NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPR/CAS9 TRONG TẠO ĐỘT BIẾN GEN GmGOLS03, GmGOLS19 TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL) NHẰM GIẢM LƯỢNG ĐƯỜNG HỌ RAFFINOSE TRONG HẠT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - LÊ THỊ NHƯ THẢO NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPR/CAS9 TRONG TẠO ĐỘT BIẾN GEN GmGOLS03, GmGOLS19 TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL) NHẰM GIẢM LƯỢNG ĐƯỜNG HỌ RAFFINOSE TRONG HẠT Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã sỗ: 42 02 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2022 Cơng trình hồn thành tại: - Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Viện Công nghệ sinh học Người hướng dẫn khoa học 1: TS Đỗ Tiến Phát Viện Công nghệ sinh học Người hướng dẫn khoa học 2: PGS TS Phạm Bích Ngọc Viện Cơng nghệ sinh học Phản biện 1: GS Chu Hoàng Mậu Phản biện 2: TS Điêu Thị Mai Hoa Phản biện 3: TS Lê Quỳnh Mai Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 2022 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill), thuộc họ đậu (Fabaceae) loại cơng nghiệp có giàu dinh dưỡng có giá trị kinh tế cao, sử dụng làm thực phẩm cho người, thức ăn chăn nuôi, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp xuất Cây đậu tương có tính cải tạo đất trồng tốt Hạt đậu tương phận có giá trị dinh dưỡng cao Thành phần hạt bao gồm glucid (12,5-25%), lidpid (12,5-25%) xem nguồn dầu thực vật chủ lực tồn cầu, protein (35-50%) có giá trị dinh dưỡng tương đương với protein có nguồn gốc từ động vật chiếm khoảng 69% lượng protein tồn cầu phục vụ cho ngành chăn ni gia súc, gia cầm Ngồi ra, thành phần hạt cịn chứa vitamin nhóm (B, D, E…), số axit amin thiết yếu thành phần muối khoáng Tuy nhiên, ngồi thành phần dinh dưỡng giúp ích cho sức khỏe người, hạt đậu tương lại có diện nhóm đường họ raffinose (Raffinose family oligosaccharide - RFOs) nhóm đường khó tiêu chiếm 50% tổng lượng cacbon hịa tan hạt Nhóm đường RFOs chứa liên kết α-galactosidic (1-6) phân giải enzyme galactosidase, nhiên hệ tiêu hóa người nhóm động vật khơng nhai lại khơng chứa enzyme Thế nên, RFOs vào hệ tiêu hóa người nhóm động vật khơng nhai lại khơng tiêu hóa dày, đến ruột non nhóm đường khơng huyển hóa, khơng hấp thu Khi RFOs vận chuyển đến đại tràng nhóm vi sinh vật lên men tạo carbon dioxide, hydro mêtan gây tượng đầy hơi, khó chịu, ngăn cản q trình tiêu hóa Chính nguyên nhân làm giảm giá trị dinh dưỡng hạt đậu tương Những năm qua, nhà khoa học áp dụng nhiều biện pháp nghiên cứu chọn tạo giống theo hướng truyền thống lại tạo, đột biến, chuyển gen hay công nghệ RNAi nhằm giảm thiểu thành phần RFOs nâng cao giá trị dinh dưỡng hạt đậu tương Tuy nhiên phương pháp chưa thật mang lại hiệu Gần đây, phát triển công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 mở hội việc nghiên cứu chức gen mức độ DNA ứng dụng rộng rãi cải tạo giống trồng, đặc biệt có đậu tương CRISPR/Cas9 với ưu điểm dễ dàng thiết kế cấu trúc chuyển gen, tác động tới nhiều gen lúc với hiệu cao đặc biệt tạo dòng đột biến không mang gen chuyển, công nghệ phát triển ứng dụng rộng rãi nhiều loại thực vật Đặc biệt, nghiên cứu gần đậu tương cho thấy CRISPR/Cas9 áp thành cơng để tạo dịng đậu tương đột biến định hướng không mang gen chuyển Galactinol synthase (GOLS) enzyme quan trọng xúc tác phản ứng chuyển hóa L-myoinositiol thành galactinol Đây phản ứng đường sinh tổng hợp đường khó tiêu họ raffinose Trên đậu tương, nghiên cứu xác định gen mã hóa cho enzyme GOLS, gen Glyma.03G222000 (GmGOLS03) Glyma.19G219100 (GmGOLS19) có biểu mạnh trình hạt phát triển Việc giảm hàm lượng Galactinol thông qua đột biến định hướng gen riêng biệt đồng thời hai gen (GmGOLS03, GmGOLS19) kỳ vọng tăng hàm lượng sucrose, đồng thời giảm hàm lượng đường khó tiêu RFOs có hạt đậu tương Các nghiên cứu trước việc điều khiển biểu gen mã hóa enzyme xúc tác sinh tổng hợp nhóm đường RFOs nhằm giảm hàm lượng nhóm đường hạt đậu tương thu kết khả quan Trong đó, nghiên cứu giảm biểu gen mã hóa