Preliminary data of the biodiversity in the area VNU Journal of Science Natural Sciences and Technology, Vol , No (20 ) 1 8 1 Original Article Development of Real time PCR Kit for Detection and Quanti[.]
VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol… , No…… (20……) 1-8 Original Article Development of Real-time PCR Kit for Detection and Quantitation of Six Common Mutations A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A of Human Mitochondrial Genome Nguyen Thi Hong Loan1, Phung Bao Khanh1, Le Ngoc Anh1, Cao Vu Hung2, Pham Van Anh2, Phan Tuan Nghia1,* VNU University of Science, Hanoi, 334 Nguyen Trai, Thanh Xuan, Hanoi, Vietnam Vietnam National Children' Hospital, 18/879 La Thanh, Dong Da, Hanoi, Vietnam Received 01 August 2021 Revised 11 September 2021; Accepted 13 Septerber 2021 Abstract: A procedure for the production of a real-time PCR kit for detection and quantitation of six common mitochondrial genome mutations including A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A using fluorescent locked nucleic acid (LNA) Taqman probes was reported The procedure consists of designing specific primers and LNA probes, selection of master mixture components, and real-time PCR thermal conditions The produced kit had a specificity of 100% and sensitivity ≥ 1% and remained fully active after days of storage at 25 oC or 20 days at oC or months at –20 oC The kit was used to analyze A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A mutations from 69 patients tentatively diagnosed with mitochondrial diseases and cases of A3243G carriers (4.34%) was found In these cases, the A3243G mutation was heteroplasmic, maternally inherited, and the heteroplasmy level was shown to be related to the symptom expression Keywords: A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A, real-time PCR D* _ * Corresponding author E-mail address: phantuannghia@vnu.edu.vn https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.5285 N T H Loan et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol , No (20 .) 1-11 Tạo kit phát định lượng đột biến gen ty thể A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C G11778A của người real-time PCR Nguyễn Thị Hồng Loan1, Phùng Bảo Khánh1, Lê Ngọc Anh1, Cao Vũ Hùng2, Phạm Vân Anh2, Phan Tuấn Nghĩa1,* Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội, Việt Nam Bệnh viện Nhi Trung ương, 18/879 La Thành, Đống Đa, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 01 tháng năm 2021 Chỉnh sửa ngày 11 tháng năm 2021; Chấp nhận đăng ngày 13 tháng năm 2021 Tóm tắt: Trong nghiên cứu này, quy trình sản xuất kit phát định lượng đột biến gen ty thể của người phổ biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A real-time PCR sử dụng mẫu dị huỳnh quang dạng cầu khóa axit nucleic (LNA) thiết lập Quy trình bao gồm việc thiết kế cặp mồi đặc hiệu, mẫu dò dạng huỳnh quang cầu khóa LNA, lựa chọn dung dịch master mix chu kỳ nhiệt Bộ kit có độ đặc hiệu 100% độ nhạy ≥ 1%, bảo quản ngày 25 oC oC 20 ngày tháng –20 oC cho kết phát định lượng đột biến tin cậy Bộ kit sử dụng để điều tra có mặt đột biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A 69 bệnh nhân nghi bị bệnh ty thể trường hợp mang đột biến A3243G (chiếm 4,34%) phát Các thành viên gia đình của bệnh nhân mang đột biến A3243G phân tích có mặt tỷ lệ đột biến, kết cho thấy đột biến A3243G bệnh nhân di truyền từ mẹ sang tồn dạng không đồng tế bào, tỷ lệ đột biến có tương quan với biểu lâm sàng của bệnh Từ khóa: A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A Mở đầu * Ty thể bào quan có mặt hầu hết tế bào nhân chuẩn với chức sản xuất lượng dạng ATP cho hoạt động của tế bào Hệ gen ty thể (mtDNA) của người có cấu trúc sợi đơi, DNA mạch vịng với kích thước 16,569 bp, gồm 37 gen mã hóa cho 13 protein, 22 RNA vận chuyển (tRNA) RNA