũ thành các chất dinh dưỡng nhằm 2 cung cấp cho sự phát triển của cây mầm Phôi hạt có protein, lipid, vitamin, đường hay các enzyme khác Màng lúa: chiều cao khoảng 1/3 vỏ hạt Tùy vào giống lúa cũng như là điều kiện canh tác mà độ dài của màng lúa sẽ có sự khác nhau Vỏ trấu hồng hơn so với màng lúa thì lại có màu vàng nhạt 1.1.2 Thành phần dinh dưỡng Tùy theo điều kiện canh tác, giống lúa hay điều kiện đất đai mà thành phần dinh dưỡng của hạt lúa sẽ khác nhau Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của hạt lúa Thành phần dinh dưỡng Protein Tinh bột Lipid ( tổng số) (Nguồn Nguyễn Đức Lượng, 2004) Nước: ở trong hạt thóc nước vừa ở dạng tự do vừa ở dạng liên kết Chất lượng của hạt lúa phụ thuộc vào lượng nước và lượng nước sẽ càng giảm đối với hạt lúa càng già Protein: chiếm 8-9% Lượng protein bị biến tính và thoái hóa dần trong lúc bảo quản Khi kết hợp với nước, protein sẽ trương nở và thành thể keo Lipid: chiếm 2% hàm lượng trong hạt Glucid: amylose và amylopectin là hai thành phần chính có trong tinh bột.Tùy thuôc vào giống lúa mà amylose và anylopectin sẽ có sự thay đổi Gạo tẻ khoảng 19,5% amylose và 81,5% amylopectin; nếp khoảng 0,7% amylose và amylopectin là 99,3% Cellulose và hemicellulose chủ yếu ở trong vỏ trấu và vỏ hạt, là những polysaccharide không thể tiêu hóa được Vitamin: carotenoid, B6, PP, B1, B2, H, C, E Amino acid: là những sản phẩm trung gian dùng để tổng hợp hoặc thủy phân protein Enzyme: là các enzyme amylase: enzyme oxy hóa khử, α-amylase và β-amylase, protease và một số enzyme khác Trong quá trình nảy mầm các enzyme hoạt động mạnh và tăng cao thúc đẩy cho các phản ứng sinh- lý-hóa với nhau và sinh tổng hợp các loại enzyme Các quá trình gần giống ở đại mạch, chỉ khác mức độ tạo thành enzyme cũng như tốc độ phản ứng 3 1.2 Enzyme amylase 1.2.1 Định nghĩa Amylase là một nhóm thuộc các enzyme tiêu hoá thuỷ phân các liên kết glycosidic của tinh bột thành glucose, maltos và dextrin hạn chế Nhiều enzyme hoạt động trên tinh bột hoặc trên các oligosaccharise có nguồn gốc từ chúng, dưới sự xúc tác và phân giải các liên kết glucoside nội phân tử trong các polysaccharide có sự tham gia của nước Ở trong nước bọt của người có loại enzyme amylase và được gọi là ptyalin nhưng ở một số loài động vật có vú khác như chó, mèo, ngựa thì lại không có sự hiện diện của amylase Ptyalin bắt đầu thuỷ phân tinh bột từ vùng miệng và quá trình này sẽ được ruột non hoàn tất nhờ amylase ở tuyến tuỵ và còn gọi là amylopsin Amylase của malt sẽ thủy phân tinh bột lúa mạch để tạo thành disaccharide làm cơ chất của quá trình lên men bởi các nấm men Hình 1.1 Cấu tạo enzyme amylase (nguồn: internet) Để cải thiện năng suất tiềm năng của enzyme amylase, bộ gen sinh vật phải đổi theo hai cách khác nhau: một là cải thiện dòng cổ điển bằng cách đột biến và có sự chọn lọc, hai là sử dụng enzyme amylase tái tổ hợp được tạo bởi các vi sinh vật sử dụng trong quá trình lên men chìm và lên men ở trạng thái rắn Enzyme amylase có các ứng dụng tiềm năng và đa dạng chiếm khoảng 30% sản lượng enzyme trên thế giới Một cuộc khảo sát toàn diện các tài liệu về α-amylase, ß-amylase và γ-amylase, cấu trúc của chúng, các đặc điểm chính, các nguồn gốc khác nhau như thực vật, nấm, động vật và vi sinh vật cũng như