cho enzyme raffinose synthase stachyose synthase thực thành công đậu tương, ghi nhận việc giảm đáng kể hàm lượng raffinose stachyose hạt Điều minh chứng khoa học cho việc điều khiển hoạt động enzyme tham gia trình sinh tổng hợp đường khó tiêu họ raffinose nâng cao chất lượng hạt đậu tương Xuất phát từ sở khoa học nhu cầu thực tiễn tạo giống đậu tương có hàm lượng đường RFOs thấp, tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 tạo đột biến gen GmGOLS03, GmGOLS19 đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) nhằm giảm lượng đường họ Raffinose hạt” Mục tiêu đề tài Phát triển ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 để tạo đột biến định hướng gen mã hóa GOLS nhằm nâng cao chất lượng hạt đậu tương Mục tiêu cụ thể - Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 xây dựng thành công phương pháp kiểm tra hoạt động gây tạo đột biến gen hệ thống giống đậu tương Việt Nam - Tạo dòng đậu tương mang đột biến định hướng hai gen mã hóa enzyme GOLS thơng qua hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 - Phân tích đặc điểm, tính di truyền ảnh hưởng đột biến định hướng hai gen mã hóa enzyme GOLS đến hình thái, sinh trưởng phát triển thành phần hạt dòng đột biến tiềm Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài  Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu sở khoa học khẳng định vai trò gen GmGOLS tới thành phần đường hạt đậu tương, đồng thời cho thấy tiềm hiệu gây tạo đột biến định hướng đậu tương thông qua hệ thống chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9  Ý nghĩa thực tiễn Các dịng đậu tương đột biến khơng mang gen chuyển vật liệu cho cơng tác chọn dịng, lai tạo phát triển giống đậu tương Việt Nam có suất chất lượng tốt Những đóng góp luận án - Đã thiết kế thành công cấu trúc chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 nhằm gây tạo đột biến định hướng gen mã hóa enzyme GOLS kiểm tra hoạt động thơng qua hệ thống cảm ứng rễ tơ in vitro giống đậu tương ĐT22 ĐT26 Tạo thành cơng dịng đậu tương mang đột biến định hướng gen mã hóa cho - enzyme GOLS xác định dịng đậu tương (mang đột biến tiềm có hàm lượng đường khó tiêu hạt giảm Khẳng định vai trò hai gen GmGOLS03 GmGOLS19 tới đường sinh tổng hợp - đường khó tiêu họ raffinose đậu tương CHƯƠNG TỔNG QUAN Tình hình sản xuất chọn tạo giống đậu tương Sinh tổng hợp đường khó tiêu raffinose (raffinose family oligosaccharide) 1.1 1.2 đậu tương 1.3 Chỉnh sửa hệ gen thông qua hệ thống CRISRP/Cas9 1.4 Hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ ứng dụng nghiên cứu biểu gen chỉnh sửa hệ gen đậu tương 1.5 Những nghiên cứu ngồi nước có liên quan trực tiếp đến luận án CHƯƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu - Bốn giống đậu tương: Hai giống đậu tương ưu tú Việt Nam ĐT22, ĐT26 cung cấp Trung tâm Nghiên cứu Phát triển đậu đỗ - Viện Cây lương thực Cây thực phẩm Việt Nam hai giống đậu tương nước Maverick (Mr), William82 (WL 82) cung cấp từ đại học Missouri-Colombia, MO, Hoa Kỳ Giống đậu tương ĐT26 giống định hướng cải biến di truyền tạo đột biến ứng dụng phát triển Giống Maverick (Mr) vật liệu bổ sung dùng để kiểm tra qui trình chuyển gen đậu tương giống William82 (WL 82) dùng làm sở so sánh trình tự gen đích giống đậu tương thí nghiệm Khuẩn A rhizogenes K599 mang hai cấu trúc chuyển gen pFGC/gfp, pZY102/gus khuẩn A tumefaciens AGL1 mang hệ thống vector chuyển gen CRISPR/Cas9 - Vector HBT-pcoCas9 cung cấp từ phịng thí nghiệm Jen Sheen (RRID: Addgene_52254), vector pBlu/gRNA cung cấp từ phịng thí nghiệm Robert Stupar (RRID: Addgene_59188), vector pFGC5941 (RRID: Addgene_84084) - Các mồi đặc hiệu DNA oligonucleotide đặt tổng hợp nhân tạo công ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa (Cần Thơ, Việt Nam) 2.2 Nội dung nghiên cứu Đề tài nghiên cứu gồm nội dung: Nội dung 1: Thiết kế hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 nhằm gây tạo đột biến gen GmGOLS đậu tương Nội dung 2: Phát triển hệ thống cảm ứng rễ tơ thông qua vi khuẩn A Rhizogenes số