Đặc điểm hình thái, phân tử và đặc tính xâm nhiễm, sinh học của tác nhân gây bệnh teo đầu lá nha đam tại Ninh Thuận.pdf

ĐẠI HOC NGUYỄN TẤT THÀNH NGUYEN TAT THANH THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP KHOA CỒNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ĐẶC ĐIÈM HÌNH THÁI, PHÂN TỬ VÀ ĐẶC TÍNH XÂM NHIỄM, SINH HỌC CỦA TÁC NHÂN GÂY BỆNH TEO ĐẦU LÁ NHA ĐAM TẠI NINH THUẬN Sinh viên thực : Lê Minh Trường 1511540265 MSSV : GVHD : ThS Nguyền Thị Nhã TP HỒ CHÍ MINH, 2019 ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH NGUYEN TAT THANH THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP KHOA CỒNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP ĐẶC ĐIÉM HÌNH THÁI, PHÂN TỬ VÀ ĐẶC TÍNH XÂM NHIỄM, SINH HỌC CỦA TÁC NHÂN GÂY BỆNH TEO ĐẦU LÁ NHA ĐAM TẠI NINH THUẬN Sinh viên thực : Lê Minh Trường Mã sô sinh viên : 1511540265 Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Nhà TP HỒ CHÍ MINH, 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYÊN TÁT THÀNH KHOA CỊNG NGHỆ SINH HỌC CỘNG HỊA XÀ HƠI CHÙ NGHĨA VIỆT NAM Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc - -oOo - NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Họ tên: Lê Minh Trường MSSV: 1511540265 Lớp: 15DSH1A Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Đầu đề khóa luận: Đặc điểm hình thái, phân tử đặc tính xâm nhiễm, sinh học tác nhân gây bệnh teo đầu nha đam Ninh Thuận Mục tiêu: - Định danh tác nhân gây bệnh teo đầu nha đam - Nghiên cứu đặc tính sinh học, đường xâm nhiễm lan truyền tác nhân gây bệnh Nội dung: - Nội dung 1: Xác định đặc điểm hình thái, đặc điểm ni cấy tác nhân gây bệnh teo đầu nha dam Ninh Thuận - Nội dung 2: Xác định đường lây nhiễm tác nhân gây bệnh teo đầu thông qua lây nhiễm nhân tạo - Nội dung 3: Định danh phân tử dựa vùng trình tự ITS rRNA tác nhân gây bệnh - Nội dung 4: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ, ánh sáng lên sinh trưởng phát triển tác nhân gây bệnh Thời gian thực hiện: Tháng 02/2019 đến tháng 8/2019 Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Nhã Nội dung yêu cầu KLTN thông qua Bộ môn TP HCM, ngày thảng năm20 Bộ MÔN (Ký ghi rõ họ tên) CÁN Bộ HƯỚNG DẲN (Ký ghi rõ họ tên) LỜI CẢM ƠN Đe hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Ban Giám hiệu Truông Đại học Nguyễn Tất Thành tạo cho tơi bầu khơng khí, mơi trường học tập nghiên cứu tốt nhất, tự hào học trường mang tên Bác suốt năm qua Ban chủ nhiệm khoa, Quý thầy cô khoa Cơng nghệ Sinh học điều kiện, nhiệt tình giảng dạy truyền đạt kiến thức chuyên môn cho suốt năm học tập trường Cô ThS Nguyền Thị Nhã hồ trợ tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập, thực tập nghiên cứu đe hoàn thành tốt đề tài Chị Ks Hồ Thị Cẩm Nguyễn hồ trợ, động viên tơi hồn thành tốt đề tài Các bạn sinh viên phịng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật, phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học Y dược phối hợp, hợp tác đe thực tốt đề tài Cuối xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên, khuyến khích, hồ trợ cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Lê Minh Trường Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ỉ MỤC LỤC ỉi TÓM TẮT V SUMMARY vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC BẢNG BIẾU viii DANH MỤC • CHŨ VIẾT TẤT ix ĐẶT VẤN ĐỀ X CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình sản xuất che biến nha đam Thế Giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình sản xuất chế biến nha đam Thế Giới 1.1.2 Tình hình sản xuất chế