PHÂN TÍCH IN SILICO HỌ GEN KNOX Ở CÂY ĐẬU COVE (Phaseolus vulgaris L

PHÂN TÍCH IN SILICO HỌ GEN KNOX Ở CÂY ĐẬU COVE (Phaseolus vulgaris L 90 Cao Phi Bằng, Nguyễn Văn Đính, Trương Trọng Kiên ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG, GIẢI PHẪU VÀ THOÁT HƠI NƯỚC CỦA CÂY PHONG LAN PHI ĐIỆP TÍ[.]

Cao Phi Bằng, Nguyễn Văn Đính, Trương Trọng Kiên 90 ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG, GIẢI PHẪU VÀ THOÁT HƠI NƯỚC CỦA CÂY PHONG LAN PHI ĐIỆP TÍM (Dendrobium anosmum Lindl.) IN VITRO TRONG QUÁ TRÌNH LUYỆN EX VITRO GROWTH, ANATOMY AND TRANSPIRATION CHARACTERISTICS OF MICROPROPAGATED Dendrobium anosmum Lindl DURING EX VITRO ACCLIMATIZATION PROCESS Cao Phi Bằng1, Nguyễn Văn Đính2, Trương Trọng Kiên2,3 Trường Đại học Hùng Vương; phibang.cao@hvu.edu.vn Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Sở Giáo dục Đào tạo Vĩnh Phúc Tóm tắt - Q trình luyện ex vitro có vai trị quan trọng, giúp in vitro thích nghi với điều kiện sống thay đổi Nghiên cứu có mục tiêu phân tích đặc điểm sinh trưởng, giải phẫu nước phong lan Phi điệp tím trình luyện ex vitro Kết nghiên cứu cho thấy rằng, thời điểm sau trình luyện ex vitro, có tăng lên số lượng lá, số lượng rễ kích thước quan lá, thân rễ so với thời điểm D0 Phân tích giải phẫu cho thấy rằng, rễ ex vitro có lớp vỏ lụa, ngoại bì, nội bì trụ dẫn phát triển so với rễ in vitro Lá in vitro có cường độ thoát nước cao ex vitro Tuy nhiên, khả giữ nước mô ex vitro cao so với in vitro Abstract - The ex vitro acclimatization process has a major role This process helps in vitro plantlets to adapt to the environmental changes This work aims to assess the growth, anatomy and transpiration characteristics of Dendrobium anosmum Lindl plantlets during ex vitro acclimatization process The results show the increase in leaf and root numbers as well as in the size of leaf, stem and root at late point of ex vitro acclimatization process compared to initial point (D0) Anatomical analysis show that root of ex vitro plantlets develops the velamen, exodermis, endodermis layers and vascular cylinder more than root of in vitro plantlets The in vitro leaf transpiration is more intensive than the ex vitro leaf However, ex vitro plantlets have higher leaf water retention than in vitro ones Từ khóa - giải phẫu;; khả giữ nước; luyện ex vitro; phong lan Phi điệp tím; sinh trưởng; nước Key words - anatomy; growth, Dendrobium anosmum Lindl., ex vitro acclimatization; leaf water retention; transpiration; Đặt vấn đề Phong lan Phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) thuộc chi Hồng thảo (Dendrobium), họ phong lan (Orchidaceae) Phi điệp tím có hoa đẹp, thích hợp trang trí, làm cảnh, nên nhiều người ưa chuộng Để đáp ứng nhu cầu ngày cao người với loài phong lan này, việc nhân giống phong lan Phi điệp tím công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật thực [5] Cây có nguồn gốc in vitro cần phải trải qua giai đoạn luyện ex vitro thích nghi với mơi trường tự nhiên Trong q trình luyện ex vitro, phải thích nghi với thay đổi môi trường sống từ nhân tạo đến tự nhiên thời gian ngắn Nhiều biến đổi sinh lý, hóa sinh in vitro giai