giống đậu tương Việt Nam, kiểm tra hoạt động cấu trúc chuyển gen chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 Nội dung 3: Tạo đậu tương mang đột biến gen mã hóa Galactinol synthase thơng qua hệ thống CRISPR/Cas9 Nội dung 4: Phân tích di truyền đột biến định hướng gen chuyển Nội dung 5: Phân tích sinh trưởng phát triển thành phần hạt dòng đậu tương mang đột biến định hướng Nội dung 6: Kiểm tra đột biến ngồi định hướng lựa chọn dịng đột biến tiềm không mang gen chuyển Phương pháp nghiên cứu 2.3 Để thực nội dung nghiên cứu Chúng dùng phương pháp sau: - Thiết kế vector CRISPR/Cas9 Phương pháp chuyển gen thông qua rễ tơ - Phương pháp chuyển gen vào đậu tương qua nốt mầm - Tách chiết DNA tổng số theo phương pháp CTAB - PCR - Điện di sản phẩm Agarose, PAGE - Giải trình tự gen theo phương pháp Sanger - HPLC - Phương pháp thống kê phần mềm SPSS 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Thiết kế hệ thống chỉnh sửa CRISPR/Cas9 nhằm gây tạo đột biến gen GmGOLS đậu tương Lựa chọn trình tự gen mã hóa Galactinol synthase (GmGOLS) thiết kế cấu trúc chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 Thông qua cơng cụ tìm kiếm BLAST, chúng tơi phân tích, kiểm tra mối quan hệ phát sinh lồi GmGOLS đậu tương loài thực vật khác Dựa trình tự protein Arabidopsis GOLS, gen GmGOLS giả định xác định từ sở liệu hệ gen đậu tương SoyBase.org (Hình A) Đồng thời, tham khảo sở liệu mức độ phiên mã gen GmGOLS khác mô khác giai đoạn phát triển khác hạt Hình B, chúng tơi nhận thấy có sáu gen GmGOLS (Glyma.03G222000, Glyma.19G219100, Glyma.03G229800, Glyma.20G094500, Glyma.10G145300, Glyma.19G227800) nhóm lại tạo thành ba cặp tương đồng AtGOLS1, AtGOLS2 AtGOLS3 Trong đó, biểu Glyma.03G222000 (GmGOLS03) Glyma.19G219100 (GmGOLS19) tăng mạnh hạt chín cho thấy mức độ biểu hạt cao số tất gen GmGOLS Các liệu gen GmGOLS03 có khả gen mã hóa cho enzyme galactinol synthase tham gia vào trình sinh tổng hợp RFOs q trình phát triển hạt đậu tương Do đó, nghiên cứu luận án gây đột biến gen GmGOLS03 gen tương đồng GmGOLS19 hệ thống CRISPR/Cas9 để kiểm tra chức GmGOLS trình sinh tổng hợp RFOs hạt đậu tương Căn vào liệu thí nghiệm trước, chúng tơi chọn giống đậu tương ưu tú Việt Nam (ĐT26) giống Mr làm vật liệu để gây đột biến có mục tiêu Sử dụng trình tự gen giống đối chứng Williams 82 kết giải trình tự sơ cho thấy trình tự gen GmGOLS03 GmGOLS19 giống Mr ĐT26 tương đồng 100% với trình tự tương ứng gen giống đối chứng William 82 [127] Dựa trình tự khai thác hai giống vật liệu, hai trình tự RNA định hướng (sgRNAs) chọn từ vị trí đích tiềm GmGOLS03 GmGOLS19 Hai trình tự đích giống nằm exon hai gen GmGOLS (Hình Cấu trúc gen GmGOLS vị trí trình tự gRNA) Hình Cấu trúc gen GmGOLS vị trí trình tự gRNA Sau xác định sgRNA, trình tự mã hóa sgRNA tổng hợp nhân tạo ghép nối vào vector chuyển gen chứa trình tự mã hóa protein Cas9 để tạo thành cấu trúc chuyển gen hoàn chỉnh sơ đồ minh họa bên Hình Sơ đồ minh họa cấu trúc vector chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 kế để chuyển gen vào đậu tương Sau thu cấu trúc chuyển gen hồn chỉnh, chúng tơi tiến hành xây dựng hệ thống cảm ứng rễ tơ để kiểm tra hoạt động cấu trúc chuyển chỉnh sửa gen 3.2 Kiểm tra hoạt động cấu trúc chuyển gen chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 thông qua hệ thống cảm ứng rễ tơ  Phát triển hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ điều kiện in vitro số giống đậu tương Quá trình xây dựng hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ điều kiện in vitro tiến hành cho hai giống đậu tương có nguồn gốc nước Williams 82 (WL82), Marverick (Mr) hai giống đậu tương trồng phổ biến Việt Nam giống ĐT22, ĐT26 Chủng vi khuẩn A rhizogenes K599 mang hai cấu trúc chuyển gen (pZY102/gus, pFGC/gfp) sử dụng thí nghiệm chuyển gen vào rễ tơ đậu tương Kết ghi nhận tiêu tỉ lệ mẫu tạo rễ tơ sau ngày nuôi cấy môi trường cảm ứng tạo rễ cho thấy, bốn giống đậu tương thí nghiệm biến nạp khuẩn K599- pFGC/gfp có tỉ lệ mẫu phát sinh rễ tơ đạt