KHẢO sát nấm mốc TRONG mốc TƯƠNG và TƯƠNG NAM đàn THÀNH PHẨM lê văn điệp

3.2. Bảo quản chủng vi sinh vật Thông qua công đoạn phân lập, thuần khiết ta thu được các nhóm vi sinh vật đã thuần khiết. Để thuận tiện cho việc định tên các loài và sản xuất thực nghiệm, vi sinh vật đã thuần khiết được bảo quản. Đối với nấm mốc, sử dụng phương pháp nuôi cấy ba chấm trên môi trường PDA và Czapeck, sau 1 ngày bắt đầu tiến hành quan sát cho tới lúc trên đĩa peptri xuất hiện sợi nấm phát triển lan rộng ra, dùng que cấy vô trùng chọn lấy sợi nấm và cấy vào ống nghiệm chứa môi trường PDA, Czapeck, và nuôi ở nhiệt độ 28 0 C trong vòng 3-4 ngày hình thành các bào tử. Tiến hành bao gói và bảo quản trong tủ lạnh ở 4 0 C. Mỗi chủng vi sinh vật bảo quản trong 3 ống nghiệm (Zhao Mou Ming, 2001; Wei Jing Zhao , 1979) . 3.3. Định tên Nấm mốc 3.3.1. Phương pháp sử dụng a) Nuôi cấy theo phương pháp ba chấm Từ các nhóm nấm mốc đã được thuần hoá, tiến hành lựa chọn các đơn bào hoặc đơn khuẩn, nuôi cấy theo phương pháp ba chấm trên môi trường PDA và Czapeck, trong tủ nuôi cấy sinh hoá ở nhiệt độ 28 0 C. Rồi tiến hành quan sát và ghi chép những thay đổi hình thái (màu sắc, kích thước), đặc điểm sinh trưởng (Zhao Mou Ming, 2001; Wei Jing Zhao , 1979) . b) Nuôi cấy trên tấm lam Đối với nhóm nhân thực sản sinh ra các bào tử có kích thước nhỏ bé và dễ bị làm hỏng cấu trúc tự nhiên của nó khi dùng kính hiển vi quan sát, do đó để quan sát đặc điểm hình thái, cấu tạo của nó một cách rõ ràng, nguyên vẹn là điều hết sức khó khăn. Sử dụng phương pháp nuôi cấy trên lam không những khắc phục được các khó khăn trên mà còn có thể quan sát quá trình sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật tại các khoảng thời gian khác nhau (Zhao Mou Ming, 2001; Wei Jing Zhao , 1979) . c) Phương pháp quan sát trực tiếp Quan sát trực tiếp trên kính hiển vi (Z

1 KHẢO SÁT NẤM MỐC TRONG MỐC TƯƠNG VÀ TƯƠNG NAM ĐÀN THÀNH PHẨM Họ tên tác giả: Lê Văn Điệp Địa chỉ: Khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại học Vinh Điện thoại: 0915232859; email: levandiep@vinhuni.edu.vn TÓM TẮT: Tương Nam Đàn là một trong những sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống có từ lâu đời ở Nghệ An. Nó là một loại nước chấm giàu đạm, được sản xuất bởi quá trình lên men tự nhiên từ nguồn nguyên liệu đậu tương, nếp (ngô), muối và nước. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật truyền thống được sử dụng trong phân lập, định tên nấm mốc trong mốc tương và tương thành phẩm. Kết quả cho thấy trong các mẫu mốc tương Nam Đàn phát hiện các chủng nấm mốc gồm: Moniliales, Moniliaceae, Aspergillus Micheli, Aspergillus oryzae; Moniliales, Moniliaceae, Aspergillus Micheli, Aspergillus niger; Mucorales, Mucoraceae, Rhizopus oryza; Moniliales, Moniliaceae, Aspergillus Micheli, Aspergillus candidus;Moniliales, Moniliaceae, Penicillium Link, Penicillium chrysogenum Thom. Đối với tương Nam Đàn thành phẩm không thấy sự xuất hiện của nấm mốc trên tất cả các môi trường nuôi cấy. Từ khóa: Nấm mốc; Mốc tương; Tương Nam Đàn; Thực phẩm lên men. