Phân tích đồng thời các chất kích thích sinh trưởng thực vật cytokinin trong rau xanh

Trích dẫn bài viết Vietnam J Chem , 2020, 58(6E12), 16 20 Bài nghiên cứu 16 Phân tích đồng thời các chất kích thích sinh trưởng thực vật cytokinin trong rau xanh Lê Văn Nhân 1,2* , Nguyễn Ngọc Tùng 1[.]

Trích dẫn viết: Vietnam J Chem., 2020, 58(6E12), 16-20 Bài nghiên cứu Phân tích đồng thời chất kích thích sinh trưởng thực vật cytokinin rau xanh Lê Văn Nhân1,2*, Nguyễn Ngọc Tùng1, Nguyễn Quang Trung1 Trung tâm Nghiên cứu Chuyển giao Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, 18 Hồng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội 10000, Việt Nam Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, 18 Hồng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội 10000, Việt Nam Đến Tòa soạn 24-6-2020; Chấp nhận đăng 15-12-2020 Abstract Plant growth regulators belonged to Cytokinins such as N6-benzyladenine, N6-isopentenyladenine, isopentenyladenosine, trans-zeatin, kinetin, dihydrozeatin riboside, and trans-zeatin riboside were studied Plant tissues were finely ground into powder, then were extracted by 2-propanol/deionized water/HCl (2/1/0.002 v/v/v) and dichloromethane This method showed good linearity for all plant growth regulators, with regression coefficients R2 > 0.998 The limit of detection ranged from 0.2 to 4.6 ng g -1, the overall average of recovery of plant growth regulators ranged from 82.30 % to 92.30 %, and the repeatability standard deviation was less than 20 % The proposed method is fast, simple, sensitive, accurate, and efficient for the analysis of cytokinins in vegetables, which could be the basis to develop the method for determination of cytokinins in other vegetables as agricultural products This supports to the local authorities in monitoring the application of plant growth regulators in agricultural production and thereby minimizing the potential health risks for consumers Keywords Cytokinin, plant growth regulator, vegetable, simultaneous analysis MỞ ĐẦU Việc phát triển phương pháp phân tích định lượng hormone thách thức lớn nhà khoa học, chúng diện nồng độ thấp mô thực vật (10-9 đến 10-6 M) (Maren Sergi, 2011; Izumi et al., 2009) Ngồi ra, chất kích thích sinh trưởng có tính chất hóa học cấu trúc đa dạng, khiến cho việc định lượng đồng thời trở nên khó khăn (Yu et al., 2012) Nhiều phương pháp xác định định lượng phytohormone báo cáo như: bioassay, xét nghiệm miễn dịch, sắc ký khí khối phổ (GC-MS) Tuy nhiên, phương pháp có nhiều hạn chế liên quan đến việc chuẩn bị mẫu, độ đặc hiệu độ lặp lại thấp, nhiều chất bị phân hủy nhiệt độ cao (GC),… gây cản trở việc ứng dụng chúng phân tích chất kích thích sinh trưởng thực vật (Weiler, 1984; Sandberg et al., 1987; Meyer et al., 2003; Del Blanch, 2007) Qingfeng et al (2014) báo cáo sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với đầu dị điện hóa hiệu thấp phân tích định lượng hormone thực vật nội sinh hàm lượng nano mẫu thực vật Điều trình tinh chế phức tạp 16 khó khăn việc đạt giới hạn định lượng (LOQ) cần thiết với mẫu nhỏ (Pan et al., 2010) Sự phát triển đầu dò khối phổ kết hợp với sắc ký lỏng (LC) giúp cải thiện độ nhạy độ chọn lọc, cho phép xác định định lượng đồng thời nhiều hợp chất thí nghiệm (Matías et al., 2015; Qingfeng et al., 2014; Ljung cộng sự, 2004) Tuy nhiên, cách