Xác định tác nhân gây bệnh thối trái mít trồng tại Tiền Giang

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH 0O0 BÁO CÁO TỐNG KÉT ĐÈ TÀI CHƯƠNG TRÌNH SINH VIÊN NCKH NĂM 2020 TÊN ĐÈ TÀI: XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH THĨI TRÁI MÍT TRỊNG TẠI TIỀN GIANG Mã số đề tài: Chủ nhiệm đề tài: Mai Phạm Minh Trí Giảng viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Nhã Khoa: Cơng nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh, thảng 10 năm 2020 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, sơ ĐỒ, HÌNH ẢNH CHƯƠNG TỎNG QUAN CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.2 Phân lập làm tác nhân gây bệnh 2.3 Nuôi tăng sinh môi trường LB lỏng 2.4 Phưcmg pháp nhuộm Gram tế bào vi khuẩn 2.5 Phưong pháp lây nhiễm nhân tạo 2.6 Phương pháp tách chiết DNA 10 2.7 Phản ứng Polymerase Chain Reaction 11 2.8 Phương pháp điện di 11 CHƯƠNG KÉT QUẢ VÀ SẢN PHẨM ĐẠT ĐƯỢC 13 3.1 Triệu chứng bệnh trái mít 13 3.2 Ket phân lập mẫu bệnh 13 3.3 Ket nuôi tăng sinh 14 3.4 Ket nhuộm Gram 14 3.5 Ket lây nhiễm nhân tạo 15 3.6 Đặc điểm phân tử vùng nhận dạng trình từ vi khuẩn 16S rRNA 17 3.6.1 Kết điện di sản phẩm PCR 17 3.6.2 Giải trình tự sản phẩm PCR vùng trình tự 16S rRNA 18 3.6.3 Ket PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu với Klebsiella variicola Pectobacterium carotovorum 19 3.6.4 Ket xây dựng phát sinh loài 21 CHƯƠNG KẾT LUẬN 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO 25 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIÉT TẤT FAO : Tổ chức Lương nông Liên Hiệp Quốc (Food and Agriculture Organization) NA : Nutrient Agar LB : Luria Bertani ITS : Internal Transcribed Spacer PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic Acid DNA : Deoxyribonucleic Acid TBE : Tris - Borate - EDTA NCBI : National Center for Biotechnology Information BLAST : Basic Local Alignment Search Tool Taq : Thermus aquaticus Bp : Base pair uv : Ultraviolet F : Forward R : Reverse ELISA : Enzyme - linked Immunosorbent Assay DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, sơ ĐỊ, HÌNH ẢNH Bảng 2.1 Các thành phần phản ứng PCR 11 Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 11 Bảng 3.1 Danh sách chủng Klebsiella sp tham chiếu 21 Hình 3.1 Ket phân lập mẫu bệnh thối trái mít 13 Hình 3.2 Ket nuôi tăng sinh môi trường LB lỏng 14 Hình 3.3 Ket quan sát vi khuẩn kính hiển vi 15 Hình 3.4 Mầu mít bị bệnh sau tiêm dịch tăng sinh vi khuẩn 16 Hình 3.5 Quả mít bị bệnh sau 4-5 ngày tiêm dịch vi khuẩn 16 Hình 3.6 Tái phân lập lại mẫu bệnh 17 Hình 3.7 Ket điện di sản phẩm PCR khuếch đại vùng trình tự 16S rRNA 18 Hình 3.8 Ket đọc trình tự phần mềm BioEdit 18 Hình 3.9 Ket BLAST trình tự vi khuẩn gây bệnh với sở liệu NCBI 19 Hình 3.10 Kết điện di với cặp mồi Hsp60 EXPCC .21 Hình 3.11 Cây phát sinh lồi chủng vi khuẩn Klebsiella variicola 