Phân lập nấm Chaetomium globosum từ lá cây ớt ngọt (Capsicum annuum L.)

Bài viết Phân lập nấm Chaetomium globosum từ lá cây ớt ngọt (Capsicum annuum L.) khảo sát sự có mặt của một số chủng nấm nội sinh lá, cụ thể là ở cây ớt ngọt với mong muốn tìm được chủng nội sinh có lợi để ứng dụng như tác nhân kiểm soát sinh học thay thế thuốc diệt nấm hoá học.

PHÂN LẬP NẤM CHAETOMIUM GLOBOSUM TỪ LÁ CÂY ỚT NGỌT (Capsicum annuum L.) Đặng Khánh Hoàng Minh Đăng*, Phạm Đăng Hồng Hà, Lý Thị Bích Ngân *Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, Trường Đại học Cơng Nghệ TP Hồ Chí Minh GVHD: TS Nguyễn Hồi Hương TĨM TẮT Mẫu ớt từ nông trại huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng sau thu nhận vận chuyển phịng thí nghiệm Viện Khoa học Ứng dụng tiến hành phân lập làm Các chủng nấm tiếp tục nuôi cấy môi trường thạch dextrose khoai tây (PDA) để quan sát hình thái khuẩn lạc đánh giá đặc điểm sợi nấm kính hiển vi quang học với vật kính 40x 100x Trong số chín chủng nấm khảo sát có chủng V142 nghi ngờ thuộc chi Chaetomium Để khẳng định chủng định danh cách giải trình tự gen 18S ITS theo phương pháp Sanger; tiếp sau so sánh DNA thu với sở liệu Ngân hàng Gen (GenBank) the National Center for Biotechnology Information (NCBI) Kết cho thấy chủng nấm xác định Chaetomium globosum với độ tương đồng 99,87% Từ khoá: ớt ngọt, nấm nội sinh, Chaetomium globosum, phương pháp Sanger GIỚI THIỆU Trong nông nghiệp, sâu hại mầm bệnh làm giảm suất trồng hàng năm tồn cầu ước tính từ 30 đến 50%, tổn thất cần phải đấu tranh để đảm bảo an ninh lương thực cho dân số ngày tăng (Grabka R et al., 2022) Hiện nay, người nông dân thường sử dụng thuốc diệt nấm hố học biện pháp phịng ngừa điều trị để kiểm soát mầm bệnh thực vật (J.H Park et al., 2005) Tuy nhiên, giải pháp ngày để lộ nhiều hạn chế mà việc sử dụng bừa bãi mức dẫn đến tình trạng nhiễm mơi trường, tính kháng thuốc số mầm bệnh Bên cạnh nhu cầu người tiêu dùng sản phẩm hữu dần tăng Do đó, việc tìm giải pháp an tồn nhằm thay thuốc diệt nấm hoá học cần thiết Trong số vi khuẩn nội sinh có lợi sử dụng tác nhân kiểm soát sinh học để bảo vệ trồng, nhận nhiều ý Vì chúng thúc đẩy phát triển thực vật bảo vệ chống lại sâu hại mầm bệnh thông qua chế khác tiết hợp chất thứ cấp nhằm ngăn chặn giảm tác động tiêu cực từ mầm bệnh; cạnh tranh dinh dưỡng nơi sống với mầm bệnh; số cịn có đặc tính thúc đẩy tăng trưởng giúp khoẻ mạnh (Grabka R et al., 2022) Chaetomium globosum số Khi có báo cáo cho thấy sử dụng chúng 467 tác nhân đối kháng tiềm với mầm bệnh thực vật khác mà phần lớn có nguồn gốc từ đất hạt giống (J.H Park et al., 2005) Tuy nhiên, nghiên cứu năm gần quần xã nội sinh có liên quan đến lồi thực vật khác đa dạng nấm nội sinh cư trú bên thực vật phần lớn bị đánh giá thấp (Grabka R et al., 2022) Chính vậy, nghiên cứu nhằm mục đích khảo sát có mặt số chủng nấm nội sinh lá, cụ thể ớt với mong muốn tìm chủng nội sinh có lợi để ứng dụng tác nhân kiểm soát sinh học thay thuốc diệt nấm hoá học VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Nguồn phân lập: mẫu ớt thu nhận từ nông trại địa bàn huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng 2.2 Phương pháp 2.2.1 Phân lập nấm nội sinh Dựa theo kỹ thuật cải tiến Petrini (1992), mẫu sau thu nhận rửa vòi nước máy để loại bỏ bụi bẩn Dùng dao vô trùng cắt nhỏ thành miếng có kích thước x mm Sau đó, mẫu khử