mức cao Quan sát mẫu đặt môi trường cảm ứng tạo rễ, vị trí tạo tổn thương nhận thấy, mơ sẹo cảm ứng sinh rễ xuất ngày thứ Sau ngày cảm ứng tạo rễ, tỉ lệ tạo rễ tơ từ cấu trúc mang gen gfp giống ĐT22 đạt 100% WL82 đạt 98,33% Trong đó, tỉ lệ giống Mr 95% ĐT26 đạt 93,33% Với cấu trúc mang gen thị gus, tỉ lệ tạo rễ tơ cao hai giống ĐT22 WL82 biến nạp đạt mức 95% Tỉ lệ giảm xuống 88,33% với giống ĐT26 61,67% giống Mr Kết cho thấy giống đậu tương cấu trúc chuyển gen có ảnh hưởng trực tiếp tới tỉ lệ mẫu tạo rễ tơ in vitro biến nạp sử dụng vi khuẩn A rhizogenes Tổng hợp kết cho thấy hai giống đậu tương ĐT22 ĐT26 tỉ lệ rễ số rễ tơ trung bình tạo từ trình cảm ứng chuyển hai cấu trúc pZY102/gus pFGC/gfp đạt tỉ lệ cao Hiệu cảm ứng tạo rễ tơ in vitro thấp giống WL82 Từ kết nghiên cứu thí nghiệm này, thiết lập đưa quy trình cảm ứng tạo rễ tơ in vitro cho giống đậu tương nghiên cứu Hình  Kiểm tra hiệu chuyển gen hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ Rễ tơ bốn giống đậu tương biến nạp gen với cấu trúc pZY102/gus pFGC/gfp cắt thành đoạn có chiều dài từ 1,5-2 cm nuôi cấy môi trường chọn lọc chứa hoạt chất chọn lọc glufosinate (1-3 mg/l) để đánh giá có mặt hoạt động gen chuyển, cấu trúc chuyển gen có chứa gen bar kháng thuốc trừ cỏ Tiến hành soi gfp điện di kiểm tra sựu có mặt gen chuyển, kết thể hình bên Trong nghiên cứu này, mầm đậu tương ngày tuổi dùng làm nguyên liệu biến nạp gen, toàn phần cuống mầm loại bỏ trước tạo tổn thương nhiễm khuẩn Hiệu cảm ứng tạo rễ tơ tỉ lệ chuyển gen có biến động giống đậu tương nghiên cứu Tỉ lệ chuyển gen cao mà thu 79,8% với giống ĐT26 sử dụng cấu trúc mang gen gfp Tỉ lệ cảm ứng tạo rễ tơ đạt 90% với giống đậu tương Như vậy, giống nghiên cứu phát triển rễ tơ điều kiện in vivo, chúng tơi nhận thấy, yếu tố giống có ảnh hưởng trực tiếp tới hiệu cảm ứng tạo rễ tơ chuyển gen Bên cạnh đó, tuổi mầm cách thức chuẩn bị mẫu mầm lây nhiễm khuẩn đóng vai trị quan trọng tới hiệu chuyển gen thông qua rễ tơ đậu tương  Kiểm tra hoạt động chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 dòng rễ tơ Với nghiên cứu này, dòng rễ tơ thu mang gen chuyển thông qua việc khuếch đại gen cặp mồi đặc hiệu gen bar gen Cas9 Kết điện di cho thấy, toàn sản phẩm PCR mẫu rễ tơ nghiên cứu xuất băng vạch DNA khác biệt so với rễ tơ không chuyển gen hai gen quan tâm Các đột biến xảy dòng rễ tơ đậu tương chuyển gen vi khuẩn A rhizogenes K599 mang cấu trúc vector pFGC5941-G03-19 ghi nhận thông qua xuất băng sai lệch kích thước gel polyacrylamide 15% so với mẫu đối chứng không mang gen chuyển (WT) Để kiểm tra đặc điểm đột biến, hai dòng rễ tơ số lựa chọn ngẫu nhiên để tiến hành giải trình tự vùng gen quan tâm Kết cho thấy đột biến đoạn khác dao động từ -3 bp đến -25 bp xảy vùng định hướng tạo đột biến hai gen quan tâm Như vậy, hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 thiết kế hoạt động tốt với hệ thống cảm ứng rễ tơ giống đậu tương Việt Nam ĐT26 Trong điều kiện phịng thí nghiệm phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, hiệu chuyển gen thông qua rễ tơ hai giống đậu tương nước thể ưu việt so với hai giống đậu tương nước Biểu gen chuyển hoạt động hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 kiểm chứng hiệu với phương pháp nuôi cấy rễ tơ in vitro Kết sở để tiến hành chuyển cấu trúc chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 vào đậu tương nhằm tạo dòng đậu tương mang đột biến định hướng gen GmGOLS Hình Kiểm tra hoạt động chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 dòng rễ tơ 3.3 Tạo đậu tương đột biến gen mã hóa Galactinol synthase  Tạo đậu tương mang cấu trúc chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 Giống đậu tương ĐT26 đánh giá giống ưu tú Việt Nam, trồng phổ biến, có khả kháng bệnh gỉ sắt, đốm nâu khả chịu ruồi đục thân, chống đổ khá, suất cao để tạo đậu tương đột biến nhằm tăng chất lượng hạt ứng dụng công tác phát triển giống Giống đậu tương Mr sử dụng giống mơ hình cho quy trình chuyển gen Chủng vi khuẩn A tumefaciens