biến nha đam Việt Nam 1.2 Bệnh hại nha đam 1.3 Bệnh teo đầu 1.4 Nấm Curvularia sp 1.5 Xác định tác nhân gây bệnh thơng qua đặc điếm hình thái 1.6 Xác định tác nhân gây bệnh thông qua đặc điểm phân tử 1.6.1 PCR (Polymerase Chain Reaction) 1.6.2 Mồi - Primers 1.6.3 Vùng trình tự ITS .9 1.6.4 Điện di 11 1.7 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến quy luật phát sinh, phát triến bệnh hại 12 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 13 2.1 Nơi thực 13 ii 2.2 Nội dung nghiên cứu 13 2.3 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 13 2.3.1 Xác định đặc điếm hình thái, đặc điếm nuôi cấy tác nhân gây bệnh teo đầu nha đam Ninh Thuận 13 2.3.2 Lây nhiễm nhân tạo tác nhân gây bệnh 15 2.3.3 Xác định tác nhân gây bệnh phương pháp định danh phântử 16 2.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ, ánh sáng lên sinh trưởng vàphát triển tác nhân gây bệnh 20 2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng phát trien tác nhân gây bệnh 20 2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng ánh sáng lên sinh trưởng phát triên cùa tác nhân gây bệnh 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Đặc điểm hình thái đặc điểm nuôi cấy tác nhân gây bệnh teo đầu nha dam Ninh Thuận 21 3.1.1 Triệu chứng gây bệnh 21 3.1.2 Phân lập, làm tác nhân gây bệnh 23 3.1.3 Đặc điểm hiến vi nấm gây bệnh teo 24 3.2 Xác định đường xâm nhiễm, lan truyền cùa tác nhân gây bệnh teo đầu thông qua lây nhiễm nhân tạo 25 3.3 Xác định tác nhân gây bệnh phương pháp định danh phân tử 27 3.3.1 PCR khuếch đại vùng trình tự 18S rRNA 28 3.3.2 Giải trình tự sản phẩm PCR 28 3.3.3 Kiểm tra BLAST chủng nấm phân lập 29 3.3.4 Xây dựng phát sinh loài 30 3.4 Ket khảo sát nhiệt độ, ánh sáng lên sinh trưởng phát triển chủng nấm phân lập 33 iii 3.4.1 Kết khảo sát nhiệt độ lên sinh trưởng phát triển cùa chủng nấm phân lập 33 3.4.2 Kết khảo sát ánh sáng lên sinh trưởng phát triển chùng nấm phân lập 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC 42 IV TÓM TẤT Nha đam loại dược phẩm, thực phẩm từ thiên nhiên lợi ích có thành phần mà mang lại, nha dam bị nhiều bệnh làm ảnh hưởng đến chất lượng, suất Chính vậy, đề tài “Đặc điểm hình thái, phân tử đặc tính xâm nhiễm, sinh học tác nhân gây bệnh teo đầu nha đam Ninh Thuận” thực từ tháng 2/2019 đến 8/2019 Phòng Sinh học Phân tử Thực vật, khoa Công nghệ Sinh học, Đại học Nguyễn Tất Thành với mục tiêu nhằm tìm nguyên nhân gây bệnh có biện pháp phịng ngừa thích họp Đe tài có bốn nội dung: Xác định đặc điểm hình thái, đặc điểm ni cấy tác nhân gây bệnh teo đầu nha dam Ninh Thuận; Xác định đường lây nhiềm tác nhân gây bệnh teo đầu thông qua lây nhiễm nhân tạo; Định danh phân tử dựa vùng trình tự ITS rRNA tác nhân gây bệnh; Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ, ánh sáng lên sinh trưởng phát triên tác nhân gây bệnh Những kết đạt sau tháng nghiên cứu: Phân lập tác nhân gây bệnh teo đầu nha dam môi trường PDA với đặc điểm hệ sợi nấm màu nâu, có vách ngăn khơng phân nhánh cuống bào tử có màu nâu đậm, thẳng hình trụ đa lớp Tơ nấm có màu trắng, tơ nấm lan hết đĩa dần chuyến sang màu đen xám bề mặt tản nấm dày hơn, phong cao lên Điều kiện tiên đe bệnh phát trien bào tử nấm bám vào nha dam Tái phân lập mầu bệnh từ lây nhiễm nhân tạo thấy đặc diem hình thái giống với đặc điếm mầu phân lập đồng Đặc điếm di truyền dựa trình tự gen 18S - 28S rRNA cho thấy chủng nấm Curvularia hawaiiensis nghiên cứu phân bố nhóm với chủng nấm phân lập từ nhiều nước khác Bukina Faso, Pakistan, Hà Lan, Thái