22 CHƯƠNG TƠNG QUAN Tính cấp thiết đề tài Mít (Ạrtocarpus heterophyllus Lam.) ăn thuộc họ dâu tằm Moraceae, có nguồn gốc từ khu vực Western Ghats Ấn Độ Bên cạnh nguồn cung cấp thực phẩm, muối khống vitamin, mít cịn nguồn cung cấp gỗ, duợc liệu nhiều công dụng khác, nguồn thực phẩm sẵn có cho khu vực nông thôn nuớc phát Nam Á Đông Nam Á Thống kê năm 2018, diện tích trồng mít nước khoảng 26.174 ha, suất 16,5 tấn/ha, sản lượng 307.534 tấn; vùng Đồng Bằng Sơng Cửu Long có diện tích lớn với 10.105 Riêng tháng đầu năm 2019, nông dân tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long tiếp tục trồng 1.141 mít Thái Theo ghi nhận gần Tổ chức Lương nông Liên Hiệp Quốc (FAO), Trung Quốc phát triển diện tích mít lên đến 180.000 Hiện nước ta diện tích mít Thái ngày tăng giá lại có xu hướng giảm nhẹ, nhiên, nhiều nhà vườn cho biết với mức giá thu nhập từ trồng mít tốt nhiều so với trồng lúa Thị trường xuất mít Thái chủ yếu Trung Quốc, thị trường xuất hàng hóa lớn Việt Nam, đặc biệt nông sản Thị trường siết chặt nhập tiểu ngạch để chuyển sang nhập ngạch, với yêu cầu cao chất lượng, truy xuất nguồn gốc, xuất xứ Trong năm gần đây, bệnh hại trái mít gây tổn thất lớn đến suất, chất lượng sản phẩm, khiến cho nhiều hộ nông dân trồng mít bị thiệt hại nặng nề Trong số loại bệnh bệnh thối trái gây thiệt hại nặng để lại hậu nghiêm trọng Đã có vài báo cáo tỉnh phía Nam nguy lây lan tình hình phát triển bệnh thối trái mít gây tổn thất cho nơng nghiệp Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu chi tiết tác nhân gây bệnh yếu tố liên quan đến phát sinh bệnh Xuất phát từ lý mong muốn tìm tác nhân gây bệnh, để từ đề xuất biện pháp phịng trừ bệnh thối trái mít phù họp, chúng tơi thực đề tài: “Xác định tác nhân gây bệnh thối trái mít trồng Tiền Giang” Mục tiêu đề tài - Xác định đuợc tác nhân gây bệnh thối trái mít - Xác định đuợc đặc tính xâm nhiễm tác nhân gây bệnh thối trái mít CHƯƠNG NỘI • DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu Mầu trái mít bị thối thu nhận xã Mỹ Tân, huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang Địa điêm thời gian: Các thí nghiệm thực phịng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật, khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại học Nguyễn Tất Thành, tiến hành từ tháng 4-9 năm 2020 2.2 Phân lập làm tác nhân gây bệnh Sau thu mẫu, tiến hành bảo quản mẫu bệnh túi zip sạch, ghi tên mẫu, địa điểm, thời gian thu vận chuyển phịng thí nghiệm Cắt phần nhỏ mẫu mít bị bệnh cho vào đĩa cấy vô trùng Dùng Ethanol 70 % xịt xung quanh mẫu đế sát trùng bên ngồi Dùng dao mố vơ trùng cắt phần vết bệnh cho vào tube 1,5 ml Hút 300 pl nước cất cho vào tube chứa mẫu bệnh, dùng đũa thủy tinh nghiền nát Vortex cho tan hỗn họp Dùng que cấy hơ lửa đèn cồn, để nguội, sau nhúng vào tube 1,5 ml chứa dung dịch cấy lên bề mặt mơi trường NA theo