Chương 2 thể nhiễm sắc của tế bào tổ chức chứa ADN chương 2 thể nhiễm sắc của tế bào tổ chức chứa ADN

1 Chương Thể nhiễm sắc tế bào - tổ chức chứa ADN Nguyễn Như Hiền Di truyền tế bào NXB Đại học quốc gia Hà Nội 2005 Từ khoá: Thể nhiểm sắc c a t bào, T Morgan, C B Bridges, Kiểu nhân, Băng nhiễm sắc Tài liệu Thư viện điện tử ĐH Khoa học Tự nhiên sử dụng cho mục đích học tập nghiên cứu cá nhân Nghiêm cấm hình thức chép, in ấn phục vụ mục đích khác không chấp thuận nhà xuất tác giả Mục lục Chương Thể nhiễm sắc tế bào - tổ chức chứa ADN 2.1 Hình thái thể nhiễm sắc 2.1.1 Kích thước thể nhiễm sắc 2.1.2 Số lượng thể nhiễm sắc 2.2 C u trúc hiển vi c a thể nhiễm sắc 2.2.1 Thể nhiễm sắc thư ng thể nhiễm sắc giới tính 2.2.2 Trung ti t (Centromere) 10 2.2.3 Thể mút (telomere) 11 2.2.4 Các băng nhiễm sắc (chromosome bands) 12 2.3 C u trúc siêu vi c a thể nhiễm sắc 13 2.4 Học thuy t thể nhiễm sắc c a Di truyền 14 2.4.1 Thí nghiệm c a T Morgan 14 2.4.2 Thí nghiệm c a C B Bridges 16 2.4.3 Cơ s thể nhiễm sắc c a quy luật Mendel 17 2.5 Kiểu nhân - Ti n hóa c a kiểu nhân 18 2.5.1 Kiểu nhân (caryotype) 18 2.5.2 Ti n hóa kiểu nhân 2.5.3 Nghiên c u kiểu nhân 2.5.4 Phương pháp nhận bi t loài 30 t bào nhân chuẩn (Eukaryota) 23 côn trùng truyền bệnh 28 Chương Thể nhiễm sắc tế bào - tổ chức chứa ADN Mục tiêu: Sau học xong chương học viên có kh năng: - Trình bày c u trúc hiển vi, siêu hiển vi phân tử c a thể nhiễm sắc - Phân biệt đơn bội, lưỡng bội, đa bội thể nhiễm sắc - Phân biệt cặp thể nhiễm sắc thư ng cặp thể nhiễm sắc giới tính s thể nhiễm sắc c a xác định giới tính - Ch ng minh s thể nhiễm sắc c a di truyền - Nắm kỹ thuật làm kiểu nhân kỹ thuật nhuộm cắt băng 2.1 Hình thái thể nhiễm sắc 2.1.1 Kích thước thể nhiễm sắc Thể nhiễm sắc c a t bào nhân chuẩn quan sát trung kỳ nguyên phân thư ng có dạng hình ch m hình que thư ng có kích thước vào kho ng 0,2 - 3μm đư ng kính 0,2 - 50μm chiều dài Ví d thể nhiễm sắc ngư i, bé nh t thể nhiễm sắc số 21 22 có kích thước L = 1,5μm; chi c lớn nh t thể nhiễm sắc số có L = 10μm Về kích thước c a thể nhiễm sắc nói chung mang tính đặc trưng cho t bào cá thể c a lồi Tuy nhiên, có trư ng hợp mô khác c a thể có bi n đổi hình dạng kích thước thể nhiễm sắc để thích nghi với ch c c a giai đoạn phát triển Ví d , t bào c a mơ n nước bọt u trùng loài hai cánh ruồi qu (Drosophila) ngư i ta quan sát th y thể nhiễm sắc khổng lồ (còn gọi thể nhiễm sắc đa sợi) có kích thước đạt tới L = 300μm D = 20μm nghĩa lớn g p hàng ch c lần so với thể nhiễm sắc bình thư ng có mơ khác c a thể ruồi (xem hình 2.1) Hình 2.1 Sơ đồ chi ti t thể nhiễm sắc khổng lồ n nước bọt Drosophilla 2.1.2 Số lượng thể nhiễm sắc Về số lượng thể nhiễm sắc tiêu đặc trưng cho loài thể nhiễm sắc Theo quy luật chung, cá thể lồi có số lượng thể nhiễm sắc đặc trưng cho lồi Ví d : Ngư i (Homo sapiens) 2n = 46 Vượn (Gorilla gorila) 2n = 48 Khỉ (Macaca rhezus) 2n = 42 Bò rừng (Bos taurus) 2n = 60 Chó (Canis familiaris) 2n = 78 Mèo (Felis domesticus) 2n = 38 Ngựa (Equus calibus) 2n = 64 Chuột nhắt (Mus musculus) 2n = 40 Chuột cống (Rattus norvegicus) 2n = 42 Thỏ (Oryctolagus cuniculus) 2n = 44 Gà (Gallus domesticus) 2n = 78 Cá s u (Alligator mississipiensis) 2n = 32 ch (Rana pipiens) Cá chép (Cyprinus carpio) 2n = 26 2n = 104 Tằm dâu (Bombyx mori) 2n = 56 Ruồi nhà (Musca domestica) 2n = 12 Ruồi qu (Drosophila melanogaster) 2n = Đỉa phi n (Planaria torva) 2n = 16 Th y t c (Hydra vulgaris) 2n = 32 Giun tròn (Caenorhabditis elegens) 2n = 11(đực), 12(cái) Thuốc (Nicotiana tabacum) 2n = 48 Khoai tây (Solanum tuberosum) 2n = 48 Hành (Allium cepa) 2n = 16 Cà chua (Lycopersicum solanum) 2n = 24 Lúa mì mềm (Triticum vulgare) 2n = 42 Đậu (Pisum sativum) 2n = 14 Ngô (Zea mays) 2n = 20 T o l c (Acetabularia mediteranea) 2n = 20 N m men (Saccharomyces cerevisiae) 2n = 36 Tuy nhiên, ta khơng thể máy móc dựa vào số lượng thể nhiễm sắc để đánh giá m c độ ti n hóa c a lồi, l thể m c độ ti n hóa cao nh t lại có số lượng thể nhiễm sắc (ví d : ngư i có 46 thể nhiễm sắc, số lượng thể nhiễm sắc vượn 48 gà có đ n 78 thể nhiễm sắc) giống hàm lượng ADN, có tính ổn định lồi chưa thể tính logic c a bậc thang ti n hóa V n đề cần ph i xem xét m c độ tổ ch c hoạt động c a hệ gen ADN thể nhiễm sắc Số lượng thể nhiễm sắc đặc trưng cho thể nhiễm sắc Ngư i ta phân biệt: + Bộ đơn bội (haploid) ký hiệu n đặc trưng cho t bào, thể đơn bội t bào sinh d c chín (các giao tử) thể sinh s n hữu tính Ví d ngư i, tinh trùng t bào tr ng có n = 23 thể nhiễm sắc + Bộ lưỡng bội (diploid) ký hiệu 2n đặc trưng cho t bào thể lưỡng bội Trong thể sinh s n hữu tính t bào soma có ch a 2n thể nhiễm sắc Ví d ngư i 2n = 46 tập hợp 23 thể nhiễm sắc c a tinh trùng 23 thể nhiễm sắc c a t bào tr ng sau th tinh tạo thành hợp tử có 2n = 46 Như vậy, thể lưỡng bội, thể nhiễm sắc tồn thành cặp (một từ bố từ mẹ) gọi cặp thể nhiễm sắc tương đồng, cặp hình thành từ lúc th tinh (2n) phân ly lúc phân bào gi m nhiễm (n) + Bộ đa bội (polyploid), đặc trưng cho t bào thể đa bội Số thể nhiễm sắc tăng lên theo bội số c a n Ví d , tam bội 3n (triploid), t bội 4n (tetraploid) Nhiều trư ng hợp lồi giống (genus) có số thể nhiễm sắc tạo thành dãy đa bội ngư i ta phân biệt số đơn bội kh i ngun x từ hình thành dạng đa bội Ví d : lúa mì (Triticum) có dãy đa bội là: Triticum monococum 2n = 14 (n = 7) Triticum dicocum 2n = 28 (n=14) Triticum vulgare 2n = 42 (n = 21) Trong số đơn bội kh i nguyên x = Hiện tượng đa bội thư ng th y thực vật, cịn động vật có trư ng hợp đa bội ch ngư i ta quan sát th y có trư ng hợp bát bội 8n = 104 thể nhiễm sắc động vật có vú trư ng hợp đa bội quan sát th y chuột đồng (Cricetus cricetus) Nói chung, động vật bậc cao t bào mơ đa bội thể tính trạng bệnh lý Ngư i ta quan sát th y chu kỳ xoắn c a thể nhiễm sắc thay đổi qua chu kỳ t bào gian kỳ sợi nhiễm sắc trạng thái m xoắn nhiều m c độ khác tồn dạng ch t nhiễm sắc tiền kỳ c a mitos sợi nhiễm sắc tr nên xoắn hơn, bị đơng đặc co ngắn lại, đ n trung kỳ th y rõ nh t trạng thái xoắn tối đa (so với đầu tiền kỳ độ co ngắn g p 2,5 lần) đ n mạt kỳ s giãn xoắn để bước vào gian kỳ c a t bào trạng thái sợi ch t nhiễm sắc m xoắn – trạng thái ch t nhiễm sắc Sự giãn xoắn