Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, Tập 33, Số (2017) 1-8 Phân tích in Silico họ gen Glutamate dehydrogenase đậu tương (Glycine max L.) Cao Phi Bằng* Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Hùng Vương, Phú Thọ, Việt Nam Nhận ngày 30 tháng năm 2015 Chỉnh sửa ngày 16 tháng năm 2015; Chấp nhận đăng ngày 28 tháng năm 2017 Tóm tắt: Glutamate dehydrogenase (GDH, EC 1.4.1.2~4) enzyme xúc tác phản ứng thuận nghịch khử amin hóa glutamate tới -ketoglutarate 2-oxoglutarate Chúng tơi xác định mười gen mã hóa GDH hệ gen đậu tương Các protein GDH suy diễn có kích thước 637 411 amino acid, ngoại trừ GmGDH06 Phân tích phả hệ xây dựng từ GHD đậu tương khác cho thấy GDH đậu tương xếp vào hai nhóm, hai gen nhóm I tám gen nhóm II Các protein nhóm II có motif bảo thủ tín hiệu khu trú ti thể, motif bảo thủ gắn chất đặc hiệu -ketoglutarate vùng gắn đặc hiệu coenzyme NADH Các protein nhóm I có vùng gắn chất đặc hiệu có vùng gắn coenzyme NADPH Sự biểu gen GDH đậu tương khác mô khác Bốn gen GmGDH03, GmGDH04, GmGDH05và GmGDH07 biểu tất mô tất giai đoạn phát triển nghiên cứu Các GmGDH biểu mô sinh sản mạnh mô sinh dưỡng, ngoại trừ GmGDH06, gen biểu đặc hiệu nốt sần Từ khóa: Glutamate dehydrogenase, biểu gen, phả hệ, đặc trưng gen, đậu tương Mở đầu gia Công nghệ sinh học), Shoemaker (Nhóm nghiên cứu trùng ngũ cốc Di truyền nông nghiệp USDA-ARS), Jackson (Khoa Nông học, Đại học Purdue), Schmutz (Trung tâm giải trình tự hệ gen HudsonAlpha), Rokhsar (Viện nghiên cứu hệ gen) Phiên hệ gen đậu tương có kích thước xấp xỉ 975 Mb, gồm có 20 nhiễm sắc thể [3] Glutamate dehydrogenase (GDH, EC 1.4.1.2~4) enzyme xúc tác phản ứng thuận nghịch khử amin hóa glutamate tới ketoglutarate 2-oxoglutarate nhờ sử dụng NADH NADPH coenzyme [4] GDH có khắp sinh vật từ vi khuẩn đến sinh vật nhân chuẩn Ở thực vật, enzyme phong phú có mặt nhiều quan, Đậu tương (Glycine max) trồng quan trọng trồng nhiều nơi giới Hạt đậu tương chứa nhiều protein dầu Đậu tương thực phẩm có lợi cho sức khỏe [1, 2] Một đặc điểm đáng ý lồi cịn có khả cố định nitơ tự khí nhờ hệ vi sinh vật cộng sinh rễ chúng Nhờ giá trị cao, hệ gen đậu tương giải trình tự xong vào năm 2010 tập thể nhà khoa học Mỹ dẫn đầu Stacey (Trung tâm Quốc _ ĐT.: 84-904922412 Email: phibang.cao@hvu.edu.vn https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4503 C.P Bằng / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số (2017) 1-8 định khu ti thể, lục lạp dịch bào [4] Glutamate dehydrogenase tham gia vào q trình đồng hóa NH4+ thực vật với hệ thống GS/GOGAT Enzyme tham gia vào cân glutamate nội mơ, amino acid giữ vai trị trung tâm nhiều trình trao đổi chất [5, 6] Các GDH thường liên quan tới tính chống chịu thực vật thông qua cân N/C thực vật [7] Về cấu trúc, GDH có mang hai vùng bảo thủ đặc trưng vùng gắn Glutamate vùng gắn NAD(P) [8] Nhiều nghiên cứu gần thực vật có hai gen mã hóa cho GDH, mã hóa cho đơn vị mã hóa cho đơn vị , hai đơn vị kết hợp với theo tỉ lệ khác tạo thành dạng isozyme khác [9] Các họ GDH phân tích Arabidopsis [10], lúa [11], cà chua [12] Tuy nhiên, nghiên cứu điều hòa biểu gen GDH chưa nhiều Đến nay, biểu GDH biết có đáp ứng với tác nhân bất lợi vô sinh hạn, mặn, nhiệt độ, kim loại nặng thiếu carbon [5, 13, 14] Rất gần đây, biểu gen GDH trình chín cà chua báo cáo [12, 15] Tuy nhiên chưa có nghiên cứu tồn diện họ gen GDH quy mô hệ gen đậu tương, lồi có khả cố định N2 Trong nghiên cứu này, hướng tới việc xác định gen mã hóa cho GDH hệ gen đậu tương Đồng thời trình bày kết phân tích đặc tính hóa-lí cấu trúc biểu gen thơng qua phân tích kết RNAseq (giải trình tự ARN) Phương pháp nghiên cứu 2.1 Cơ sở liệu trình tự hệ gen RNAseq đậu tương Trình tự hệ gen đậu tương lấy từ Schmutz et al (2010) [3] Dữ liệu RNAseq lấy từ Severin et al (2010) [16] 2.2 Xác định gen thuộc họ GDH đậu tương Các protein GDH Arabidopsis thaliana [7, 10, 14, 17, 18] dùng làm khn dị để tìm kiếm gen tương đồng toàn hệ gen đậu tương nhờ chương trình TBLASTN 2.3 Xây dựng phả hệ Cây phả hệ xây dựng từ protein GDH nghiên cứu nhờ phần mềm MEGA5 [19] sau chúng dãy MAFFT [20] 2.4 Phân tích đặc điểm hóa - lí Các đặc điểm vật lí, hóa học gen/protein phân tích cơng cụ ExPASy [21] Cấu trúc exon/intron xây dựng nhờ GSDS 2.0 [22] 2.5 Khảo sát biểu gen Sự biểu gen phân tích qua kết RNAseq (giải trình tự tập hợp ARN thơng tin) đậu tương [16] Kết thảo luận 3.1 Xác định họ gen GDH đậu tương đặc điểm chúng Khi sử dụng chương trình TBLASTN với khn dị protein GDH A thaliana, xác định GDH đậu tương họ đa gen nhỏ với 10 gen Protein suy diễn gen mang vùng bảo thủ tương ứng với mã số PF02812 PF00208 ngân hàng gen Đây vốn hai vùng bảo thủ đặc trưng cho GDH biết So kích thước họ gen, đậu tương có họ GDH lớn so với A thaliana, cà chua lúa Thực vậy, số lượng gen GDH báo cáo loài gen [11, 12, 18] Các đặc điểm vật lí gen protein suy diễn thể bảng Các gen quy định protein có kích thước gần C.P Bằng / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, Tập 33, Số (2017) 1-8 nhau, có độ dài 411 412 amino acid, ngoại trừ GmGDH04, GmGDH05 GmGDH06 Hai protein đầu có 637 amino acid protein thứ ba có 330 amino acid Ngoại trừ ba protein này, protein khác có khối lượng dao động khoảng 44,5 kD, gần giống với GDH biết Bryopsis maxima [23], Nicotiana plumbaginifolia [24], A thaliana [10] Các protein GDH đậu tương có tính axit yếu đến trung tính Các gen GDH đậu tương mã hóa khơng liên tục, gen có từ tới 14 intron (hình 1) Gen GmGDH06 có intron, hai gen GmGDH04 GmGDH05 có 14 intron, gen cịn lại có intron Đặc điểm giống với gen GDH cà chua [12] Bảng Các gen thuộc họ GDH đậu tương đặc điểm chúng Gen Tên locus GmGDH01 GmGDH02 GmGDH03 GmGDH04 GmGDH05 GmGDH06 GmGDH07 GmGDH08 GmGDH09 GmGDH10 Glyma01g41310 Glyma02g07940 Glyma05g05460 Glyma07g01510 Glyma08g20930 Glyma11g16320 Glyma16g04560 Glyma16g26940 Glyma17g15740 Glyma19g28770 Kích thước gen/CDS (bp) 3397/1236 3894/1236 3862/1239 9015/1914 7498/1914 2867/993 4039/1236 4521/1236 3698/1239 3706/1236 Chiều dài protein (aa) 411 411 412 637 637 330 411 411 412 411 Khối lượng protein (kD) 44,86 44,45 44,88 