tiếp cận khác yêu cầu tùy thuộc vào phương pháp tách loại đầu dị khối phổ, ví dụ: đầu dò ba tứ cực (TQ), bẫy ion, tứ cực thời gian bay (Q-TOF) Orbitrap Do đó, việc phát triển phương pháp nhanh chóng, đơn giản, độ nhạy cao, xác hiệu để phân tích định lượng chất kích thích sinh trưởng thực vật mẫu sinh học phức tạp quan trọng nghiên cứu thực vật Mục tiêu nghiên cứu phát triển xác nhận phương pháp phân tích, sử dụng HPLC/ESI-MS để định lượng đồng thời chất kích thích sinh trưởng thực vật rau gồm: N6benzyladenine (BA), N6-isopentenyladenine (iP), isopentenyladenosine (iPR), kinetin (K), trans-zeatin (tZ), dihydrozeatin riboside (DHZR) trans-zeatin riboside (tZR) Lê Văn Nhân cộng TCHH, 58(6E12), 2020 THÍ NGHIỆM Xcallibur (Version 2.2, Thermo Fisher Scientific) 2.1 Hóa chất thí nghiệm Các chất chuẩn BA (≥ 98 %), iP (≥ 99 %), iPR (≥ 99 %), tZ (≥ 99 %), K (≥ 98 %), DHZR (≥ 98 %), tZR (≥ 98 %) mua từ Công ty OlChemim Ltd (Olomouc, Czech Republic Các dung môi metanol (MeOH; HPLC grade; 99,80 %) formic acid (FA; ≥ 98 %) cung cấp Tập đoàn Sigma−Aldrich (Singapore) Nước cất sản xuất máy Milli-Q Integral Water Purification System (Merck Millipore, France) Phịng thí nghiệm Trọng điểm An tồn thực phẩm Mơi trường - Trung tâm Nghiên cứu Chuyển giao Công nghệ 2.2 Phương pháp xử lý phân tích mẫu Điều kiện phân tích HPLC  Thiết bị Ultimate 30000 UPLC system (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany)  Cột sắc ký: Hypersll GOLD aQ with DIM 150 2,1 mm, kích thước hạt: µm  Pha động A: nước deion (chứa 0,1 % axit formic)  Pha động B: MeOH (chứa 0,1 % axit formic)  Tốc độ dòng: 0,1 mL/min  Khay đựng mẫu trì oC cột tách kiểm soát điều kiện 40 oC  Các chất kích thích tăng trưởng tách cột sắc ký rửa giải pha động theo chế độ thay đổi dòng thời gian 15 phút với tỷ lệ dung môi metanol biến đổi từ 30-90 % Điều kiện khối phổ Việc định lượng xác định chất kích thích tăng trưởng chất chuyển hóa chúng thực thiết bị phân tích khối phổ LCQ Fleet MS (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Đức) trang bị nguồn ion hóa điện hóa (ESI) Dung dịch chuẩn nồng độ ng.µL-1 hc-mơn tăng trưởng chuẩn bị hỗn hợp MeOH/H2O/FA (50/50/0,001, v/v/v) Dung dịch chuẩn bơm trực tiếp vào detector MS thông qua đầu kim bơm Hamilton (500 µL, Hoa Kỳ) tốc độ dịng µL.min-1 Các điều kiện phân tích khối phổ tối ưu hóa thiết lập bao gồm: nhiệt độ nguồn phun 100 o C, lưu lượng khí mang 25 arb, lưu lượng khí bổ trợ arb, lưu lượng khí qt buồng ion hóa arb, điện nguồn phun 3,6 kV, nhiệt độ mao quản 200 oC, điện mao quản -11 V điện thấu kính hội tụ ion -55,98 V Các liệu phân tích, xử lý đánh giá thiết bị khối phổ MS thực phần mềm 17 Hình 1: Sơ đồ quy trình xử lý phân tích chất kích thích sinh trưởng thực vật rau Xây dựng đường chuẩn xác minh phương pháp Tùy theo đối tượng mẫu phân tích mà xây dựng đường chuẩn mẫu cách sử dụng hỗn hợp dung dịch chuẩn trung gian 10 µg mL-1 pha thành điểm chuẩn có nồng độ khác gồm 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1,000 ng mL-1 nhằm xác minh tính chọn lọc phương pháp phân tích Đường chuẩn chất kích thích sinh trưởng xây dựng từ việc tính tốn diện tích pic, sử dụng q trình xác minh định lượng Giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp phân tích tính tốn dựa tỷ lệ cường độ tín hiệu chất phân tích so với đường cách thêm chuẩn 10 ppb vào mẫu