trùng lần đầu cồn 70% lần hai dung dịch NaClO 1%; lần thực vòng - phút Tiếp đến tráng lại lần nước cất vô trùng để khô giấy lọc vô trùng trước cấy lên mơi trường PDA (Hernawati et al., 2011) có bổ sung 0,5 g/L Chloramphenicol hấp tiệt trùng Ủ nhiệt độ phòng vòng - ngày quan sát hình thành tơ nấm từ rìa 2.2.2 Cấy truyền Quan sát đĩa phân lập thấy môi trường xuất nhiều tản nấm có hình dạng, màu sắc kích thước khác phải tách riêng dạng tản nấm để làm cách cắt miếng thạch nhỏ có kích thước × mm từ rìa tản nấm Sau đó, cấy chúng sang đĩa khác chứa môi trường PDA Khi tản nấm mọc từ miếng cấy đạt đến khoảng mm tiến hành cấy truyền tiếp qua đĩa có mơi trường PDA cách dùng que cấy lấy sợi nấm từ tản nấm cấy vào đĩa Ủ nhiệt độ phòng vòng - ngày 468 2.2.3 Làm Chuẩn bị đĩa petri chứa môi trường ½ PDA mà độ nghiêng bên đĩa cao phía cịn lại khoảng mm Dùng đục lỗ thạch đường kính mm lấy miếng nấm từ đĩa cấy truyền đặt vào phần dày đĩa mơi trường ½ PDA Sau ngày soi đĩa nguồn sáng để tìm sợi nấm Lưu ý chọn vị trí sợi nấm mọc thưa thớt dùng que cấy dẹp cắt miếng thạch chứa sợi nấm đặt qua mơi trường PDA Ủ nhiệt độ phòng vòng - ngày để quan sát hình thái khuẩn lạc 2.2.4 Quan sát hình thái sợi nấm Sử dụng phương pháp phòng ẩm để đánh giá đặc điểm hình thái sợi nấm khảo sát Trước tiên cần phải chuẩn bị lame, lamelle đĩa petri phi 10 có lót giấy lọc hấp tiệt trùng; đổ lớp mỏng (khoảng cm) môi trường PDA lên đĩa petri phi Sau dùng dao mổ vơ trùng cắt thạch thành khối vuông (1 x cm) đặt lên lame sau dùng que cấy vịng lấy sinh khối nấm cấy vào bốn cạnh miếng thạch, dùng kẹp vô trùng đặt lamelle lên trên, nhỏ nước cất vô trùng cho thấm ướt giấy lọc Đậy đĩa petri lại ủ nhiệt độ phòng ngày trước quan sát kính hiển vi vật kính 40x 100x 2.2.5 Định danh chủng nấm phân lập Chủng nấm có hình thái khuẩn lạc đặc điểm sợi nấm mà nghi ngờ chi Chaetomium gửi giải trình tự vùng ITS (internal transcribed spacer) Công ty TNHH Dịch vụ Thuơng mại Nam Khoa (Nam Khoa Biotek CO., Ltd) phương pháp Sanger dựa vào trình tự thu được, tìm kiếm sở liệu GenBank phần mềm trực tuyến BLAST NCBI KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập nấm nội sinh Mẫu sau phân lập ngày từ rìa bắt đầu xuất sợi tơ Tuy nhiên, đặc điểm màu sắc tốc độ phát triển khơng rõ ràng phải đến ngày thứ màu sắc tốc độ phát triển tảng nấm có khác biệt rõ rệt 3.2 Cấy truyền làm Những tảng nấm có đặc điểm màu sắc tốc độ phát triển khác tách riêng cách cấy truyền nhiều lần Sau làm thuẩn thu nhận chủng nấm có hình thái khuẩn lạc khác Tuy nhiên có chủng V142 cho thấy đặc điểm giống với mô tả chi Chaetomium Khuẩn lạc chủng V142 môi trường PDA có màu trắng nhạt với mảng màu sậm Tản nấm mọc khơng đều, khơng xuất vịng trịn đồng tâm, sợi nấm nhiều bơng xốp Mặt cịn lại có màu nâu sậm tâm nhạt dần phần rìa (Hình 1) Kết tương đồng với mô tả Afra Khiralla (2015) 469 Mặt Mặt Hình 1: Hình thái khuẩn lạc chủng V142 môi trường PDA 3.3 Quan sát hình thái sợi nấm Quả thể dạng chai (Perithecia) có hình cầu bao phủ sợi lơng mặt (Hình 2) Các sợi lơng có hình trụ thẳng, cong phần đỉnh (Hình 3) Kết cho thấy tương đồng với báo cáo Afra Khiralla (2015) Tuy nhiên, trình soi kính, chưa tìm thấy bào tử túi hình oval (ascospores) Chính để chắn cần phải tiến hành định danh chủng Vật kính 40x Vật kính 100x Hình 2: Đặc điểm thể dạng chai chủng V142 kính hiển vi 470 Hình 3: Đặc điểm sợi