71,35 71,31 36,17 44,55 44,52 44,71 44,53 pI 5,97 6,39 6,15 6,91 6,54 5,72 6,04 6,28 6,09 5,97 Nhiễm sắc thể 01 02 05 07 08 11 16 16 17 19 Số lượng intron 8 14 14 8 8 Hình Cấu trúc exon/intron gen GDH đậu tương 3.2 Các motif bảo thủ GDH đậu tương Sự dãy protein GDH đậu tương cho phép phát motif bảo thủ chúng Các motif bảo thủ đánh dấu khung tô màu (hình 2) Ở đầu amin (N-terminal), GDH đậu tương có mang motif bảo thủ peptide tín hiệu định hướng protein vào ti thể (đóng khung nét đứt), ngoại trừ GmGDH04 GmGDH05 Motif gắn đặc hiệu chất -ketoglutarate (được đóng khung nét liền) có tất GDH Vùng gắn NAD(P)H tô xám, đó, GmGDH04 GmGDH05 có vùng gắn đặc hiệu NADPH (GxGx2Ax10G), protein lại đậu tương có vùng gắn đặc hiệu NADH (GxGx2Gx10G) Các Motif C.P Bằng / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số (2017) 1-8 bảo thủ GmGDH tương đồng cao với GDH số loài thực vật khác lúa [11] thuốc [24], cà chua [12] Kết dãy protein cho phép phát vùng bị xóa GmGDH06 Vùng nằm hai motif peptide tín hiệu định hướng protein vào ti thể motif gắn đặc hiệu chất (hình 2) Vùng bị giải thích GmGDH06 có kích thước ngắn có số lượng intron GmGDH khác Hình Kết dãy vùng bảo thủ protein GDH đậu tương Dấu đánh dấu amino acid bảo thủ, amino acid tín hiệu định hướng protein vào ti thể đóng khung nét đứt, vùng gắn -ketoglutarate đóng khung nét liền, vùng gắn NAD(P)H tơ xám C.P Bằng / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số (2017) 1-8 3.3 Phân tích phả hệ phân loại Glutamate dehydrogenase Cây phả hệ xây dựng từ protein GDH loài đậu tương, Arabidopsis, cà chua lúa giới thiệu hình Các protein xếp hai nhánh lớn phả hệ, có nhánh nhỏ, gồm có hai trình tự đậu tương, lúa Arabidopsis Nhánh lại phân chia thành nhiều nhánh nhỏ Sự phân bố GDH phả hệ cho phép phân chia GDH đậu tương thành hai nhóm chính, tương tự lồi thực vật khác [11, 18] Nhóm I gồm có hai gen GmGDH04 GmGDH05, xếp nhánh với AtGDH4 OsGDH4 Tám gen lại đậu tương thuộc nhóm II Trong nhóm này, GDH đậu tương chia thành hai phân nhóm nhỏ chưng phân bố hai phân nhánh khác nhau, phân nhóm IIa với gen GmGDH02, GmGDH06, GmGDH07, GmGDH08 GmGDH10, gen thuộc phân nhóm IId GmGDH01, GmGDH03 GmGDH09 Hiện tượng tương tự thấy loài khác Arabidopsis (IIa IIc), thuốc (IIa IIc) lúa (IIa IIb) Sự phân chia GDH thành hai nhóm khác phả hệ phù hợp với cấu trúc chúng, nhóm I gồm protein có motif bảo thủ gắn NADPH (GxGx2Ax10G) nhóm II gồm protein có motif bảo thủ gắn NADH (GxGx2Gx10G) Hình Cây phả hệ xây dựng từ GDH đậu tương (Gm), A thaliana (At) cà chua (Sl) lúa (Os) Cây phả hệ xây dựng với tham biến: thuật tốn Maximum Likelihood, mơ hình JonesTaylor-Thornton (JTT), phương pháp Bootstrap với 1000 lần lặp lại, giá trị bootstrap (%) thể nhánh (giá trị nhỏ 50 hiện), tỷ lệ xích số amino acid thay vị trí 6 C.P Bằng / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số (2017) 1-8 Cây phả hệ cho phép phát nhiều kiện nhân gen GDH hệ gen (Whole Genome Duplication, WGD) đậu tương, hình thành nên gen GmGDH04 GmGDH05, GmGDH02 GmGDH08, GmGDH07 cặp GmGDH06 với