các khía cạnh sản xuất khác nhau: lên men, bánh mì, dệt, giấy và dược phẩm, các amylase từ nấm còn có thể sử dụng rộng rãi cho các ứng dụng thương mại hay trong các ngành công nghiệp chế biến thực phẩm và trong việc làm rõ khói mù trong nước trái cây, đồ uống có cồn, sản xuất xi-rô glucose và maltose, các sản phẩm thực phẩm khác, bên cạnh đó ứng dụng khá quan trọng nhất của amylase là trong công nghiệp tinh bột và sản xuất đường từ tinh bột 4 1.2.2 Phân loại Amylase có sáu loại trong đó có ba loại phổ biến: α-amylase, γ-amylase và β-amylase, dextrin-6-glucanhydrolase, amylopectin-6-glucanhydrolase và oligodextrin-6glucanhydrolase (hay dextrinase) Amylase chia thành hai nhóm: endoamylase (enzyme nội bào) hoạt động trên phần bên trong của phân tử cơ chất, và exoamylase (enzyme ngoại bào) thì ngược lại hoạt động trên các đầu tận cùng và không có tính khử Do đó, gốc glucose ở đầu tận cùng và các liên kết α-1, 6 không thể bị phân cắt bởi α-amylase Endoamylase: α-amylase và các nhóm enzyme khử nhánh Có hai loại thuộc nhóm enzyme khử nhánh là nhánh khử trực tiếp (pullulanase hay α-dextrin 6gluccanohydrolase), nhánh khử gián tiếp (amylo-1,6-glucosidase và transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase)) Các loại enzyme trên thủy phân các liên kết ở bên trong của chuỗi polysaccharide Exonuclease: β-amylase và γ-amylase Đó là những loại enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide Amylase Exonuclease β-amylase Endoamylase γ-amylase Enzyme khử nhánh α-amylase Khử trực tiếp Khử gián tiếp α-dextrin 6glucanohydrolase oligo-1,6-glucosidase (pullulanase) (transglucosylase) và amylo 1,6-glucosidase Hình 1.2 Các loại enzyme endoamylase và exoamylase Ở nguồn khác nhau thì đặc tính thủy phân, thành phần, nhiệt độ hoạt động, pH tối ưu và tính chất ổn định với nhiệt cũng khác nhau Amylase dễ tan trong nước và các dung dịch hay rượu loãng Protein của α-amylase có tính chất của globulin và acid yếu Có điểm đẳng điện thường nằm trong vùng có độ pH 4,2 – 5,7 5 1.2.3 Đặc tính và cơ chế hoạt động α-amylase α-amylase là một enzyme hydrolase xúc tác cho quá trình thuỷ phân các liên kết α-1, 4glycosidic của cơ chất trong tinh bột một cách ngẫu nhiên tạo ra glucose và maltose và là endoenzym (enzyme nội bào) Bên cạnh α-amylase có khả năng phân hủy hồ tinh bột và cả khả năng phân hủy hạt tinh bột nguyên vẹn α-amylase hiện tại là enzym có tầm quan trọng và thiết yếu do hoạt động thủy phân tinh bột của nó và các hoạt động đó được thực hiện nhờ quá trình thủy phân Một trong những hoạt động như vậy là sản xuất xi-rô glucose và fructose từ tinh bột (α-amylase xúc tác là bước đầu tiên trong quá trình này) Trước đây, tinh bột được thủy phân thành glucozơ bằng phương pháp thủy phân bằng axit Tuy nhiên có những hạn chế về điều kiện nhiệt độ cao và hoạt động có tính axit cao Những hạn chế này được khắc phục bằng cách thủy phân tinh bột bằng enzyme để thu được xi-rô fructose cao Enzyme an toàn với môi trường và tăng cường khả năng tẩy rửa để loại bỏ các vết bẩn khó giặt Chúng có thể phân hủy sinh học và hoạt động ở điều kiện nhẹ hơn so với chất xúc tác hóa học và do đó được ưa chuộng hơn chất xúc tác sau này α-amylase có nhiều ứng dụng vào ngành công nghiệp Việt nam và đó cũng chính là động lực