PHÁT HIỆN LOÀI fusarium spp gây BỆNH THỐI XƯƠNG RỒNG (cactaceae) BẰNG PHƯƠNG PHÁP POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN LỒI Fusarium spp GÂY BỆNH THỐI XƢƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG PHƢƠNG PHÁP POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003 – 2007 Sinh viên thực : PHẠM THỊ HẰNG - Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** PHÁT HIỆN LOÀI NẤM Fusarium spp GÂY BỆNH THỐI XƢƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction) Giáo viên hƣớng dẫn KS DƢƠNG THÀNH LAM TS LÊ ĐÌNH DƠN Sinh viên thực PHẠM THỊ HẰNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM TẠ Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, tơi nhận đƣợc nhiều ủng hộ giúp đỡ từ gia đình, thầy bạn bè Nay tơi xin chân thành cảm ơn đến: Cha Mẹ ngƣời thân tạo điều kiện, động viên suốt trình học tập trƣờng Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ Sinh học tất Thầy Cơ tận tình giúp đỡ, dạy dỗ, truyền đạt kiến thức quý báu cho suốt thời gian học tập trƣờng Thầy Lê Đình Đơn thầy Dƣơng Thành Lam hết lịng giúp đỡ, hƣớng dẫn tơi suốt q trình thực tập tốt nghiệp Anh Nguyễn Văn Lẫm, Anh Chị làm việc phịng thí nghiệm 105 Bộ Mơn Bảo Vệ Thực Vật khoa Nông Học Anh Chị làm việc Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học Công nghệ Môi trƣờng Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực khóa luận Các Bạn sinh viên lớp công nghệ sinh học 29 động viên, giúp đỡ suốt thời gian học tập làm đề tài tốt nghiệp Tp Hồ Chí Minh tháng năm 2007 Phạm Thị Hằng ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT PHẠM THỊ HẰNG, Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, tháng 9-2007 “PHÁT HIỆN LOÀI NẤM Fusarium spp GÂY BỆNH THỐI XƢƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction)” phịng Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nơng Học trƣờng Đại học Nông Lâm Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học Cơng nghệ Mơi trƣờng – phịng Công nghệ Sinh học Thực vật Trƣờng Đại học Nông Lâm – TP.HCM Thời gian thực đề tài: 20/3/2007 đến 30/7/2007 Giáo viên hƣờng dẫn: KS Dƣơng Thành Lam TS Lê Đình Đơn  Nội dung nghiên cứu  Điều tra tình hình bệnh hại xƣơng rồng địa bàn Tp Hồ Chí Minh  Thu thập xƣơng rồng bị bệnh từ vƣờn điều tra Từ phân lập, nhân thu sinh khối dòng nấm phân lập đƣợc  Ly trích thu DNA Thực quy trình phản ứng PCR khuếch đại trình tự nằm vùng tef primer ef1 ef2 dịng nấm phân lập đƣợc  Giải trình tự sản phẩm PCR  Chủng bệnh lên xƣơng rồng khỏe mạnh  Kết đạt đƣợc  Tỷ lệ nhiễm bệnh vƣờn điều tra: Bệnh vi khuẩn: 7,43% Bệnh nấm: 18,2% Bệnh virus: 0,16%  Phân lập đƣợc 12 dòng nấm từ mẫu xƣơng rồng bị bệnh với hình thái có màu khuẩn lạc đặc trƣng: Khuẩn lạc nấm màu trắng, tròn, tơ mịn Khuẩn lạc nấm màu tím, trịn, tơ mịn iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com  Ly trích đƣợc DNA tổng số 12 dòng nấm phân lập đƣợc Khuếch đại đƣợc đoạn DNA có kích thƣớc 700 bp nằm vùng tef dòng nấm (dựa vào thang ladder)  Giải trình