AGL1 mang vector pFGC5941/G03-19 sử dụng để chuyển gen vào đậu tương thông qua nốt mầm hạt trưởng thành hai giống đậu tương ĐT26 Mr theo phương pháp tối ưu Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật - Viện CNSH Hình Minh họa trình chuyển gen vào đậu tương thơng qua nốt mầm (A Mảnh mầm đồng nuôi cấy ngày, B Mảnh mầm sau 14 ngày chọn lọc, C Mảnh mầm sau 28 ngày chọn lọc, D Chồi kéo dài môi trường chọn lọc, E Lá DT 1.1 (+) với ppt 200 mg/l, F Lá ĐT26 (-) với ppt 200 mg/l, G Cây chuyển gen 25 ngày tuổi) Với tổng lượng mẫu biến nạp 1082, sau lần chọn lọc liên tiếp giai đoạn cảm ứng tạo chồi với nồng độ glufosinate mg/l lần chọn lọc giai đoạn kéo dài chồi với nồng độ glufosinate mg/l thu 14 chồi kéo dài với giống ĐT26 14 chồi với giống Mr, chồi đạt chiều cao 2,5–3,5 cm có cắt sang mơi trường tạo rễ Sau 7-10 ngày, chồi có rễ hoàn chỉnh trồng giá thể TN1 bổ sung 25% TRiBAT Sau q trình thích nghi sinh trưởng buồng sinh trưởng nhiệt độ 28oC, độ ẩm 80%, quang chu kỳ 16 sáng/8 tối, thu tổng số 16 đậu tương hoàn chỉnh giá thể hai giống nghiên cứu bảng bên Bảng Kết biến nạp vector chuyển gen vào mảnh mầm đậu tương Giống Số mẫu Số mẫu tạo Số chồi Số chồi Số sống đậu tương biến nạp đa chồi kéo dài tạo rễ giá thể ĐT26 606 300 14 8 Mr 476 289 14 8  Xác định dòng đậu tương chuyển gen mang đột biến định hướng Với sống giá thể hai giống đậu tương ĐT26 Mr (như bảng trên) Chúng tiến hành sàng lọc phương pháp phết thuốc cỏ glufosinate 200 mg/l trực tiếp lá, sau xác nhận sàng lọc PCR có mặt trình tự T-DNA sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen pcoCas9 vùng mở rộng 35SPPDK – pFGC vector chuyển gen Kết quả: dòng đậu tương T0 phết trực tiếp glufosinate 200 mg/l bề mặt Sau ngày phết thuốc diệt cỏ, phần vị trí phết đối chứng số dịng chuyển gen co lại, dần sắc tố xanh lục chuyển vàng; sau ngày phết, vị trí thử chất diệt cỏ chuyển sang vàng nâu, cháy khơ Bên cạnh đó, số dịng chuyển gen không xuất dấu hiệu gây hại chất diệt cỏ vị trí thử, khơng bị màu màu sắc Kết phù hợp với kết sàng lọc gen chuyển PCR Đồng thời, tiến hành biến tính hồi tính sản phẩm PCR dịng T0 phân tích gel polyacrylamide 15% để xác định đột biến hai gen đích Hình Kết sàng lọc thuốc trừ cỏ kiểm tra sản phẩm PCR dịng T0 phân tích gel polyacrylamide 15% 10 Kết thu dịng chuyển gen hệ T0 có dịng (DT1.1) thuộc giống ĐT26 dịng (M3.1 M4.1) thuộc giống MR mang đột biến đoạn gen đích GmGOLS03 GmGOLS19 Trong đó, dịng DT1.1 cho đoạn lớn gen GmGOLS03 Kiểm chứng đột biến T0 phương pháp giải trình tự Kết cho thấy tất dòng đậu tương chuyển gen T0 (3/3) tạo từ hai giống ĐT26 Mr mang đột biến gây CRISPR/Cas9 gen GmGOLS03 GmGOLS19, đoạn giao động từ ∆-7 bp đến ∆-77 bp Cả dồng T0 tạo nhiều alen mang đột biến đoạn, chứng tỏ chúng có tượng chemeric Tuy nhiên đột biến đoạn (8/9) hầu hết nằm trình tự định hướng chứng tỏ hệ thống CRISPR/Cas9 hoạt động có độ xác cao, hình phân tích trình tự bên dưới: Hình Phân tích trình tự gen dịng hệ T0 gen GmGOLS19 (A) GmGOLS19 (B) Sau thu dòng đậu tương chuyển gen hệ T0, chăm sóc tiếp tục theo dõi di truyền chúng qua hệ sau 3.4 Sàng lọc dòng đậu tương chỉnh sửa gen qua hệ T1 T2 3.4.1 Phân tích di truyền đột biến dịng thuộc giống Maverick Phân tích di truyền phân ly dòng đậu tương đột biến hệ T1 giống Mr Thực phương pháp xác định có mặt gen chuyển tiến hành hệ T0 Chúng thu dòng đậu tương đột biến hệ T1 (M3.1-2, M3.1-6, M4.1-1, M4.1-5) giống Mr khơng có phản ứng glufosinate 200 mg/l, đồng thời kết điện di ghi nhận băng vạch 11 xuất rõ nét dòng(M3.1-2, M3.1-6, M4.1-1, M4.1-5) hệ T1, điều chứng tỏ gen bar di truyền cách ổn định từ hệ T0 sang T1 Ở hệ T0, chúng tơi nhận thấy dịng M3.1 M4.1 mang đột biến thể khảm (chemeric) hai gen GmGOLS03 vàGmGOLS19 Tuy nhiên, hầu hết đột biến không truyền sang hệ Sự di truyền phân ly đột biến tạo CRISPR/Cas9 hệ T1 dòng M3.1 M4.1 thuộc giống Mr nghiên cứu cách điện di gel giải trình tự Kết cụ thể dạng phân ly kiểu gen dòng đột biến hệ T1 thống kê Bảng Danh sách dòng đậu tương mang đột