đoạn luyện ex vitro đáng ý quan sát [12,15] Chẳng hạn, hàm lượng sắc tố quang hợp (diệp lục, carotenoid) thay đổi in vitro ex vitro thuốc [12], hay Tam (Cardiospermum halicacabum) [11], riềng (Alpinia sp.) [9] lan Đai châu (Rhynchostylis gigantea) [1] Bên cạnh đó, huỳnh quang chlorophyll ex vitro tăng nhẹ so với in vitro [1, 9] Động thái hoạt độ enzyme chống oxy hóa quan tâm nghiên cứu nhiều trình luyện ex vitro peroxidase, superoxide dismutase, catalase… Các enzyme liên quan đến loại bỏ gốc oxy hóa tự H2O2 hình thành mơ thực vật nên chúng giữ vai trò bảo vệ quan trọng, chống lại stress bất lợi môi trường [11] Ở Tam phỏng, hoạt tính superoxide dismutase tăng mạnh bảy ngày đầu, sau giảm dần cuối trình, đó, hoạt tính catalase ascorbate peroxidase tăng dần [11] Ở Cúc đồng tiền (Gerbera jamesonii H Bolus ex Hook), hoạt độ bốn enzyme superoxide dismutase, ascorbate peroxidase, catalase superoxide dismutase mô nhỏ luyện ex vitro so với in vitro [2] Ở phong lan Đai châu, hoạt độ catalase tăng lên thời kì đầu luyện so với in vitro [1] Bên cạnh đó, trao đổi nước q trình luyện ex vitro quan tâm nghiên cứu Ở thuốc hay dâu đen, in vitro có cường độ thoát nước cao nước nhiều so với ex vitro [6,8] Cơ sở khác biệt cường độ thoát nước phần khác mật độ, kích thước khí khổng in vitro ex vitro Trong đó, in vitro thường có nhiều khí khổng hơn, kích thước khí khổng lớn mật độ khí khổng cao [6] Ngồi ra, số đặc điểm hình thái quan giải phẫu chúng có khác biệt in vitro ex vitro [3,7,13] Những biến đổi trình luyện thú vị phát cho thấy in vitro đối tượng nghiên cứu tốt Tuy nhiên, nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng, giải phẫu thoát nước cịn ý nghiên cứu trước chưa thực phong lan Phi điệp tím Nghiên cứu có mục tiêu xác định biến đổi hàm lượng nước chất khô, hàm lượng sắc tố quang hợp, huỳnh quang chlorophyll hoạt độ enzyme chống oxy hóa tương đối phức tạp q trình luyện ex vitro Những kết nghiên cứu động thái sinh lí, hóa sinh có ý nghĩa cung cấp thơng tin khoa học bổ ích, sở góp ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 5(114).2017-Quyển 91 phần xây dựng biện pháp kĩ thuật để luyện cách có hiệu Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu Cây phong lan Phi điệp tím in vitro có nguồn gốc từ hạt ni cấy mơi trường Knudson có bổ sung 30 g/l đường sucrose, 100mg/l nước dừa, 100g/l khoai tây, 1g/l than hoạt tính, g/l agar (hãng sản xuất Qualigens, Mumbai, India) 0,3 mg/l NAA (Merck, Đức) 2.2 Phương pháp nghiên cứu Bố trí thí nghiệm: Các bình đặt phịng ni với điều kiện nhiệt độ 25°C+2°C thời gian chiếu sáng 12h/ngày với đèn neon (hãng Rạng Đông, Việt Nam), cường độ ánh sáng khoảng 2.000 lux Sau tuần nuôi cấy, mơi trường tạo rễ, in vitro có 3-4 rễ sử dụng cho trình luyện ex vitro Bình chứa in vitro đặt cạnh cửa sổ, tiếp xúc với ánh sáng tự nhiên (cường độ ánh sáng dao động khoảng 350-900 lux) ngày, in vitro rửa agar ngâm phút dung dịch KMnO4 0,1%, đặt bề mặt giá có khay chứa nước phía thời gian ngày, phun sương lần/ngày, sau trồng chậu nhựa có giá thể hỗn hợp rêu khô:dớn (tỉ lệ 1:1), đặt nhà lưới Trung tâm Nghiên cứu Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Hùng