hình chữ z Tiếp tục dùng que cấy, cấy sang đĩa môi trường NA khác để giảm mật độ vi khuẩn Nuôi tủ ấm 37 °C 24 - 48 kiểm tra kết 2.3 Nuôi tăng sinh môi trường LB lỏng Chọn khuẩn lạc khỏe từ đĩa môi trường, cấy chuyền vào ống falcon có chứa ml mơi trường LB lỏng Vortex cho hồn họp Sau cho vào máy lắc ủ nhiệt ni cấy 37 °C, 200 vịng/phút 24 - 48 2.4 Phương pháp nhuộm Gram tế bào vi khuẩn Nhuộm Gram phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt lồi vi khuẩn thành nhóm: Gram dương Gram âm, dựa đặc tính lý hóa thành tế bào Phương pháp đặt tên theo người phát minh nó, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853 - 1938) Các bước thực sau: Bước 1: Đặt phết bệnh phẩm vi khuẩn lên lame Để khô tự nhiên cố định cách hơ nóng qua lửa đèn cồn Bước 2\ Nhỏ vài giọt Crystal Violet cho phủ lên bề mặt phết nhuộm để yên phút Bước 3: Rửa nhanh nước cất Bước 4\ Nhỏ vài giọt Lugol cho phủ lên bề mặt phết nhuộm để yên phút Bước 5: Rửa nhanh nước cất Bước 6: Tẩy màu cách nghiêng lame kính nhỏ từ từ dung dịch Alcohol lên phết nhuộm , giọt Alcohol rời khỏi lame kính khơng có màu tím ngưng Bước 7: Rửa nhanh nước cất Bước 8: Nhỏ vài giọt Safranine cho phủ lên bề mặt phết nhuộm để yên phút Bước 9: Rửa nhanh nước cất Bước 10: Thấm khơ phết nhuộm quan sát kính hiển vi 2.5 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo Việc lây bệnh nhân tạo cung cấp thơng tin để khẳng định vi sinh vật phân lập tác nhân theo quy tắc Koch Các bước thực hiện: - Mô tả triệu chửng biểu trái mít bị bệnh - Phân lập vi sinh vật tác nhân gây bệnh từ có triệu chứng bệnh giống - Dùng mẫu vi sinh vật làm để lây nhiễm mít khỏe mạnh, khơng bị bệnh - Quan sát triệu chứng biểu đuợc lây bệnh, so sánh với triệu chứng bệnh mít bị bệnh ngồi tự nhiên - Tái phân lập lại tác nhân gây bệnh từ bị nhiễm bệnh, so sánh với mẫu vi sinh vật dùng để lây nhiễm Tiến hành thực nghiệm: - Tiến hành tăng sinh tác nhân gây bệnh môi truờng LB lỏng - Dùng Ethanol 70° khử trùng bề mặt mít khơng bị bệnh, cho vào tủ cấy, dùng dao mổ vô trùng hơ lửa đèn cồn rạch đuờng nhỏ mít - Dùng kim tiêm vô trùng hút dịch tăng sinh vi khuẩn, tiêm vào vị trí tạo vết thương mít, vừa tiêm vừa rút nhẹ đầu kim cho dịch lan dần mít - Sau tiêm dịch tăng sinh, để mít nhiệt độ phịng quan sát triệu chứng hàng ngày biểu bệnh Thí nghiệm lặp lại lần, lần mít Ở đối chứng, thay tiêm dịch vi khuẩn gây bệnh, tiêm nước cất vô trùng 2.6 Phương pháp tách chiết DNA Sử dụng phương pháp shock nhiệt để tách chiết DNA từ mẫu vi khuẩn nuôi tăng sinh Các bước sau: Bước ỉ: Lấy 0,5 ml dung dịch tăng sinh cho vào tube 1,5 ml Bước 2\ Ly tâm 13000 vòng /5 phút, bỏ dịch nổi, thu phần lắng Bước 3: Tiếp tục cho 500 |11 nước cat, vortex Bước 4\ Ly tâm 13000 vòng /5 phút, bỏ dịch nổi, thu phần lắng Lặp lại lần Bước 5: Bổ sung 300 pl nước cat, vortex cho tan Giữ ống vi khuẩn khay đá - 10 phút Bước 6: Đặt ống vi khuẩn lên máy gia nhiệt khô 95 °C 15 phút Bước 7: Ly tâm 13000 vòng /5 phút, lấy phần bên chứa DNA vi khuẩn 10 CHƯƠNG KÉT QUẢ VÀ SẢN PHẢM ĐẠT ĐƯỢC 3.1 Triệu chứng bệnh trái mít Mầu mít bệnh thu thập xã Mỹ Tân, huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang cho thấy triệu chứng điển hình bệnh thối trái mít Lúc bệnh, bề mặt mít có dấu hiệu chuyển màu từ xanh sang nâu, sau 4-5 ngày bề mặt bị thối, phần bị bệnh xuất vết ngã màu nâu đen, mềm dập chưa vỡ tế bào thành khối nhầy Đây giai đoạn thích hợp cho việc phân lập thu kết tốt Quả mít tiêm dịch vi khuẩn bắt đầu chuyển màu nâu nhạt, sau lan dần hết tồn mít, bên ruột mít có màu nâu đen có mùi 3.2 Ket phân lập mẫu bệnh Phân lập làm khâu có ý nghĩa quan trọng việc nghiên cứu vi sinh vật gây bệnh thực vật Kết sau 24h từ lúc phân lập, khuẩn lạc vi khuẩn phát triển tương đối nhanh môi trường Nutrient Agar Khuẩn lạc có dạng hình trịn, màu vàng đục đồng hình dạng, khơng phát bị tạp nhiễm phân lập (Hình 3.1) Hình 3.1 Kết phân lập mẫu bệnh thối trái mít 13 3.3 Ket nuôi tăng sinh Khi nuôi cấy tác nhân gây bệnh môi trường LB lỏng ủ tủ ấm với nhiệt độ 37 °C 24 giờ, kết cho thấy vi khuẩn phát triển nhanh làm đục môi trường nuôi cấy, đồng thời xuất cặn vi khuẩn lắng đáy ống falcon (Hình 3.2) Hình 3.2 Kết ni tăng sinh mơi trường LB lỏng 3.4 Ket nhuộm Gram Dựa vào đặc tính Gram âm Gram dưong, người ta đưa chẩn đoán loại vi khuẩn Kết nhuộm Gram vi khuẩn quan sát kính hiển vi với độ phóng đại 100 lần cho thấy chủng vỉ khuẩn gây bệnh có dạng hình que, không di động, bắt màu hồng đặc trưng lồi vi khuẩn Gram âm (Hình 3.3) 14 Hình 3.3 Ket quan sát vi khuẩn kính hiển vi 3.5 Ket lây nhiễm nhân tạo Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo theo quy tắc Koch thực cho kết sau 4-5 ngày Be mặt mít xuất màu nâu đen, từ vị trí vết thưong, mít bị mềm nhũn lan dần xung quanh Sau ngày, bị thối, bên mít vết bệnh màu nâu đen, có mùi hôi, giống với triệu chứng bệnh miêu tả ban đầu (Hình 3.4) 15 Al Bl Cl A2 B2 C2 Hình 3.4 Mầu mít bị bệnh sau tiêm dịch tăng sinh vi khuẩn (Al, Bl, C1 - kết lây nhiễm nhân tạo trước sau tiêm 3, ngày; A2, B2, C2 mẫu làm đối chứng không tiêm dịch tăng sinh trước sau 3, ngày) Hình 3.5 Quả mít bị bệnh sau 4-5 ngày tiêm dịch vi khuẩn 16 Khi tái phân lập mẫu mít bị bệnh sau ngày lây nhiễm nhân tạo, môi truờng NA, sau 24 nuôi tủ ấm 37 °C, kết xuất khuẩn lạc có hình dạng giống nhu mẫu phân lập truớc (Hình 3.6) Hình 3.6 Tái phân lập lại mẫu bệnh 3.6 Đặc điểm phân tử vùng nhận dạng trình từ vi khuẩn 16S rRNA 3.6.1 Kết điện di sản phẩm PCR Sau tách chiết DNA phương pháp shock nhiệt để phá vỡ màng tế bào vi khuẩn từ ống môi trường tăng sinh, thực phản ứng PCR khuếch đại vùng gen mã hóa 16S rRNA, sử dụng cặp moi 27F 1492R Sản phẩm khuếch đại dự kiến có kích thước khoảng 1000 bp Trình tự cặp mồi