biến gen GmGOLS03 GmGOLS19 Ghi chú: (*) Dấu “-” thể đột biến đoạn (**) WT thể gen quan tâm không đột biến, “Hetero” thể đột biến xảy alen gen alen cịn lại khơng đột biến, “homo” thể đột biến xảy đồng thời hai alen đột biến giống hai alen, “biallelic” thể đột biến khác xảy hai alen gen Xác định di truyền phân ly dòng T1 sang hệ T2 chứa đột biến đoạn kích thước nhỏ, hệ thống thị phân tử xây dựng nhằm nhận diện đột biến Các thị phân tử xây dựng dựa ngun tắc bổ sung với mạch khn DNA Trong đó, GOLS12 seg F thiết kế đặc hiệu để nhận biết alen WT (tức alen không đột biến) alen đột biến 22 bp (Δ-22 bp), nhiên với thị chưa phân biệt dạng đột biến đoạn biallelic (22/-33 bp) Thế nên, GOLS-seg F1 thiết kế để nhận biết alen mang đột biến Δ-33 bp; GOLS-seg F3 thiết kế để nhận biết alen mang đột biến Δ-30 bp Khi thị phân tử kết hợp với mồi đặc hiệu cho gen GmGOLS03 GmGOLS19, thông qua PCR, alen khuếch đại xuất băng vạch điện di gel agarose (như hình bên dưới) Hình Kết sàng lọc đột biến hệ thống thị phân tử Kết sau sàng lọc thu đột biến hệ T2 giống Mr sau: 13 Nhằm kiểm tra khả phân biệt xác dạng đột biến gen GmGOLS với thị phân tử phát triển, số dòng T2 chọn để tiến hành giải trình tự vùng DNA mang đột biến hai gen GmGOLS03 GmGOLS19 Kết giải trình tự hoàn toàn phù hợp với kết PCR điện di gel agarose việc sàng lọc thị phân tử Như trình bày phần vật liệu nghiên cứu giống đậu tương Marverick, chúng tơi dừng lại việc phân tích đột biến định hướng giống Maverick hệ T2 Theo định hướng ban đầu nghiên cứu, giống đậu tương ĐT26 giống ưu tú Việt Nam, chọn để phát triển giống, nên chúng tơi tiến hành phân tích sâu đột biến tiêu để chọn giống đậu tương đột biến tiềm 3.4.2 Phân tích di truyền đột biến dịng thuộc giống ĐT26 Thơng qua phương pháp phết với thuốc diệt cỏ glufosinate nồng độ 200 mg/l sàng lọc PCR có mặt trình tự T-DNA sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen pcoCas9 vùng mở rộng 35SPPDK – pFGC gen chuyển tương tự hệ T0 Kết thu 29 đậu tương đột biến hệ T1 dịng DT1.1 thuộc giống ĐT26 khơng mẫn cảm với glufosinate 200 mg/l, phân tích mẫu T1 phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu, sản phẩm PCR phân tích điện gel agarose 1% cho kết dương tính với gen bar, điều chứng tỏ gen chuyển bar di truyền phân ly dòng đột biến thuộc hệ T1 Phân tích di truyền phân ly đột biến hệ T1trên hai gen GmGOLS phương pháp điện di gel agarose, kết hợp với việc giải trình tự, thu kết sau: Ở hệ T1 có phân li mang đột biến đoạn lớn -77 bp gen GmGOLS 1A di truyên từ hệ T0 Tổng hợp kết phân tích thu được: dịng đột biến kép đồng hợp tử (DT1.1-5, DT1.1-6, DT1.1-13) dòng đột biến đơn (GmGOLS03)đồng hợp tử: DT1.1-7, DT1.114 14 Tiếp tục kiểm tra di truyền phân ly đột biến hệ T2 thông qua điện di gel agarose giải trình tự Kết cho thấy đột biến đoạn di truyền ổn định từ hệ T1 sang hệ T2 hai gen Thế hệ T2 giống ĐT26, thu được: dòng đột biến kép đồng hợp tử: DT1.1-5-4, DT1.1-7-1, DT1.1-13-1, dòng đột biến đơn (GmGOLS03 ): DT1.17-2, DT1.1-14-1, DT1.1-14-3 Tổng hợp kết di truyền dòng đột biến thuộc giống ĐT26 sau: Từ kết trên, chọn dòng mang đột biến triển vọng hệ T2 giống ĐT26 trồng điều kiện nhà lưới để tiến hành đánh giá sinh trưởng, hình thái phân tích tiêu thành phần hạt 3.5 Phân tích sinh trưởng phát triển thành phần hạt dòng đậu tương mang đột biến định hướng  Đánh giá sinh trưởng, phát triển hình thái dịng đậu tương mang đột biến Lựa chọn đậu tương đột biến đồng hợp T2 (thế hệ DT1.1-4, DT1.1-5, DT1.16, DT1.1-7, DT1.1-14) wild-type ĐT26 để trồng điều kiện nhà lưới nhằm phân tích hình thái Kết theo dõi ghi nhận cho thấy sinh trưởng phát triển dòng đậu tương mang đột biến gen GmGOLS không mang đột biến (WT) Các tiêu về: số lóng, số cành cấp 1, chiều dài, chiều rộng khối lượng 100 hạt dịng mang đột biến WT khơng có khác biệt có ý nghĩ mặt thống kê  Thành phần hạt dòng đột biến trồng điều kiện nhà lưới  Phân tích RFOs có hạt dịng đậu tương mang đột biến Trong nghiên cứu này, kỹ thuật CRISPR/Cas9 gây đột biến chức gen