Vương với điều kiện chiếu sáng độ ẩm tự nhiên, phun sương ngày/lần Các mẫu thu vào thời điểm ngày (D0) chuyển tiếp xúc với ánh sáng tự nhiên, ngày thứ chuyển khay (D7), ngày thứ 12 (D12), bắt đầu đặt vào chậu chứa giá thể ngày 28 (D28), 56 (D56) tính từ thời điểm D0 Các tiêu kích thước (chiều dài, chiều rộng), kích thước thân (chiều cao, đường kính) kích thước rễ (chiều dài) xác định cách sử dụng thước Palmer kĩ thuật (Mitutoyo digimatic micrometer, Nhật)[14] Số lượng lá/cây rễ/cây xác định cách đếm Sinh trưởng tương đối lan Phi điệp tím tính cách lấy giá trị sinh trưởng thời điểm nghiên cứu (D28 D56) so với thời điểm ban đầu (D0) [14] Giải phẫu rễ phân tích cách thực lát cắt ngang rễ cây, nhuộm xanh methylen 0,2% thời gian phút, quan sát kính hiển vi quang học (Optika, Italia)[14] Cường độ thoát nước xác định phương pháp cân nhanh [14] Khả giữ nước xác định thông qua lượng nước bị đặt mặt thoáng, cân khối lượng thời điểm khác để xác định lượng nước bị mất, sau sấy khơ cân để xác định khối lượng nước mô [14] tăng trung bình 0,25 lá/cây Số tăng trung bình thời điểm D56 so với D0 0,68 lá/cây Kích thước phong lan Phi điệp tím thay đổi khơng nhiều q trình luyện ex vitro Ở thời điểm D28 D56, chiều dài tăng lên 0,54 mm/lá 1,09 mm/lá so với thời điểm D0 Kết nghiên cứu bàn luận 3.1 Sinh trưởng phong lan Phi điệp tím Sự sinh trưởng phong lan Phi điệp tím đánh giá thơng qua số tiêu liên quan tới phận lá, thân rễ Sinh trưởng tương đối xác định thơng qua số lượng hình thành tăng kích thước thời điểm D28 D56 so với thời điểm D0 trình luyện ex vitro (Hình 1) So với thời điểm D0, đến thời điểm D28, số lượng Hình Sinh trưởng tương đối thân phong lan Phi điệp tím thời kì luyện ex vitro.D = ngày Thanh sai số thể giá trị độ lệch chuẩn Đối với tiêu nghiên cứu, sai số đánh dấu chữ khơng khác có ý nghĩa thống kê (p=0,05) kiểm định với phép kiểm tra Duncan Hình Sinh trưởng tương đối phong lan Phi điệp tím thời kì luyện ex vitro D = ngày (day).Thanh sai số thể giá trị độ lệch chuẩn Đối với tiêu nghiên cứu, sai số đánh dấu chữ khơng khác có ý nghĩa thống kê (p=0,05) kiểm định với phép kiểm tra Duncan Tương tự, tăng chiều rộng phong lan Phi điệp tím 0,13 mm/lá 0,64 mm/lá thời điểm D28 D56 so với thời điểm D0 Như vậy, trình luyện cây, sinh trưởng lan diễn chậm Trong nhiều nghiên cứu trước rằng, thời kì luyện ex vitrolà cần thiết để phát triển đáp ứng chức nhằm thích nghi với điều kiện mơi trường mới, đó, q trình sinh trưởng diễn với tốc độ chậm Ở thuốc lá, thời điểm ngày thứ 80 q trình luyện cây, số lượng khơng thay đổi so với thời điểm in vitro mơi trường dinh dưỡng có chứa đường (nồng độ 3%) Chỉ công thức mà môi trường dinh dưỡng khơng có đường, luyện ex vitro (80 ngày) có số nhiều so với thời điểm in vitro ban đầu [12] Thân cây lan Phi điệp tím có thay đổi kích thước thời điểm D28 D56 trình luyện so với thời điểm ban đầu,mặc dù thay đổi tương đối nhỏ (Hình 2) Chiều cao tăng 0,67 mm 1,06 mm thời điểm D28 D56 so với thời điểm D0 Tương tự, 92 đường kính thân tăng 0,24 mm 0,43 mm thời điểm Tương tự thân, sinh trưởng rễ lan Phi điệp diễn chậm trình luyện Cụ thể, so với thời điểm