sử dụng phản ứng Mồi xuôi (27F): 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' Mồi ngược (1492R): 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' Sản phẩm PCR khuếch đại sử dụng cặp mồi 27F 1492R kiểm tra cách điện di hiệu điện 80 V 35 phút gel agarose % Sau điện di, tiến hành soi gel kiểm tra kết quả, sản phẩm PCR hiển thị band sáng rõ, với kích thước dự kiến đoạn gen khuếch đại (khoảng 1000 bp) (Hình 3.7) 17 M MT1 -XIT2 1000 bp Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại vũng trình tự 16S rRNA 3.6.2 Giải trình tự sản phẩm PCR vùng trình tự 16S rRNA Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi khuếch đại vùng trình tự 16S rRNA đuợc gửi giải trình tự cơng ty First Base, theo phuơng pháp giải trình tự Sanger Sequencing Ket giải trình tự phân tích phần mềm BioEdit (Hình 3.8) A = Adenine T = Thymine, c = Cystein, G = Guanine Hình 3.8 Ket đọc trình tự phần mềm BioEdit Trình tự vùng gen 16S rRNA vi khuẩn sử dụng để so sánh với trình tự chủng tham chiếu ngân hàng gen NCBI công cụ BLAST Ket cho 18 thấy chủng vi khuẩn nghiên cứu có tỉ lệ tuơng đồng cao (> 99 %) với chủng Klebsiella varỉỉcola tham chiếu nuớc giới (Hình 3.9) Ma ữescnmran Tcí Sdcki? Sooee Query E Cc-Tiỉr value Per Aoessọri Idenl □ IQeteeỊla va-ncda strain Oĩ-3 Ị1 2614 26686 98% 00 1_J Kteaseiia varhccta sarain AJ292 genccne assentJy chramcsome 2614 20774 38% 00 LR1305381 □ Kteoseila vencda saan GJ3 egnotele qencme 2614 23665 96% 00 » 86% CP017289 i Kle^u, m 2614 20685 38% 00 90S6% CP017W& ì □ Kieosdla vancda strain GJ1 complete qenane 2614 20685 98% 0.0 9986% CP0172841 2614 20746 98% 0.0 9386% CP010523 □ manured Kteõaetta so done SUB 16S ncosoiral IWA oene aaiud sequence 2614 2614 98% 0.0 99 86% HQ2WM.T □ Iba/lurad Kjeteiellaso done Flax 18 16S Ifocsamal IWA oene aatiial sequence 2614 2614 98% 00 99.86% GCK1383L □ KlgKjdB va-icda Slian FDAARGOS 626 dxcnwsorne 2606 20652 98% 0.0 »79% □ KteOdelle wneda strain AHKv-SQl chiQTCsxne KHTdele oerp-ne 2606 20724 98% 0.0 »79% CP04736Q1 2606 207« 98% 00 »79% CPW57831 2606 20868 98% 00 99 79% cpq?8555 26C6 2830 98% 00 »79% LRÕ07362 2606 2606 99% 0.0 »72% MKB24W1 26C6 2638- 93% 00 9058% MH767Q4B 2606 20668 98% 0.0 □ stran GJ2 asseTtly :hr.?TO>jme • vaTOte» igasTpYỴBVXgy-yọe asseaofr- ■ĩdTxrọMrrẹ -die vanda gran C4 “53260899A aerccne assents dYWCSdne 9980% LR130544.1 £ [3 Feedback Hình 3.9 Ket BLAST trình tự vi khuẩn gây bệnh với sở liệu NCBI Tuy nhiên, theo nghiên cứu Weisburg et al., 1991 ghi nhận Dỉckeya fangdongzhai nguyên nhân gây bệnh thối trái mít Malaysia Do đó, bệnh thối trái mít gây vài chủng vi khuẩn khác nhau, tùy theo điều kiện tự nhiên quốc gia khác Từ kết BLAST ta thấy trình tự vi khuẩn gây bệnh Klebsiella variỉcola trái mít có độ tương đồng đến 99 % với chủng vi khuẩn Klebsiella sp phân lập quốc gia Trung Quốc, Mỹ, Hàn