xoắn lại c a thể nhiễm sắc có liên quan đ n ch c c a chúng 2.2 Cấu trúc hiển vi thể nhiễm sắc 2.2.1 Thể nhiễm sắc thường thể nhiễm sắc giới tính Trong lưỡng bội, thể nhiễm sắc tồn thành cặp tương đồng, ví d ngư i có 23 cặp tương đồng, cặp thành viên (1 thể nhiễm sắc từ bố, từ mẹ) giống hình dạng, kích thước Những cặp th gọi thể nhiễm sắc thư ng (autosome) Ngồi cịn có cặp thành viên khác hình dạng, kích thước trạng thái hoạt động gọi thể nhiễm sắc giới tính (sex chromosome) Ví d , ngư i có 22 cặp thể nhiễm sắc thư ng cặp (cặp th 23) thể nhiễm sắc giới tính nam giới, cặp thể nhiễm sắc giới tính XY, cịn nữ giới XX (xem hình 2.2) Hình 2.2 Kiểu nhân (Caryotip) người Cặp thể nhiễm sắc giới tính s di truyền để xác định giới tính xác định tính di truyền liên k t giới tính đa số thể sinh s n hữu tính 2.2.1.1 Cơ sở thể nhiễm sắc xác định giới tính Đa số thể đa bào sinh s n phương th c hữu tính phân hóa giới tính đực giới tính Giới tính biểu tính trạng sinh d c ngun sinh (có n sinh d c tinh hồn, buồng tr ng) tính trạng sinh d c th sinh (các phần ph sinh d c tính trạng khác c a thể phân biệt đực cái) Những tính trạng qui định b i nhân tố di truyền nhân tố môi trư ng thể mơi trư ng ngồi Đối với đa số thể giới tính xác định b i thể nhiễm sắc giới tính (sexchromosome) thể kiểu: + Kiểu đồng giao tử (XX) dị giao tử (XY) đực (ví d đa số sâu bọ châu ch u, ruồi qu v.v., động vật có vú, ngư i, số thực vật có hoa) có cặp thể nhiễm sắc tương đồng giống XX, cịn đực có cặp tương đồng khác nhau: chi c X chi c Y Thể nhiễm sắc X có kích thước dài ch a nhiều gen thể nhiễm sắc Y (ví d ngư i thể nhiễm sắc X ch a 163 triệu cặp nucleotit với 1.218 gen, lúc thể nhiễm sắc Y ch a có 51 triệu cặp nucleotit với 128 gen) Như vậy, thể nhiễm sắc X có r t nhiều gen khơng có alen tương ng so với Y giới tính xác định b i có mặt c a thể nhiễm sắc X, cịn giới tính đực xác định b i có mặt c a thể nhiễm sắc Y Nghiên c u nhiều trư ng hợp sai lệch giới tính ngư i cho th y: giới tính xác định b i có mặt hay khơng nhiễm sắc Y Ví d trư ng hợp hội ch ng Turner có kiểu gen X0 (một thể nhiễm sắc X khơng có Y) nữ giới, trư ng hợp hội ch ng Clinfenter có kiểu gen XXY có hai XX có Y nên giới tính nam Rõ ràng thể nhiễm sắc Y có tác động trội quy t định giới tính, thể chỗ qúa trình phát triển sớm c a phơi thể nhiễm sắc Y điều khiển phát triển c a mầm n sinh d c nguyên th y thành tinh hồn (tính trạng sinh d c ngun sinh) tinh hồn ch ti t testosteron kích thích hình thành tính trạng đực th sinh Ngư i ta ch ng minh nhân tố xác định tinh hồn mã hóa b i gen SRY (sex- determining region Y) định vị v ngắn c a thể nhiễm sắc Y c a ngư i Có r t nhiều trư ng hợp sai lệch giới tính thể chỗ nam giới có kiểu gen XX ngược lại nữ giới có kiểu gen XY Trong trư ng hợp nam XX gen SRY chuyển đoạn sang X chúng điều khiển phát triển tinh hồn, cịn trư ng hợp nữ XY Y khơng có gen SRY thi u nhân tố phát triển tinh hoàn mầm n sinh d c phát triển thành buồng tr ng Nhiều nghiên c u ch ng minh gen SRY có c thể nhiễm sắc Y c a chuột phát ch phân tử điều khiển phát triển giới tính từ gen SRY thơng qua hệ hormon testosteron th quan c a testosteron Đối với đực XY bình thư ng, gen SRY s n sinh nhân tố xác định tinh hoàn (TDF- testis determining factor) kích thích vùng t y mầm n sinh d c phát triển thành tinh hoàn, tinh hoàn ch ti t testosteron kích thính phát triển tính trạng sinh d c th sinh đực Đối với XX bình thư ng khơng có Y (khơng có gen SRY) nên khơng có nhân tố TDF, vùng t y mầm n sinh d c không phát triển thành tinh hoàn mà vùng vỏ c a n phát triển buồng tr ng, buồng tr ng ch ti t hormon estrogen kích thính phát triển tính trạng sinh d c th sinh Đối với trư ng hợp sai lệch giới: XY (có Y cái) có Y phát triển giới tính Y m t gen SRY nên khơng có nhân tố TDF, vùng t y mầm n sinh d c không phát triển thành tinh hoàn, trái lại vùng vỏ mầm sinh d c phát triển thành buồng tr ng Thật gen SRY xác định giới tính đực thơng qua tương tác với nhiều gen khác định vị thể nhiễm sắc thư ng thể nhiễm sắc X Ví d gen SOX9, gen SF1, gen AMH thể nhiễm sắc thư ng phối hợp với gen SRY xác định giới tính đực Ngư i ta phát gen DAX1 định vị thể nhiễm sắc X có vai trị phối hợp với gen SRY xác định giới tính đực Gen DAX1 mã hóa cho th quan c a hormon tesotsteron testosteron thu nhận xâm nhập vào t bào để hoạt hóa gen có vai trị tạo nên tính trạng sinh d c đực th sinh Những đực XY có gen DAX1 bị đột bi n s khơng s n sinh th quan testosteron khơng thu nhận vào t bào thể phát triển theo hướng hóa Đối với XX, gen DAX1 phối hợp với gen WNT4 (định vị thể nhiễm sắc thư ng) xác định phát triển c a buồng tr ng đực gen WTN4 bị c ch , gen DAX1 phối hợp với gen SRY xác định phát triển tinh hoàn Đối với ruồi qu , có cặp thể nhiễm sắc giới tính XX (con cái) XY (con đực), ch xác định giới tính xác định giới tính khác với động vật có vú thể nhiễm sắc Y c a chúng khơng có gen xác định giới tính SRY Sự xác định giới tính ruồi qu diễn theo ch : tỷ lệ thể nhiễm sắc X với thể nhiễm sắc thư ng Ruồi qu nhiễm sắc 2n = có cặp giới tính XX (con cái) XY (con đực) cặp thể nhiễm sắc thư ng kí hiệu AA Tỷ lệ X/A s qui định giới tính c a ruồi (xem b ng sau) NSTgiới (X) NST thư ng (A) Tỷ lệ X/A Kiểu hình giới 1X 2A 0.5 Con đực 2X 2A 1.0 Con 3X 2A 1.5 Siêu 4X 3A 1.33 Siêu 4X 4A 1.0 Con t bội 3X 3A 1.0 Con tam bội 3X 4A 0.75 Trung giới 2X 3A 0.67 Trung giới 2X 4A 0.5 Con đực t bội 1X 3A 0.33 Siêu đực Qua b ng ta th y rõ ruồi kể c đực, thể nhiễm sắc Y khơng gây nh hư ng lên kiểu hình giới tính Tuy nhiên, Y gây nh hư ng lên tính hữu th c a đực Ngày ngư i ta bi t gen Sxl gọi gen gây ch t giới (Sex- lethal) định vị X đóng vai trị ch y u xác định giới tính ruồi qu theo ch sau: - XY/ AA → 0.5 → gen Sxl không hoạt động → đực - XX/ AA → 1.0 → gen Sxl hoạt động → N u gen Sxl hoạt động ngược lại (hoạt động phôi đực không hoạt động phơi cái) s gây ch t cho phơi (nên có tên gọi gen gây ch t) Trạng thái hoạt động c a gen Sxl liên k t với X (định vị X) liên quan chặt ch với hoạt động c a gen khác định vị thể nhiễm sắc thư ng (AA) Ví d thể nhiễm sắc số c a ruồi qu có gen lặn tra (transformer gene), n u trạng thái đồng hợp s bi n ruồi lưỡng bội thành ruồi đực b t th : cá thể XX/ tratra có tính trạng giống đực bình thư ng b t th + Kiểu đồng giao tử đực (ZZ) dị giao tử (ZW) (quan sát th y lồi bướm, chim số lồi bị sát), đực nhiễm sắc tương đồng giống nhau, cịn đực có cặp tương đồng khác nhau, thể nhiễm sắc W bé khơng có đoạn tương đồng với Z + Kiểu xác định giới tính 2n- n (con → 2n, đực → n) quan sát th y số sâu bọ sống thành xã hội mà điển hình ong mật Con đực phát triển từ tr ng đơn bội khơng th tinh, nhiễm sắc n, ong thợ ong chúa ong phát triển từ tr ng th tinh, nhiễm sắc 2n Sự điều chỉnh tỷ lệ giới quần thể ong chúa Ong chúa th tinh b i ong đực tinh trùng tích trữ túi ch a tinh c a ong chúa Khi ong chúa đẻ tr ng n u tr ng th tinh b i tinh trùng từ túi ch a tinh s phát triển thành ong 2n, cịn ong chúa đẻ tr ng khơng th tinh tr ng đơn bội s phát triển thành ong đực n Ong chúa điều khiển sinh s n r t nhiều ong thợ nhiễm sắc 2n b t th (không đẻ tr ng) làm nhiệm v ki m ăn, xây tổ, chăm sóc ni dưỡng ong chúa ong đực sinh s n ong đực nhiễm sắc đơn bội hữu th nghĩa có kh giao c u cung c p tinh trùng cho ong chúa Qua qúa trình gi m phân noãn bào c a ong chúa phân chia tạo nên tr ng đơn bội Đối với ong đực tinh bào khơng gi m phân mà thơng qua qúa trình nguyên phân để tạo nên tinh trùng đơn bội Ong chúa phát triển từ u trùng nuôi dưỡng th c ăn đặc biệt (sữa ong chúa) nên có kích thước lớn có kh sinh s n Mỗi quần thể (tổ ong) thư ng có ong chúa san đàn ong chúa tạo từ u trùng 2.2.1.2 Sự bù liều gen liên kết X Các thể sinh s n hữu tính đực cái, gen có b n (genalen) định vị thể nhiễm sắc tương đồng Nhưng thể nhiễm sắc giới tính, có 2X cịn đực có 1X nghĩa gen X có alen tương ng, đực gen X khơng có alen tương ng Để bù đắp cho thi u h t có ch bù liều (dosage compensation) thuộc kiểu khác nhau: (1) b t hoạt c a thể nhiễm sắc X (quan sát th y động vật có vú), (2) tăng cư ng hoạt động c a thể nhiễm sắc X đực (quan sát th y ruồi qu ) - Bất hoạt gen liên kết - X động vật có vú Cơ ch b t hoạt X động vật có vú Mary Lyon đề xu t từ năm 1961 nghiên c u chuột nhắt Sự b t hoạt c a X x y qúa trình phát triển phơi chuột phơi đạt cỡ vài nghìn t bào Sự lựa chọn b t hoạt X 2X ngẫu nhiên, tùy thuộc vào t bào k t qu toàn t bào c a thể ch a X b t hoạt (ch a gen không hoạt động) Như vậy, động vật có vú ch a hai dịng t bào kh m di truyền: dòng ch a X b t hoạt đ n từ mẹ dòng ch a X b t hoạt đ n từ bố Cá thể dị hợp tử gen liên k t - X s có kh cho kiểu hình khác Ví d điển hình kiểu hình kh m quan sát th y màu lơng chuột mèo Đối với c loài, thể nhiễm sắc X ch a gen qui định màu lông Con dị hợp gen có đặc điểm kh m màu lơng: lơng có đốm sáng (trắng, vàng) xen lẫn đốm đen (ví d mèo đốm, chuột đốm, chó đốm) Màu đốm trắng alen qui định, màu đốm đen alen qui định Tuy ch c a b t hoạt X nhiều 10 v n đề chưa sáng tỏ, nhiều nghiên c u di truyền ch ng minh b t hoạt x y vùng c a v dài c a X gọi trung tâm b t hoạt X – XIC (X- inactivation center) Từ vùng XIC b t hoạt s lan c hai v c a X thể methyl hóa ADN xoắn lại cô đặc c a sợi nhiễm sắc (dị nhiễm sắc hóa - heterochromatine) Thể nhiễm sắc X bị dị nhiễm sắc hóa thể thể Barr (được Muray Barr phát lần đầu tiên) nhân t bào soma c a (th y rõ nh t t bào xoang miệng nữ giới) Thể nhiễm sắc X b t hoạt tồn t t c t bào soma c a thể, dòng t bào mầm (t bào sinh d c) X b t hoạt tái hoạt hóa cần thi t cho qúa trình sinh tr ng (oogenesis) ngư i trư ng hợp sai lệch thể nhiễm sắc giới tính, nữ giới có số lượng XXX bình thư ng X c a họ b t hoạt - Tăng hoạt tính gen liên kết thể nhiễm sắc X ruồi đực Đối với ruồi qu bù liều gen x y theo ch tăng cư ng hoạt động c a gen thể nhiễm sắc X đực, có vai trị c a gen Sxl (gen gây ch t) gen có tác động ch đạo xác định giới tính gen Sxl hoạt động, cịn đực gen Sxl khơng hoạt động Khi khơng có s n phẩm c a gen Sxl (gen Sxl không hoạt động đực), ph c hệ protein s tác động kích thích gen X tăng cư ng hoạt động g p hai lần Khi gen Sxl hoạt động ( cái), s n phẩm c a gen Sxl s kìm hãm ph c hệ protein tăng cư ng hoạt động gen X không x y Bằng ch bù liều hoạt động c a gen liên k t với X cân 2.2.2 Trung tiết (Centromere) Trung ti t c u trúc định khu chiều dọc thể nhiễm sắc vùng gọi eo thắt c p (primary constriction) trung kỳ ta dễ dàng quan sát th y trung ti t trung ti t nơi hai nhiễm sắc tử đính k t với trung kỳ sớm trung ti t phân hóa thành tâm động (kinetochore) để đính với sợi tâm động c a thoi phân bào c phía đối mặt với cực có ch c di chuyển nhiễm sắc tử cực Nghiên c u sinh học phân tử cho bi t vùng trung ti t (c a thể nhiễm sắc c a N m men mọc chồi – Saccharomyces cerevisiae) c u tạo gồm đoạn ADN khơng có c u trúc nucleoxom, ch a kho ng 125 cặp nucleotit gồm đoạn, đoạn I đoạn III hai đầu cuối đoạn II giữa, đoạn II có kho ng 90 cặp nucleotit giàu A:T (>90%) có kh liên k t với protein c a sợi tâm động c a thoi phân bào tạo thành tâm động Trung ti t có vai trò vận chuyển nhiễm sắc tử hai cực t bào (thơng qua tạo tâm động) Ngồi ra, ngư i ta cho tâm động cịn có ch c tham gia vào di truyền ngoại sinh (epigenetic) bi n đổi di truyền không bi n đổi nucleotit c a ADN mà thay đổi biểu c a gen methyl hóa ADN liên k t c a ADN với protein c u trúc không gian c a sợi nhiễm sắc thể nhiễm sắc Đối với N m men phân đôi (Schizosaccharomyces pombe), ruồi qu ngư i, trung ti t có c u tạo ph c tạp nhiều Trung ti t c a S pombe gồm 110.000 cặp nucleotit, c a ruồi qu gồm 420.000 cặp nucleotit c a ngư i gồm từ 300.000 cặp (trung ti t c a thể nhiễm sắc Y) cho đ n triệu cặp nucleotit (trung ti t thể nhiễm sắc số 7), ch a nhiều ADN satellit ADN ch a r t nhiều nucleotit lặp Trung ti t chia thể nhiễm sắc thành hai vai, chiều dài c a hai vai ph thuộc vào vị trí trung ti t Ngư i ta thành lập số trung ti t (centromere index Ic) để xác định vị trí c a trung ti t phân loại thể nhiễm sắc (xem hình 1.7) Ic = P P+Q 17 Bridges quan sát th y ruồi XXX mà có Xw+ s ruồi mắt đỏ, ruồi với XwXw+Y Xw+Xw+Y s ruồi mắt đỏ Ruồi với kiểu gen Xw+O s ruồi đực mắt đỏ hữu th Cịn ruồi có kiểu gen YO ruồi đực khơng có s c sống ch t sớm Bridges gọi tượng không phân ly c a thể nhiễm sắc qua gi m phân có liên quan đ n tính trạng gen định khu thể nhiễm sắc tương ng, ông chưa nghiên c u nguyên nhân c a tượng