phân tích thiết bị LC-ESI-MS2 Trong đó, MDL = × S/N MQL = 10 × S/N, hay MQL = 10/3 × S/N [EMA, 2012] Độ thu hồi (R) phương pháp giá trị dùng để đánh giá độ xác phương pháp phân tích, tính tốn cách so sánh hàm lượng chất kích thích sinh trưởng có mẫu thêm chuẩn/chiết chiết/thêm chuẩn Các mẫu thêm chuẩn chuẩn bị cách pha vào ống Teflon chứa 300 mg mẫu tươi cần phần tích với mL dung Phân tích đồng thời chất… TCHH, 58(6E12), 2020 R (%) = A/B  100 % đó: A B diện tích pic chất cần phân tích mẫu thêm chuẩn/chiết mẫu chiết/thêm chuẩn dịch loại chất kích thích sinh trưởng ba nồng độ khác nhau, gồm 10 ng.mL-1 (mức thấp), 100 ng.mL-1 (mức trung bình) 1.000 ng.mL-1 (mức cao) Các mẫu pha sau chiết miêu tả Phần cịn lại sau thổi khơ dịng khí nitơ hòa tan dung dịch MeOH chứa hàm lượng cuối chất kích thích sinh trưởng Tất mẫu kiểm chuẩn thực lặp lại ba lần Kết phân tích trình bày dạng: Giá trị trung bình ± SD KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân tích chất kích thích sinh trưởng thực vật Hình 2: Sắc ký đồ chất kích thích sinh trưởng Cytokinin Nhìn chung, hợp chất kích thích sinh trưởng rửa giải toàn khoảng thời gian 10 phút trình rửa giải theo chế độ thiết lập sẵn, với pha động MeOH nước DI Hình cho thấy tZR rửa giải 4,29 phút, tiếp DHZR tZ 4,40 4,44 phút Bốn loại chất kích thích sinh trưởng cịn lại bao gồm K, iPR, BA iP phát theo thứ tự 4,99 phút, 5,38 phút, 5,56 phút 5,61 phút Sự khác biệt q trình chuyển hóa từ ion tiền chất thành ion sản phẩm theo phương pháp SRM cho phép phát chất kích thích sinh trưởng có hỗn hợp Để phân tích định tính cách xác hợp chất này, giá trị thời gian rửa giải sắc ký lỏng LC kết phân tích chuyển hóa ion tiền chất thành ion sản phẩm khối phổ ESI-MS/MS hai thông số vô quan trọng Đây hai thơng số việc phân tích định lượng hợp chất kích thích sinh trưởng có mẫu rau mẫu sản phẩm nông nghiệp khác 3.2 Đường chuẩn, giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Giới hạn phát (MDL) giới hạn định lượng (MQL) hai thông số dùng để xác minh phương pháp phân tích Đường chuẩn cho tất hợp chất kích thích sinh trưởng xây dựng dựa mẫu chuẩn có nồng độ 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 1.000 ng mL-1, mẫu phân tích lặp lại ba lần Hệ số tương quan (R2) cao thu 0,9999 phân tích hai chất kích thích sinh trưởng DHZR tZ, 0,9995 phân tích hai chất kích thích sinh trưởng iP Giá trị R2 iPR K ghi nhận 0,9988 0,9982 Nhìn chung, hệ số tương quan hợp chất kích thích sinh trưởng cao giá trị 0,99 coi chấp nhận Bảng liệt kê giá trị giới hạn phát (MDL) giới hạn định lượng (MQL) Trong đó, giá trị MDL nồng độ thấp chất cần phân tích mà hệ thống phân tích cịn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín 18 Lê Văn Nhân cộng TCHH, 58(6E12), 2020 hiệu nền, định nghĩa ngưỡng nồng độ mà tỷ lệ tín hiệu chất cần phân tích/tín hiệu nhiễu (S/N) = Các chất kích thích sinh trưởng BA, DHZR, iP, tZ tZR phát mức ng g-1 K iPR phát mức 1,2 4,6 ng g-1 (bảng 1) dao động từ 82,37 % đến 97,75 % nhóm chất có nồng độ thấp, từ 76,81 % đến 92,23 % nhóm chất có nồng độ trung bình từ 75,20 % đến 96,72 % nhóm chất có nồng độ cao Do đó, hiệu suất thu hồi trung bình PGR cao, dao động từ 82,30 % đến 92,30 % Độ lệch chuẩn lặp lại (RSD) độ thu hồi cho ba nhóm nồng độ 20% Theo tài liệu hướng dẫn SANTE/11813/2017, giá trị hiệu suất thu hồi trung bình chấp