CHĂN NUÔI ĐỘNG VẬT VÀ CÁC VẤN ĐỀ KHÁC KHKT Chăn nuôi số 265 tháng 5 năm 2021 93 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SP SINH ENZYME VÀ KHÁNG VI KHUẨN ECHERICHIA COLI Nguyễn Thị Hạnh Chi1*, Văng Khá[.]
CHĂN NUÔI ĐỘNG VẬT VÀ CÁC VẤN ĐỀ KHÁC chó lai thấp chó ngoại Vụ ThuĐơng, chó nhiễm ve với tỷ lệ cường độ cao vụ Xuân-Hè TÀI LIỆU THAM KHẢO Cù Xuân Đức (2011) Đặc điểm dịch tễ bệnh ve chó hai huyện, thị tỉnh Thái Nguyên, thử nghiệm thảo dược trị ve chó chó, Luận văn Thạc sĩ khoa học Nông nghiệp, ĐH Thái Nguyên Nguyễn Thanh Hải (2007) Nghiên cứu tác dụng diệt ve ký sinh chó bị chế phẩm thuốc mỡ chế từ Thuốc cá, Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp chuyên ngành thú y, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội Hoepple R and Feny L.C (1933) Experimental Studies on ticks, Chienes Med Tourn, VIII: 29 Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Văn Quang Nguyễn Quang Tuyên (1999) Giáo trình ký sinh trùng thú y, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, trang 170 Nguyễn Thị Kim Lan (2012) Ký sinh trùng bệnh ký sinh trùng thú y, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, trang 244 Latrofa M.S., Dantas-tores F., Giannelli A and Otranto D (2014) Molecular detection of tick-borne pathogens in Rhipicephalus sanguineus group ticks, Ticks Tick Borne Dis., 5(4): 158 Nguyễn Thị Liên (2018) Nghiên cứu số đặc điểm sinh học, dịch tễ học ve ký sinh chó phịng khám thú y Mỹ Đình biện pháp phòng trị, Hà Hải Hà - tỉnh Quảng Ninh, thử nghiệm chiết xuất Thuốc lào Bách trị ve cho chó, Luận văn thạc sĩ Thú y, Học viên Nông nhiệp Việt Nam Maia C., Ferreira A., Nunes M., Vieira M L., Campino L and Cardoso L (2014) Molecular detection of bacterial and parasitic pathogens in hard ticks from Portugal, Ticks Borne Dis., 5(4): 409 Đỗ Thế Mạnh (2015) Nghiên cứu số đặc điểm dịch tễ bệnh ve chó huyện Đầm Hà Hải Hà - tỉnh Quảng Ninh, thử nghiệm chiết xuất Thuốc lào Bách trị ve cho chó, Luận văn thạc sĩ Thú y, Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên 10 Lê Thị Thu Phương (2019) Nghiên cứu số đặc điểm dịch tễ bệnh ve chó ni quận Tây Hồ - Thành phố Hà Nội biện pháp phòng, trị, Luận văn thạc sĩ Thú y, Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên 11 Nguyễn Văn Thiện, Nguyễn Khánh Quắc Nguyễn Duy Hoan (2002) Giáo trình Phương pháp nghiên cứu chăn nuôi, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, trang 72 12 Nguyễn Hồ Bảo Trân Nguyễn Hữu Hưng (2014) Tình hình nhiễm ngoại ký sinh trùng chó thành phố Cần Thơ, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 2: 69 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SP SINH ENZYME VÀ KHÁNG VI KHUẨN ECHERICHIA COLI Nguyễn Thị Hạnh Chi1*, Văng Khánh Ly1, Đặng Nguyễn Hoàng Minh1, Võ Hồng Nhịnh1 Nguyễn Tuyết Giang1 Ngày nhận báo: 30/03/2021 - Ngày nhận phản biện: 12/04/2021 Ngày báo chấp nhận đăng: 24/04/2021 TÓM TẮT Nghiên cứu thực từ tháng 01/2020 đến tháng 4/2020 khu Thực hành - Thí nghiệm trường Đại học An Giang, nhằm phân lập tuyển chọn chủng Bacillus sp có đặc tính sinh học cao Qua kết kiểm tra đặc tính sinh hóa 137 chủng vi khuẩn Bacillus phân lập ban đầu, nghiên cứu sàng lọc 96 chủng Bacillus sp Tiếp tục tuyển chọn chủng Bacillus qua đặc tính sinh enzyme amylase, protease, cellulase phát triển 50oC cho kết 76,04; 95; 85 82,19% Sau đó, ứng dụng kỹ thuật PCR giải trình tự gen 16S rRNA 10 chủng sinh enzyme thu chủng B subtilis, chủng B licheniformis, chủng B cereus chủng B pumilus Các chủng có tương đồng di truyền cao với chủng vi khuẩn Bacillus có GenBank Kiểm tra khả đối kháng 7/8 chủng định danh (bỏ chủng B cereus) E coli, kết đường kính vòng kháng khuẩn 9,3-15,33mm Như vậy, chủng có khả sinh enzyme sử dụng làm nguồn probiotic dùng xử lý chất thải Từ khóa: Bacillus, E coli, đặc tính sinh học, đối kháng, phân lập Trường Đại học An Giang, Đại học Quốc Gia TP HCM Tác giả liên hệ: TS Nguyễn Thị Hạnh Chi, Trường Đại học An Giang, Đại học Quốc Gia TP HCM, Điện thoại: 0914.251.296; Email: nthchi71@gmail.com * KHKT Chăn nuôi số 265 - tháng năm 2021 93 CHĂN NUÔI ĐỘNG VẬT VÀ CÁC VẤN ĐỀ KHÁC ABSTRACT Isolation and selection of Bacillus sp strains for the enzyme production and resistance to E coli The study was conducted from Jan to Apr 2020 at the Practice-Experiment Area of An Giang University, to isolate and select of Bacillus sp strains which exhibited high biological properties Among 137 Bacillus isolates initially isolated, 96 strains were Bacillus sp were screened based on biochemical characteristics These strains were then selected for the properties of producing enzymes amylase, protease, cellulase and development at 50oC with the results of 76.04, 95, 85 and 82.19%, respectively PCR technique and 16S rRNA gen sequencing were used; obtaining two strains of B subtilis, five strains of B licheniformis, two strains of B cereus and one strain of B pumilus These strains possessed overall high genomic similarity with the Bacillus strains in GenBank Further test (without two strains of B cereus) showed that 7/8 strains with antagonistic ability against E coli The inhibition zone of mean diameters ranged from 9.3 to 15.33mm Finally, these seven strains were capable of producing enzymes and can be used as probiotic sources or used in waste treatment Keywords: Bacillus, E coli, biological properties, antagonistic ability, isolation ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, để khắc phục tình trạng chủng vi khuẩn gây bệnh đa kháng với kháng sinh kháng sinh tích lũy thể gia súc gây ảnh hưởng đến sức khoẻ người tiêu dùng, người chăn nuôi ứng dụng biện pháp sinh học, đặc biệt chế phẩm sinh học từ chủng vi khuẩn đối kháng xem giải pháp thay hiệu cung cấp phương thức an tồn, bền vững người ni tiêu dùng Thực tế, sử dụng chế phẩm probiotic mang lại nhiều lợi ích cho người chăn ni hỗ trợ tiêu hóa thức ăn, cân hệ vi sinh đường ruột cách cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh, tác dụng tốt lên hệ thống kháng thể, phòng trừ bệnh tiêu chảy heo hiệu hạn chế stress (Kabir, 2009), từ giảm chi phí phịng bệnh tăng suất cho vật ni (Reuter, 2001) Ở nước ta, chủng vi khuẩn Bacillus nghiên cứu sử dụng phổ biến chúng sở hữu đặc tính quan trọng như: an tồn với người động vật, có khả cạnh tranh vị trí bám dính sản sinh chất kháng khuẩn (bacteriocins) gây bất lợi với chủng vi khuẩn gây bệnh Ngoài ra, chủng vi khuẩn Bacillus có khả sinh enzyme ngoại bào, dễ pha trộn, chịu đựng nhiệt độ cao trình sản xuất, dễ bảo quản 94 Từ lý trên, đề