Về sau nhà nghiên c u di truyền t bào ngư i ch ng minh ngư i x y tượng không phân ly thể nhiễm sắc qua gi m phân tạo dạng lệch bội (aneuploide) thể nhiễm sắc giới tính (XO XXY) mà cịn thể nhiễm sắc thư ng (ví d thể ba nhiễm sắc 21- gây hội ch ng Down xem phần sau) nguyên nhân tuổi đ i ngư i mẹ qúa cao (trên 35 tuổi) 2.4.3 Cơ sở thể nhiễm sắc quy luật Mendel Năm 1865, Mendel trình bày thí nghiệm quy luật di truyền ph i đ n 35 năm sau, năm 1900 thí nghiệm tái phát b i H.de Vries, C Correns E Tschermak cơng nhận rộng rãi, b i sau năm 1880 nhà nghiên c u phát thể nhiễm sắc tập tính c a thể nhiễm sắc tạo thành cặp tương đồng bố mẹ (2n) phân ly vào giao tử (n) k t hợp lại hợp tử (2n) th tinh Nhân tố di truyền mà Mendel gi định thành cặp bố mẹ, chúng tồn quy định nên tính trạng khơng hịa lẫn vào mà phân ly lại tổ hợp lại th hệ sau Các nhân tố di truyền Mendel gi định sau gọi gen (Johannsen 1909) Ví d cặp thể nhiễm sắc tương đồng, chi c (bố) mang alen A chi c (mẹ) mang alen a (hoặc ngược lại) Cơ thể bố mẹ 2n AA (đồng hợp trội), aa (đồng hợp lặn) Aa (dị hợp) phân ly s cho A a, tổ hợp s lại cho AA, aa Aa Đó qui luật phân ly c a Mendel nghiên c u với cặp gen - alen N u hai cặp gen – alen định khu hai cặp thể nhiễm sắc tương đồng khác chúng s phân ly độc lập tổ hợp tự theo qui luật c a Mendel Ví d , cặp gen - alen Aa cặp thể nhiễm sắc tương đồng cặp gen - alen Bb cặp thể nhiễm sắc tương đồng khác chúng s phân ly độc lập tổ hợp tự (nghĩa không ph thuộc vào nhau) tạo giao tử hình thành hợp tử, nghĩa s tạo nên bốn loại giao tử khác AB, ab, Ab, aB tổ hợp tự s tạo nên 16 loại hợp tử khác 18 Một điều kiện cần cho qui luật hai cặp gen - alen (A-a B-b) ph i thể nhiễm sắc tương đồng khác hai cặp Hiện tượng di truyền liên k t nghĩa di truyền tính trạng qui định b i gen định khu thể nhiễm sắc W Bateson R Punnet nghiên c u từ đầu th kỷ XX đối tượng đậu Họ ch ng minh rằng, gen qui định màu hoa gen qui định độ dài hạt ph n di truyền không độc lập t c không tuân theo định luật phân ly độc lập c a Mendel Về sau, T Morgan học trị c a ơng H Sturtevant ch ng minh tượng di truyền liên k t di truyền hốn vị gen có liên quan đ n thể nhiễm sắc Di truyền liên k t gen định khu thể nhiễm sắc qua gi m phân s phân ly giao tử, cịn di truyền hốn vị gen (hay di truyền liên k t khơng hồn tồn) có hốn vị gen hai thể nhiễm sắc tương đồng tiền kỳ c a gi m phân I Dựa nghiên c u di truyền liên k t di truyền hoán vị, ngư i ta ch ng minh t bào số thể nhiễm sắc (ví d ruồi qu 2n=8) lúc số lượng gen r t nhiều (ví d ruồi qu có kho ng 13.000 gen) Vì vậy, thể nhiễm sắc ch a r t nhiều gen Các gen định khu thể nhiễm sắc x p theo dãy dọc liên ti p tạo thành nhóm liên k t (ví d ruồi qu có n = t c có nhóm liên k t) dựa vào tượng di truyền liên k t di truyền hoán vị, ngư i ta thành lập b n đồ thể vị trí gen định vị thể nhiễm sắc theo dãy dọc Ngày nay, di truyền học phân tử ch ng minh thể nhiễm sắc ch a phân tử ADN r t dài gen x p theo dãy dọc liên t c, t c theo trình tự x p c a nucleotit phân tử ADN Với kỹ thuật gi i trình tự nucleotit hệ gen, ngư i ta xây dựng b n đồ gen (gen map) c a r t nhiều thể sinh vật kể c ngư i 2.5 Kiểu nhân - Tiến hóa kiểu nhân 2.5.1 Kiểu nhân (caryotype) Tập hợp t t c thể nhiễm sắc trung kỳ phân chia c a t bào gọi kiểu nhân hầu h t sinh vật, t bào có kiểu nhân Tuy nhiên, thể nhiễm sắc mang tính đặc thù cho lồi số lượng, hình dạng kích thước trung kỳ c a nguyên phân Thậm chí sinh vật có quan hệ gần gũi có kiểu nhân khác Ví d thể nhiễm sắc lưỡng bội c a ngư i 46, c a tinh tinh 48, c a thỏ 44, chuột nhà 40, đậu vư n 14; thể nhiễm sắc c a l c t o 16, n m men bánh mì 17, n m mốc xanh bánh mì v.v Kiểu nhân c a ngư i gồm 46 thể nhiễm sắc, tạo nên 22 cặp thể nhiễm sắc thư ng (autoxom) cặp thể nhiễm sắc giới tính 22 cặp thể nhiễm sắc thư ng chia thành b y nhóm ký hiệu từ A-G, dựa vào kích thước vị trí thể nhiễm sắc Như vậy, cặp thể nhiễm sắc số lớn nh t sau đ n cặp số c ti p t c vậy, nhiên cặp thể nhiễm sắc số 21 lại nhỏ cặp thể nhiễm sắc số 22 mang tính lịch sử Cặp thể nhiễm sắc số 23 quy định giới tính, nam gồm thể nhiễm sắc X thể nhiễm sắc Y X có kích thước lớn Y nữ XX Những hiểu bi t kích thước, hình thái, kiểu nhuộm băng thể nhiễm sắc cho phép xác định số đột bi n c a chúng Ví d thể nhiễm sắc hi m thay đổi hình dạng m t thêm vào phần thể nhiễm sắc thay đổi số đoạn với thể nhiễm sắc không tương đồng khác Mặt khác số lượng thể nhiễm sắc thay đổi 19 kiểu nhân sai sót qúa trình phân chia t bào, ví d thể nhiễm sắc không phân chia, đột bi n thể nhiễm sắc 2.5.1.1 Nghiên cứu kiểu nhân người Các ch t giêm sa, orcein ch t nhuộm đồng hình, khó phân biệt thể nhiễm sắc có kích thước hình dạng giống Tuy nhiên, có số phương pháp nhuộm tạo thể nhiễm sắc bắt màu đậm, nhạt khác nhau, cho băng nhuộm r t đặc trưng Nh băng nhuộm ngư i ta dễ dàng phân biệt thể nhiễm sắc có hình dạng kích thước giống t bào nhân chuẩn, thể nhiễm sắc có phân hóa cao c u trúc ch c Sự phân hóa tổ ch c vật ch t di truyền t bào nhân chuẩn thể qua phân hóa thể nhiễm sắc c chiều ngang lẫn chiều dọc Bằng phương pháp nhuộm đặc biệt gọi nhuộm cắt băng (banding techniques) th y rõ vùng dị nhiễm sắc (heterochromatin) phân bố riêng đặc trưng cho thể nhiễm sắc loài Nhiều nghiên c u sinh hóa t bào cho th y miền dị nhiễm sắc ch a số lượng gen r t nhỏ, sợi nhiễm sắc vùng luôn trạng thái xoắn với hàm lượng ADN cao Ch c c a ch t dị nhiễm sắc, tác gi cho th y, có ý nghĩa qúa trình ti p hợp phân ly c a thể nhiễm thể tương đồng, đặc biệt qúa trình ti n hóa, thơng qua tái c u trúc c a thể nhiễm sắc điều hịa hoạt động c a gen Có thể phát vùng dị nhiễm sắc (heterochromatin region) thể nhiễm sắc phương pháp nhuộm băng Rooney tổng k t 20 phương pháp nhuộm băng điển hình, băng Giêmsa (G - banding), băng Quinacrin (Q - banding), băng C (C - banding) băng huỳnh quang (Hoechest - 33258: H - 33258 banding) r t nhiều phương pháp nhuộm băng khác Kỹ thuật nhuộm băng giêmsa ng d ng rộng rãi nh t nghiên c u thể nhiễm sắc đặc biệt côn trùng Chi ti t c a phương pháp nhuộm băng trình bày đây: a) Phương pháp nuôi cấy tủy xương Phương pháp nuôi c y máu t y xương 24 gi mơi trư ng nhân tạo để tìm thể nhiễm sắc b t thư ng Nguyên