GmGDH10, GmGDH01 cặp GmGDH03 với GmGDH09 Các kiện nhân gen xảy loài khác, gen thuộc nhóm II 3.4 Phân tích biểu gen Chúng tơi phân tích biểu gen gen GDH qua kết RNAseq (giải trình tự ARN thông tin) thu từ mô, quan đậu tương giai đoạn phát triển khác nhau, gồm mô lá, mô hoa, mô (ở ba thời điểm), mô hạt (ở thời điểm khác nhau), mô rễ nốt sần Bản đồ nhiệt giới thiệu biểu gen (hình 4) Tất gen GDH đậu tương biểu loại mơ, mức độ biểu khác tùy gen thay đổi tùy loại mô khác Hai gen GmGDH02 GmGDH06 gen biểu yếu nhất, gen thứ biểu hoa gen thứ hai biểu nốt sần Các gen GmGDH03, GmGDH04, GmGDH05 GmGDH07 gen biểu tất mô tất giai đoạn phát triển nghiên cứu Xét mô khác nhau, ba gen GmGDH04, GmGDH05 GmGDH07 biểu mạnh lá, gen GmGDH07 biểu mạnh hoa, rễ nốt sần, gen GmGDH01 biểu mạnh hạt Với gen, mức độ biểu cao thấy mô sinh sản (ngoại trừ GmGDH06) Sự biểu khác gen GDH mô khác báo cáo Arabidopsis [14], cà chua [12] Ngoài ra, nghiên cứu biểu gen GDH ảnh hưởng điều kiện môi trường đươc thực lúa (trong điều kiện thiếu hụt nitơ phospho) [11], thuốc (trong điều kiện thiếu hụt đường, nitơ, mặn nhiễm độc kim loại nặng) [13, 24] Hình Sự biểu gen GDH đậu tương mô nghiên cứu Kết luận Trong tồn hệ gen đậu tương, có mười gen mã hóa GDH, có hai gen thuộc nhóm I (nhóm NADPH-GDH) gen thuộc nhóm II (nhóm NADH-GDH) Các gen mã hóa khơng liên tục với 14 intron intron, ngoại trừ gen GmGDH06 Các gen quy định protein có kích thước tương đồng, 637 amino acid 411 amino acid, ngoại trừ GmGDH6 có vùng bị xóa Phân tích phả hệ cho thấy GDH C.P Bằng / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số (2017) 1-8 đậu tương xếp vào hai nhóm giống nhiều thực vật khác, nhóm I (hai gen GmGDH04 GmGDH05) nhóm II (gồm gen cịn lại) Các protein nhóm II có motif bảo thủ tín hiệu khu trú ti thể đầu amin, motif bảo thủ gắn chất đặc hiệu -ketoglutarate vùng gắn đặc hiệu coenzyme NADH So với protein nhóm II, protein nhóm I có vùng gắn chất đặc hiệu vùng gắn coenzyme khác biệt nhẹ gắn với NADPH Sự biểu gen họ GDH đậu tương khác mô khác Gen GmGDH02 biểu đặc hiệu hoa GmGDH06 biểu đặc hiệu nốt sần Chỉ bốn gen GmGDH03,GmGDH04, GmGDH05và GmGDH07 biểu tất mô tất giai đoạn phát triển nghiên cứu Ngoại trừ gen GmGDH06, gen cịn lại biểu mơ sinh sản mạnh mô sinh dưỡng Những kết nghiên cứu bổ sung thông tin khoa học cấu trúc, phân loại, vai trò gen GDH đậu tương, mở đường cho việc tách dịng gen phân tích đầy đủ chức gen họ GDH đậu tương Lời cảm ơn Cơng trình hồn thành với hỗ trợ kinh phí từ chương trình nghiên cứu khoa học Trường Đại học Hùng Vương, tỉnh Phú Thọ [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] Tài liệu tham khảo [1] M Friedman and D L Brandon, Nutritional and health benefits of soy proteins, J Agric Food Chem 49 (2001) 1069-86 [2] K Liu, Soybeans as functional foods and ingredients, AOCS Publishing (2005) [3] J Schmutz, S B Cannon, J Schlueter, J Ma, T Mitros, W Nelson, et al., Genome sequence of the palaeopolyploid soybean, Nature, 463 (2010) 178183 [4] F Dubois, T Tercé-Laforgue, M.-B GonzalezMoro, J.