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Tương Nam Đàn là một trong những sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống của Nghệ An, phong phú về thành phần dinh dưỡng, có lịch sử sản xuất lâu đời và được rất nhiều người ưa chuộng. Do đời sống của người dân Việt Nam trong những năm gần đây ngày một tăng, nên yêu cầu về chất lượng dinh dưỡng và vệ sinh an toàn thực phẩm đối với sản phẩm tương Nam Đàn cũng ngày một tăng theo. Để đáp ứng nhu cầu đó của người tiêu dùng thì sản phẩm tương Nam Đàn cần phải có những nghiên cứu cải tiến quy trình kỹ thuật nhằm tăng sản lượng, chất lượng dinh dưỡng và đặc biệt là chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm. Nghiên cứu này là bước đầu tìm hiểu về hệ nấm mốc có trong mốc tương và trong tương thành phẩm. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu: Nấm mốc, mốc tương và tương Nam Đàn thành phẩm 2. Nội dung nghiên cứu: Nuôi cấy, phân lập và định tên nấm mốc có trong mốc tương và tương Nam Đàn thành phẩm. 3. Phương pháp nghiên cứu 3.1. Phân lập và thuần hoá vi sinh vật Từ các hộ sản xuất tương Nam Đàn truyền thống chọn lấy 20 mẫu (10 mẫu mốc và 10 mẫu tương thành phẩm), các mẫu thí nghiệm được lấy ngẫu nhiên từ 10 hộ sản xuất tương. Mẫu sau khi thu về được pha loãng trong điều kiện vô trùng. Nuôi cấy trên môi trường Czapek, PDA, agar-agar sau 5-7 ngày xuất hiện vi sinh vật phát triển. Từ các vi sinh vật đó dựa vào hình thái, màu sắc, đặc điểm sinh trưởng để chọn ra từng nhóm riêng biệt, rồi tiếp tục nuôi cấy theo phương pháp dích dắt trên môi trường PDA và Czapeck sau 3-5 ngày tiến hành thuần hoá và cứ 2 lặp lại từ 2-3 lần, cho tới khi thu được chủng vi sinh vật thuần khiết (Zhao Mou Ming, 2001; Wei Jing Zhao, 1979). 3.2. Bảo quản chủng vi sinh vật Thông qua công đoạn phân lập, thuần khiết ta thu được các nhóm vi sinh vật đã thuần khiết. Để thuận tiện cho việc định tên các loài và sản xuất thực nghiệm, vi sinh vật đã thuần khiết được bảo quản. Đối với nấm mốc, sử dụng phương pháp nuôi cấy ba chấm trên môi trường PDA và Czapeck, sau 1 ngày bắt đầu tiến hành quan sát cho tới lúc trên đĩa peptri xuất hiện sợi nấm phát triển lan rộng ra, dùng que cấy vô trùng chọn lấy sợi nấm và cấy vào ống nghiệm chứa môi trường PDA, Czapeck, và nuôi ở nhiệt độ 28 0 C trong vòng 3-4 ngày hình thành các bào tử. Tiến hành bao gói và bảo quản trong tủ lạnh ở 4 0 C. Mỗi chủng vi sinh vật bảo quản trong 3 ống nghiệm (Zhao Mou Ming, 2001; Wei Jing Zhao, 1979). 3.3. Định tên Nấm mốc 3.3.1. Phương pháp sử dụng a) Nuôi cấy theo phương pháp ba chấm Từ các nhóm nấm mốc đã được thuần hoá, tiến hành lựa chọn các đơn bào hoặc đơn khuẩn, nuôi cấy theo phương pháp ba chấm trên môi trường PDA và Czapeck, trong tủ nuôi cấy sinh hoá ở nhiệt độ 28 0 C. Rồi tiến hành quan sát và ghi chép những thay đổi hình thái (màu sắc, kích thước), đặc điểm sinh trưởng (Zhao Mou Ming, 2001; Wei Jing Zhao, 1979). b) Nuôi cấy trên tấm lam Đối với nhóm nhân thực sản sinh ra các bào tử có kích thước nhỏ bé và dễ bị làm hỏng cấu trúc tự nhiên của nó khi dùng kính hiển vi quan sát, do đó để quan sát đặc điểm hình thái, cấu tạo của nó một cách rõ ràng, nguyên vẹn là điều hết sức khó khăn. Sử dụng phương pháp nuôi cấy trên lam không những khắc phục được các khó khăn trên mà còn có thể quan sát quá trình sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật tại các khoảng thời gian khác nhau (Zhao Mou Ming, 2001; Wei Jing Zhao, 1979). c) Phương pháp quan sát trực tiếp Quan sát trực tiếp trên kính hiển vi (Zhao Mou Ming, 2001; Wei Jing Zhao, 1979). 