lý c a kỹ thuật dựa phân bào tự nhiên c a t bào non máu t y mà không cần sử d ng ch t kích thích phân bào P.H.A (Phytohaemaglutinin) * Ti n hành nuôi c y Nuôi c y t y xương 24 gi (dựa theo kỹ thuật c a B Durtillaux J Coutuier, 1981; C Harison, 1987) + Bước 1: Chuẩn bị d ng c Các d ng c kim chọc t y, bơm tiêm, lọ nuôi c y v.v ph i s y vô trùng trước sử d ng, thao tác ph i đ m b o từ khâu l y bệnh phẩm (l y t y l y máu) cho đ n k t thúc nuôi c y + Bước 2: Thao tác l y bệnh phẩm Đặt bệnh nhân nằm s p, chân duỗi thẳng, tay để phía đầu Sát trùng vùng mào chậu định chọc t y cồn iot cồn 70o Gây tê điểm chọc t y để thông l y t y Bơm tiêm vô 20 trùng tráng 0,1ml heparin 5000UI/ml để chống đông máu Hút l y kho ng 0,5-1ml dịch t y xương, lắc nhẹ cho t y hòa với heparin để không bị đông + Bước 3: Đ m bạch cầu Dùng phần nhỏ dịch t y l y ti n hành đ m bạch cầu + Bước 4: Nuôi c y dịch t y Môi trư ng nuôi c y cho lọ: Môi trư ng Parker 199: 6ml Huy t AB: 2ml T y chống đông sử d ng để nuôi c y tùy thuộc vào số lượng bạch cầu với tỉ lệ thích hợp 5.105 bạch cầu/1ml mơi trư ng, t c lọ c y kho ng 40 105 bạch cầu Các lọ nuôi c y đậy nút cao su vô trùng, lắc nhẹ tay cho sau để t m 37oC 24 gi b) Nuôi cấy máu ngoại vi Theo kỹ thuật c a B Dutrillaux J Couturier, 1981 + Bước 1: Chuẩn bị d ng c Giống nuôi c y t y xương + Bước 2: Thao tác l y bệnh phẩm Bơm kim tiêm vô trùng, tráng 0,1 heparin 5000UI/ml L y 1-2ml máu tĩnh mạch c a ngư i bệnh, lắc nhẹ cho máu hịa Heparin để khơng bị đơng + Bước 3: Đ m bạch cầu + Bước 4: Nuôi c y Môi trư ng nuôi c y c a lọ giống nuôi c y t y xương 24 gi Lọ c y để t m 37oC 24 gi * Thu hoạch dịch c y làm tiêu b n Ti n trình thu hoạch dịch c y t y máu giống dựa theo nhà nghiên c u + Bước 5: c ch phân bào Colchicine Sau nuôi c y 37oC 22 gi 30 phút, sử d ng Colchicine làm đ t thoi vô sắc, c ch phân bào giai đoạn Metaphase, giai đoạn này, nhà nghiên c u th y thể nhiễm sắc có kích thước lớn hình dạng rõ nh t Cho vào lọ nuôi c y 0,05ml Colchicine nồng độ 4mg/ml Lắc nhẹ, giữ t m 37oC ti p gi 30 phút + Bước 6: Nhược trương t bào Dung dịch nhược trương có nồng độ tương ng sau: Nước c t để m: 5ml Huy t AB: 1ml KCl 0,07M: 3ml EDTA: 0.1ml 21 Chuyển toàn dịch c y sang ống ly tâm nhọn đáy, đem ly tâm 1000 vòng/phút, hút bỏ phần trên, cho vào ống 7ml dung dịch nhược trương (đã để m 37oC), trộn nhẹ pipet Pasteur Để ống t m 37oC cho t bào thẩm th u dung dịch nhược trương 12 phút Sau cho thêm vào ống 0,1ml dung dịch Carnoy II trộn nhẹ, lại ly tâm 1000 vòng/phút Hút bỏ phần + Bước 7: Cố định thể nhiễm sắc Để giữ hình dạng thể nhiễm sắc thành phần sau: metaphase cần định hình hai dung dịch Carnoy có Dung dịch Carnoy I: + Cồn 96o: thể tích + Axit axetic: thể tích Dung dịch Carnoy II: + Cồn 96o: thể tích +Clorofooc: thể tích + Axit axetic: thể tích Bước định hình là: Cho 6ml dung dịch Carnoy I vào ly tâm nhọn đáy, trộn nhẹ, để phút nhiệt độ phòng, ly tâm 1000vòng/phút phút, hút bỏ phần Bước định hình ti p theo dung dịch Carnoy II, cho vào ống ly tâm nhọn đáy 6ml, trộn nhẹ, để phút nhiệt độ phòng, ly tâm 1000vòng /phút phút, hút bỏ phần trên, l y dịch đáy ống ly tâm làm tiêu b n + Bước 8: Làm tiêu b n Sử d ng lam kính sạch, để vào ngăn đá c a t lạnh cho ph lớp băng mặt lam Nhỏ giọt dịch t bào ống ly tâm lên lam kính cho hỗn dịch lan theo mặt băng tan mặt lam Khi thể nhiễm sắc diện lam kính thành c m c) Các kỹ thuật nhuộm tiêu thể nhiễm sắc 1) Nhuộm Giêm sa nguyên ch t Dung dịch Giêm sa: Bột Giêm sa nguyên ch t: 1g Methanol: 66ml Glyxerin: 66ml Pha loãng dung dịch 4%, nhuộm tiêu b n 20 phút Rửa tiêu b n nước thư ng nước c t, để khơ đưa lên soi kính hiển vi Bằng phương pháp nhuộm này, thể nhiễm sắc bắt màu nên khó quan sát tổn thương c u trúc c a thể nhiễm sắc Để khắc ph c nhược điểm áp d ng số kỹ thuật nhuộm băng thể nhiễm sắc Nguyên lý c a kỹ thuật dựa tính ch t đặc trưng phân bố đoạn ADN giàu A - T G - C kéo theo phân bố loại gen mã hóa cho protein đặc trưng thể nhiễm sắc Dưới tác d ng c a nhiệt độ cao, môi trư ng muối cặp thể nhiễm 22 sắc tính ch t s bị phân h y vị trí đặc hiệu, sau nhuộm giêm sa thông thư ng s tạo nên băng ngang đậm, nhạt xen k có tính ch t đặc trưng riêng cho thể nhiễm sắc Do vậy, nhận định xác cặp thể nhiễm sắc phần c a giúp phát khác biệt rối loạn c u trúc c a thể nhiễm sắc 2) Nhuộm băng R ( Reverse-banding technique) Theo kỹ thuật c a B Dutrillaux Lurwune (1971), Sehested (1974), Vowjma Lubs (1975) Phương pháp nhuộm để nhận dạng thể nhiễm sắc Philadelphia bệnh Leukemia mãn tính phát tổn thương c u trúc c a thể nhiễm sắc nhóm Leukemia khác Phương pháp tiến hành sau: Tiêu b n trước nhuộm s y khô t nhiễm sắc bám chặt mặt lam 37oC ngày cho thể m Xử lý tiêu b n dung dịch đệm Earle pH = 6,5 15 - 45 phút 87oC bể men 100ml kho ng Rửa nước, để khô, nhuộm Giêm sa 2% dung dịch đệm Quan sát thể nhiễm sắc với băng sáng tối xen k kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1.000 lần 3) Kỹ thuật nhuộm băng Giemsa (G-banding technique): Theo kỹ thuật c a Sun, N.C; Chu, E.H.Y Chang, C.C (1973) + Bước 1: Chuẩn bị dung dịch Dung dịch Giêm sa chuẩn (đậm đặc) Bột Giêm sa nguyên ch t: 1g Methanol: 66ml Glyxerin: 66ml Sau pha dung dịch để hai ngày lạnh trước dùng nh t hai tuần nhiệt độ phòng lọ màu tối để t Dung dịch nhuộm băng ( sử d ng ngày) Dung dịch đệm pH 6,8: 26ml Methanol: 7ml Trypsin1/250 ( DIFCO5g/l)+ EDTA: 2g/l Giêm sa chuẩn: 0.8ml + Bước 2: Trình tự nhuộm tiêu b n dung dịch đệm phosphat pH 6,8 560C phút Nhuộm tiêu b n ngập dung dịch nhuộm phút Rửa tiêu b n nước c t, để khơ Soi kính khơng cần đậy lamen nhiệt độ phòng 23 d) Kỹ thuật nhuộm băng Q Kỹ thuật ti n hành với ch t nhuộm đặc biệt Qinacrin với quy trình thực ph c tạp, k t qu ch t nhuộm gắn vào vùng giàu A - T c a ADN ta quan sát kính hiển vi huỳnh quang Màu hồng c a băng r t đặc trưng cho cặp thể nhiễm sắc Đây đặc điểm có ích phân tích di truyền thơng tin phần ch a gen đặc thù Sắp x p công th c thể nhiễm sắc Đọc tiêu b n kính hiển vi với độ phóng đại 1.000 lần, quan sát b t thư ng n u có x p thể nhiễm sắc theo công th c quy định danh pháp thể nhiễm sắc thông qua hội nghị Di truyền t bào học năm 1960 Denver - Mỹ 2.5.2 Tiến hóa kiểu nhân tế bào