D0, số lượng rễ thời D28 D56, trung bình có 1,00 1,56 rễ/cây hình thành Chiều dài rễ tăng 0,28 0,49 mm (Hình 3) Đến nay, có nghiên cứu sinh trưởng có nguồn gốc in vitro q trình luyện Có thể thời kì phát triển phản ứng thích nghi nên sinh trưởng nhà khoa học ý, có nghiên cứu thân ex vitro có đường kính lớn thân in vitro[13] Hình Sinh trưởng tương đối rễ phong lan Phi điệp tím thời kì luyện ex vitro D = ngày Thanh sai số thể giá trị độ lệch chuẩn Đối với tiêu nghiên cứu, sai số đánh dấu chữ khơng khác có ý nghĩa thống kê (p=0,05) kiểm định với phép kiểm tra Duncan 3.2 Giải phẫu rễ phong lan phi điệp tím Đặc điểm giải phẫu rễ thời điểm khác q trình luyện có khác khác với thời điểm ban đầu in vitro Khi quan sát lát cắt ngang hoàn chỉnh rễ phong lan Phi điệp tím thời điểm D0, D28 D56, nhận thấy rễ in vitro chưa phát triển lớp vỏ lụa hay mạc (velamen) đặc trưng phong lan Cao Phi Bằng, Nguyễn Văn Đính, Trương Trọng Kiên Trụ dẫn ngày phát triển, bó trụ dẫn phát triển mạnh thời điểm D56 so với thời điểm D0 Như vậy, tổ chức rễ phát triển mạnh thời điểm ex vitro so với thời điểm in vitro Ở số lồi, tượng tương tự quan sát Sự phát triển rễ có vai trị lớn, tăng cường khả hấp thu CO2, dinh dưỡng khoáng dự trữ nước, chống lại điều kiện thiếu nước [13] 3.3 Cường độ thoát nước phong lan Phi điệp tím Sự nước có vai trị quan trọng đời sống thực vật Q trình nước động lực đầu vận chuyển nước, dinh dưỡng khoáng Cường độ nước mơ có ảnh hưởng trực tiếp đến q trình sinh lí, sinh hóa quan trọng q trình quang hợp hơ hấp, đồng thời có vai trị điều tiết nhiệt độ Trong nghiên cứu này, cường độ thoát nước mạnh phong lan Phi điệp tím in vitro Ở thời kì sau, cường độ nước giảm xuống Thực vậy, so với thời điểm D0, cường độ thoát nước thời điểm D7 D56 54,72% 60,80% Cường độ thoát nước giảm thấp hai thời kì D12 D28, giá trị tương đối cường độ thoát nước so với thời kì D0 đạt 38,75% 44,02% Một số nghiên cứu in vitro có cường độ nước qua lớn, độ mở khí khổng cao in vitro có sáp, lớp lơng bề mặt mật độ khí khổng lớn Khi đưa tự nhiên, cường độ nước giảm khí khổng đóng bớt lại, tổ chức sáp lơng bề mặt phát triển hơn, mật độ khí khổng giảm [3, 13] Hình Cường độ nước phong lan Phi điệp tím thời kì luyện ex vitro; D = ngày (day) Thanh sai số thể giá trị độ lệch chuẩn Các sai số đánh dấu chữ không khác có ý nghĩa thống kê (p=0,05) kiểm định với phép kiểm tra Duncan Hình Lát cắt ngang rễ phong lan Phi điệp tím; D = ngày Thanh tỉ lệ = 500 m (hình trên) tỉ lệ = 50 m (hình dưới), ve = vỏ lụa (căn mạc, velamen), ex = ngoại bì (exoderrmis), co = cortex, en = nội bì (endodermis), vc = trụ dẫn (vascular cylinder) Lớp vỏ lụa phát triển ngày mạnh rễ ex vitro, thời điểm D28 D56 trình luyện Đặc điểm giải phẫu đáng ý lớp mạc vốn biết có nhiều vai trị đời sống phong lan, đặc biệt vai trò bảo vệ chúng [4] Lớp ngoại bì gồm tế bào có kích thước bé, thành tế bào mỏng thời điểm D0 có kích thước lớn hơn, thành tế bào dày thời điểm D28 D56 Lớp nội bì với mức độ cellulose hóa thấp rễ D0 cellulose hóa mạnh dần thời điểm D28 đặc biệt D56 3.4 Khả giữ nước mô phong lan Phi điệp tím Khả giữ nước mơ giúp thực vật chống lại điều kiện thiếu