-M Estavillo, R Sangwan, A Gallais, et al., Glutamate dehydrogenase in plants: is there a [13] [14] [15] new story for an old enzyme?, Plant Physiol and Biochem 41 (2013) 565-576 B G Forde and P J Lea, Glutamate in plants: metabolism, regulation, and signalling, in J Exp Bot 58 (2007) 2339-58 B G Forde, Glutamate signalling in roots, in J Exp Bot 65 (2014) 779-787 J X Fontaine, T Terce-Laforgue, P Armengaud, G Clement, J P Renou, S Pelletier, et al., Characterization of a NADH-dependent glutamate dehydrogenase mutant of Arabidopsis demonstrates the key role of this enzyme in root carbon and nitrogen metabolism, in Plant Cell 24 (2012) 4044-4065 P J Baker, K L Britton, P C Engel, G W Farrants, K S Lilley, D W Rice, et al., Subunit assembly and active site location in the structure of glutamate dehydrogenase, Proteins 12 (1992) 75-86 K A Loulakakis and K A RoubelakisAngelakis, Plant NAD(H)-Glutamate Dehydrogenase Consists of Two Subunit Polypeptides and Their Participation in the Seven Isoenzymes Occurs in an Ordered Ratio, Plant Physiol 97 (1991) 104-111 F J Turano, S S Thakkar, T Fang, and J M Weisemann, Characterization and expression of NAD(H)-dependent glutamate dehydrogenase genes in Arabidopsis, Plant Physiol 113 (1997) 1329-1341 X Qiu, W Xie, X Lian, and Q Zhang, Molecular analyses of the rice glutamate dehydrogenase gene family and their response to nitrogen and phosphorous deprivation, Plant Cell Rep 28 (2009) 1115-1126 G Ferraro, S Bortolotti, P Mortera, A Schlereth, M Stitt, F Carrari, et al., Novel glutamate dehydrogenase genes show increased transcript and protein abundances in mature tomato fruits, in J Plant Physiol 169 (2012) 899-907 F M Restivo, Molecular cloning of glutamate dehydrogenase genes of Nicotiana plumbaginifolia: structure analysis and regulation of their expression by physiological and stress conditions, Plant Science 166 (2004) 971-982 Y Miyashita and A G Good, NAD(H)dependent glutamate dehydrogenase is essential for the survival of Arabidopsis thaliana during dark-induced carbon starvation, in J Exp Bot, 59 (2008) 667-680 G Tsilikochrisos, G Tsaniklidis, C Delis, N Nikoloudakis, and G Aivalakis, Glutamate dehydrogenase is differentially regulated in [16] [17] [18] [19] C.P Bằng / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số (2017) 1-8 seeded and parthenocarpic tomato fruits during crop development and postharvest storage, Scientia Horticulturae 181 (2015) 34-42 A J Severin, J L Woody, Y T Bolon, B Joseph, B W Diers, A D Farmer, et al., RNASeq Atlas of Glycine max: a guide to the soybean transcriptome, BMC Plant Biol 10 (2010) 160 M P Purnell, D S Skopelitis, K A RoubelakisAngelakis, and J R Botella, Modulation of higher-plant NAD(H)-dependent glutamate dehydrogenase activity in transgenic tobacco via alteration of beta subunit levels, Planta 222 (2005) 167-180 R Inokuchi, K I Kuma, T Miyata, and M Okada, Nitrogen-assimilating enzymes in land plants and algae: phylogenic and physiological perspectives, in Physiol Plant 116 (2002) 