nhân chuẩn (Eukaryota) Qúa trình phân hóa di truyền biểu m c độ khác qúa trình ti n hóa Đa hình di truyền biểu đa hình thể nhiễm sắc phổ bi n quần thể tự nhiên Baimai cho thay đổi di truyền luôn phát m c độ thể nhiễm sắc bao gồm tái c u trúc thể nhiễm sắc (chromosomal rearrangement) phân hóa c a vùng dị nhiễm sắc có liên quan đ n hàm lượng ADN thông qua thay đổi trật tự phân bố số lượng c a khối dị nhiễm sắc nằm thể nhiễm sắc Sự ti n hóa kiểu nhân c a thể sinh s n hữu tính theo phương th c thu hút ý c a nhiều chuyên gia lĩnh vực di truyền học ti n hóa Các nghiên c u cho th y khác biệt kiểu nhân tìm th y côn trùng hai cánh mà đối tượng Drosophila loài muỗi Anopheles Hơn 500 loài phân loài (subspecies) thuộc chi Drosophila nghiên c u thể nhiễm sắc nguyên phân (mitotic chromosome) thể nhiễm sắc khổng lồ (polytene chromosome) cho th y b c tranh thật phong phú đa hình thể nhiễm sắc, dẫn đ n việc khám phá nhiều lồi đồng hình tồn quần thể tự nhiên c a 100 loài muỗi tổng số 200 loài muỗi nghiên c u kỹ kiểu nhân Các tác gi mô t hàng loạt đa hình thể nhiễm sắc bên lồi (intraspecific polymorphism) khác biệt kiểu nhân loài (interpecific karyotypic differences) S dĩ loài Anopheles đặc biệt ý nhiều nguyên nhân mà nguyên nhân ph i kể đ n tầm quan trọng c a chúng y t cộng đồng tính kh thi c a v n đề nghiên c u tác gi nêu rõ: - Số lượng thể nhiễm sắc lưỡng bội lồi muỗi (2n=6) thuận lợi dễ thâu tóm đặc điểm qúa trình phân loại - Số lượng 2n=6 ln ln cố định Trên thực t nhìn chung ngư i ta chưa phát tượng đa bội thể loài thuộc chi Anopheles, nhiên Belcheva Baimai cho bi t có vài trư ng hợp ngoại lệ tượng thể nhiễm sắc bổ sung tìm th y lồi An maculipennis An messae hay lồi An indefinitus Đơng Nam Á - Các thể nhiễm sắc thư ng (autosomal chromosome) loài Anopheles có nhiều đặc điểm giống thư ng bắt đôi soma tạo thành cặp thể nhiễm sắc loại tâm (metacentric) tâm cận (submetacentric) Hai thể nhiễm sắc giới tính đồng hình (XX) (homomorphism) dị hình (XY) đực (heteromorphism) - Nét đặc trưng bật kiểu nhân c a loài muỗi Anopheles khối lượng vị trí phân bố riêng biệt c a vùng dị nhiễm sắc xác định rõ thể nhiễm sắc 24 nguyên phân băng dị nhiễm sắc đặc thù thể nhiễm sắc khổng lồ d u hiệu đáng lưu ý để sử d ng cho nghiên c u di truyền phân loại Việc phát đặc điểm khác kiểu nhân thông qua tái c u trúc thể nhiễm sắc bi n dị số lượng c a khối dị nhiễm sắc phân bố c a chúng giúp ích cho việc nghiên c u phân loại mối quan hệ ti n hóa c a nhiều nhóm trùng đặc biệt loài thuộc chi Anopheles 2.5.2.1 Sự khác biệt kiểu nhân lồi Khi phân tích khác biệt kiểu nhân (interpecific karyotypic differences) phát nhiều khác lồi có quan hệ gần quần thể tự nhiên loài thuộc chi Drosophila ngư i ta sớm nhận th y khác kiểu nhân điển hình cặp ruồi qu nghiên c u kỹ D pseudobscura (loài A) D persimilis (loài B) hai loài y hệt hình thái Thể nhiễm sắc Y lồi A có dạng chữ J, lồi B thể nhiễm sắc lại có dạng hình chữ V Việc phát làm tiền đề cho nghiên c u kiểu nhân loài thuộc chi Anopheles mà số trư ng hợp điển hình đề cập đ n nhiều tài liệu nghiên c u N u thể nhiễm sắc thư ng c a loài Anopheles giống hình thái kích thước thể nhiễm sắc giới tính lại khác nhiều khía cạnh Ba lồi đồng hình thuộc ph c hợp lồi An culicifacies trung gian truyền bệnh sốt rét n Độ phân biệt s c a khác biệt thể nhiễm sắc Y Thể nhiễm sắc Y loài C tâm cận mút (acrocentric), cịn lồi A B tâm lệch (submetacentric) Một trư ng hợp đáng lưu ý An leucosphyrus vùng Đơng Nam Á có biểu khác biệt kiểu nhân Baimai cộng mô t chi ti t Loài An leucosphyrus Thái Lan vùng Kalimanta c a Indonesia (loài A) với loài An leucosphyrus vùng Summatra c a Indonesia (loài B) thực ch t hai loài mà khác biệt biểu thể nhiễm sắc giới tính Lồi A thể nhiễm sắc giới tính tâm mút (telocentric), lồi B lại tâm lệch (submetacentric) Theo quan điểm c a Baimai kiểu nhân c a loài B hình thành qúa trình ti n hóa nh nhận thêm khối dị nhiễm sắc thể nhiễm sắc giới tính vùng tâm động Ph c hợp An dirus trư ng hợp điển hình khác biệt kiểu nhân mà Baimai dựa vào đặc điểm để nhận bi t thành viên thuộc ph c hợp An dirus Thái Lan Khi sử d ng phương pháp nhuộm băng Giêm sa (băng G) Baimai mơ t đặc điểm thể nhiễm sắc giới tính (XY) c a thành viên thuộc ph c loài An dirus là: loài A c thể nhiễm sắc X Y tâm mút (telocentric) cịn lồi B thể nhiễm sắc thuộc tâm cận mút (acrocentric) Một khác biệt độc đáo thể An dirus loài F mà Baimai cộng phát khối dị nhiễm sắc lớn nằm vị trí tâm động c a thể nhiễm sắc số III, d u hiệu đặc biệt tách loài F khỏi t t c thành viên khác ph c hợp An dirus Việc nhận bi t lồi F lồi riêng biệt có ý nghĩa lớn nghiên c u dịch tễ nghiên c u sinh thái tập tính mà Colless đề cập từ trước, mặt khác cịn ch ng để bổ sung đầy đ thành phần loài An dirus (A, B, C, D, F) có mặt Thái Lan Đối với loài khác (loài C An takasagoensis) ph c hợp tác gi khác biệt dựa s c a bốn m c độ phát sáng phương pháp nhuộm huỳnh quang (H-33258) Với đặc điểm c u trúc kiểu nhân Baimai rõ m c độ phân hóa c a 25 chúng qúa trình ti n hóa: Lồi B lồi F có chung nguồn gốc phát sinh Lồi F hình thành nh nhận thêm khối dị nhiễm sắc vị trí tâm động c a thể nhiễm sắc số III Đồng th i tác gi quan hệ loài A loài C gần nhau, loài B loài D cách xa mặt di truyền Rõ ràng phương pháp di truyền t bào dựa phân tích kiểu nhân ph c v tốt cho phân loại mà làm sáng tỏ mối quan hệ ti n hóa lồi Quan điểm đắn hướng ti n hóa kiểu nhân loài Anopheles bác bỏ quan niệm cho lồi muỗi hình thành qúa trình lai tạo tồn r t lâu đầu th kỷ XIX Các tác gi khác nêu rõ hơn: 90% chí 98% kiện dẫn đ n hình thành lồi có liên quan đ n kiểu nhân Ti n hóa kiểu nhân lồi Anopheles nêu không theo ch tăng số lượng thể nhiễm sắc mà thông qua đư ng tái c u trúc thể nhiễm sắc mà s nhận thêm khối dị nhiễm sắc Sự khác biệt kiểu nhân cịn biểu nhiều lồi khác như: An maculatus An balabacensis Ngoài cách nhận thêm khối dị nhiễm sắc, tượng tái c u trúc thể nhiễm sắc cịn biểu thơng qua đa hình đ o đoạn phổ bi n loài thuộc chi Anopheles K t qu nghiên c u thể nhiễm sắc khổng lồ c a 30 lồi Anopheles tác gi có chung nhận định tính đặc thù c a trật tự băng thể nhiễm sắc khổng lồ Đối với loài đồng hình đặc điểm c a băng phần lớn