thúc đẩy cho việc nghiên cứu sản xuất enzyme này một cách tối ưu bởi tính an toàn và tiện lợi  Đặc tính: - Trọng lượng phân tử của α-amylase malt là 59.000dkDa - Điểm đẳng điện trong vùng pH 4,2 – 5,7 - Dễ tan trong nước, các dung dịch muối và rượu loãng - Protein của các amylase này có tính chất của globuline và có tính acid yếu - Mỗi phân tử α-amylase đều chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca góp phần tạo nên sự ổn định và hình thành cấu trúc bậc 3 của enzym Khi bị tác động bởi các enzym phân giải protein và tác nhân gây biến tính khác, Ca còn có công dụng duy trì sự tồn tại cho enzyme Trường hợp Ca bị loại ra khỏi phân tử α-amylase thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất Các amylase khác chịu nhiệt kém hơn so với α-amylase Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử - Tùy vào các nguồn khác nhau mà khả năng hoạt động và điều kiện hoạt động của α- amylase là khác nhau 6 Ví dụ: pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ đại mạch nảy mầm và thóc nảy mầm là 5,3 (hoạt động tốt có thể trong khoảng pH 4,7 – 5,4) Cũng như độ bền của α-amylase nấm mốc tốt hơn so với acid của α-amylase malt Từ đó có thể thấy rằng pH tối thích của α-amylase từ vi sinh vật khác so với của α-amylase từ malt - Tuy nhiên pH và nhiệt độ là hai yếu tố ảnh hưởng đến độ bền của α-amylase Ví dụ: Ở điều kiệu nhiệt độ là 0°C và pH=3,6, thì α-amylase của malt bị mất hoạt tính hoàn toàn Tuy nhiên khi ở nhiệt độ 58-60°C thì α-amylase của mầm thóc và malt hoạt động tốt nhất Chính vì thế người ta thường đường hóa cơ chất bằng malt trong khoảng nhiệt độ từ 60-65°C để sản xuất rượu Bảng 1.2 Độ bền với nhiệt của α-amylase từ malt (Miller, John và Palmer) Nhiệt độ (0C) 65 70 75  Cơ chế: Hình 1.3 Cơ chế tác động của α-amylase lên tinh bột 7 α-amylase trong quá trình thủy phân tinh bột bao gồm nhiều giai đoạn: - Trong tinh bột, enzyme này sẽ phân cắt một số liên kết và tạo ra một lượng lớn dextrin (phân tử thấp), các dextrin này tiếp tục bị thủy phân cho ra maltose và glucose - Amylose bị phân cắt thành các polyglucose (6-7 gốc glucose) dưới tác dụng của α- amylase, sau đó các polyglucose (6-7 gốc glucose) này tiếp tục được phân cắt thành chuỗi ngắn dần và tạo thành maltose, maltotriose, maltotetrose Nếu thời gian tác dụng dài hơn, thì amylose sẽ là 13% glucose và 87% maltose cũng là sản phẩm của quá trình thủy phân này Tương tự khi cho α-amylase tác dụng lên trên amylopectin và sản phẩm được tạo là 19% glucose, 72% maltose, bên cạnh còn có dextrin (phân tử thấp) và 8% isomaltose lí do là α-amylase không cắt được liên kết 1,6-glucoside ở mạch nhánh của phân tử amylopectin Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của a-amylase: + Giai đoạn dextrin hóa: α-amylase có khả năng dextrin hóa khá cao nên có thể gọi α-amylase là: amylase dịch hóa hoặc amylase dextrin hóa + Giai đoạn đường hóa: β-amylase β-amylase là một enzyme exohydrolase hoạt động từ đầu không nhân tạo bằng cách thủy phân các liên kết α-1, 4-glucan trong tinh bột , polysaccharide và glucogen để tạo ra các đơn vị maltose liên tiếp do sự xúc tác của β-amylase có cấu hình β Vì nó không thể phân cắt các liên kết nhánh trong polysaccharide phân nhánh như glycogen hoặc amylopectin, nên sự thủy phân