Lan, Ấn Độ Ngưỡng nhiệt độ từ 25 - 35 °C ngưỡng nhiệt độ cho sợi nấm sinh trưởng phát triển tốt nhất, nhiệt độ thấp từ 18 - 20 °C nấm phát triển chậm nhiệt độ cao 40 °C sợi nấm bị ức chế hoàn toàn Nấm Curvularia hawaiiensis sinh trưởng tất điều kiện chiếu sáng V SUMMARY Aloe vera is a medicinal plant, natural food due to the benefits in the ingredients that plants bring, but now aloe vera has many diseases that affect the quality and productivity of plants Thesis title “Identification of the morphological, molecular, infection and biology of the pathogen causes withered leaves diseases on Aloe vera in Ninh Thuan province” was performed in - 8/2019 in Plant molecular biology laboratory, Faculty of Biotechnology with the intent to identify the pathogen causes diseases and take the most appropriate precautions The project has four contents: Determination of morphological, culture charaterization of the pathogen caused by withered leaves diseases on Aloe vera in Ninh Thuan; Determination the path of infection, spread of the pathogens through artificial infection; Molecular identification of the pathogen and the thermal investigation of temperature and light on the growth and development of the pathogen Results achieved: Isolation of the pathogen causes withered leaves disease on Potato Dextrose Agar medium at room temperature for days, mycelia is dark brown, without branching branch of spore stem with dark brown, straight and multi - layered Prerequisite for the development of disease is spores clinging to Aloe vera leaves After isolation of hyphae on PDA medium similar to hyphae that was isolated field Genetic characterzation based on the sequence of 18S - 28S rRNA gene indicated that Curvularia hawaiiensis in this study were clustered into the group isolated from different countries in the world such as Bukina Faso, Pakistan, Netherlands, Thailand, India Suitable temperature threshold for hyphae growth showed the best condition at 25 - 35 °C, low temperature from 18 - 20 ° c growth slowly and high temperature was attenuated at 40 °C Fungi Curvularia hawaiiensis grow in all lighting conditions vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH • Hình 1.1 Các giai đoạn phản ứng PCR Hình 1.2 Vùng trình tự ITS 11 Hình 3.1 Nha đam bị bệnh teo đầu Ninh Thuận 21 Hình 3.2 Mầu Nha đam bị bệnh teo đầu thu từ Văn Hải, Mỳ Hải Mỹ Bình 22 Hình 3.3 Hình thái cùa nấm mơi trường PDA 23 Hình 3.4 Ket soi kính hiển vi 24 Hình 3.5 Ket lây nhiễm nhân tạo nghiệm thức .26 Hình 3.6 Hình thái hình soi kính hiến vi mầu tái phân lập 27 Hình 3.7 Kêt điện di sản phâm PCR 28 Hình 3.8 Ket đọc trình tự phần mem BioEdit 29 Hình 3.9 Ket BLAST trình tự chủng nấm phân lập 29 Hình 3.10 Cây phát sinh lồi chủng nấm Curvularia hawaiiensis 32 Hình 3.11 Ảnh hưởng nhiêt độ lên phát triển nấm Curvularia hawaiiensis 34 Hình 3.12 Ảnh hưởng ánh sáng lên phát triến nấm Curvularia hawaiiensis 37 vii ... nghệ sinh học Đầu đề khóa luận: Đặc điểm hình thái, phân tử đặc tính xâm nhiễm, sinh học tác nhân gây bệnh teo đầu nha đam Ninh Thuận Mục tiêu: - Định danh tác nhân gây bệnh teo đầu nha đam -... quản lý phịng trừ bệnh Chính vậy, đề tài ? ?Đặc điểm hình thái, phân tử đặc tính xâm nhiễm, sinh học tác nhân gây bệnh teo đầu nha đam Ninh Thuận” thực nhằm tìm tác nhân gây bệnh làm sở cho việc... mà mang lại, nha dam bị nhiều bệnh làm ảnh hưởng đến chất lượng, suất Chính vậy, đề tài ? ?Đặc điểm hình thái, phân tử đặc tính xâm nhiễm, sinh học tác nhân gây bệnh teo đầu nha đam Ninh Thuận”