nhận dựa xác nhận ban đầu nằm phạm vi 70 đến 120 %, với RSD liên quan ≤ 20 %, cho chất phân tích phạm vi phương pháp định Kết nghiên cứu cho thấy phương pháp chiết xuất phù hợp để phân tích PGRs mẫu rau Bảng 1: Các thơng số đường chuẩn hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật Chất Đường chuẩn BA y = 7,59x + 11,48 R2 MDL MQL (ng g-1) (ng g-1) 0,9989 0,3 1,0 DHZR y = 49,245x + 145,59 0,9999 0,6 iP y = 49,32x – 32,74 0,9995 0,5 iPR y = 2,0122x - 12,26 0,9988 4,6 2,0 1,5 K y = 30,32x + 7,68 tZ y = 70,48x - 80,36 0,9999 0,2 0,6 tZR y = 92,742x + 176,7 0,9992 0,3 0,9 0,9982 1,2 KẾT LUẬN 15,2 Chúng tơi phát triển phương pháp phân tích định lượng đồng thời cytokinin rau xanh gồm: BA, iP, iPR, K, tZ, tZR, DHZR sử dụng thiết bị HPLC-ESI-MS Phương pháp có độ tuyến tính tốt cho tất chất kích thích sinh trưởng, với hệ số hồi quy R2 > 0,998 Giới hạn phát nằm khoảng từ 0,2 đến 4,6 ng g-1, hiệu suất thu hồi trung bình PGRs dao động từ 82,30 % đến 92,30 % độ lệch chuẩn lặp lại 20 % Đây phương pháp xem nhanh chóng, đơn giản, độ nhạy cao, xác hiệu để phân tích chất kích thích sinh trưởng thực vật rau Đây sở tin cậy việc nghiên cứu định lượng dư lượng chất tăng trưởng thực vật tích lũy sản phẩm nơng nghiệp 4,0 Giá trị MQL nồng độ thấp chất cần phân tích cho kết phân tích định lượng xác, định nghĩa ngưỡng nồng độ mà tỷ lệ tín hiệu chất cần phân tích/tín hiệu nhiễu (S/N) cao 10 Kết phân tích cho thấy, giá trị MQL chất kích thích sinh trưởng có khác rõ rệt Trong đó, giá trị MDL thấp thuộc tZ (0,6 ng g-1), tZR (0,9 ng g-1) BA (1,0 ng g-1) Vị trí thứ tư thứ năm thuộc chất iP DHZR với MQL 1,5 and 2,0 ng g-1 Giá trị MQL cao ghi nhận hợp chất K với 4,0 ng g-1, cao hợp chất iPR với 15,2 ng g-1 Kết nghiên cứu cho thấy giá trị MDL MQL có khác chất kích thích sinh trưởng, phản ánh tính phù hợp phương pháp phân tích vấn đề định tính định lượng hợp chất kích thích sinh trường mẫu rau sản phẩm nông nghiệp khác Lời cảm ơn Nghiên cứu hỗ trợ thực nhiệm vụ khoa học cơng nghệ có mã số: QTHU01.01/20-21 TDNDTP.01/19-21 TÀI LIỆU THAM KHẢO 3.3 Hiệu suất thu hồi trình tách chiết Hiệu suất thu hồi xác định tỷ lệ hàm lượng chất kích thích sinh trưởng thực vật có mẫu thêm chuẩn/chiết xuất mẫu chiết xuất/thêm chuẩn Các giá trị hiệu suất thu hồi PGR phân loại thành mức độ khác gồm: thấp, trung bình cao với nồng độ tương ứng là: 10, 100 1.000 ng mL-1 Hiệu suất thu hồi trung bình khác nồng độ khác PGR, khác PGR khác có nồng độ Hiệu suất thu hồi 19 Zhao Y C., Li H S., Ren X M., Lin P Z., Xiao Y L., Zhi W Z., Ming X C Profiling of phytohormones and their major metabolites in rice using binary solid-phase extraction and liquid chromatography triple quadrupole mass spectrometry, J Chromatogr A., 2016, 1451, 67-74 Marília A T., Gezimar D D S., Edson R F., William B and Axel M Validate method for phytohormone quantification in plants, Front Plant Sci., 2014, 5, 417 Matías M., Aurelio G C., Vicent A Rapid and reproducible determination of active gibberelins in citrus tissues by UPLC/ESI-MS/MS, Plant Physiol Biochem 2015, 94, 1-9 Maren M and Sergi M B Rapid and sensitive hormonal profilling of complex plant samples by Phân tích đồng thời chất… TCHH, 58(6E12), 2020 Bảng 2: Độ lặp lại độ thu hồi chất kích thích sinh trưởng thực vật Hợp chất BA DHZR iP iPR K tZ tZR Nồng độ pha (µg mL-1) 