ribosome ty thể (rRNA) Những sai hỏng DNA của ty thể gây rối loạn đa hệ thống, ảnh hưởng đến nhiều loại tế bào, mô tổ chức khác chủ yếu tập trung _ * Tác giả liên hệ Địa email: phantuannghia@vnu.edu.vn https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.5285 cơ, thần kinh chức chuyển hóa của thể [1] Giống tất DNA nhân, phần lớn mtDNA di truyền theo dòng mẹ [2] Tuy nhiên, tỷ lệ số mang đột biến mẹ lại khác nhau, vậy, mức độ biểu bệnh mẹ người khác Các tế bào thường chứa nhiều mtDNA, đó, xuất đột biến tế bào có mtDNA bình thường mtDNA đột biến Đặc điểm gọi tính khơng đồng (heteroplasmy) của mtDNA, cịn tất của mtDNA giống gọi tính đồng (homoplasmy) [3, 4] Hiện nay, 300 đột biến hệ gen ty thể người (chủ yếu đột biến điểm) phát hiện, có N T H Loan et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol , No (20 .) 1-11 200 đột biến gây bệnh, chủ yếu tập trung vào cơ, thần kinh, chức chuyển hoá của thể [5] Mặt khác, bệnh đột biến gen ty thể có tác động lâm sàng phức tạp nên khó để phát thơng qua việc chẩn đốn lâm sàng Cho đến nay, phân tích DNA phương pháp cho phép phát nhanh chóng xác đột biến gây bệnh Các đột biến điểm chủ yếu gây hội chứng MELAS (mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes), hội chứng MERRF (myoclonic epilepsy with ragged-red fibres), hội chứng Leigh (do nhà khoa học Leigh tìm ra), hội chứng LHON (Leber’s herteditary optic neuropathy) MELAS hội chứng não giật cơ, tăng acid lactic máu giả tai biến mạch, có tần suất xuất 1:15.000 bệnh thần kinh di truyền phổ biến nhất, có tỷ lệ tử vong cao [6, 7] Nguyên nhân của hội chứng MELAS loại đột biến điểm gen MTTL1 mã hóa cho tRNALeu gen MTND5 mã hóa cho ND5 ubiquinone oxidoreductase của phức hợp I Trong đó, đột biến A thay G vị trí 3243 (A3243G) gen MTTL1 làm thay đổi cấu trúc, rối loạn chức của tRNALeu(UUR) phổ biến tất chủng tộc, chiếm đến 80% số ca mang hội chứng MELAS [8-12] Bên cạnh đó, đột biến G3380A gen MTND1, mã hóa cho phân tử RNA vận chuyển leucine (tRNALeu) thường tồn dạng khơng đồng thường tìm thấy bệnh nhân bị hội chứng MELAS [13] MERRF hội chứng động kinh giật với sợi đỏ xé rách kèm theo trí, điếc, bệnh cơ, teo dây thần kinh thị giác, tổn thương hô hấp tim; nguyên nhân phổ biến đột biến A8344G, T8356C G8363A nằm gen MTTK mã hóa cho tRNALys gây Trong số đột biến này, đột biến A8344G phổ biến nhất, chiếm 80-90% số ca mang hội chứng MERRF [14] Leigh hội chứng với triệu chứng điển hình thối hóa thần kinh tiến triển trẻ, dẫn đến tử vong vài tháng vài năm [15] Đa số đột biến gen ty thể gây hội chứng Leigh nằm gen MTATP6 mã hoá cho ATPase phức hệ V của chuỗi hô hấp, đặc biệt đột biến đổi T thành G C vị trí 8993 chiếm tỷ lệ cao (khoảng 20% bệnh nhân mang hội chứng Leigh có biến đổi này) [16] Bệnh nhân Leigh có tỷ lệ đột biến cao; lượng đột biến từ 60 - 90% thể triệu chứng rối loạn thần kinh, điều hòa vận động viêm võng mạc [14, 17] LHON hội chứng liệt thần kinh thị giác di truyền theo Leber, tác động chủ yếu đến võng mạc, gây chứng teo dây thần kinh thị giác, làm khả nhìn thấy hai mắt Khoảng 95% trường hợp LHON gây đột biến liên quan đến tiểu đơn vị của phức hệ I, bao gồm đột biến G11778A gen ND4 (50 - 70% trường hợp), đột biến G3460A gen ND1 (15% trường hợp) đột biến T14484C gen ND6 (10% trường hợp) Trong đó, đột biến G11778A nguyên nhân phổ biến của LHON Ngồi ra, cịn có đột biến khác liên quan đến gen ND5 ND6 [18] Kỹ thuật real-time PCR sử dụng để phát định lượng đột biến gen ty thể thuộc hội chứng điển Leigh [17], MELAS [20] hay LHON [22] Tuy nhiên, nghiên cứu dừng lại việc nghiên cứu đột biến riêng lẻ; cho đên nay, chưa có kit thương mại để phát định lượng đồng thời số đột biến gen ty thể Nghiên cứu báo cáo kết phát triển kit phát định lượng đồng thời đột biến điểm phổ biến hệ gen ty thể, bao gồm: A3243G, G3380A (đột biến phổ biến gây hội chứng MELAS), A8344G (đột biến phổ biến gây hội chứng MERRF), T8993G, T8993C (đột biến phổ biến gây hội chứng Leigh) G11778A (đột biến phổ biến gây hội chứng LHON) Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu Mẫu máu ngoại vi của 69 bệnh nhân nghi bị bệnh ty thể mẫu máu của bố mẹ người thân của gia đình có bệnh nhân mang đột biến lấy từ Bệnh viện Nhi Trung ương N T H Loan et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol , No (20 .) 