Quốc, Mexico, Thái Lan Đồng thời chủng vi khuẩn Klebsiella variỉcola có độ tương đồng cao so với chủng vi khuẩn phân lập Trung Quốc 3.6.3 Kết PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu vói Klebsiella variicola Pectobacterìum carotovorum Theo kết BLAST so sánh với sở liệu Genbank, vi khuẩn gây bệnh thối trái mít ghi nhận Klebsiella variicola Tuy nhiên, để khẳng định lại kết 19 BLAST, DNA vi khuẩn gây bệnh thối trái mít PCR lại lần 2, sử dụng cặp mồi đặc hiệu riêng với vi khuẩn Klebsiella varỉỉcola (sản phẩm PCR dự kiến kích thước khoảng 350 bp), đồng thời sử dụng thêm cặp mồi đặc hiệu với Pectobacterium carotovorum - vi khuẩn gây bệnh phổ biến thực vật (sản phẩm PCR dự kiến kích thước khoảng 550 bp) Trình tự mơi HspóO vi khuan Klebsiella varỉicola: Hsp60-F: GGTAGAAGAAGGCGTGGTTGC Hsp60-R: ATGCATTCGGTGGTGATCATCAG Trình tự mồi EXPCC vi khuẩn Pectobacterỉum carotovorum EXPCC-F: GAACTTCGCACCGCCGACCTTCTA EXPCC-R: GCCGTAATTGCCTACCTGCTTAAG Sau sử dụng hai cặp mồi để khuếch đại vùng gen, kết điện di gel agarose % cho thấy, mẫu MT1 MT2 sau PCR với cặp mồi HspóO cho kết band có kích thước khoảng 350 bp (Hình 3.10), phù họp với kích thước dự kiến Tuy nhiên, khơng có band hiển thị gel mẫu PCR với cặp mồi EXPCC Điều chứng tỏ vi khuẩn Klebsiella varỉỉcola tác nhân gây bệnh thối trái mít trồng Tiền Giang 20 M MT1 MT1 MT2 MT2 1000 800 600 400 550 bp 350 bp Hình 3.10 Ket điện di với cặp mồi Hsp60 EXPCC 3.6.4 Kết xây dựng phát sinh loài Cây phát sinh loài dùng để mơ tả q trình tiến hóa mối quan hệ loài sinh vật với đặc điểm di truyền khác nhung mối quan hệ họ hàng 20 trình tự có mối liên hệ mật thiết với chủng vi khuẩn nghiên cứu đuọc chọn làm chủng tham chiếu chọn chủng vi khuấn Pectobacterỉum carotovorum làm nhóm out group Bảng 3.1 Danh sách chủng Klebsiella sp tham chiếu STT 10 Mã số LR130544 LR130538 CP017289 CP017849 CP017284 CP047360 CP028555 LR130543 CP016344 CP013985 Quốc gia Úc Úc Hàn Quốc Hàn Quốc Hàn Quốc Trung Quốc Trung Quốc Úc Trung Quốc Trung Quốc STT 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Mã số CP020847 CP009274 CP000964 MN428179 MK855126 CP054254 MN428142 CP018307 LR130539 LR134235 Quốc gia Mỹ Trung Quốc Mỹ Thái Lan Mexico Trung Quốc Thái Lan Trung Quốc Úc Anh Sử dụng trình tự gen mã hóa cho vùng trình tự 16S rRNA chủng vi khuẩn Klebsiella variicola nghiên cứu so sánh với chủng vi khuan Klebsiella sp tham chiếu (Bảng 3.1) để xây dựng phân tích phát sinh lồi Trình tự gen phân tích phần mềm CLUSTAL - X Alignment Cây phát sinh loài sử dụng dựa phàn mềm MEGA 6.0 với tham so model Kimura-2 parameter re - bootstrap 1000 lần lặp lại mô thay đổi nucleotide Ket xây dựng phát sinh thể qua Hình 3.11 Klebsiella variicola/16S/USA/2018/ CPŨ20847 Klebsiella variicola/16S/Thailanđ2Ũ19/MN428179 Klebsiella variicola/16S/Australia/2019/ LR130543 Klebsiella