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 Độ lặp lại (RSD, %) 0,56 0,06 0,02 0,82 1,11 1,11 1,22 0,58 0,22 17,17 2,83 1,66 1,46 1,91 0,28 0,67 1,25 1,60 3,39 9,13 7,45 Độ thu hồi* (%) 92,47 82,48 75,20 90,77 89,21 90,83 97,51 92,23 83,09 86,30 89,76 78,48 90,81 89,36 96,72 87,26 87,97 89,96 82,37 76,81 87,71 Độ thu hồi TB (%)* 83,38±6,87 90,26±0,92 90,95±7,29 84,85±5,78 92,30±3,90 88,40±1,40 82,30±5,45 (*) Biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, n = 6 liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry, Plant Methods, 2011, 7, 37 Izumi Y., Okazawa A., Bamba T., Kobayashi A., Fukusaki E Development of a method for comprehensive and quantitative analysis of plant hormones by highly sensitive nanoflow liquid chromatography-electrospray ionization-ion trap mass spectrometry, Anal Chim Acta., 2009, 648(2), 215-225 Yu B., Fuyou D., Yu B and Huwei L Determination strategies of phytohormones: recent advances, Anal Methods., 2012, 2(12), 1867-1873 Volksch B., Bublitz F., and Fritsche W Coronatine production by Pseudomonas syringae pathovars: screening method and capacity of product formation, J Basic Microbiol., 1989, 29, 463-468 Weiler E W Immunoassay of plant growth regulators, Annu Rev Plant Physiol., 1984, 35, 8595 Sandberg G., Crozier A and Ernstsen A Indole-3acetic acid and related compounds In: Rivier L and Crozier A (Ed.), Principles and practice of plant hormone analysis, Academic Press, London, 1987, pp 233 10 Meyer R., Rautenbach G F., Dubery I A Identification and quantification of methyl jasmonate in leaf volatiles of Arabidopsis thaliana using solidphase microextraction in combination with gas chromatography and mass spectrometry, Phytochem Anal., 2003, 14, 155-159 11 Del C M L R, Blanch G P Enantiomeric purity of (±)-methyl jasmonate in fresh leaf samples and commercial fragrances, J Sep Sci., 2007, 30, 21172122 12 Qingfeng N., Yu Z., Minjie Q., Fengxia Y and Yuanwen T Simultaneous quantitative determination of major plant hormones in pear flowers and fruit by UPLC/ESI-MS/MS, Anal Methods, 2014, 6(6), 1766 13 Ljung, K., Sandberg, G., Moritz, T Hormone analysis In: Davies, P (Ed.), Plant horm Biosynthesis, Signal Transduct Action! Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL., 2004, 671-694 14 EMA, Bioanalytical method validation, European Medicines Agency, 2012 [Online] Available: https://www.ema.europa.eu/en/bioanalytical-methodvalidation [Accessed: 08-Dec-2019] Liên hệ: Lê Văn Nhân Trung tâm Nghiên cứu Chuyển giao Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Số 18, Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội 10000, Việt Nam Điện thoại: +84- 985679437; E-mail: levannhan.na@gmail.com 20 ... 0,9999 phân tích hai chất kích thích sinh trưởng DHZR tZ, 0,9995 phân tích hai chất kích thích sinh trưởng iP Giá trị R2 iPR K ghi nhận 0,9988 0,9982 Nhìn chung, hệ số tương quan hợp chất kích thích. .. cuối chất kích thích sinh trưởng Tất mẫu kiểm chuẩn thực lặp lại ba lần Kết phân tích trình bày dạng: Giá trị trung bình ± SD KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân tích chất kích thích sinh trưởng thực. .. để phân tích chất kích thích sinh trưởng thực vật rau Đây sở tin cậy việc nghiên cứu định lượng dư lượng chất tăng trưởng thực vật tích lũy sản phẩm nơng nghiệp 4,0 Giá trị MQL nồng độ thấp chất