Trong nghiên cứu này dịch chiết EMC70, EMC90 và AMC từ lá cây trứng cá được sử dụng để đánh giá sơ bộ hoạt tính hóa học, định tính một số thành phần hóa học cơ bản bằng phương pháp LC-MS/MS, khả năng chống oxy quét gốc tự do DPPH và hoạt tính kháng khuẩn. Kết quả định tính cho thấy có nhiều hợp chất như phenolic, flavonoid, tannin và steroid.
Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (2), 2018 HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC LOẠI CAO CHIẾT TỪ LÁ CÂY TRỨNG CÁ MUNTINGIA CALABURA L Phạm Hữu Tuấn*, Nguyễn Ngọc Hồng Trường Đại học Công nghệ TP.HCM *Tác giả liên lạc: huutuanpro93@yahoo.com (Ngày nhận bài: 03/4/2018; Ngày duyệt đăng: 25/5/2018) TÓM TẮT Cây trứng cá (Muntingia Calabura L.) trồng nhiều miền Nam Việt Nam thường dùng để làm bóng mát hoạt tính sinh học nghiên cứu Trong nghiên cứu dịch chiết EMC70, EMC90 AMC từ trứng cá sử dụng để đánh giá sơ hoạt tính hóa học, định tính số thành phần hóa học phương pháp LC-MS/MS, khả chống oxy quét gốc tự DPPH hoạt tính kháng khuẩn Kết định tính cho thấy có nhiều hợp chất phenolic, flavonoid, tannin steroid dịch chiết EMC70 EMC90, AME chứa saponin amino acid tự Khả chống oxy hóa EMC70 EMC90 gần với giá trị tương đương (16,70±0,10 μg/ml 16,49±0,03 μg/ml tương ứng) thấp khoảng 3,10 lần so với axit ascorbic (IC50=5,38±0,12 μg/ml) Phân tích HPLC-MS cao chiết tổng ethanol cho thấy diện Chrysoeriod, 8-Methoxygalangin số chất khác thuộc nhóm flavonoid Khả kháng khuẩn EMC70 EMC90 tương đương chủng Enterotoxigenic E.coli-ETEC, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus Shigella flexneri Kết tổng hợp cho thấy Muntingia Calabura có hoạt tính chống oxy hóa, với tiềm kháng khuẩn số chủng vi sinh gây bệnh đường ruột Từ khóa: Chống oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn, qt gốc tự DPPH ANTIOXIDANT AND ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF EXTRACTS FROM MUNTINGIA CALABURA L Pham Huu Tuan*, Nguyen Ngoc Hong Ho Chi Minh City University of Technology *Corresponding Author: huutuanpro93@yahoo.com ABSTRACT Muntingia Calabura L was grown in southern Vietnam Until now there are not many scientific articles published on the bio-activity of Muntingia calabura leaves In this study, EMC70, EMC90 and AMC extract from Muntingia calabura are used to test phytochemical, HPLC profiling, DPPH radical-scavenging and antimicrobial activity The result screening for phytochemical analysis of Muntingia calabura showed that phenolics, flavonoids, tannins and steroids in EMC70 and EMC90 AMC with saponin and amino acid at large In antioxidant activity, IC50 of EMC70 (16.70±0.10 μg/ml) and EMC90 (16.49±0.03 μg/ml) weren’t different in statistics and less than 3.10 times as much as axit ascorbic (IC50=5.38±0.12 μg/ml) The HPLC/MS analysis revealed the presence of chrysoeriol, 8-Methoxygalangin and some flavonoid compounds in total ethanol extract of Muntingia calabura In antibacterial activity, EMC70 and EMC90 had the same activity with Enterotoxigenic