1-11 sử dụng để tách DNA cho phân tích đột biến gen ty thể Kế hoạch nghiên cứu thông qua Hội đồng đạo đức của Bệnh viện Nhi Trung ương (ngày 15/6/2016) thực sở tuân thủ chặt chẽ tiêu quy định mà Hội đồng duyệt Đối tượng cung cấp mẫu điều tra đột biến gen ty thể (bệnh nhân thành viên gia đình) có chấp thuận tự nguyện tham gia vào nghiên cứu Các plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen ty thể bình thường hay khơng có đột biến (3243A, 3380G, 8344A, 8993T, 11778G) có đột biến (3243G, 3380A, 8344G, 8993C, 8993G, 11778A) sản phẩm của đề tài KC.04.10/11-15 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm tách kit của Qiagen (Hoa Kỳ) Nồng độ DNA định lượng cách đo độ hấp thụ bước sóng 260 nm (A260) NanoDrop ND2000 (Thermo Scientific, Đức) 2.2.2 Kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang dạng khóa cầu acid nucleic Các đột biến gen ty thể phát định lượng kỹ thuật real-time PCR (qPCR) sử dụng mẫu dò huỳnh quang dạng khóa cầu acid nucleic (LNA) theo phương pháp Truong cộng [19] thiết lập, sử dụng plasmid mang đoạn gen khơng có đột biến 3243A, 3380G, 8344A, 8993T, 11778G có đột biến (3243G, 3380A, 8344G, 8993C, 8993G, 11778A) làm mẫu chuẩn Các cặp mồi thiết kế để nhân lên đoạn gen đích kích thước từ 70–114 bp vùng có chứa đột biến cần nghiên cứu Mẫu dị huỳnh quang Taqman có trình tự bổ sung với phần trình tự đoạn gen đích, dài 12–15 nucleotide, có số nucleotide dạng LNA, đặc biệt nucleotide LNA vị trí bổ sung với điểm đột biến có tính bắt buộc để mẫu dị khơng bặt cặp với DNA khn dạng khơng đột biến khoảng nhiệt độ chọn gắn mồi Đầu 5’ của mẫu dị có gắn chất phát huỳnh quang (reporter) HEX (Ex/Em = 535/556 nm) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự khơng đột biến FAM (Ex/Em = 495/520 nm) cho mẫu dị đặc hiệu với trình tự đột biến, cịn đầu 3’ của mẫu dị có gắn chất hấp phụ huỳnh quang (quencher) IBFQ (Iowa black fluorescence quencher) Theo cách thiết kế này, chạy real-time PCR, tín hiệu HEX gia tăng chứng tỏ mẫu DNA khuôn không mang đột biến Ngược lại, tín hiệu FAM gia tăng chứng tỏ DNA khuôn mang đột biến dạng đồng hai loại tín hiệu FAM HEX gia tăng chứng tỏ mẫu DNA khn mang đột biến dạng không đồng Dựa số lượng biết của mẫu chuẩn, số lượng đột biến không đột biến của mẫu cần phân tích tính ra; đồng thời thiết bị real-time PCR thông số hiệu suất PCR (E), hệ số tương quan tuyến tính chu kì ngưỡng số ban đầu (R2) Dựa kết số đột biến không đột biến của mẫu cần phân tích hiển thị máy tính, tỷ lệ đột biến của mẫu bệnh phẩm tính theo công thức: % đột biến = Số đột biến (FAM)/(Số đột biến (FAM) + Số không đột biến (HEX)) 2.2.3 Xác định độ nhạy đặc hiệu Độ nhạy của phương pháp hay kit định nghĩa giới hạn nồng độ thấp mà phương pháp hay kit cho phép phát định lượng xác Độ đặc hiệu của phương pháp hay kit đánh giá sở tỷ lệ mẫu dương tính phát /Số mẫu dương thực tỷ lệ mẫu âm tính phát /Số mẫu âm tính thực Trong đó, loại DNA khác sử dụng DNA tách từ mẫu bệnh phẩm không mang đột biến số đột biến nghiên cứu (đã xác định trước PCR-RFLP giải trình tự) sử dụng mẫu dương tính giả Mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân mang đột biến A3243G (đã phân tích trước đó) sử dụng làm mẫu dương tính thật Ngồi ra, để kiểm tra khả bắt cặp đặc hiệu của master mix vùng gen khác của ty thể, sử dụng hỗn hợp N T H Loan et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol , No (20 .) 