tự vùng tef dòng nấm thuộc Fusarium spp gồm: FC07 – 3, FC07 – 7, FC07 – 10 Xác định dòng FC07 – FC07 – 10 nấm Fusarium solani Còn dòng FC07 – đƣợc tiếp tục nghiên cứu  Chủng bệnh nấm xƣơng rồng khỏe: dịng nấm có khả gây bệnh nặng sau ngày chủng bênh (ở nhiệt độ phòng) iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ix DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ x DANH SÁCH ĐỒ THỊ .x Chƣơng 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục đích - yêu cầu .2 1.2.1 Mục đích .2 1.2.2 Yêu cầu 1.3 Giới hạn đề tài Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Một số đặc tính để phát triển kiểng xƣơng rồng 2.2 Phân loại thực vật giới thiệu xƣơng rồng (Cactaceae) 2.2.1 Phân loại thực vật 2.2.2 Giới thiệu xƣơng rồng họ 2.2.3 Tình hình sản xuất phát triển xƣơng rồng Tp Hồ Chí Minh giới 2.2.3.1 Tại Tp Hồ Chí Minh .5 2.2.3.2 Trên giới 2.2.4 Đặc tính thực vật điều kiện sinh thái xƣơng rồng (theo Huỳnh Văn Thới, 2004) 2.2.4.1 Đặc tính thực vật 2.4.2.2 Điều kiện sinh thái 10 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.2.5 2.3 Bệnh hại xƣơng rồng .11 2.2.5.1 Bệnh thối gốc xƣơng rồng 11 2.2.5.2 Bệnh đốm than .11 2.2.5.3 Tuyến trùng hại xƣơng rồng 12 2.2.5.4 Rệp sáp hại xƣơng rồng .12 Sự phân loại, phân bố, phạm vi kí chủ, đặc điểm phát sinh phát triển khả gây bệnh nấm Fusarium 12 2.3.1 Sự phân loại 12 2.3.2 Sự phân bố 14 2.3.3 Phạm vi kí chủ 14 2.3.4 Đặc điểm phát sinh phát triển nấm Fusarium 14 2.4 Khả gây hại nấm Fusarium spp gây biện pháp phòng trừ 14 2.4.1 Khả gây hại 14 2.4.2 Một số biện pháp chủ yếu để phòng trị nấm Fusarium spp 16 2.4.2.1 Sử dụng giống kháng bệnh 16 2.4.2.2 Biện pháp canh tác .16 2.4.2.3 Biện pháp hóa học .17 2.5 Tổng quan vùng tef genome nấm Fusarium 17 2.6 Ứng dụng kỹ thuật PCR phát nấm 18 2.6.1 Khái niệm 18 2.6.2 Nguyên tắc 19 2.6.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết phản ứng PCR .20 2.6.4 Ứng dụng PCR .22 2.7 Giới thiệu sơ lƣợc kỹ thuật DNA sequencing .22 2.8 Một số nghiên cứu nƣớc bệnh nấm Fusarium spp 22 2.8.1 Trên giới 22 2.8.2 Tại Việt Nam .25 2.9 Danh mục số lồi Fusarium đƣợc tìm thấy Việt nam 26 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Vật liệu thí nghiệm .27 3.1 3.1.1 Thời gian – địa điểm nghiên cứu 27 3.1.2 Vật liệu 27 Phƣơng pháp nghiên cứu 29 3.2 3.2.1 Điều tra tình hình bệnh chết xƣơng rồng TP Hồ Chí Minh 29 3.2.2 Phân lập mẫu nấm .29 3.2.3 Tăng sinh khối nấm môi trƣờng nhân sinh khối 31 3.2.4 Ly trích DNA tổng số nấm 32 Quy trình đƣợc thực dựa quy trình Lee Taylor 32 3.2.5 Điện di xem DNA tổng số 32 3.2.6 Thực phản ứng PCR khuếch đại vùng tef dòng nấm Fusarium spp 33 3.2.7 Đọc trình tự sản phẩm PCR 35 3.2.8 Chủng nấm lên xƣơng rồng 36 3.2.8.1 Tiến hành chủng bệnh xƣơng rồng .36 3.2.8.2 Đánh giá kết 36 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 Tình hình bệnh hại xƣơng rồng Tp Hồ Chí Minh 37 4.2 Các triệu chứng bệnh xƣơng rồng .37 4.2.