3.3.2. Cở sở định tên a) Đặc trưng nuôi cấy: đặc trưng sinh trưởng, sinh dưỡng (Zhao Mou Ming, 2001; Brian J.B. Wood, 2001; Wei Jing Zhao, 1979). b) Đặc trưng hình thái: kích thước khuẩn, cấu trúc, (Zhao Mou Ming, 2001; Brian J.B. Wood, 2001; Wei Jing Zhao, 1979). 4. Hóa chất dùng cho nghiên cứu 4.1. Hoá chất dùng cho nghiên cứu +) Môi trường nuôi cấy agar-agar: Pepton: 10g, cao thịt bò: 3g, NaCl: 5g, agar-agar: 15÷20g, nước cất: 1000ml, pH: 7,2÷7,4. Trộn đều hỗn hợp trên, gia nhiệt hoà tan. Tiệt trùng trong thiết bị cao áp ở 121 0 C thời gian 30 phút. +) Môi trường nuôi cấy PDA: Khoai tây bóc vỏ 200g; đường glucose 20g; agar-agar 15÷20g; nước cất 1000ml; pH đạt được của môi trường. 3 Khoai tây gọt vỏ, cắt nhỏ, cho vào 1000ml nước cất, đun sôi 30 phút, lọc qua vải màn, bổ sung nước cất đến 1000ml, cho vào glucose và agar, đun sôi, rót vào bình, tiệt trùng 121 0 C, thời gian 30 phút. +) Môi trường nuôi cấy Czapek: NaNO 3 3g, K 2 HP0 4 1g, KCl 0,5g, MgSO 4 .7H 2 O 0,5g, FeS0 4 .7H 2 0 0,01g, saccharose 30g, agar 20g, thêm nước cất đến 1000ml, pH đạt được của môi trường, 121 0 C tiệt trùng 30 phút. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Phân lập và định tên nấm mốc có trong mốc tương Nam Đàn truyền thống Từ các mẫu mốc tương Nam Đàn sản xuất theo phương pháp truyền thống chúng tôi đã phân lập được 5 nhóm nấm mốc có đặc điểm hình thái như sau: Nhóm số 1: Tế bào sinh trưởng nhanh, có dạng hình tròn, đường kính 10 ngày đạt 4÷6cm, kết cấu tơi xốp và mềm mại, giai đoạn đầu có màu trắng, tiếp tục biến đổi sang màu vàng nâu đến màu vàng hoa cau, mặt trái không màu. Sợi nấm có vách ngăn, bào tử nang có hình bầu dục hoặc hình chai. Phân sinh bào tử lúc non dạng hình elip, về sau phần lớn chuyển thành hình cầu hoặc gần giống với hình cầu. A 1 B 1 C 1 Hình 1. Đặc điểm hình thái của Aspergillus oryzae Ghi chú: A 1 : Ảnh chụp mặt trước trên môi trường PDA B 1 : Ảnh chụp mặt sau trên môi trường PDA C 1 : Cọng bào tử và túi bào tử D 1 : Sợi nấm có vách ngăn D 1 Aspergillus oryzae có khả năng sản sinh lượng lớn protease và ngày nay chúng được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất protease. Aspergillus oryzae được tìm thấy trong hầu hết các sản phẩm thực phẩm lên men dạng rắn hoặc bán rắn (P. Rama Devi et al., 2011; Dung N T P et al., 2007; Han BZ et al., 2001). Nhóm số 2: Sinh trưởng theo vùng giới hạn, hình tròn, 10÷14 ngày nuôi cấy đường kính đạt 4-7cm, sợi nấm ban đầu có màu trắng, sau chuyển thành màu đen, phản diện trung tâm có màu vàng nâu. Đỉnh phân sinh bào tử lúc còn non có dạng hình cầu, dần dần chuyển thành dạng tia, nâu đen, sợi nấm có vách ngăn. 4 A 2 B 2 C 2 D 2 Hình 2. Đặc điểm hình thái của Aspergillus niger Ghi chú: A 2 : Ảnh chụp mặt trước trên môi trường PDA; B 2 : Ảnh chụp mặt sau trên môi trường PDA C 2 : Sợi nấm có vách ngăn; D 2 : Cọng bào tử và túi bào tử Theo kinh nghiệm sản xuất của người dân khi làm mốc thấy sự có mặt của mốc đen nhiều thì thường làm cho tương thành phẩm có mùi chua. Năm 1917 nhà khoa học James Currie phát hiện ra khả năng sản sinh Aspergillus niger và ngày nay nó được sử dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất axit citric. Nhóm số 3: Nấm dạng sợi mỏng và mềm mại, ban đầu có màu trắng, 3÷4 ngày sau chuyển thành màu tro đến màu đen nâu. Giai đoạn đầu sinh trưởng sợi nấm bò lan ra xung quanh, không màu. Rễ giả phát triển, màu nâu. Nuôi cấy 1 ngày sau sợi nấm khí sinh xuất