tài “Phân lập, tuyển chọn chủng Bacillus sp sinh enzyme kháng vi khuẩn E coli” tiến hành nhằm đánh giá tiềm vi khuẩn Bacillus, góp phần tạo nguyên liệu cho việc sản xuất chế phẩm probiotics chế phẩm xử lý chất thải rắn chăn nuôi VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Phân lập vi khuẩn Bacillus từ 41 mẫu phân bò, 28 mẫu cỏ 14 mẫu đất huyện Châu Thành, tỉnh An Giang Chủng vi khuẩn E coli (E.VL28d) sử dụng thử nghiệm mang gen mã hóa kháng ngun bám dính F18 ba gen mã hóa độc tố đường ruột Sta, STb EAST1 lưu trữ với 20% glycerol (v/v) -70oC (Nguyễn Thị Hạnh Chi ctv, 2015) Vật liệu, dụng cụ, hóa chất, mơi trường dùng phân lập định danh vi khuẩn Bacillus Vật liệu, dụng cụ, hóa chất, mơi trường dùng thử nghiệm đối kháng với vi khuẩn E coli 2.2 Phương pháp 2.2.1 Phân lập định danh sơ vi khuẩn Bacillus Phân lập vi khuẩn Bacillus theo Guo ctv (2006) kiểm tra đặc tính sinh hóa vi khuẩn Bacillus theo Trần Linh Thước (2010) KHKT Chăn nuôi số 265 - tháng năm 2021 CHĂN NUÔI ĐỘNG VẬT VÀ CÁC VẤN ĐỀ KHÁC 2.2.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus dựa vào đặc tính sinh học Khả phát triển 50oC vi khuẩn khảo sát theo phương pháp Barbosa Levy (2000) có cải tiến Phương pháp xác định khả phân giải cellulose thực theo Cowan Steel (2004) có cải tiến; Phương pháp xác định khả phân giải tinh bột thực theo Harley (2004); Phương pháp xác định khả phân giải protein thực theo phương pháp Harley Prescott (2002) có cải tiến 2.2.3 Định danh vi khuẩn Bacillus kỹ thuật PCR giải trình tự gen 16S rRNA Ly trích DNA theo Zhenxiang ctv (2018) Khuyếch đại đoạn gen 16S rRNA cặp mồi phổ biến có trình tự: F : (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) R : (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’27F) (Saminathan Narayanan, 2015) Chu trình nhiệt phản ứng: chu kỳ: 94oC phút; 35 chu kỳ: 94oC phút, 55oC phút, 72oC phút chu kỳ 72oC 15 phút Giải trình tự đoạn gen 16S rRNA vi khuẩn: sản phẩm PCR sau tinh giải mã trình tự nucleotide Phân tích đặc tính di truyền mức độ phân tử chủng Bacillus Trình tự 16S rRNA phân tích thơng qua phần mềm BioEdit BLAST ngân hàng gen để xác định tương đồng với loài ngân hàng GenBank 2.2.4 Xác định khả đối kháng vi khuẩn gây bệnh Thử nghiệm khả đối kháng theo phương pháp vạch thẳng vng góc thử nghiệm khả đối kháng theo phương pháp khuếch tán: thực theo Kvanỗ v ctv (2014) 2.3 X lý s liu S liệu tổng hợp xử lý thống kê theo ANOVA phần mềm Excel Minitab 16. KHKT Chăn nuôi số 265 - tháng năm 2021 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập định danh vi khuẩn Bacillus sp 3.1.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus sp Kết phân lập 60/137 chủng (43,80%) phát triển mơi trường NA cho khuẩn lạc có màu trắng đục, khơ, bìa bất định, giống với mơ tả David ctv (2016), tác giả cho B subtilis có màu trắng đục, khơ, bìa bất định Kết cịn cho thấy có 43/137 chủng có khuẩn lạc trịn, dẹt, khơ, kích thước tế bào lớn 3µm giống với nhận định Zhenxiang ctv (2018), tác giả cho môi trường NA, khuẩn lạc B subtilis có màu trắng đục, trịn, dẹt, khơ kích cỡ trung bình Để xác định chủng thuộc giống Bacillus, số thí nghiệm cho sàng lọc bước đầu thực như: nhuộm Gram, quan sát hình thái tế bào, nhuộm bào tử, thử nghiệm sinh hóa (indol, voges