nấm chủng V142 kính hiển vi 3.4 Định danh nấm nội sinh phân lập Tiến hành định danh theo phương pháp Sanger cách sử dụng cặp mồi ITS1 5’ TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’ ITS4 5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’ để khuếch đại vùng đệm phiên mã (ITS) ribosome DNA (rDNA) (White et al., 1990) Sau giải trình tự gene 18S ITS thu đoạn gene 753 bp Kết so sánh Genbank (NCBI) cho thấy V142 Chaetomium globosum với tỉ lệ tương đồng 99,87% Chi Chaetomium báo cáo có nhiều lồi thuộc nấm đối kháng, khơng có tác dụng phịng chống bệnh hại trồng mà sử dụng để tăng độ màu mỡ cho đất, kích thích trồng phát triển hấp thụ dinh dưỡng (Nguyễn Thế Quyết cộng sự, 2017) Kết gợi ý cho nghiên cứu khảo sát số đặc điểm có lợi lồi Chaetomium globosum việc ứng dụng tác nhân đối kháng lại với mầm bệnh gây hại Pythium ultimum, Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum f sp lycopersici, Venturia inaequalis, Pyricularia oryzae, Botrytis cinera, Phomopsis, Colletotrichum spp (Nguyễn Thế Quyết cộng sự, 2017) sinh chất hỗ trợ tăng trưởng IAA, GA3, (Abdul Latif Khan et al., 2012) KẾT LUẬN Mẫu ớt thu nhận từ huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng sau phân lập làm thu nhận chủng nấm có đặc điểm khuẩn lạc khác Trong q trình ni cấy khuẩn lạc khảo sát đặc điểm hình thái kính hiển vi có chủng V142 có đặc điểm giống mơ tả Chaetomium globosum Afra Khiralla (2015) khẳng định cách giải trình tự gene trình tự ITS so sánh DNA thu với trình tự Genbank NCBI Những nghiên cứu hoạt tính kháng nấm bệnh hỗ trợ tăng trưởng ớt chủng phân lập tiến hành để đánh giá toàn diện khả áp dụng chủng phân lập phát triển nông nghiệp hữu 471 TÀI LIỆU THAM KHẢO Abdul Latif Khan et al., 2012 Role of endophyte Chaetomium globosum Lk4 in growth of Capsicum annuum by producion of gibberellins and indole acetic acid,Pak J Bot., 44 (5), 1601 - 1607 Afra Khiralla, 2015 Phytochemical study, cytotoxic and antibacterial potentialities of endophytic fungi from medicinal plants from Sudan, Université de Lorraine Grabka R, d’Entremont T.W, Adams S.J, Walker A.K, Tanney J.B, Abbasi P.A & Ali S, 2022 Fungal Endophytes and Their Role in Agricultural Plant Protection against Pests and Pathogens Plants 11, 384 Hernawati et al., 2011 Leaf endophytic fungi of Capsicum annuum, Biodiversitas 12 (4), 187 - 191 Nguyễn Thế Quyết, Kasem Soytong & Hà Viết Cường, 2017, Xác định danh tính nấm Chaetomium cupreum Chaetomium globosum đất trồng ăn có múi miền Bắc Việt Nam, Vietnam J Agri Sci 15 (10), 1323 - 1331 Park et al., 2005 Antifungal activity against plant pathogenic fungi of chaetoviridins isolated from Chaetomium globosum, FEMS Microbiology Letters 252, 309 - 313 472 ... thay thuốc diệt nấm hoá học VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Nguồn phân lập: mẫu ớt thu nhận từ nông trại địa bàn huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng 2.2 Phương pháp 2.2.1 Phân lập nấm nội sinh Dựa... trưởng ớt chủng phân lập tiến hành để đánh giá toàn diện khả áp dụng chủng phân lập phát triển nông nghiệp hữu 471 TÀI LIỆU THAM KHẢO Abdul Latif Khan et al., 2012 Role of endophyte Chaetomium globosum. .. LUẬN 3.1 Phân lập nấm nội sinh Mẫu sau phân lập ngày từ rìa bắt đầu xuất sợi tơ Tuy nhiên, đặc điểm màu sắc tốc độ phát triển khơng rõ ràng phải đến ngày thứ màu sắc tốc độ phát triển tảng nấm có