hiện, 24÷48 giờ có thể phát triển tràn đĩa peptri. Cuống bào tử thẳng hoặc hơi cong, thông thường từ 2÷4 nhánh, ít có loại đơn nhánh hoặc 5 nhánh, bào tử nang phồng to, nang bên trong sinh bào tử, bào tử có dạng hình cầu, cuống bào tử có màu nâu hoặc không màu. Bào tử hình cầu, màu nâu tro. A 3 B 3 C 3 D 3 Hình 3. Đặc điểm hình thái của Rhizopus oryzae Ghi chú: A 3 : Ảnh chụp mặt trước trên môi trường PDA B 3 : Cọng bào tử và túi bào tử C 3 : Thân giả D 3 : Sợi nấm không có vách ngăn E 3 E 3 : Khuẩn căn 5 Rhizopus oryzae với khả năng sản sinh protease hoạt lực cao, nên được sử dụng nhiều trong lên men các sản phẩm thực phẩm truyền thống từ đậu nành như Tempeh của Indonesia (Hachmeister K. A., Fung, D.Y.C., 1993). Nhóm số 4: Sinh trưởng theo vùng giới hạn, 10÷14 ngày đường kính khuẩn lạc đạt 3÷4cm. Màu trắng và có màu vàng kem, phản diện có màu vàng nhạt. Đầu phân sinh bào tử lúc còn non dạng hình cầu, già thì phân thành các đoạn hình chùy mềm mại. Phân sinh bào tử dài ngắn không đồng đều, có vách ngăn, đỉnh đầu dạng hình cầu hoặc gần giống hình cầu. A 4 B 4 C 4 D 4 Hình 4. Đặc điểm hình thái của Aspergillus candidus Ghi chú: A 4 : Ảnh chụp mặt trước trên môi trường PDA; B 4 : Ảnh chụp mặt sau trên môi trường PDA C 4 : Cuống bào tử và bào tử; D 4 : Sợi nấm có vách ngăn Trong một số sản phẩm thực phẩm truyền thống sự có mặt của của Aspergillus candidus thường làm cho sản phẩm có mùi mốc (Wan Ping, 2004; Brain J.B. Wood, 2001). Nhóm số 5: Sinh trưởng theo giới hạn, 10÷14 ngày có đường kính đạt 3,45÷4,5cm, có các đường dạng tia, với màu trắng xung quanh, bào tử rất nhiều, màu xanh, về sau chuyển thành màu đỏ tía nhạt. Phần lớn xuất hiện dịch nhiều, ở dạng giọt có màu vàng nhạt cho đến màu vàng chanh. Phản diện có màu vàng sáng hoặc vàng hơi sẫm, phân sinh bào tử cuống mềm mại, chia làm 2÷3 nhánh, phân sinh bào tử có dạng elip, rất ít có dạng gần giống hình cầu. Các nhánh phụ có độ dài ngắn không đồng nhất, sợi nấm dinh dưỡng không màu. A 5 B 5 C 5 Hình 5. Đặc điểm hình thái của Penicillium chrysogenum Ghi chú: A 5 : Ảnh chụp mặt trước trên môi trường PDA B 5 : Ảnh chụp mặt sau trên môi trường PDA 6 D 5 C 5 : Sợ nấm dinh dưỡng; D 5 : Cọng phân sinh bào tử và bào tử Penicillium chrysogenum thường sản sinh ra chất kháng sinh Penicillium, chất này sẽ ức chế sự sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm mốc khác (Wan Ping, 2004; Brain J.B. Wood, 2001). Đây là kết quả bước đầu nghiên cứu hệ nấm mốc trong mốc tương Nam Đàn, để có những đánh giá chính xác hơn về vai trò của chúng trong quá trình sản xuất tương cần có những nghiên cứu tiếp theo xác định hệ vi sinh vật như sử dụng phương pháp sinh học phân tử trong định tên vi sinh vật kết hợp với phân tích sản phẩm trao đổi chất của chúng trong quá trình sản xuất. 2. Phân lập và định tên nấm mốc trong tương Nam Đàn thành phẩm Từ 10 mẫu tương thành phẩm thu được ở các hộ sản xuất sản phẩm tương Nam Đàn truyền thống, chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên môi trường agar-agar, môi trường PDA, môi trường Czapek trong buồng nuôi cấy sinh hoá ở nhiệt độ 28 0 C, độ ẩm 85÷90% (Lê Văn Nhương, Quan Văn Thịnh, 1998; Zhao Mou Ming, 2001; Wei Jing Zhao, 1979). Sau 5÷7 ngày nuôi cấy không thấy xuất hiện nấm mốc sinh trưởng trên cả 3 môi trường nuôi cấy trên. Điều đó có thể do nồng độ muối cao trong tương thành