proskauer, catalase) (Guo ctv, 2006; Zhenxiang ctv, 2018) Kết thu tổng cộng 137 chủng vi khuẩn có hình que, Gram dương có khả sinh bào tử quan sát sau 48 Trong đó, 50,36% khuẩn lạc có bào tử trung tâm 37,96% khuẩn lạc có bào tử khơng làm biến đổi hình dạng tế bào Điều cho thấy 137 chủng vi khuẩn có nhiều chủng có tiềm B subtilis 3.1.2 Định danh Bacillus sp phản ứng sinh hóa Từ 137 chủng phân lập, tiêu sinh hóa tiến hành kiểm tra đặc tính sinh hóa theo trình tự: tế bào vi khuẩn bắt màu tím sau nhuộm Gram, vi khuẩn có khả di động, dương tính với catalase, Voges Proskauer âm tính với indol (Cowan Steel, 2004) Theo quy trình chọn lọc, 100% chủng vi khuẩn B subtilis trực khuẩn Gram dương; 119/137 chủng có tính di động (86,86%); 116/137 chủng khơng có khả chuyển đổi tryptophan thành indole Tiếp tục kiểm tra phản ứng catalase, 122/137 chủng dương tính với catalase; 96/137 chủng cho kết dương tính với VP, 41 chủng cho kết âm tính bị loại bỏ 95 CHĂN NUÔI ĐỘNG VẬT VÀ CÁC VẤN ĐỀ KHÁC Bảng Sàng lọc Bacillus sp qua đặc tính sinh hóa Chỉ tiêu Gram dương Di động (+ tính) Indol (- tính) Catalase (+ tính) n 137 119 116 122 Tỷ lệ (%) 100,00 86,86 84,67 89,05 VP (Voges Proskauer) (+ tính) 96 70,07 3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp 3.2.1 Đặc tính sinh học chủng vi khuẩn Bacillus sp Qua kết kiểm tra đặc tính sinh hóa, sàng lọc 96 chủng Bacillus sp Tiếp tục tuyển chọn chủng Bacillus qua đặc tính sinh học, loại dần chủng không đạt yêu cầu Bảng Chọn Bacillus sp qua đặc tính sinh học Chỉ tiêu Amylase (+ tính) Phát triển 50oC Cellulase (+ tính) Protease (+ tính) n 96 73 60 60 Kết Tỷ lệ (%) 73 76,04 60 82,19 51 85,00 57 95,00 Kết Bảng cho thấy, đặc tính sinh học kiểm tra amylase, để kiểm tra khả thủy phân tinh bột 96 chủng vi khuẩn Dựa nguyên tắc amylase xúc tác thủy phân tinh bột thành đường, lượng tinh bột lại phản ứng màu với iod Kết kiểm tra cho thấy có 73/96 chủng dương tính với amylase, có khả phân giải tinh bột Bào tử B subtilis ghi nhận có khả phát triển 50oC (Cowan Steel, 2004) Kết kiểm tra cho thấy có 60 chủng có khả phát triển 50oC, loại bỏ 13 chủng cho kết âm tính Phản ứng thực để kiểm tra khả thủy phân gelatine nhằm xác định chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme protease Kết kiểm tra có 57/60 chủng có khả phân giải protease Kết phù hợp với nhận định Gori ctv (2011); Sundarram Murthy (2014) đặc tính bật lồi Bacillus có khả sinh nhiều loại enzyme có hoạt tính cao enzyme cellulase, protease amylase Bacillus có khả tiết enzyme protease góp phần phân hủy nhanh chất 96 hữu Theo Kim ctv (2012), vi khuẩn B subtilis có khả sản xuất loại enzyme CMCase, FPCase, Avicelase xylanase β-glucosidase cho khả phân giải nhiều loại chất kể tinh thể cellulose Kết kiểm tra cho thấy có 51 chủng có enzyme cellulase khả sinh enzyme amylase, protease có khả phát triển nhiệt độ cao (50oC) Như vậy, nghiên cứu tuyển chọn 51 chủng có đặc tính sinh học có lợi cho q trình phân hủy chất hữu Nghiên cứu tiếp tục chọn 10/51 chủng có đồng thời ba đặc tính sinh học để định danh kỹ thuật PCR giải trình tự gen 3.2.2 Định danh vi khuẩn Bacillus kỹ thuật PCR giải trình tự gen 16S rRNA Mười sản phẩm PCR (ly trích từ mười chủng Bacillus sp.) điện di thạch agarose 2% Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy khuyếch đại thành công đoạn gen có kích thước 1.500bp mười chủng vi khuẩn dương tính (Hình 1) Để xác định danh pháp đến mức loài, chủng vi khuẩn sau thực phản ứng PCR tiến hành giải trình tự nucleotide đoạn gen 16S rRNA Trình tự nucleotide 10 chủng vi khuẩn chọn sau giải mã tiến hành so sánh với loài vi khuẩn lưu trữ từ ngân hàng liệu gen NCBI (Bảng 3) Hình Sản phẩm điện di phản ứng PCR xác định Bacillus (1.500bp) thạch agarose DL: DNA marker 100bp; giếng 1-8: dương tính C175d; D1-5a; B15-5d; Đ15-5b; C17-5b; B15-5b; D16-3b; C17-4b Bảng cho thấy, 10 chủng vi khuẩn Bacillus có mang gen mã hóa vi khuẩn Bacillus phân lập từ phân bò, đất cỏ Trong đó, có chủng có tương đồng di KHKT Chăn nuôi số 265 - tháng năm 2021 CHĂN NUÔI ĐỘNG VẬT VÀ CÁC VẤN ĐỀ KHÁC truyền cao (99,32-99,76%) với chủng với chủng vi khuẩn B pumilus có vi khuẩn B subtilis có ngân hàng gen; GenBank Điều chứng minh 8/10 chủng chủng có tương đồng di truyền cao (90,37- Bacillus phân lập huyện Châu Thành 99,77%) với chủng vi khuẩn B licheniformis nghiên cứu có trình tự nucleotide có GenBank; chủng có tương đồng khơng có sai khác nhiều so với chủng di truyền cao (99,93-100%) với chủng vi công bố giới có mức tương khuẩn B cereus có GenBank chủng đồng đạt ≥99% có tương đồng di truyền cao (99,51%) Bảng Kết định danh Bacillus phương pháp giải trình tự gen Chủng Bacillus phân lập D1-5a C15-4b B15-5b B15-5d STT P 3-3 D15-5b D16-3b C17-4b C17-5b C17-5d 10 Chủng vi khuẩn tham chiếu NCBI Bacillus subtilis Bacillus pumilus Bacillus cereus Bacillus licheniformis Bacillus cereus Bacillus licheniformis Bacillus subtilis Bacillus licheniformis Bacillus licheniformis Bacillus licheniformis Mã ngân hàng gen GQ280099.1 Tỷ lệ tương đồng (%) 99,32 MN216227.1 JN998748.1 99,93 93,68 KC771039.1 99,51 CP039269.1 NR118996.1 100,00 99,00 KM277364.1 JQ660649.1 KP216572.1 99,77 90,37 99,22 MH910177.1 99,76 Ghi chú: NCBI: National Center for Biotechnology Information Tóm lại, từ 137 chủng vi khuẩn phân lập ban đầu sau tiến hành bước chọn lọc phương pháp kiểm tra phản ứng sinh hóa, đặc tính sinh học,… ứng dụng kỹ thuật PCR giải trình tự gen 16S rRNA 10 chủng, kết có chủng B subtilis, chủng B licheniformis, chủng B cereus chủng B pumilus Trong trình chọn lọc, nghiên cứu bỏ qua khơng kiểm tra phản ứng sinh hóa lecithinase để loại bỏ lồi Bacillus có độc tính Vì lecithinase enzyme có khả phá vỡ hệ thống mô bào, gây ngộ độc (Sharaf ctv, 2014) Theo UK Standards for Microbiology Investigations (2015), loài Bacillus âm tính với lecithinase, ngoại trừ nhóm B cereus Do đó, có 2/10 chủng bị loại sau xác định B cereus 3.2.3 Khả đối kháng vi khuẩn Bacillus với E coli gây bệnh tiêu chảy heo a Khả đối kháng theo phương pháp vạch thẳng vng góc Bảng Kết đối kháng theo phương pháp vạch thẳng vng góc chủng Bacillus sp STT Chủng Bacillus phân lập D16-3b D1-5a C15-4b C17-5b C17-5d D15-5b B15-5b C17-4b Khoảng cách kháng khuẩn 24 (mm) 15,44a±0,19 12,67b±0,39 12,44bc±0,60 11,67bc±0,33 11,22c±0,80 6,89d±0,69 4,44e±0,20 Khoảng cách kháng khuẩn 32 (mm) 15,33a±0,33 12,89b±0,58 13,33b±0,51 12,00b±0,88 12,00b±0,57 7,67c±0,33 5,78d±0,19 Khoảng cách kháng khuẩn 48 (mm) 12,67a±0,88 11,00b±0,19 9,78b±0,67 10,00b±0,33 9,78b±0,19 5,22 ±0,84 3,78c±0,39 - P