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh vi khuẩn, nấm, virus gây qua vƣờn điều tra (số liệu điều tra tháng 04 năm 2007) .39 4.3 Phân lập mẫu nấm 40 4.4 Kết ly trích thu DNA tổng số từ loài nấm Fusarium spp 41 4.5 Kết phản ứng PCR khuếch đại vùng tef 43 4.6 Kết giải trình tự vùng tef .43 4.7 Chủng bệnh xƣơng rồng 50 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52 5.1 Kết luận 52 5.2 Đề nghị .53 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 58 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PCR :Polymerase chain reaction DNA :Deoxyrybonucleotide acid TE :Tris EDTA TAE :Tris Acetate EDTA dNTP :Deoxynucleotide triphosphate Taq :Thermus aquaticus UV :Ulta violet PGA :Potato glucose agar WA :Water agar EtBr :Ethidium bromide l :micro lít g :micro gam M :micro gam/ lít mM :mili gam/ lít ctv :cộng tác viên ng :nano gam bp :base pair rDNA : ribosomal DNA RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism Tm : Melting Tempereture TEF : Translation elongation factor ITS : Internal Transcribed Spacer viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NCBI : National Center for Biotechnology Informatic DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Hình thái bào tử nấm Fusarium spp .13 Hình 2.2 Vùng gen tef nấm Fusarium sử dụng FUSARIUM-ID 17 Hình 4.1 Xƣơng rồng với triệu chứng thối gốc 38 Hình 4.2 Xƣơng rồng với triệu chứng thối vàng đen gốc 39 Hình 4.3 Xƣơng rồng với triệu chứng thối thân 39 Hình 4.4 Xƣơng rồng cắt dọc với triệu chứng thối từ lõi ngồi 39 Hình 4.5 Nấm phân lập từ xƣơng rồng bệnh môi trƣờng PGA 42 Hình 4.6 Sản phẩm ly trích DNA tổng số nấm 43 Hình 4.7 Sản phẩm PCR khuếch đại cặp primer ef1 ef2 44 Hình 4.8 Xƣơng rồng khỏe mạnh trƣớc chủng bệnh 51 Hình 4.9 Xƣơng rồng với triệu chứng thối sau chủng 51 Hình 4.10 Nấm phân lập từ xƣơng rồng bị bệnh sau chủng nấm ngày môi trƣờng PGA 52 ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Kết đọc trình tự vùng tef dòng FC07 – 3, FC07 – , FC07 – 10  Kết đọc trình tự vùng tef dòng FC07-3 Ghi chú: M1 tên đặt cho dòng FC07-3, M2 tên đặc cho dòng FC07 – 7, M3 tên đặt cho dòng FC07-10 Kết đọc trình tự vùng tef dịng FC07 – LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Kết đọc trình tự vùng tef mẫu FC07 – (M2) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Kết đọc trình tự vùng tef mẫu FC07 – 10 (M3) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... Các bệnh thƣờng gặp xƣơng rồng: bệnh thối gốc, bệnh đốm than… bệnh phổ biến bệnh thối nấm Fusarium spp. , bệnh gây nguy hiểm cho tất loại xƣơng rồng Vì vậy, vấn đề đặt xác định xác tác nhân gây bệnh. .. Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, tháng 9-2007 “PHÁT HIỆN LOÀI NẤM Fusarium spp GÂY BỆNH THỐI XƢƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction) ” phịng Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nơng... MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** PHÁT HIỆN LOÀI NẤM Fusarium spp GÂY BỆNH THỐI XƢƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction) Giáo viên hƣớng dẫn KS DƢƠNG THÀNH