variicola/16S/China/2019/CP028555 Klebsiella variicola/16S/China/2020/ CP047360 Klebsiella variicola/16S/Mexico/2019/ MK855126 KI ebsi e I la vari i co I a/15S/Tti lan 02019 M N428142 Klebsiella variicola/16S/China/2017/CP013985 Klebsiella variicolaH6S/China/2018 CPŨ18307 Klebsiella variicola/16S/Australia/2019 LR130538 Klebsiella variicola/16S/Ctiina/2Ũ2ỪCP054254 Klebsiella variicola'16S/Ctiina/2016ZCP009274 Klebsiella variicola/16S/USA/2018/ CPŨŨŨ964 Klebsiella variicola/16SZAustralia/2019 LR130539 — Klebsiellavariicola/16S/United Kingdom/2020 LR134235 Klebsiella variicola/16SZCtiinaZ2Ũ18/CPŨ16344 • Klebsiella/16SZM2/Vietnam/2020 Klebsiella varỉicola/16SZAustralia/2019 LR130544 Klebsiella variicola/16S/South Korea/2017CP017289 Klebsiella variicolaH6SZSouth Korea/2017 CP017849 Klebsiella variicola/16S/South Korea/2017/CP017284 - Pectũbacterium carotovorum/16S/Russia/2Ũ18 PJJA01000079 I 0.20 Hình 3.11 Cây phát sinh loài chủng vi khuẩn Klebsiella varỉỉcola Từ phát sinh loài cho thấy, vi khuẩn Klebsiella variicola nghiên cứu nhóm với chủng vi khuẩn Klebsiella variỉcola phân lập từ nhiều nước giới Tiling Quốc, Thái Lan, Mỹ, úc, Hàn Quốc, Mexico Trong đó, chủng vi khuẩn 22 có mức độ tương đồng cao so với chủng vi khuẩn phân lập Trung Quốc (accession number: CP016344) vào năm 2018 bắp 23 CHƯƠNG KÉT LUẬN Kết luận Phân lập vi khuẩn gây bệnh từ mẫu thối trái mít thu thập xã Mỹ Tân, huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang môi trường Nutrient Agar, với đặc điểm đồng nhất, khuẩn lạc có dạng hình trịn, màu vàng đục đồng hình dạng, vi khuẩn bắt màu hồng đặc trưng vi khuẩn Gram âm, hình que, khơng di động Dựa vào đặc điểm vùng trình tự 16S rRNA xác định vi khuẩn gây bệnh thối trái mít Klebsiella varỉicola, nhóm với chủng vi khuân Klebsiella variicola phân lập giống từ bệnh thối Bắp Trung Quốc, Đề nghị Thử nghiệm biện pháp hóa học sinh học để ức chế vi khuẩn phịng trà bệnh thối trái mít vi khuẩn Klebsiella variicola gây 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO Vũ Triệu Mân, Nguyễn Văn Tuất, Bùi Cách Tuyên, Phạm Văn Kim Bệnh Hại Cây Trồng Việt Nam Nhà xuất băn Học viện Nông nghiệp; 2018 Jaffar N, Osman M, Koyube M New Bacterial Fruit Rot Disease ofJackfruit (Artocarpus heterophyllus caused by Dickeya fangzhongdai sp in Malaysia 2018 Degefu Y, Jokela s, Joki-Tokola E, Virtanen E DNA based detection of blackleg and soft rot disease causing Erwinia strains in seed potatoes Suomen maataloustieteellisen seuran tiedote 2006(21): 1-6 Lê Lương Te, Vũ Triệu Mân Bệnh vi khuẩn virus hại trồng Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội; 1999 Yoo SY, Chang KH, Yoo SM, et al Design of ITS and 23S rDNA-targeted probes and its usefulness for the identification of bacterial pathogens Genome Informatics 2002;13:589-590 Kang H, Kwon s, Go s PCR-based specific and sensitive