E.coli-ETEC, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus and Shigella flexneri Conclusion Muntingia Calabura has antioxidant activity and intestinal antibacterial activity Keywords: Antioxidant activity, antimicrobial activity, DPPH radical-scavenging 19 Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (2), 2018 MỞ ĐẦU Muntingia Calabura L thuộc họ Elaeocarpaceae Cây dễ trồng phân bố rộng Lá, vỏ hoa có giá trị làm thuốc chữa bệnh Theo y học cổ truyền, Muntingia Calabura nấu lên sắc thuốc giảm loét dày, giảm sưng tuyến tiền liệt hay giảm bớt đau đầu Những minh chứng khoa học gần cho thấy Muntingia Calabura có hoạt tính giảm đau, kháng viêm hạ sốt (Yusof ctv, 2011) Trong báo cáo nghiên cứu khác dịch chiết Muntingia Calabura L có hoạt tính chống lt dày (Balan ctv, 2013) Muntingia Calabura L nghiên cứu nhiều nơi giới Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu lồi Mục đích nghiên cứu nhằm định tính số thành phần hóa học phương pháp HPLC/MS, khả chống oxy quét gốc tự DPPH hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết Muntingia Calabura L chloride từ BDH Labs (Cambridge, England), TSB (Tryptone casein soy broth), TSA (Tryptone casein soy agar) từ New Delhi (India) Chủng vi sinh vật thị Các chủng vi sinh vật gây bệnh sử dụng bao gồm: Escherichia coli, Enterotoxigenic E.coli-ETEC, Listeria monocytogenes, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Shigella flexneri Shigella boydii cung cấp Viện Vệ sinh Y tế công cộng, trường đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh Phương pháp xác định thành phần hóa học Phương pháp xác định thành phần hóa học dựa theo phương pháp Yadav ctv (2013) nhằm định tính nhóm chất hữu thành phần cao chiết từ Muntingia Calabura Khả chống oxy hóa gốc tự DPPH Hoạt tính chống oxy hóa qt gốc tự DPPH Muntingia Calabura xác định dựa theo mô tả Nur Alam ctv (2012) Khả chống oxy hóa xác định dựa nồng độ IC50 mà có khả ức chế 50% gốc tự Khả quét đo máy T70 UVvisible spectrometer bước sóng λ=517 nm Hoạt tính quét gốc tự (%) = AC - AS x 100% VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Thu hái xử lý mẫu Mẫu Muntingia Calabura L thu thập TP Hồ Chí Minh định danh PGS.TS Trần Hợp trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh Mẫu sau thu nhận xử lý xay với kích thước 0,2-1 mm mẫu bảo quản nơi khô ráo, tránh ánh sáng mặt trời 50 g mẫu ngâm dung môi ethanol 70, ethanol 90 nước theo tỷ lệ 1/20 (w/v) Sau 24 dịch chiết lọc thu dịch Cao chiết có cách sử dụng máy cô quay chân không 400C để thu dịch chiết thô ethanol 70 (EMC70) ethanol 90 (EMC90) dịch chiết nước (AMC) Thuốc thử hóa chất Folin-Ciocalteu (Darmstadt, Germany), DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) axit ascorbic từ MP Biomedicals (Illkirch, France), axit gallic, rutin từ Riedel-deHaen (Seelze, Germany) aluminum chloride, sodium carbonate, iron(III) AC Ac As tương ứng mẫu đối chứng (DPPH methanol) mẫu thí nghiệm axit ascorbic sử dụng đối chứng dương Các thử nghiệm tiến hành ba lần lặp Định lượng flavonoid Hàm lượng flavonoid