không hoàn toàn và các đơn vị dextrin vẫn còn 8 β-amylase hiện diện phổ biến ở thực vật bậc cao, đặc biệt là ở hạt nảy mầm VD: hạt ngũ cốc nảy mầm - Ở ngũ cốc, β-amylase tham gia vào sự phân giải tinh bột trong quá trình nảy mầm của hạt - Ở lúa, β-amylase được tổng hợp trong hạt suốt quá trình nảy mầm của hạt tuy nhiên ở hạt khô thì không được tổng hợp - Ở lúa mạch, trong hạt khô enzyme được tích lũy trong suốt quá trình phát triển của hạt, chủ yếu là liên kết với tinh bột của hạt Khi ở dạng liên kết, enzyme này là một phân tử có trọng lượng phân tử là 64kDa và khi bị phân cắt bởi một protease sẽ được phóng thích dưới dạng tự do và có trọng lượng phân tử là 59kDa Maltose là nguyên nhân chính tạo ra vị ngọt của trái cây trong quá trình chính vì được βamylase phân giải tinh bột (pH tối ưu khoảng 4,0 – 5,5) β-amylase được sử dụng cho các ứng dụng khác nhau trong nghiên cứu cũng như công nghiệp Nó có thể được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc của các phân tử tinh bột và glycogen được sản xuất bằng nhiều phương pháp khác nhau Trong công nghiệp, nó được sử dụng để lên men, sản xuất bia và chưng cất Ngoài ra còn được sử dụng để sản xuất xirô có hàm lượng maltose cao  Đặc tính: - Mầm lúa mạch có α-amylase và β-amylase - β-amylase bền với acid nhưng chịu nhiệt kém hơn α-amylase - β-amylase ở nhiệt độ 70°C bị bất hoạt (nhiệt độ hoạt động tối thích 55°C, pH 5,1-5,5) 2+ 2+ 2+ - β-amylase không bền khi có Ca , β-amylase bị kìm hãm bởi Cu , Hg , urea, iodoacetamide, iodin, ozon - β-amylase là một albumin, tâm xúc tác có chứa nhóm -SH, nhóm -COOH và vòng imidazol của các gốc histidine và là enzym ngoại bào (exoenzym) 9  Cơ chế: Hình 1.4 Cơ chế tác động của α-amylase lên tinh bột β-amylase là một exoamylase (enzyme ngoại bào) Các nhánh ngoài cùng của cơ chất tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu không khử β-amylase phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết (α-1,6 glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng Phần polysaccharide còn lại được gọi là β-dextrin là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,6 glucoside Tác dụng của β-amylase lên tinh bột như sau: Tinh bột sẽ bị thủy phân đến 95% trong trường hợp cả α và β-amylase đều được thuỷ phân đồng thời β-amylase trong quá trình thuỷ phân tinh bột: - β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose - β-amylase phân giải 54-58% amylopectin thành maltose - β-amylase phân huỷ rất mạnh hồ tinh bột và ngược lại không thủy phân các hạt tinh bột nguyên vẹn γ-amylase (glucoamylase hay α-1,4-glucan-glucohydrolase) 10 γ-amylase phân cắt các liên kết glycosidic α (1-6), ngoài ra còn phân cắt các liên kết glycosidic tận cùng α (1-4) ở các đầu không nhân tạo của amylose và amylopectin, không giống như các dạng amylase khác, nó tạo ra glucose γ-amylase hoạt động mạnh nhất trong môi trường axit và có độ pH tối ưu là 3 Tên gọi khác: α-1,4:1,6-glucan-4:6-glucohydrolase; glucoamylase; amyloglucosidase; takaamylase B; γ - amylase; maltulase, glucoamylase là enzym ngoại bào Glucoamylase có khả năng thủy phân liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside, ngoài ra cũng có thể thủy phân các liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside Khi thủy