phẩm đã có tác dụng ức chế và tiêu diệt nấm mốc. KẾT LUẬN - Trong các mẫu mốc tương Nam Đàn dùng để sản xuất tương theo phương pháp truyền thống của 10 hộ ở Nam Đàn có chứa các chủng nấm mốc sau: Chủng số 1: Moniliales, Moniliaceae, Aspergillus Micheli, Aspergillus oryzae; Chủng số 2: Moniliales, Moniliaceae, Aspergillus Micheli, Aspergillus niger; Chủng số 3: Mucorales, Mucoraceae, Rhizopus oryzae; Chủng số 4: Moniliales, Moniliaceae, Aspergillus Micheli, Aspergillus candidus; Chủng số 5: Moniliales, Moniliaceae, Penicillium Link, Penicillium chrysogenum Thom. - Trong các mẫu tương Nam Đàn thành phẩm sản xuất theo phương pháp truyền thống không phát hiện thấy nấm mốc sinh trưởng trên môi trường agar-agar, PDA và Czapeck. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Lê Văn Nhương, Quan Văn Thịnh. Công nghệ sản xuất tương và nước chấm. NXB Khoa học, 1998. [2] Brian J.B. Wood. Vi sinh vật lên men thực phẩm. Bắc Kinh, 2001. [3] Dung N T P, Rombouts F M & Nout, M J R (2007). Characteristics of some traditional Vietnamese starch-based rice wine fermentation starters (men). JFood Sci Technol, 40(1): 130-135. [4] Hachmeister, K.A., Fung, D.Y.C., (1993). Tempeh: a mold-modi®ed indigenous fermented food made from soyabean and/or cereal grains. Crit Rev Microbiol,19. [5] Han B Z, Rombouts F M & Nout M J R (2001).A Chinese fermented soybean food.Int J Food Microbiol, 65(1-2): 1-10. [6] P. Rama Devi, P. Vijaya Raghavan, I. Vasudheven , Lizy Joshua, and M. VijayaKumar (2011). Purification and Characterization of Protease from Rhizopus oligosporus. Int J Biotech, 2(2):46-49. [7] Zhao Mou Ming. Nước chấm. NXB Hoá học công nghiệp Trung Quốc, 2001. [8] Wan Ping. Kỹ thuật thực hành vi sinh vật thực phẩm. NXB Khoa học Bắc Kinh, 2004. [9] Wei Jing Zhao.Định tên vi sinh vật nhân thực. NXB Khoa học kỹthuật Thượng Hải, 1979. 7 THE PRIMARY RESEARCH ON MOLDS IN NAM DAN SOY-SAUCE Le Van Diep Faculty of Agriculture Forestry Fishery, Vinh University Cell phone: 0915232859; email:levandiep@vinhuni.edu.vn SUMMARY: Nam Dan soy-sauce is one of the famous traditional fermented foods in Nghe An province, Vietnam. It is produced by natural fermentation of soybean, glutinous rice (maize), salt and water with abundant nutrition and particular taste. To investigated the microbial population in soy-sauce fermented starter (Moc tuong) and in the end product of Nam Dan soy-sauce, samples obtained from Nam Dan district were cultivated on PDA, Agar-agar and Czapeck mediums. The results showed that the presence of visible molds in soy-sauce fermented starter include: Moniliales, Moniliaceae, Aspergillus Micheli, Aspergillus oryzae; Moniliales, Moniliaceae, Aspergillus Micheli, Aspergillus niger;Mucorales, Mucoraceae, Rhizopus oryzae; Moniliales, Moniliaceae, Aspergillus Micheli, Aspergillus candidus;Moniliales, Moniliaceae, Penicillium Link, Penicillium chrysogenum Thom. And the end product of soy- sauce had no appeared any kind of mould on the mediums. Key words: NamDan soy-sauce; Moulds; Fermented starter; Fermented food . 1 KHẢO SÁT NẤM MỐC TRONG MỐC TƯƠNG VÀ TƯƠNG NAM ĐÀN THÀNH PHẨM Họ tên tác giả: Lê Văn Điệp Địa chỉ: Khoa Nông Lâm Ngư, trường. phân lập, định tên nấm mốc trong mốc tương và tương thành phẩm. Kết quả cho thấy trong các mẫu mốc tương Nam Đàn phát hiện các chủng nấm mốc gồm: Moniliales,