GmGOLS03 gen tương đồng GmGOLS19, có biểu mạnh việc mã hóa cho galactinol synthase Để đánh giá tác động hai gen đến ảnh hưởng q trình sinh tổng 15 hợp nhóm đường họ raffinose (RFOs) chúng tơi tiến hành phân tích thành phần có hạt trưởng thành dịng đậu tương mang đột biến tiềm Kết phân tích thành phần cacbohydrat hòa tan, RFOs tổng số hàm lượng thành phần RFOs hạt dòng đột biến phương pháp sắc ký lỏng khối phổ cho thấy: so với hạt đối chứng, hạt dịng đột biến kiểm tra có lượng đường RFOs tổng hàm lượng carbohydrate hòa tan thấp Sự sụt giảm tổng lượng cacbohydrat hòa tan chủ yếu giảm stachyose sucrose, hai thành phần chiếm 90% tổng lượng cacbohydrat hòa tan định lượng hạt đối chứng Hàm lượng stachyose, sucrose, fructose, verbascose hạt dòng đột biến đơn gen so với hạt dịng đối chứng có khác biệt nhiên khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê Tổng hàm lượng RFOs, đo tổng raffinose, stachyose verbascose 64,7 mg/g khối lượng khô hạt đối chứng, giảm 30,2% xuống 45,13 mg/g thể đột biến đơn 34,1% xuống 41,95 mg/g đột biến kép Trong đó, khơng tìm thấy thay đổi đáng kể hàm lượng glucose fructose hạt đối chứng hạt đột biến (p > 0,05) Điều đặc biệt dạng carbohydrate riêng lẻ tính theo Tỉ lệ phần trăm với carbohydrate hòa tan tổng số dễ thấy Tỉ lệ tương đối sucrose thực tăng lên đột biến đơn kép so với đối chứng Ngoài ra, Tỉ lệ stachyose đột biến kép đơn thấp so với đối chứng Tổng số cacbohydrat hòa tan tổng số RFOs đo HPLC Thành phần carbohydrate hạt đậu tương, với carbohydrate chiếm lượng lớn stachyose sucrose (A) carbohydrate lượng nhỏ (B)  Các thành phần khác có hạt dịng đậu tương mang đột biến Chúng tơi tiến hành phân tích định lượng thành phần khác hạt bao gồm độ ẩm, protein, chất béo tinh bột Kết phân tích khơng có khác biệt đáng kể thành phần tinh bột hạt hạt đột biến kiểm tra hạt đối chứng Tuy nhiên, hàm lượng protein 16 có dịng đột biến tăng so với đối chứng Kết cho thấy chức GmGOLS03 GmGOLS19 không giới hạn q trình sinh tổng hợp RFOs mà cịn liên quan đến q trình sinh tổng hợp số thành phần khác có hạt đậu tương nghiên cứu sâu cần thực để làm rõ kết luận Phân tích khả nảy mầm dòng đột biến gen Trong nghiên cứu này, tiến hành xử lý nảy mầm hạt T3 từ DT1.1 đột biến gen đơn GmGOLS03 đột biến kép GmGOLS03/GmGOLS19 Kết quả: tỉ lệ nảy mầm hạt thí nghiệm quan sát ghi nhận: sau 24 giờ, Tỉ lệ nảy mầm dòng mang đột biến đơn đạt 29±2% 23±2% đột biến kép, tỉ lệ tương đối thấp so với đối chứng đạt 30±5%; sau 48 tỉ lệ nảy mầm đạt 92±7% đột biến đơn 89±3% đột biến kép thấp so với hạt đối chứng đạt 94±3% Tuy nhiên, khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê Nhìn chung, tỉ lệ nảy mầm tất nhóm hạt mức ổn định 95% sau 96 thí nghiệm, khơng tìm thấy khác biệt đáng kể khả nảy mầm hạt đột biến GmGOLS hạt đối chứng ĐT26  Phân tích đột biến khơng mong muốn lựa chọn dịng đột biến khơng mang gen chuyển Để đạt mục tiêu nghiên cứu tạo đậu tương đột biến có hàm lượng RFOs tổng số thấp, sinh trưởng phát triển WT không mang gen chuyển Chúng tiến hành tiếp tục sàng lọc hệ T2 dòng DT1.1 Kết xác định dịng DT1.1-7-1, có kiểu gen đột biến GmGOLS kép dòng DT1.17-2 mang đột biến đơn gen GmGOLS03 không mang gen kháng thuốc trừ cỏ Dựa vào chương trình tin sinh học, chọn vùng trình tự có khả xuất đột biến không 17 muốn nằm gen Glyma.07G34570 Glyma.09G14090, hai vị trí có khả gây tạo đột biến ngồi trình tự mục tiêu Tiến hành giải trình tự dòng đột biến tiềm năng, kết giải trình tự dịng đột biến cho thấy dịng đột biến tiềm khơng có trình tự đột biến ngồi mục tiêu Kết thúc q trình nghiên cứu, nhóm nghiên cứu chúng tơi thu dịng đậu tương đột biến có tiềm ứng dụng việc phát triển giống đậu tương (như bảng bên dưới) CHƯƠNG THẢO LUẬN 4.1 Hiệu hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ giống đậu tương Việt Nam 4.2 Chọn trình tự mục tiêu thiết kế cấu trúc chỉnh sửa gen đậu tương 4.3 Khả xuất đột biến định hướng muộn thông qua hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 4.4 Đột biến gen GmGOLS nảy