giống nhau, ngư i ta dễ dàng nhận bi t d u hiệu khác biệt n u có so sánh phân loại Trên thực t tác gi cho bi t việc sử d ng thể nhiễm sắc khổng lồ thông qua đ o đoạn thu nhận k t qu với độ xác cao, Coluzzi cặp lồi đồng hình khác nh t đ o đoạn, nghiên c u khác cho bi t trung bình có nh t đ o đoạn cá thể Theo White, An gambiae ph c hợp loài mà biểu phong phú nh t đa hình c a đ o đoạn, điển hình hai lồi An gambiae (17 đ o đoạn) An arabiensis (18 đ o đoạn) Các tác gi cho th y 11 đ o đoạn phân biệt lồi đồng hình ph c hợp đ o đoạn thể nhiễm sắc X đóng vai trị ch đạo phân loại N u l y thể nhiễm sắc X loài An quadrianulatus làm chuẩn An gambiae phân biệt b i đ o đoạn An balabacensis phân bi t b i đ o đoạn thể nhiễm sắc X Đối với An melas, An merus lồi cịn lại tác gi phân biệt b i đ o đoạn cố định thể nhiễm sắc 2R Ph c hợp An dirus điển hình Đơng Nam châu Á song đa hình đ o đoạn Baimai mơ t lại có nhiều đặc điểm khác hẳn Trong bốn loài An dirus A, B, C, D có mặt Thái Lan ba lồi A, B, C có đặc điểm chung đơn hình thể nhiễm sắc khổng lồ Riêng thể nhiễm sắc 3L c bốn lồi có c u trúc (Baimai cộng sự) Loài D khác biệt với ba lồi A, B, C b i đa hình đ o đoạn N u cho thể nhiễm sắc loài A chuẩn hai lồi A D có tương ph n tượng đ o đoạn Sự khác thể rõ c thể nhiễm sắc X thể nhiễm sắc thư ng: Thể nhiễm sắc X thâu tóm tồn đ o đoạn x y loài A nhiên tần số đ o đoạn r t th p (7 18 quần thể nghiên c u) lồi D tác gi không phát trư ng hợp đ o đoạn thể nhiễm sắc Ngược lại toàn thể nhiễm sắc thư ng loài D đặc trưng b i đa hình đ o đoạn chí thể nhiễm sắc 2L mà theo ý ki n c a Baimai trư ng hợp r t gặp, cịn lồi A chúng lại đơn hình trật tự băng dị nhiễm N u loài đồng hình ph c hợp An.gambiae tồn đ o đoạn ph c hợp An Dirus, Baimai cho th y tổng số 287 cá thể thuộc loài B thu thập từ 10 địa điểm khác Thái Lan không phát b t kỳ đ o đoạn Tương tự thể nhiễm sắc khổng lồ loài C hoàn toàn đặc trưng b i băng chuẩn qua phân tích 367 cá thể ni từ gia đình Vì vậy, nhận bi t lồi tác gi khơng dựa s c a đ o đoạn 26 mà băng dị nhiễm đặc thù riêng biệt c a thành viên ph c hợp Phân tích kiểu nhân tác gi cịn cho bi t lồi A C có nhiều điểm giống trật tự băng thể nhiễm sắc khổng lồ, riêng loài D hoàn toàn khác với loài A thành viên khác ph c hợp An dirus hình thái hai loài A C đặc biệt Hiện tượng tái c u trúc thể nhiễm sắc khổng lồ thơng qua đ o đoạn cịn phổ bi n nhiều loài khác thuộc chi Anopheles Ba loài đồng hình phát ph c hợp An culicifacies (A, B, C) tách biệt b i đ o đoạn nằm thể nhiễm sắc X thể nhiễm sắc số II trợ bào tr ng Ph c hợp An maculipennis với lồi đồng hình nhận bi t qua đ o đoạn loài th (An beklemishevi), phát b i phương pháp di truyền t bào mà việc phân tích kiểu nhân làm s Ph c hợp An maculatus đặc trưng b i đa hình đ o đoạn bật nh t loài B Nhìn chung, qua phân tích tần số đ o đoạn tác gi cho th y phần lớn đ o đoạn xa tâm (paracentric) cố định (fixed inversion) chúng tồn trạng thái đồng hợp tử Dạng phổ bi n An gambiae, An dirus, An culicifacies An maculatus Dạng đ o đoạn quanh tâm (pericentric inversion) x y An quadrianulatus với tần số r t th p Một dạng đ o đoạn khác x y số loài c a Anopheles đ o đoạn m ng (floating inversion) c trạng thái đồng hợp tử dị hợp tử Loại thư ng gặp loài An supictus Grassi An stephensi Colluzzi cho bi t thêm thể nhiễm sắc X thể nhiễm sắc 2R r t nhạy c m với đ o đoạn, số loại thể nhiễm sắc khác lại r t b o th việc giữ nguyên trạng thái c u trúc Mỗi tần số đ o đoạn, tác gi cho th y, thư ng có liên quan đ n tập tính kh truyền bệnh c a muỗi Tần số đ o đoạn thể nhiễm sắc 2R An gambiae An.arabiensis có liên quan đ n tập tính điều kiện khí hậu đặc điểm hình thái Các đ o đoạn có xu hướng tăng miền Nam Châu Phi mùa ẩm, mẫu thu thập ngồi nhà, cịn miền Tây mùa khô tần số đ o đoạn lại cao mẫu thu thập nhà Tóm lại, khu vực, điều kiện sinh sống tạo s c ép chọn lọc liên t c lên quần thể c a t t c loài buộc chúng ph i thích ng Vì vậy, lồi quần thể tự nhiên khác biệt khơng đặc điểm hình thái mà cịn đặc điểm sinh học khác, hay nhiều chi phối phương diện di truyền Đa hình đ o đoạn chi phối đ n tập tính c a trùng truyền bệnh qúa trình thích nghi tác gi đề cập đ n nhiều tài liệu nghiên c u Qúa trình tăng cư ng thích nghi c a lồi với mơi trư ng s chọn lọc v n đề ti n hóa Nghiên c u đa hình đ o đoạn khơng có ý nghĩa việc nghiên c u lồi đồng hình, mà làm sáng tỏ mối quan hệ ti n hóa lồi Một lần lại tái khẳng định lại quan điểm đắn c a White cho phân hóa kiểu gen để hình thành loài mới, thay đổi thể nhiễm sắc giữ vai trò ch đạo, nhiều chuyên gia lĩnh vực tán đồng Ngoài ra, nghiên c u ng d ng tái c u trúc thể nhiễm sắc mà s đ o đoạn k t hợp với chuyển đoạn lại có ý nghĩa thực tiễn vô to lớn việc sử d ng biện pháp di truyền cho m c đích phịng chống vectơ truyền sốt rét 2.5.2.2 Đa hình thể nhiễm sắc biến dị lồi Tính bi n dị loài thể thay đổi vị trí phân bố số lượng c a vùng dị nhiễm sắc phổ bi n t bào nhân chuẩn Đặc tính giúp ích r t nhiều 27 cho việc nghiên c u lồi có quan hệ gần c động vật thực vật Hiện tượng khơng ph i gặp lồi thuộc chi Drosophila R t nhiều cơng trình nghiên c u bi n dị lồi mơ t đa hình c a vùng dị nhiễm sắc (heterochromatin polymorphism) lồi muỗi Anopheles giúp ích r t nhiều việc nghiên c u loài đồng hình Anopheles dirus Peyton Harrison (dirus A) Baimai cộng phát có đa hình thể nhiễm sắc giới tính Ba dạng (X1, X2, X3) hai dạng (Y1, Y2) tác gi phân biệt dựa m c độ khác kích thước phân bố c a vùng dị nhiễm sắc số lượng c a chúng thể nhiễm sắc Một trư ng hợp bật đa hình bi n dị thể nhiễm sắc giới tính lồi thể An dirus (lồi B), Baimai cộng phát dạng bi n dị thể nhiễm sắc giới tính, dạng bi n dị thuộc thể nhiễm sắc X (X1-X5) dạng bi n dị khác thuộc thể nhiễm sắc Y (Y1-Y4) Phân tích đa hình c a thể nhiễm sắc X tác gi d u hiệu khác vị trí tâm động để phân biệt thể nhiễm sắc X1 tâm mút (telocentric), X2, X3, X4 tâm cận mút (acrocentric) X5 tâm lệch (submetacentric) Ba thể nhiễm sắc X2, X3, X4 phân biệt dựa m c độ khác kích thước đặc điểm vùng dị nhiễm sắc Ngồi Baimai cịn cho th y dạng dị hợp tử X1X2 phổ bi n quần thể tự nhiên khác với dạng dị hợp tử X3X4 lại xu t hầu h t gia đình muỗi nghiên c u Hình 2.6 Sự khác biệt kiểu