xác định theo phương pháp Woisky and Salatino (1998) ml mẫu (mg/ml) thêm vào ml AlCl3 2%, ủ nhiệt độ phòng 45 phút đo quang bước sóng λ = 420 nm Hàm lượng flavonoid tính tốn dựa vào đường chuẩn rutin 20 Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (2), 2018 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng Định lượng phenolic Hàm lượng phenolic xác định khuẩn cao chiết dựa phương pháp phương pháp Folin-Ciocalteu theo Von khuếch tán đĩa thạch (Aibinu ctv, Gadow ctv (1997) sử dụng axit gallic 2007) 0,1 ml dịch vi khuẩn thị có mật chất chuẩn Cho nồng độ mẫu (mg/ml) vào độ 106 cfu/ml hút từ môi trường tăng ống nghiệm Thêm 2,5 ml thuốc thử Folin- sinh Tryptone casein soy broth (TSB) để Ciocateau (1/10) Sau khoảng đến phút cấy trang đĩa thạch chứa môi trường bổ sung thêm ml Na2CO3 7,5%, lắc đều, Tryptone casein soy agar (TSA) tiệt trùng ủ 400C nhiệt độ phòng 30 phút, Sử dụng ống kim loại tiệt trùng có đường tiến hành đo quang bước sóng λ = 765 kính mm đục lỗ đĩa thạch Hút nm Hàm lượng phenolic tổng số tính 100 µl dịch chiết cần khảo sát nhỏ vào toán dựa vào đường chuẩn axit gallic lỗ đĩa thạch vừa trang vi khuẩn thị Các đĩa petri sau đem ủ tủ Phương pháp HPLC-MS Phân tích dịch trích ly cồn từ ấm nhiệt độ từ 37oC 24 Hoạt Muntingia Calabura phương pháp tính kháng khuẩn dịch chiết từ sắc ký cao áp (HPLC) thực Muntingia Calabura xác định cột C18 (kích thước 4,6 x 150 mm, cách đo đường kính vịng ức chế 3,5 μm) cung cấp Weber Xử lý số liệu Consulting Ltd., Hungary Pha động gồm Tất số liệu xử lý phần nước – axit formic (A; 100:0,1, v/v) – mềm Microsoft® Excel® 2016 methanolic- axit formic (B; 100:0.1, v/v) (16.0.7070.2022), phần mềm SAS (r) 9.4 A B cho theo khoảng thời gian TS Level 1M1 với trắc nghiệm Tukey sau: min, A: B = 90:10; 35 min, A: B = 0:100; 60 min, A: B = 0:100 Tốc độ KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN dòng chảy 0,5 ml/phút nhiệt độ cột Thành phần hóa học có sắc ký giữ 400C Tất dung môi Muntingia Calabura lọc qua lọc 0,45 µm khử khí Kết định tính sơ thành phần hóa học siêu âm buồng siêu âm trước Muntingia Calabura cho thấy sử dụng Tình trạng MS sau ion nhóm hợp chất phenolic cụ thể hóa tia điện ESI; ion dương âm; pin đối flavonoid chứa nhiều ba loại dịch RF: với tốc độ 250,0 vịng/phút; khí khơ chiết (bảng 1) Điều giống với nghiên 9,0 l/phút, chất làm nóng khơ 200C; van cứu trước Ogunleye Ibitoye điều chỉnh: nguồn; áp lực máy phun (2003) Trong dịch chiết EMC70 sương: 1,2 bar; mao dẫn: 4500V; EMC90 cho thấy diện nhóm Offset: -500V; quét từ 50 – 3000 m/z; cài hợp chất flavonoid, phenolic, tannin đặt thông số thông minh: không hoạt động steroid Trong dịch chiết AMC có Dùng phần mềm Chemstation để thu thập diện flavonoid, phenolic, tannin, liệu (Agilent Corporation, MA, USA) saponin amino acid tự Alkaloid không diện ba loại dịch chiết Thử hoạt tính kháng khuẩn Bảng Định tính thành phần hóa học có Muntingia Calabura Alkaloid EMC70 EMC90 Marquis Mayer ‒ ‒ ‒ ‒ Dragendro f ‒ ‒ Saponi n Anthraquinone Amino acid HaGer Wag -ner Foam Test BonTrager Ninhydrin ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ + ‒ 21 Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (2), 2018 AMC ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ Alka -line Shinod a Phenolic compound Lead Ferric Gela acet clorid -tin a-te EMC 70 ‒ +++ ++++ +++ EMC 90 ‒ +++ ++++ +++ ‒ ++ Flavonoid Tannin Ferric clorid Lead acetate ++ ++++ +++ +++ ++++ +++ ++ Steroid Salkowski Triterpenoi d Triterpenoi d ‒ AMC + + +++ +++ ++ +++ +++ Ghi chú: ‒ khơng có + có ++ có +++ có nhiều ++++ có nhiều 3,10 lần so với (IC50=5,38±0,12 μg/ml) Khả chống oxy hóa quét gốc tự Phương pháp DPPH dùng phổ biến AMC có khả chống oxy hóa nghiên cứu chống oxy hóa khoảng 4,60 lần so với axit ascorbic đơn giản, nhanh chóng ổn định Do (IC50=5,38±0,12 μg/ml) đó, phương pháp sử dụng rộng So với nghiên cứu trước khả rãi để sàng lọc chất chống oxy hóa Kết chống oxy hóa dịch chiết EMC70 trình bày hình Trong đó, khả EMC90 thấp khoảng 1,69 lần so chống oxy hóa EMC70 với dịch chiết methanol (Premakumari EMC90 gần với giá trị IC50 ctv 2010) cao khoảng 3,96 lần so lần lược 16,70±0,10 μg/ml với dịch chiết petroleum ether 16,49±0,03 μg/ml thấp khoảng Muntingia Calabura Hình Hoạt tính qt gốc tự nồng độ Muntingia Calabura L Muntingia Calabura L trình bày Định lượng flavonoid phenolic Hàm lượng polyphenol tổng số bảng sau flavonoid tổng số từ dịch chiết Bảng Hàm lượng polyphenol flavonoid tổng số Hàm lượng polyphenol tổng số Hàm lượng flavonoid tổng số EMC70 120,77 ± 0,54 mg GAE/g 90,94 ± 2,12 mg RE/g EMC90 43,18 ± 0,30 mg GAE/g 35,48 ± 1,23 mg RE/g AMC 60,60 ± 0,93 mg GAE/g 20,25 ± 1,39 mg RE/g 22 Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (2), 2018 EMC70 có hàm lượng polyphenol cao với mẫu khảo sát (90,94 ± 2,12 mg (120,77 ± 0,54 mg GAE/g), tương tự RE/g) hàm lượng flavonoid đạt cao so Bảng Hệ số tương quan Pearson Hàm lượng polyphenol tổng số Hàm lượng flavonoid tổng số IC50 DPPH -0,45667 -0,78111 Dựa vào kết định lượng polyphenol -0,45667 (p>0,05) chứng tỏ hàm lượng flavonoid kết chống oxy hóa flavonoid tăng số lượng gốc tự thấy chúng có liên hệ với DPPH giảm chứng tỏ khả chống Giá trị IC50 loại gốc tự DPPH oxy hóa cao cao chiết có tương quan ngược với kết Hoạt tính kháng khuẩn quét gốc tự DPPH với hệ số pearson Bảng Hoạt tính kháng khuẩn từ Muntingia Calabura Chủng vi sinh vật EMC70 (mg/ml) 100 Hoạt tính kháng khuẩn EMC90 AMC Ciprofloxacin (µg/ml) (mg/ml) (mg/ml) 50 25 100 50 25 100 50 25 125 63 32 Escherichia ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ coli E Coli-ETEC ++ + ‒ + + + ‒ ‒ ‒ +++++ +++++ +++++ L ++ + + +++ ++ + +++ ++ + +++++ ++++ ‒ monocytogenes S typhi ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ +++++ ++++ ‒ S aureus +++ ++ + ++ + ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ Shi flexneri ++ + ‒ +++ ++ + ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ Shi boydii ++ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ Ghi chú: IZ = vùng ức chế (mm) ‒ khơng có + IZ≤9,0 mm ++ 9,0 mm