mầm hạt đậu tương 4.5 Đột biến gen GmGOLS ảnh hướng đến thay đổi hàm lượng cacbohydrat có hạt 4.6 Tiềm chọn tạo giống đậu tương thông qua hệ thống chỉnh sửa hệ gen KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Hai gen GmGOLS03 GmGOLS19 lựa chọn để gây tạo đột biến làm giảm hoạt động enzyme galactinol synthase đậu tương dựa vào việc phân tích trình tự mức độ biểu gen Cấu trúc chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 mang hai trình tự định hướng gRNA thiết kế thành công để gây tạo đột biến hai gen GmGOLS03 GmGOLS19 Cấu trúc gắn vào vector chuyển gen với hệ chọn lọc sử dụng thuốc trừ cỏ Hệ thống cảm ứng rễ tơ in vitro thiết lập hai giống đậu tương ĐT22 ĐT26 Việt Nam với hiệu suất cao (71%- 79,8%) Các hệ thống cảm ứng rễ tơ áp dụng 18 thành công đánh giá hiệu chuyển gen biểu gen thị gus gfp Tỉ lệ chuyển gen ghi nhận mức 72,33% gen gus 79,8% với gen gfp Hệ thống ứng dụng để kiểm tra hoạt động cấu trúc CRISPR/Cas9 việc gây tạo đột biến hai gen GmGOLS03 GmGOLS19 dòng rễ tơ giống đậu tương nghiên cứu Tỉ lệ gây tạo đột biến dòng rễ tơ ghi nhận mức 80% Cấu trúc chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 hoạt động hiệu việc tạo đột biến gen GmGOLS03 GmGOLS19 hai giống đậu tương Maverick ĐT26 Các đột biến nằm xác vùng định hướng gây tạo đột biến cho thấy hoạt động xác hệ thống vector chỉnh sửa gen Các dòng đậu tương mang đột biến định hướng dạng đồng hợp tử đơn gen hai gen GmGOLS03 GmGOLS19 xác định di truyền qua hệ kỹ thuật PCR Hạt dòng đậu tương mang đột biến đồng hợp tử hai gen GmGOLS03 GmGOLS19 có hàm lượng đường khó tiêu họ raffinose giảm đáng kể (giảm từ 30,2% đến 34,1%), hàm lượng đường succrose tăng lên (tăng từ 48% đến 51%) so với đậu tương giống gốc không mang đột biến Ở số dòng đậu tương đột biến (DT1.1-7-2, DT1.1-14-3) ghi nhận tăng lên đáng kể hàm lượng protein hạt Tuy nhiên, khơng ghi nhận khác biệt hình thái, khả sinh trưởng phát triển dòng đậu tương đột biến so với giống gốc Các đột biến đồng hợp tử đơn gen hai gen GmGOLS, có hàm lượng đương họ raffinose thấp không mang gen chuyển xác định hệ T2 dòng đậu tương đột biến có nguồn gốc từ giống ĐT26 Các phân tích khơng ghi nhận đột biến ngồi định hướng (offtargets) dòng đậu tương đột biến triển vọng KIẾN NGHỊ Tiếp tục đánh giá sinh trưởng, phát triển, suất chất lượng hạt dòng đậu đột biến điều kiện đồng ruộng từ lựa chọn dịng tiềm cho cơng tác phát triển giống đậu tương phục vụ sản xuất Mở rộng việc ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 nhằm giảm hàm lượng đường khó tiêu rafinose giống đậu tượng tiềm nước đồng thời phát triển cải tạo tính trọng quý khác đậu tương 19 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ Huy Le, Nhung Hong Nguyen, Dong Thị Ta, Thao Nhu Thi Le, Thao Phuong Bui, Ngoc Thu Le, Cuong Xuan Nguyen, Hardy Rolletschek, Gary Stacey, Minviluz G Stacey, Ngoc Bich Pham, Phat Tien Do, Ha Hoang Chu “CRISPR/Cas9-mediated knockout of galactinol synthaseencoding genes resulted in low raffinose family oligosaccharides in soybean seeds” Frontiers in Plant Science, 2020 Dec 17 Doi:10.3389/fpls.2020.612942 Lê Thị Như Thảo, Nguyễn Hồng Nhung, Lê Quang Huy, Bùi Phương Thảo, Lê Thu Ngọc, Phạm Bích Ngọc, Chu Hồng Hà, Đỗ Tiến Phát “Phát triển hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ in vitro số giống đậu tương phục vụ nghiên cứu biểu gen chỉnh sửa hệ gen” Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 2021, 19 (3), trang 1-12 Lê Thị Như Thảo, Nguyễn Hồng Nhung, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Đỗ Tiến Phát “Xây dựng thị phân tử phân tích di truyền đột biến tạo hệ thống crispr/CAS9” Hội Nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc 2021, trang 776-781 Đại học Thái Nguyên Duy Dinh Trinh, Ngoc Thu Le , Thao Phuong Bui, Thao Nhu Thi Le , Cuong Xuan Nguyen, Ha Hoang Chu, Phat Tien Doa “A sequential transformation method for validating soybean genome editing by CRISPR/Cas9 system” Đã gửi đăng (4/2022) tạp chí Saudi Journal of Biological Sciences 20