nhân loài Anopheles minimus (A & C) đa hình thể nhiễm sắc lồi Bốn dạng thể nhiễm sắc Y nhận bi t s đặc tính tương tự thể nhiễm sắc X Dạng dị hợp tử X3Y4, X4Y2 dạng phổ bi n nh t dạng X3Y3 X4Y4 lại r t hi m tác gi phát trư ng hợp tổng số 126 gia đình phân tích Nhìn chung bi n dị thể nhiễm sắc giới tính kiểu nhân c a hai loài An dirus A B biểu quy mô rộng Các bi n dị theo xu hướng nhận thêm khối dị nhiễm sắc (trư ng hợp X2, X3, Y2 An dirus A X5, Y3, Y4 An dirus B) m t khối dị nhiễm (trư ng hợp X1, X3, Y1 An dirus B) Thực t cho th y ti n hóa kiểu nhân thông qua tái c u trúc 28 nhận thêm m t khối dị nhiễm sắc phổ bi n cho lồi muỗi Phương Đơng Kiểu bi n dị lồi mà biểu đa hình c a dị nhiễm sắc th y đối tượng khác tác gi mô t r t chi ti t Ph c hợp lồi An gambiae lại có đặc trưng đa hình dị nhiễm sắc thể nhiễm sắc giới tính Điểm bật đa hình thể nhiễm sắc X tác gi tìm th y quần thể tự nhiên cịn phịng thí nghiệm thể nhiễm sắc X lại đơn hình c hai loài An gambiae An arabiensis Với phương pháp nhuộm băng huỳnh quang H-33258 tác gi mô t dạng thể nhiễm sắc X Y khác c hai loài An gambiae An arabiensis Hơn Gatti cộng k t qu định tính huỳnh quang ph n ánh phù hợp c a khác hóa t bào di truyền t bào c hai loài ph c hợp Rõ ràng bi n dị lồi giữ vai trị quan trọng ti n hóa, nhiên v n đề s sáng tỏ vai trò sinh lý cu ch t dị nhiễm sắc nghiên c u đầy đ Mặc dù vậy, gi thi t vai trò c a dị nhiễm sắc mối quan hệ vectơ ký sinh trùng truyền cho ngư i thơng qua vectơ nhiều tác gi đặc biệt quan tâm 2.5.3 Nghiên cứu kiểu nhân côn trùng truyền bệnh Áp d ng phương pháp làm tiêu b n thể nhiễm sắc trung kỳ (metaphase chromosome) nguyên phân c a Baimai, ti n hành mổ l y t bào não bọ gậy (tuổi IV) Các bước c thể ti n hành sau: Xử lý bọ gậy dung dịch Colchicine (catologue number: Colchicine Sigma cat N0 C 9754) với nồng độ 0,1% (trong - gi ) nhiệt độ phòng Sau xử lý, bọ gậy vớt ra, chuyển vào dung dịch Citrat - Natri 1%, qúa trình mổ l y não thực hai kim nhọn, nhỏ, thao tác thực kính hiển vi 29 Hình 2.7 Thể nhiễm sắc kỳ nguyên phân c a bọ gậy muỗi Con đực; Con - thuộc Anopheles barbumbrosus; 3,4 đực; Con - thuộc Anopheles umbrosus; 6,7 Con đực; 8,9 Con thuộc Anopheles letifer Chuyển não (bao gồm hai khối nhỏ, màu trắng) sang dung dịch nhược trương (th i gian nhược trương tuỳ thuộc vào đối tượng) Định hình não dung dịch Carnoy ( lam kính khác nh vào động tác chuyển não r t khéo léo từ dung dịch nhược trương sang dung dịch định hình) Dùng pipet Pasteur bơm hút t bào não (còn cho đ n huyền dịch t bào tr nên đồng nh t dạng hai khối nhỏ màu trắng) nhiều lần Cũng dùng pipet nhỏ huyền dịch t bào lên lam kính sạch, hơ nóng máy s y với nhiệt độ 45oC (5 - 10 phút) Với th i gian đ để t bào bám dính vào lam kính cịn axít axetic dư thừa s tự bay Như vậy, qúa trình làm tiêu b n thể nhiễm sắc hồn thành Có thể áp d ng phương pháp nhuộm tiêu b n thể nhiễm sắc c a muỗi c a ngư i 30 Hình 2.8 Sơ đồ hóa kiểu nhân c a số lồi Anopheles 2.5.4 Phương pháp nhận biết loài Việc nhận bi t lồi đồng hình biện pháp di truyền t bào mà s thể nhiễm sắc thể r t rõ nhiều cơng trình 10 năm nghiên c u ph c hợp An dirus Thái Lan Phân tích đa hình thể nhiễm sắc mà s đa hình dị nhiễm sắc (heterochromatic polymorphism), tác gi phát nhiều dạng thể nhiễm sắc giới tính khác Dựa vào dạng k t hợp c a giao tử (các hợp tử) tìm th y quần thể tự nhiên, tác gi bi n dị bên loài khác biệt loài Quan điểm loài sinh học định nghĩa loài c a Mayr mà ch cách ly sinh s n xem tiêu chuẩn để xác định cá thể thuộc loài hay thuộc hai loài tác gi quán triệt suốt qúa trình phân loại Tuy nhiên, tác gi việc áp d ng tiểu chuẩn cách độc lập hay dạng k t hợp (với tiêu sinh học khác) ph i ph thuộc vào trư ng hợp c thể Trư ng hợp phổ bi n tóm tắt trình bày Các cá thể muỗi (cùng vùng phân bố) có dạng thể nhiễm sắc khác X1 X2 luôn tồn dạng đồng hợp tử (X1X1) (X2X2) mà không bắt gặp cá thể dạng dị hợp tử (X1X2) (qúa trình giao phối khơng x y ra) chúng thuộc hai loài khác Về phương diện di truyền học, hai loài tồn tự nhiên r t giống hình thái cách ly sinh s n với b i ch tiền giao phối Nhưng, dạng đồng hợp tử (X1X1) (X2X2) tìm th y khác vùng phân bố (qúa trình giao phối khơng thể thực được) khơng có nghĩa chúng thuộc hai loài Trong trư ng hợp ph i k t hợp với tiêu khác để kiểm tra k t qu M c độ hòa hợp di truyền thể k t qu c a phép lai phịng thí nghiệm s cho 31 k t qu tồn ch cách ly hậu giao phối đem lại độ xác cao phân loại Cịn trư ng hợp ngồi dạng đồng hợp tử (X1X1) (X2X2) cịn tìm th y c dạng dị hợp tử (X1X2) vùng phân bố chúng thuộc lồi Sự có mặt c a dị hợp tử ch ng tỏ qúa trình giao phối hai lồi x y Cơ ch giao phối ngẫu nhiên quy t định k t hợp ngẫu nhiên c a giao tử Vì vậy, tần số hợp tử đồng hợp tử (X1X1) (X2X2) dị hợp tử (X1X2) ph i phù hợp với định luật Castle - Hardy - Weinberg (1908) C H - W: p2X1X1 + 2pq X1X2 + q2X2X2 Ngoài trư ng hợp tác gi khái quát nêu rõ trên, thực t trư ng hợp ngoại lệ cần lưu ý việc tìm th y dạng dị hợp với tỷ lệ khơng đáng kể khó khăn kỹ thuật việc thực phép lai phịng thí nghiệm khơng ph n ánh m c độ xác c a k t qu phân loại Trong trư ng hợp vậy, ph i k t hợp với nhiều tiêu khác Vấn đề thảo luận chương 2: Vẽ sơ đồ trình bày cấu trúc phân tử NST Giải thích mối tương quan đơn bội, lưỡng bội đa bội Phân biệt NST thường NST giới tính Trình bày sở NST xác định giới tính Trình bày đặc điểm vai trị trung tiết tiết mút Nêu giải thích thí nghiệm chứng minh sở NST di truyền Thực hành: làm kiểu nhân muỗi Anopheles người (Homo sapiens) Phân tích tiến hóa loài muỗi thuộc chi Anopheles sở phân tích kiểu nhân ... n ch c c a chúng 2. 2 Cấu trúc hiển vi thể nhiễm sắc 2. 2 .1 Thể nhiễm sắc thường thể nhiễm sắc giới tính Trong lưỡng bội, thể nhiễm sắc tồn thành cặp tương đồng, ví d ngư i có 23 cặp tương đồng,... 46 thể nhiễm sắc, tạo nên 22 cặp thể nhiễm sắc thư ng (autoxom) cặp thể nhiễm sắc giới tính 22 cặp thể nhiễm sắc thư ng chia thành b y nhóm ký hiệu từ A-G, dựa vào kích thước vị trí thể nhiễm sắc. .. Hình 2. 1 Sơ đồ chi ti t thể nhiễm sắc khổng lồ n nước bọt Drosophilla 2. 1 .2 Số lượng thể nhiễm sắc Về số lượng thể nhiễm sắc tiêu đặc trưng cho loài thể nhiễm sắc Theo quy luật chung, cá thể lồi