detection of Pectobacterium carotovorum ssp carotovorum by primers generated from a URP-PCR fingerprinting-derived polymorphic band Plant pathology 2003;52(2): 127-133 Subandiyah s, Iwanami T, Tsuyumu s, leki H Comparison of 16S rDNA and 16S/23S intergenic region sequences among citrus greening organisms in Asia Plant disease 2000;84(l):15-18 Kolbert CP, Persing DH Ribosomal DNA sequencing as a tool for identification of bacterial pathogens Current opinion in microbiology 1999;2(3):299-305 Czernilofsky A, Kurland c, Stoffler G 30S ribosomal proteins associated with the 3'-terminus of 16S RNA FEBS letters 1975;58(l-2):281-284 Nguyễn Lân Dũng Vi sinh vật học Nhà xuất Giáo dục 2009 Nguyễn Thị Pha, Nguyễn Hữu Hiệp Khảo sát vùng gen 16s rDNA số dịng vi khn có khả cố định đạm đất vùng rễ lúa tình Đồng Tháp Tạp chi Khoa học 2012;23:184-192 Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study Journal of bacteriology’ 1991;173(2):697-703 Fulton J, Bec s, Fayette J, Ploetz R, Garrett K, Harmon c First Report of Plantain Soft Rot Caused by Klebsiella variicola in Haiti Plant Disease 2020; 104(6): 1851 Fan H, Zeng L, Yang p, Guo z, Bai T First report of banana soft rot caused by Klebsiella variicola in China Plant Disease 2016; 100(2):517-517 Chandrashekar B, Prasannakumar M, Puneeth M, et al First report of bacterial soft rot of carrot caused by Klebsiella variicola in India New Disease Reports 2018;37:21-21 Jaffar N, Osman M, Koyube M New Bacterial Fruit Rot Disease ofJackfruit (Artocarpus heterophyllus) caused by Dickeya fangzhongdai sp in Malaysia Malaysian Journal ofMicrobiology 2018; Vol 15(4):214 219 25 Abu-Obeid I, Khlaif H, Salem N Identification and genetic diversity of Jordanian potato soft rot isolates, Pectobacterium carotovorum subspecies carotovorum (DYE 1969) African Journal ofBiotechnology 2018;17(24):753-759 Abu-Obeid I, Khlaif H, Salem N Comparison of Different Sets of Primers Used in Detection and Identification of Potato Soft Rot Pectobacteriumcarotovorum subsp carotovorum (DYE 1969) Asian Journal of Research in Crop Science 2018:1-12 26 Chủ nhiệm đề tài Giảng viên hướng dẫn (Kỷ ghi rõ họ tên) (Kỷ ghi rõ họ tên) Tỉ ... phịng trừ bệnh thối trái mít phù họp, chúng tơi thực đề tài: ? ?Xác định tác nhân gây bệnh thối trái mít trồng Tiền Giang? ?? Mục tiêu đề tài - Xác định đuợc tác nhân gây bệnh thối trái mít - Xác định. .. triển bệnh thối trái mít gây tổn thất cho nơng nghiệp Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu chi tiết tác nhân gây bệnh yếu tố liên quan đến phát sinh bệnh Xuất phát từ lý mong muốn tìm tác nhân gây bệnh, ... ĐẠT ĐƯỢC 3.1 Triệu chứng bệnh trái mít Mầu mít bệnh thu thập xã Mỹ Tân, huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang cho thấy triệu chứng điển hình bệnh thối trái mít Lúc bệnh, bề mặt mít có dấu hiệu chuyển màu