1-11 10 plasmid chứa đoạn gen ty thể khác không chứa trình tự trùng với trình tự của mẫu dị mồi thiết kế để làm mẫu âm tính Các thí nghiệm định lượng tỷ lệ đột biến lặp lại lần, số liệu xử lý phương pháp thống kê để tính giá trị trung bình của mẫu độ lệch chuẩn theo phần mềm Excel Kết nghiên cứu thảo luận 3.1 Xác định điều kiện real-time PCR để phát định lượng đột biến gen ty thể A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A Sau lần thử nghiệm, xác định thành phần thích hợp của master mix bao gồm: hỗn hợp 2X (sẵn có Taq DNA polymerase, đệm, dNTP, dUTP, MgCl2, Uracyl-N-glucosylase), bổ sung 10 pmol mồi xi, 10 pmol mồi ngược, pmol mẫu dị đột biến, pmol mẫu dị khơng đột biến, bổ sung đệm TE 1X đến thể tích cuối 15 µL Master mix sử dụng cho real-time PCR nghiên cứu thay đổi nồng độ mẫu dò bổ sung A D thêm dUTP, Uracyl-N-glucosylase (UNG) để loại khả có kết dương tính Trên sở nhiệt độ Tm của mồi, mẫu dò thăm dò điều kiện nhiệt độ cho bước phản ứng, chọn chế độ nhiệt là: 50 oC phút để UNG loại bỏ gốc uracyl khỏi sản phẩm PCR (của lần thí nghiệm trước đó) lẫn vào hỗn hợp phản ứng, 95 oC 10 phút cho biến tính DNA ban đầu, đồng thời bất hoạt UNG, 40 chu kì bao gồm 95 oC 15 giây để biến tính DNA, 60 o C 30 giây cho gắn mồi kéo dài chuỗi Tiếp theo, master mix thử nghiệm để xác định điều kiện thích hợp cho việc định lượng đột biến thơng qua xây dựng đường chuẩn Kết cho thấy có tương quan tuyến tính giá trị chu kỳ ngưỡng logarit số với kênh HEX (khơng đột biến) kênh FAM (có đột biến) (Hình 1) Giá trị hiệu suất PCR (E) của phản ứng nằm khoảng 90 - 110%, hệ số tương quan tuyến tính R2 hai kênh lớn 0,99 (Bảng 1) khẳng định master mix cho phép định lượng đột biến nêu với độ tin cậy cao B E C F Hình Biểu đồ tương quan tuyến tính chu kì ngưỡng số ban đầu của đột biến A: Đột biến A3243G, B: đột biến G3380A, C: Đột biến A8344G, D: Đột biến T8993G, E: Đột biến T8993C, F: Đột biến G11778A Đường màu đỏ đường chuẩn của kênh đột biến (FAM), đường màu xanh đường chuẩn của kênh không mang đột biến (HEX) 6 N T H Loan et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol , No (20 .) 1-11 Bảng Hiệu suất real-time PCR hệ số tương quan tuyến tính của đường chuẩn đột biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993G/C G11778A Tín hiệu FAM (Đột biến) Đột biến A3243G G3380A A8344G T8993G T8993C G11778A Hiệu suất real-time PCR (E) % R2 110 91 90 96 94 98 0,998 0,996 0,999 0,993 0,994 0.999 Trên sở dung dịch master mix tạo được, tạo kit (100 phản ứng/bộ) phát định lượng đột biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A gồm có thành phần sau: i) Master mix (Mix): ống x 0,5 mL; ii) Mẫu chuẩn (PC) nồng độ DNA 5.103 - 5.106: ống x 50 µL/ống; iii) Đối chứng âm (NC): ống x 0,2 ml (4 pg/µL); iv) H2O cất loại ion: 1,2 mL Mẫu chuẩn hay đối chứng dương bao gồm plasmid mang đoạn gen ty thể tương ứng có đột biến khơng đột biến trộn sẵn theo tỷ lệ 1:1 với nồng độ từ 5x103, 5x104, 5x105 5x106 của đột biến A3243G, T8993G, G11778A, G3380A, A8344G, T8993C Đối chứng âm plasmid mang đoạn gen ty thể tương ứng đột biến 3.2 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu điều kiện bảo quản kit 3.2.1 Xác định độ nhạy của kit Việc đánh giá độ nhạy của kit tạo cách sử dụng mẫu chuẩn hỗn hợp plasmid mang đoạn gen ty thể có đột biến Tín hiệu HEX (Không đột biến) Hiệu suất real-time R2 PCR (E) % 91 1,000 110 0,991 91 1,000 100 0,997 98 0,996 94 0,999 khơng có đột biến với tỷ lệ plasmid mang đoạn gen đột biến khác Biểu đồ đường cong khuếch đại sau kết thúc real-time PCR (Hình 2) cho thấy với mẫu phân tích có gia tăng tín hiệu của hai kênh đột biến (FAM) không đột biến (HEX), tức có nhân lên của đoạn gen đích đột biến không đột biến, chứng tỏ kit cho phép phát đột biến tỷ lệ 1% (và không cho kết tỷ lệ đột biến thấp hơn) Trong đó, tỷ lệ đột biến ≤ 0,1% khơng phát gia tăng tín hiệu của kênh đột biến Độ nhạy của số phương pháp real-time PCR tới 0,1% đột biến [19, 20], chí tới 0,01% [21] mức 5% [22] tùy thuộc vào việc thiết kế mẫu dò So với phương pháp khác kỹ thuật pyrosequencing [23] phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao biến tính có độ nhạy 1% [24], kit tạo nghiên cứu có đủ độ nhạy việc phát định lượng đột biến gen ty thể phổ biến Hình Biểu đồ đường cong khuếch đại phản ứng realtime PCR sử dụng khuôn 1% tỷ lệ đột biến A: Đột biến A3243G, B: Đột biến G3380A, C: Đột biến A8344G, D: Đột biến T8993G, E: Đột biến G11778A, F: Đột biến T8993C Mẫu dò huỳnh quang mang HEX, đặc hiệu cho mẫu khơng đột biến, mẫu dị huỳnh quang mang FAM, đặc hiệu cho mẫu đột biến N T H Loan et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol , No (20 .) 1-11 3.2.2 Xác định độ đặc hiệu của kit Kết thu với mẫu dương tính giả, tín hiệu nhân xuất kênh HEX đặc hiệu cho mẫu khơng đột biến mà khơng xuất tín hiệu nhân kênh FAM đặc hiệu cho mẫu có đột biến (Hình 3A) Ngược lại, với mẫu DNA tách từ mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân có đột biến A3243G, kit A3243G cho thấy gia tăng tín hiệu kênh đột biến (3243FAM) khơng đột biến (3243HEX), phù hợp với tính tốn lý thuyết ban đầu bệnh nhân mang đột biến dạng khơng đồng (Hình 3B) Trong đó, sử dụng khuôn hỗn hợp plasmid chứa đoạn gen ty thể không thuộc vùng mang đột biến quan tâm khơng có mẫu cho thấy có gia tăng tín hiệu của hai kênh đột biến khơng đột biến (Hình 3B) Các kết thu chứng tỏ kit có độ đặc hiệu cao (100%) Trong tế bào ty thể tồn với nhiều sao, đoạn gen đích khác F nucleotide, phương pháp phát đột biến gen ty thể địi hỏi phải có độ đặc hiệu cao gần tuyệt đối Hầu hết nghiên cứu sử dụng real-time PCR phát đột biến A3243G, T8993G/C, G11778A cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu lên tới 100% [20-22] Bộ kit tạo nghiên cứu cho phép phát xác đột biến A3243G, G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C khơng có xảy khả bắt cặp nhầm vùng DNA khác hệ gen ty thể Bộ kit tạo ký hiệu: Mito-6-mutations q.PCR Ngoài ra, kit cho kết phát đột biến tương tự, sử dụng mẫu dương tính nhân tạo với đột biến cách trộn tỷ lệ định (5x108 sao) của loại plasmid mang đột biến (3243G, 3380A, 8344G, 8993G, 8993C 11778A) với huyết của người không mang đột biến thay cho mẫu bệnh nhân nghi bị đột biến gen ty thể Hình Đường cong khuếch đại đoạn gen mang đột biến A3243G real-time PCR A: mẫu bệnh phẩm không mang đột biến; B: trường hợp dương tính với A3243G đoạn gen khác hệ gen ty thể 3.2.3 Xác định thời gian bảo quản của kit Chúng tiến hành bảo quản kit Mito-6-mutations q.PCR tháng –20 oC, sau đó, xây dựng đường chuẩn của đột biến quan tâm để kiểm tra chất lượng thành phần của master mix Kết thu (Bảng 2) cho thấy, sau tháng bảo quản kit cho tín hiệu đường cong khuếch đại ổn định, hệ số tương quan tuyến tính chu kì ngưỡng số ban đầu của kênh HEX FAM của đột biến nằm khoảng 0,970–0,999 Kết vòng tháng kể từ ngày sản xuất, bảo quản –20 oC, kit Mito-6-mutations q.PCR cho phép phát định lượng đột biến tin cậy, phù hợp với tiêu chuẩn sở đặt Tương tự, kit bảo quản nhiệt độ phòng (25 oC) ngày, ngày, 10 ngày oC 10 ngày, 20 ngày 30 ngày; sau đánh giá khả phân tích đột biến A3243G, G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C Kết thu cho thấy, sau ngày bảo quản nhiệt độ phòng tương tự sau 20 N T H Loan et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol , No (20 .) 