nước Đại lượng đặc trưng cho khả chống lại nước nguyên sinh chất, có liên quan đến mức độ chịu nước Lượng nước đơn vị thời gian từ khối lượng mẫu tươi cao khả giữ nước thấp, tính chống chịu với mơi trường bất lợi ngược lại, mô nước chậm khả giữ nước cao, tính chống chịu với môi trường bất lợi tốt [8] Khả giữ nước mơ phân tích thời gian 20 phút, 40 phút, 60 phút 80 phút sau cắt ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 5(114).2017-Quyển khỏi Ở tất thời gian nghiên cứu, in vitro nhiều nước so với giai đoạn lại Cụ thể, sau 20 phút cắt rời đặt mặt thoáng, in vitro (D0) 1,95% tổng lượng nước, lượng nước bị thời điểm D7 D56 1,38% 1,48% tổng lượng nước Lá thời điểm D12 D28 nước nhất, 0,79% 0,87% tổng lượng nước Hình Khả giữ nước phong lan Phi điệp tím thời kì luyện ex vitro;D = ngày (day).Thanh sai số thể giá trị độ lệch chuẩn Ở thời gian nghiên cứu, sai số đánh dấu chữ không khác có ý nghĩa thống kê (p=0,05) kiểm định với phép kiểm tra Duncan Tuy nhiên, sau 40 phút 60 phút đặt bề mặt thoáng, lượng nước thời điểm D7 D56 tương đương với thời điểm D0, có thời điểm D12 D28 nước so với thời điểm D0 Sau 80 phút đặt bề mặt thoáng, lượng nước thời điểm khác khác cao thời điểm D0 thấp thời điểm D12 Như vậy, thời điểm D12 có khả giữ nước tốt thời điểm D0 có khả giữ nước Kết nghiên cứu khả giữ nước phù hợp với kết nghiên cứu cường độ thoát nước Kết phù hợp với số ngiên cứu loài thực vật khác Hàm lượng nước tương đối in vitro cao so với luyện ex vitro[6] Đồng thời, lượng nước in vitro cao so với ex vitro[8] Kết luận Đặc điểm sinh trưởng, giải phẫu rễ thoát nước phong lan Phi điệp tím q trình luyện ex vitro phân tích nghiên cứu Trong trình luyện cây, sinh trưởng lá, thân rễ phong lan Phi điệp tím ghi nhận, có tăng số lượng rễ, kích thước ba quan thời điểm luyện cuối so với thời điểm ban đầu Đặc điểm giải phẫu rễ có thay đổi thời điểm D28 D56 so với thời điểm D0, đáng ý phát triển lớp vỏ lụa, ngoại bì, nội bì trụ dẫn Cường độ thoát nước giảm thời điểm khác trình luyện ex vitro so với in vitro Ngược lại, in vitro có khả giữ nước so với ex vitro 93 Lời cảm ơn Cơng trình hồn thành với hỗ trợ kinh phí từ chương trình nghiên cứu khoa học Trường Đại học Hùng Vương TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Cao Phi Bằng, Trần Thị Thanh Huyền, Tống Thị Thu Phương, 2016,Biến động hàm lượng sắc tố quang hợp, huỳnh quang chlorophyll hoạt độ catalase phong lan đai châu (Rhynchostylis gigantea) thời kì luyện ex vitro, Hội nghị Khoa học Quốc gia lần thứ Nghiên cứu Giảng dạy Sinh học Việt Nam, Đà Nẵng, Việt Nam, 75-82 [2] Chakrabarty, D., & Datta, S K.,"Micropropagation of gerbera: lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities during acclimatization process",Acta Physiologiae Plantarum, 30(3), 325331, 2008 [3] Darwesh, & Rasmia, S S.,"Morphology, physiology and anatomy in vitro affected acclimatization ex vitro date palm plantlets: A Review",International Journal of Chemical, Environmental & Biological Sciences, 3(2), 183-190, 2015 [4] de Cỏssia Andreota, R., de Barros, F., & das Graỗas Sajo, M., "Root and leaf anatomy of some terrestrial representatives of the