phân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, sẽ lần lượt tách từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose Ở nhiệt độ 50°C và pH 3,5-5,5 glucoamylase có hoạt lực cao nhất, kém bền trong rượu acetone và không được bảo vệ bởi Ca2+ nhưng lại bền với acid hơn α-amylase Tinh bột, panose, glucogen, dextrin, isomaltose, maltose và amylopectin hoàn toàn bị thuỷ phân bởi glucoamylase thành glucose mà không cần có sự góp mặt của khác enzyme khác Glucoamylase thủy giải các polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so với các chất có phân tử nhỏ Các polysaccharide có nhánh như amylopectin, glucogen, β-dextrin bị gluoamylase thủy phân khá nhanh Oligo-1,6-glucosidase hay dextrinage tới hạn Trong isomaltose, panose và các dextrin tới hạn, oligo-1,6-glucosidase sẽ thuỷ phân liên kết a-1,6-glucoside thành đường có thể lên men được Hoạt động dextrinase mạnh nhất ở điều kiện tốt thích là 40°C và độ pH tối ưu là 5,1 Hệ dextrinase trong hạt ngũ cốc nảy mầm hoặc đại mạch, thóc nảy mầm có amylopectin 1,6-glucosidase hay R-enzyme và dextrin-1,6-glucosidase hay amylo-1,6glucosidase hay dextrin- 6-glucanhydrolase Trong quá trình thuỷ phân thì dịch thuỷ phân có nhiều maltose vì các enzyme này thủy phân dextrin triệt để hơn so với α và β-amylase 1.2.4 Cơ chất của enzyme amylase Tinh bột Tinh bột trong thực vật được xem như chất dự trữ năng lượng quan trọng và có chủ yếu ở các loại củ như khoai lang, khoai tây, khoai mì, trong các loại ngũ cốc, các loại hạt Tinh bột là một polysaccharide bao gồm hai loại: amylose và amylopectin Amylose chiếm 20-25% phân tử tinh bột là một chuỗi tuyến tính gồm các đơn vị glucose kết nối với nhau bằng liên kết α-1, 4-glycosidic tạo thành một mạch xoăn dài không phân nhánh Amylopectin chiếm 75-80% tinh bột, đặc trưng bởi các chuỗi phân nhánh từ các đơn vị glucose được liên kết bằng liên kết α- 1, 4-glycosidic và α-1, 6 glycosidic tạo thành mạch có nhiều nhánh Tùy vào nhiệt độ, nguồn gốc, điều kiện thuỷ phân mà thành phần dịch 11 thuỷ phân thu được sau khi thuỷ phân tinh bột sẽ có thay đổi và pH tối ưu cho hoạt động được tìm thấy là 7,0 Hiện tượng hồ tinh bột là khi tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng khi hỗn dịch tinh bột được đun 60-85°C Sự phân cắt các liên kết glucoside làm xuất hiện hiện tượng tinh bột bị thủy phân bởi tác động của enzyme amylase và xảy ra theo hai mức độ: dịch hóa và đường hóa Sản phẩm trung gian của sự dịch hóa này là dextrin và khi tiếp tục đường hóa thì sản phẩm sẽ là maltose và glucose Đường (glycogen) Là một loại carbohydrate được dự trữ ở trong cơ thể động vật chuyển hóa thành năng lượng để phục vụ cho nhu cầu của cơ thể Ở tế bào vi sinh vật và động vật, amylase không thể thiếu vì giúp chuyển hóa glucid Ở người và động vật, glycogen tập trung chủ yếu ở trong gan và dễ tan trong nước, nếu carbohydrate được nạp quá nhiều và cơ thể chúng ta thì sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo để dự trữ 12 2 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN 2 1 Sơ đồ quy trình Hình 1.5 Sơ đồ quy trình thu nhận amylase 13 2 2 Tinh sạch enzyme amylase bằng phương pháp sắc ký a Tinh sạch enzyme amylase bằng phương pháp sắc ký Hạt lúa được cho hút ẩm và ủ trong tối ở 30°C trong 8 ngày Hạt nảy mầm được