1-11 ngày oC, thành phần của kit hoạt động tốt, biểu đồ đường cong khuếch đại của đột biến cho tín hiệu ổn định, hệ số tương quan tuyến tính R2 Ct số ban đầu của kênh đột biến không đột biến của mẫu chuẩn lớn 0,99 chứng tỏ đường chuẩn có giá trị tin cậy Bảng Hiệu suất PCR (E) hệ số tương quan tuyến tính (R2) của đường chuẩn đột biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993G/C G11778A sử dụng kit bảo quản sau tháng –20 oC Đột biến Tín hiệu FAM Tín hiệu HEX E (%) R2 E (%) R2 A3243G 114,3 0,972 151,7 0,999 G3380A 83,2 0,995 96,4 0,995 A8344G 96,9 0,998 117,8 0,971 T8993G 91,4 0,994 83,6 0,996 T8993C 104,7 0,984 104,6 0,996 G11778A 83,6 0,997 95,7 0,999 Tuy nhiên, sau 10 ngày bảo quản nhiệt độ phòng (25 oC) sau 30 ngày oC, độ tương quan tuyến tính chu kì ngưỡng số ban đầu của đột biến khơng cịn đủ độ tin cậy cho việc định lượng (R2 < 0,99) Như kit Mito-6-mutations q.PCR bảo quản nhiệt độ phòng (25 oC) ngày, o C 20 ngày hay –20 oC tháng 3.3 Kiểm tra khả phát đột biến ty thể kit 3.3.1 Kiểm tra khả phát định lượng đột biến G1177A Trong nghiên cứu trước [25], phát bệnh nhân (nữ, 7,5 tháng tuổi) mang đột biến G11778A thuộc hội chứng LHON với tỷ lệ đột biến 2,710,12% Bố mẹ bệnh nhân khơng phát thấy có mang đột biến Với kit Mito-6-mutations q.PCR tạo ra, tiến hành lặp lại việc phân tích có mặt tỷ lệ đột biến Kết thu (Hình 4) cho thấy mẫu bệnh nhân có mang đột biến với tỷ lệ 2,7%, mẫu bố mẹ bệnh nhân không thấy mang đột biến Kết phù hợp với phát trước đây, có mặt của đột biến G11778A của bệnh nhân phát sinh q trình phát triển cá thể I B A Hình Kết real-time PCR với mẫu gia đình bệnh nhân (A) đường chuẩn thể tương quan logarit số gen ty thể chu kỳ ngưỡng của đột biến G11778A (đường dạng có đột biến, đường dạng không mang đột biến) (B) 3.3.2 Ứng dụng kit sàng lọc có mặt của đột biến gen ty thể bệnh nhân Bộ kit Mito-6-mutations q.PCR sử dụng thử nghiệm điều tra có mặt định lượng đột biến gen ty thể A3243G, G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C 69 bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng nghi bệnh ty thể Khoa Thần kinh, Bệnh viện Nhi Trung ương Kết thu cho thấy: 57 số 69 mẫu bệnh phẩm cho kết âm tính Ở nêu trường hợp làm minh họa Cụ thể bệnh nhân số (ký hiệu BN1), kết thu Hình cho thấy, đột biến, đồ thị tín hiệu real-time PCR nhân với mẫu dị khơng đột biến HEX xuất với số chu kỳ ngưỡng Ct dao động từ 14 - 17 khơng thu tín hiệu khuếch đại của kênh FAM với mẫu dò đột biến Trong đó, N T H Loan et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol , No (20 .) 1-11 đối chứng dương của đột biến cho đường khuếch đại với mẫu dò không đột biến HEX xuất với chu kỳ ngưỡng Ct dao động từ 19 - 23 mẫu dò đột biến FAM xuất với chu kỳ ngưỡng Ct dao động từ 18 - 26 Các kết chứng tỏ, bệnh nhân BN1 không mang đột biến nghiên cứu A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C G11778A gen ty thể Các bệnh nhân ký hiệu BN4, BN11 BN30, đồ thị nhân với mẫu dò FAM HEX xuất với cặp mồi mẫu dò đặc hiệu cho đột biến A3243G, bệnh nhân cịn lại thu tín hiệu HEX mà khơng thu tín hiệu FAM (Hình 5) Kết chứng tỏ bệnh nhân BN4, BN11, BN30 có mang đột biến A3243G dạng khơng đồng Bên cạnh đó, đồ thị tín hiệu nhân với mẫu dị FAM khơng xuất với cặp mồi mẫu dò đặc hiệu cho đột biến G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C, đồ thị tín hiệu nhân xuất với HEX, chứng tỏ số 69 bệnh nhân điều tra, khơng có bệnh nhân mang đột biến G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C I F Hình Kết thử nghiệm kit Mito- 6-mutations q.PCR phát đột biến gen ty thể của bệnh nhân BN1, BN4, BN11 BN30 Xét tỷ lệ đột biến, với số lượng mẫu 69 bệnh nhân nghiên cứu, có bệnh nhân mang đột biến A3243G dạng không đồng phát hiện, chiếm tỷ lệ 4,34% Tỷ lệ đột biến gần với tỷ lệ 5,7% mà Truong cộng [26] trước phát điều tra 106 bệnh nhân người Việt Nam nghi bị bệnh ty thể Trong nghiên cứu trước 631 bệnh nhân người Hungary có triệu chứng bệnh ty thể, Gal cộng [27] cho thấy có 2,2% bệnh nhân mang đột biến A3243G Tỷ lệ 1,74% nghiên cứu khác, 230 bệnh nhân người Nhật bị giảm khả nghe [28] Trên thực tế, bên cạnh đặc điểm di truyền, tỷ lệ đột biến gen ty thể phụ thuộc tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân, đối tượng, độ tuổi, Kết luận Bộ kit Mito-6-mutations q.PCR tạo cho phép phát định lượng xác đột biến gen ty thể A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C G11778A real-time PCR sử dụng mẫu dò dạng LNA Bộ kit thử nghiệm để phân tích có mặt của đột biến gen ty thể cho bệnh nhân Bệnh viện Nhi Trung ương 10 N T H Loan et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol , No (20 .) 