Cranichideae tribe (Orchidaceae)",Brazilian Journal of Botany, 38(2), 367-378, 2015 [5] Dewi, P Y A., Kriswiyanti, E., Astarini, I A.,"Embryo rescue Dendrobium anosmum Lindl using in vitro culture", Metamorfosa, 3(2), 129-139, 2016 [6] Díaz-Pérez, J C., Sutter, E G., Shackel, K A.,"Acclimatization and subsequent gas exchange, water relations, survival and growth of microcultured apple plantlets after transplanting them in soil",Physiologia Plantarum, 95(2), 225-232, 1995 doi:10.1111/j.1399-3054.1995.tb00831.x [7] Ďurkovič, J., Mišalová, A.,"Wood formation during ex vitro acclimatisation in micropropagated true service tree (Sorbus domestica L.)",Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 96(3), 343-348, 2009 doi:10.1007/s11240-008-9492-8 [8] Ďurkovič, J., Čaňová, I., Pichler, V., "Water loss and chlorophyll fluorescence during ex vitro acclimatization in micropropagated black mulberry (Morus nigra L.)", Propag Ornam Plants, 9, 107-112, 2009 [9] Vũ Xuân Dương, Cao Phi Bằng, 2016,Biến đổi sinh lý, hóa sinh riềng địa Bắc Kạn (Alpinia sp.) in vitro thời kì ex vitro, Hội nghị Khoa học Quốc gia lần thứ Nghiên cứu Giảng dạy Sinh học Việt Nam, Đà Nẵng, Việt Nam [10] Faisal, M., Anis, M.,"Effect of light irradiations on photosynthetic machinery and antioxidative enzymes during ex vitro acclimatization of Tylophora indica plantlets",Journal of Plant Interactions, 5(1), 21-27, 2010 [11] Jahan, A A., Anis, M.,"Changes in Antioxidative Enzymatic Responses during Acclimatization of In vitro Raised Plantlets of Cardiospermum halicacabum L against Oxidative Stress",J Plant Physiol Pathol 2, 4, 2, 2014 [12] Kadleček, P., Tichá, I., Haisel, D., Čapková, V., & Schäfer, C.,"Importance of in vitro pretreatment for ex vitro acclimatization and growth",Plant Science, 161(4), 695-701, 2001 doi:http://dx.doi.org/10.1016/S0168-9452(01)00456-3 [13] Kumar, K., & Rao, I U.,"Morphophysiologicals problems in acclimatization of micropropagated plants in–Ex vitro conditions-A Review",J Ornam Hortic Plants, 2(4), 271-283, 2012 [14] Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ông Xuân Phong, Phương pháp nghiên cứu Sinh lý học thực vật, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, 2013 [15] Pospíšilová, J., Synková, H., Haisel, D., Semoradova, S., "Acclimation of Plantlets to Ex vitro Conditions: Effects of Air Humidity, Irradiance, CO2 Concentration and Abscisic Acid (A Review),Acta Horticulturae, 748, 29, 2007 (BBT nhận bài: 14/10/2016, hoàn tất thủ tục phản biện: 07/04/2017) ... Ďurkovič, J., Čaňová, I., Pichler, V., "Water loss and chlorophyll fluorescence during ex vitro acclimatization in micropropagated black mulberry (Morus nigra L. )", Propag Ornam Plants, 9, 107-112, 2009... microcultured apple plantlets after transplanting them in soil",Physiologia Plantarum, 95(2), 225-232, 1995 doi:10.1111/j.1399-3054.1995.tb00831.x [7] Ďurkovič, J., Mišalová, A.,"Wood formation during... M.,"Changes in Antioxidative Enzymatic Responses during Acclimatization of In vitro Raised Plantlets of Cardiospermum halicacabum L against Oxidative Stress",J Plant Physiol Pathol 2, 4, 2, 2014