đồng hóa trong một máy trộn và một polytron với 800ml dung dịch đệm TRIS/HCI 50mM (pH 8,5) (dung dịch đệm A) Sản phẩm đồng hóa được ép qua hai lớp lưới nylon và dịch lọc thô được đưa vào ly tâm với tốc độ 15.000 vòng trong 20 phút Phần ở trên được xem nhu dịch enzym thô Dịch enzym thô được cho kết tủa với (NH.)SO (25-60%) Phần kết tủa thu được đem hòa tan trong 10ml dung dịch đệm A và ly tâm với tốc độ 15.000 vòng trong 20 phút Sau khi sử dụng phương pháp thẩm tích thì phần nổi ở trên trong dung dịch đệm A thi sẽ được cho qua cột DEAE cellulose, DE 52 (Whatman) và được cân bằng bởi dung dịch đệm A; enzyme được tách ra bằng NaCI nồng độ 0-0,5M Dung dịch được thẩm tích và được lôi cuốn qua cột CHA (ancyclodextrin), cột này được đặc biệt sử dụng để lôi cuốn amylase Các phân đoạn qua cột thu được sẽ được chuyển qua 12 sắc ký cột superose b.Thu nhận enyme amylase bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide Hạt lúa được ngâm nước và ủ cho nảy mầm Sau 14 ngày, cây mầm được xay nhuyễn với đệm Tris-HCl 0,005M (pH 8,0) Tỷ lệ mô đệm là 1:2 (trọng lượng/ thể tích) Hỗn hợp sau khi đồng hóa được ly tâm với tốc độ 10.000ppm trong 15 phút ở nhiệt độ 4 độ C Phần nổi ở trên được chuyển sang một ống ly tâm khác và được xem là dịch enzyme Gel được chuẩn bị sẵn sàng và được đưa vào điện di với cường độ dòng điện 70V Sau khi hoàn tất việc chạy điện di, gel được đưa ra nhuộm với dung dịch nhuộm màu để xác định sự hiện diện của amylase 3 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME AMYLASE 3.1 Quá trình thuỷ phân tinh bột Amylase chuyển hóa tinh bột thành glucose và các loại siro khác nhau Amylase là một enzyme quan trọng để tiêu hóa và hấp thụ tinh bột Thêm amylase vào thức ăn có thể cải thiện quá trình tiêu hóa và hấp thụ tinh bột của động vật, cải thiện hiệu suất sản xuất và tăng khả năng sử dụng thức ăn 3.2 Enzyme amylase trong công nghiệp rượu – bia Enzyme amylase tham gia vào giai đoạn đường hóa tinh bột Amylase được sử dụng trong quá trình đường hóa tinh bột thành maltose, glucose, dùng làm cơ chất cần thiết cho tiến trình lên men 14 + Trong sản xuất rượu ở Việt Nam, người ta dùng canh trường bề mặt nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus usamii, Aspergillus awamori để đường hóa Chế phẩm enzyme amylase từ vi khuẩn Bacillus subtilis chịu nhiệt cao, dùng trong giai đoạn dịch hóa tinh bột lúc đầ Ở nhiệt độ 80 – 90 độ C trong 10 – 15 phút thì a-amylase của vi khuẩn bị vô hoạt một phần rất nhỏ + Trong sản xuất bia thường dùng Aspergillus oryzae và Bacillus subtilis để đường hóa thay malt, nguyên liệu khá đắt tiền Dùng chế phẩm enzyme này người ta có thể thay thế một lượng malt bằng đại mạch không nảy mầm Khi dùng chế phẩm enzyme vi sinh vật thay malt cần bổ sung nguồn nguyên liệu có bột như bắp, sắn, gạo,… Việc sử dụng amylase có trong các hạt nảy mầm thay thế malt đã góp phần đáng kể trong việc giảm giá thành mà chất lượng bia vẫn được đảm bảo 3.3 Enzyme amylase trong sản xuất bánh mì Trong sản xuất bánh mì, người ta có thể sử dụng chế phẩm enzyme amylase của nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori hay của vi khuẩn, nhưng chế phẩm từ nấm mốc được áp dụng nhiều hơn vì nó có hiệu quả hơn Sử dụng với lượng 0,002 – 0,05% chế phẩm enzyme amylase