1-11 Lời cảm ơn Nghiên cứu thực với hỗ trợ kính phí của Đề tài cấp Đại học Quốc gia Hà Nội, mã số KLEPT16.03 [10] Tài liệu tham khảo [11] [1] P Mishra, D C Chan, Mitochondrial Dynamics and Inheritance During Cell Division, Development and Disease, Nat, Rev, Mol, Cell, Biol, Vol 15, 2014, pp 634-646 [2] P F Chinnery, Inheritance of Mitochondrial Disorders, Mitochondrion, Vol 2, 2002, pp 149-155 [3] S Shanske, J Pancrudo, P Kaufmann, K Engelstad, S Jhung, J Lu, A Naini, S DiMauro, D C De Vivo, Varying Loads of the Mitochondrial DNA A3243G Mutation in Different Tissues: Implications for Diagnosis, Am, J Med, Genet, Part A, Vol 130A, 2004, pp 134-137 [4] M K Koenig, Presentation and Diagnosis of Mitochondrial Disorders in Children, Pediat, Neurol, Vol 38, 2008, pp 305-313 [5] X Zhou, H Zhang, F Zhao, Y Ji, Y Tong, J Zhan, Y Zhang, L Yang, Y Qian, F Lu, J Qu, M X Guan, Very High Penetrance and Occurrence of Leber’s Hereditary Optic Neuropathy in a Large Han Chinese Pedigree Carrying the ND4 G11778A Mutation, Mol, Genet, Metab, Vol 100, 2010, pp 379-384 [6] Y Ma, F Fang, Y Cao, Y Yang, L Zou, Y Zhang, S Wang, S Zhu, Y Xu, P Pei, Y Qi, Clinical Features of Mitochondrial DNA m.3243A>G Mutation in 47 Chinese Families, J Neurol, Sci, Vol 291, 2010, pp 17-21 [7] S Rahman, J Poulton, D Marchington, A Suomalainen, Decrease of A3243G mtDNA Mutation from Blood in MELAS Syndrome: A Longitudinal Study, Am, J Hum, Genet, Vol 68, 2001, pp 238-240 [8] E Ciafaloni, E Ricci, S Shanske, C T Moraes, G Silvestri, M Hirano, S Simonetti, C Angelini, M A Donati, C Garcia, A Martinuzzi, R Mosewich, S Servidei, E Zammarchi, E Bonilla, D C DeVivo, L P Rowland, E A Schon, S DiMauro, MELAS: Clinical Features, Biochemistry, and Molecular Genetics, Annal, Neurol, Vol 31, 1992, pp 391-398 [9] K Majamaa, J S Moilanen, S Uimonen, A M Remes, P I Salmela, M Kärppä, K A Voltti, H Rusanen, M Sorri, K J Peuhkurinen, I E Hassinen, Epidemiology of A3243G, the Mutation for Mitochondrial Encephalomyopathy, Lactic Acidosis, and Strokelike Episodes: Prevalence of the [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] Mutation in an Adult Population, Am, J Hum, Genet, Vol 63, 1998, pp 447-454 P J Lorenzoni, R H Scola, C S K Kay, R C Arndt, A A Freund, I Bruck, M L S F Santos, L C Werneck, MELAS: Clinical Features, Muscle Biopsy and Molecular Genetics, Arquivos de Neuro-Psiquiatria, Vol 67, 2009, pp 668-676 M Mimaki, H Hatakeyama, T Ichiyama, H Isumi, S Furukawa, M Akasaka, A Kamei, H Komaki, I Nishino, I Nonaka, Y I Goto, Different Effects of Novel mtDNA G3242A and G3244A Base Changes Adjacent to a Common A3243G Mutation in Patients with Mitochondrial Disorders, Mitochondrion, Vol 9, 2009, pp 15-122 C Glatz, K D’Aco, S Smith, N Sondheimer, Mutation in the Mitochondrial tRNA(Val) Causes Mitochondrial Encephalopathy, Lactic Acidosis and Stroke-like Episodes, Mitochondrion, Vol 11, 2011, pp 615-619 R Horvath, R Reilmann, E Holinski-Feder, E B Ringelstein, T Klopstock, The Role of Complex I Genes in MELAS: A Novel Heteroplasmic Mutation 3380G>A in ND1 of mtDNA, Neuromusc, Disord, Vol 18, 2008, pp 553-556 A L Gropman, The Neurological Presentations of Childhood and Adult Mitochondrial Disease: Established Syndromes and Phenotypic Variations, Mitochondrion, Vol 4, 2004, pp 503-520 Y Suzuki, T Wada, T Sakai, Y Ishikawa, R Minami, N