1-11 K Tamura, D Peterson, N Peterson, G Stecher, M Nei, and S Kumar, MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods, Mol Biol Evol 28 (2011) 2731-2739 [20] K Katoh and D M Standley, MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability, Mol Biol Evol 30 (2013) 772-780 [21] E Gasteiger, C Hoogland, A Gattiker, M R Wilkins, R D Appel, and A Bairoch, Protein identification and analysis tools on the ExPASy server, in The proteomics protocols handbook, Springer, (2005) 571-607 [22] A Y Guo, Q H Zhu, X Chen, and J C Luo, GSDS: a gene structure display server, Yi Chuan 29 (2007) 1023-1026 [23] R Inokuchi, K Motojima, Y Yagi, K Nakayama, and M Okada, Bryopsis maxima (Chlorophyta) glutamate dehydrogenase: multiple genes and isozymes, Journal of Phycology 35 (1999) 1013-1024 [24] A Ficarelli, F Tassi, and F M Restivo, Isolation and characterization of two cDNA clones encoding for glutamate dehydrogenase in Nicotiana plumbaginifolia, Plant Cell Physiol 40 (1999) 339-342 In Silico Analysis of Glutamate Dehydrogenase Gene Family in Soybean (Glycine max L.) Cao Phi Bang Faculty of Natural Sciences, Hung Vuong University, Phu Tho, Vietnam Abstract: Glutamate dehydrogenase (GDH, EC 1.4.1.2~4) are the enzymes which catalyze reversible deamination reaction of L-glutamate to 2-oxoglutarate or -ketoglutarate (-KG) We identified a total of ten GDH encoded genes in soybean genome The full length sequence of predicted proteins had 637 or 411 amino acids, except GmGDH06 Analysis of phylogenetic tree constructed from GDH proteins of soyean and other plants showed that the soybean GDH were classified into two groups, the group I inclued two genes and the group II included eight genes The group II proteins possessed a mitochondrial target motif, a conserved specific -ketoglutarate binding and a specific NADH coenzyme binding region The group I proteins also included a specific subtrat binding but they contained a NADPH coenzyme binding The expression of soybean GDH genes was dissimilar in different tissues Four genes GmGDH03, GmGDH04, GmGDH05 and GmGDH07 expressed in all tissues at all studied development stages In addition, all soybean GDH genes expressed stronger in reproductive tissues than in vegetative tissues, except GmGDH06 which specifically expressed in nodules Keywords: Glutamate dehydrogenase, gene expression, phylogenetic tree, gene characterization, soybean ... Nicotiana plumbaginifolia, Plant Cell Physiol 40 (1999) 339-342 In Silico Analysis of Glutamate Dehydrogenase Gene Family in Soybean (Glycine max L. ) Cao Phi Bang Faculty of Natural Sciences, Hung... abundances in mature tomato fruits, in J Plant Physiol 169 (2012) 899-907 F M Restivo, Molecular cloning of glutamate dehydrogenase genes of Nicotiana plumbaginifolia: structure analysis and regulation... 2.1 Cơ sở liệu trình tự hệ gen RNAseq đậu tương Trình tự hệ gen đậu tương l? ??y từ Schmutz et al (2010) [3] Dữ liệu RNAseq l? ??y từ Severin et al (2010) [16] 2.2 Xác định gen thuộc họ GDH đậu tương