so với bột nhão sẽ làm tăng cường quá trình lên men bột, làm rút ngắn thời gian lên men, làm tăng độ xốp, tăng thể tích bánh lên men đáng kể, màu sắc vỏ bánh đẹp hơn, bắt mắt hơn, ruột bánh xốp và sáng màu hơn, tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm được ứng dụng Bánh mì ngọt nếu được bổ sung enzyme amylase thì sẽ xảy ra quá trình thủy phân bột thành đường, do đó góp phần làm giảm lượng đường tiêu hao trong quá trình sản xuất 3.4 Enzyme amylase trong một số ngành công nghiệp khác Enzyme amylase được phát hiện đã góp phần quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm - Trong công nghiệp dệt, chế phẩm enzyme amylase của vi khuẩn Bacillus subtilis có tính chịu nhiệt cao, dùng trong rũ hồ vải, tạo điều kiện tốt hơn dễ dàng hơn cho quá trình tẩy, nhuộm vải sau này - Chế phẩm enzyme amylase được sử dụng riêng rẽ hoặc sử dụng kết hợp với các enzymw khác để sản xuất các loại thức ăn dễ tiêu hóa, hấp thu trong chăn nuôi, tăng trọng, giảm khả năng bệnh tật cho vật nuôi - enzyme amylase và một số enzyme khác được cho chữa bệnh thiếu enzyme, khả năng chuyển hóa kém, bệnh tiêu hóa, tim,… Ngoài ra còn dùng để điều chế môi trường nuôi vi sinh vật phục vụ nghiên cứu - Trong sản xuất bánh kẹo, maltose là sản phẩm thủy phân tinh bột bằng amylase và glucose bằng glucoamylase Chính glucoamylase là yếu tố làm tăng hiệu suất alpha amylase - Enzyme amylase có thể tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau như amylase từ thực vật động vật, mầm thóc, mầm đại mạch (malt), hạt bắm nảy mầm hay từ nấm mốc,… nguyên liệu cho sản xuất là gạo, bắp, khoai mì… đây là những nguyên liệu dễ tìm, rẻ có thể dễ 15 dàng tìm thấy ở Việt Nam Do đó, đây là một lợi thế và là hướng phát triển mạnh làm cơ sở cho nhiều ngành khác phát triển 4 VAI TRÒ VÀ HIỆU QUẢ 16 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hương và Phan Thị Huyền Công nghệ enzyme, (2004) NXB Đại học Quốc gia Thành phố Cần Thơ Hồ Chí Minh [2] Ứng dụng của enzyme amylase trong công nghiệp Đại học Công nghiệp Thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh [3] H Taniguchi, Y Honnda, in Encyclopedia of Microbiology (Third Edition), (2009) P Williams, in Encyclopedia of Analytical Science (Second Edition), 200 [4] Ajita Sundarram, and Thirupathihalli Pandurangappa Krishna Murthy, “α-Amylase Production and Applications: A Review.” Journal of Applied & Environmental Microbiology, vol 2, no 4 (2014): 166-175 [5] Ritu Saini, Harnek Singh Saini and Anjali Dahiya, “Amylase: Characteristics and industrial applications” Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 2017;6(4): 18651871 17 ... phát triển Vì vậy, đề tài ? ?Tìm hiểu q trình trích ly enzyme amylase từ mầm lúa (Oryza sativa) ” thực nhằm xác định số hoạt tính điều kiện trích ly mầm lúa thu nhận enzyme amylase Qua đó, giúp mở... PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN Sơ đồ quy trình Hình 1.5 Sơ đồ quy trình thu nhận amylase 13 2 Tinh enzyme amylase phương pháp sắc ký a Tinh enzyme amylase phương pháp sắc ký Hạt lúa cho hút ẩm ủ tối 30°C... Amino acid: sản phẩm trung gian dùng để tổng hợp thủy phân protein Enzyme: enzyme amylase: enzyme oxy hóa khử, α -amylase β -amylase, protease số enzyme khác Trong trình nảy mầm enzyme hoạt động