Tachi, S Saitoh, Phenotypic Variability in a Family with a Mitochondrial DNA T8993C Mutation, Pediat, Neurol, Vol 19, 1998, pp 283-286 E M Rebai, W Chaari, S Younes, R Bousoffara, M T Sfar, F Fakhfakh, Maternally Inherited Leigh Syndrome: T8993G Mutation in a Tunisian Family, Pediat Neurol, Vol 40, 2009, pp 437-442 H Tajima, K Sueoka, S Y Moon, A Nakabayashi, T Sakurai, Y Murakoshi, H Watanabe, S Iwata, T Hashiba, S Kato, Y I Goto, Y Yoshimura, The Development of Novel Quantification Assay for Mitochondrial DNA Heteroplasmy Aimed at Preimplantation Genetic Diagnosis of Leigh Encephalopathy, J Assist, Reprod, Genet, Vol 24, 2007, pp 227-232 G C Black, K Morten, A Laborde, J Poulton, Leber's Hereditary Optic Neuropathy: Heteroplasmy is Likely to be Significant in the Expression of LHON in Families with the 3460 ND1 Mutation, Brit, J Ophthalmol, Vol 80, 1996, pp 915-917 T H Truong, T V A Nguyen, T H L Nguyen, V A Pham, T N Phan, Sensitive Quantitation of N T H Loan et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol , No (20 .) 1-11 [20] [21] [22] [23] [24] Mitochoncirial Mutation Using New Taqman Probes, Cent, Eur, J Med, Vol 9, 2014, pp 839-848 R Singh, S Ellard, A Hattersley, L W Harries, Rapid and Sensitive Real-time Polymerase Chain Reaction Method for Detection and Quantification of 3243A>G Mitochondrial Point Mutation, J Mol, Diagn, Vol 8, 2006, pp 225-230 H Strand, O C Ingebretsen, O Nilssen, Real-time Detection and Quantification of Mitochondrial Mutations with Oligonucleotide Primers Containing Locked Nucleic Acid, Clin, Chim, Acta, Vol 390, 2008, pp 126-133 J Y Wang, Y S Gu, Y Tong, Y Wang, J B Shao, M Qi, MGB Probe Aassay for Rapid Detection of mtDNA11778 Mutation in the Chinese LHON Patients by Real-time PCR, J Zhejiang, Univ, Sci B, Vol 9, 2008, pp 610-615 H E White, V J Durtonand, A Seller, Accurate Detection and Quantitation Of heteroplasmic Mitochondrial Point Mutations by Pyrosequencing, Genet, Test, Vol 9, 2005, pp 190-199 K S Lim, R K Naviaux, R H Haas, Quantitative Mitochondrial DNA Mutation Analysis by Denaturing HPLC, Clin, Chem, Vol 53, 2007, pp 1046-1052 [25] N V Minh, P B Khanh, N T H Loan, L N Anh, P V Anh, C V Hung, P T Nghia, Detection and Quantitation of Mitochondrial G11778A Mutation of LHON Syndrome in a Vietnamese Patient with Tentatively Diagnosed Mitochondrial Disease, VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 33, 2017, pp 20-25 [26] T H Truong, T V A Nguyen, V L Nguyen, V A Pham, T N Phan, Screening of Common Point-mutations and Discovery of New T14727C Change in Mitochondrial Genome of Vietnamese Encephalomyopathy Patients, Mitochondrial DNA, Vol 27, 2016, pp 441-448 [27] A Gal, K Komlosi, A Maasz, P Pentelenyi, V Remenyi, C Ovary, A Valikovics, P Dioszeghy, D Bereczkil, B Melegh, M J Molnár, Analysis of mtDNA A3243G Mutation Frequency in Hungary, Cent, Eur, J Med, Vol 5, 2010, pp 322-328 [28] H Nagata, K Kumahara, T Tomemori, Y Arimoto, K Isoyama, K Yoshida, A Konno, Frequency and Clinical Features of Patients with Sensorineural Hearing Loss Associated with the A3243G Mutation of the Mitochondrial DNA in Otorhinolaryngic Clinics, J Hum, Genet, Vol 46, 2001, pp 595-959 d s 11 ... Frequency and Clinical Features of Patients with Sensorineural Hearing Loss Associated with the A3243G Mutation of the Mitochondrial DNA in Otorhinolaryngic Clinics, J Hum, Genet, Vol 46, 2001,... Holinski-Feder, E B Ringelstein, T Klopstock, The Role of Complex I Genes in MELAS: A Novel Heteroplasmic Mutation 3380G>A in ND1 of mtDNA, Neuromusc, Disord, Vol 18, 2008, pp 553-556 A L Gropman, The Neurological... Qi, Clinical Features of Mitochondrial DNA m.3243A>G Mutation in 47 Chinese Families, J Neurol, Sci, Vol 291, 2010, pp 17-21 [7] S Rahman, J Poulton, D Marchington, A Suomalainen, Decrease of A3243G