XÂY DỰNG QUI TRÌNH PCR PHÁT HIỆN nấm ustilago scitaminea gây BỆNH THAN TRÊN mía

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ….  … KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUI TRÌNH PCR PHÁT HIỆN NẤM Ustilago scitaminea GÂY BỆNH THAN TRÊN MÍA Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: HỒ BỬU THƠNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  … XÂY DỰNG QUI TRÌNH PCR PHÁT HIỆN NẤM Ustilago scitaminea GÂY BỆNH THAN TRÊN MÍA Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS TS BÙI CÁCH TUYẾN HỒ BỬU THƠNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** ESTABLISHING A PROTOCOL PCR TO DETECT Ustilago scitaminea CAUSING SUGARCANE SMUT Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: PhD BUI CACH TUYEN HO BUU THONG Term: 2003 - 2007 HCMC, 9/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM TẠ Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ Gia đình chỗ dựa vững tinh thần vật chất cho Em vô biết ơn Thầy Bùi Cách Tuyến tận tình hướng dẫn truyền đạt cho em kinh nghiệm quý báu suốt thời gian làm đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian học tập vừa qua Ban giám đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hố Sinh thuộc Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Công nghệ Môi trường - Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh tồn thể anh chị tạo điều kiện thuận lợi tối đa tận tình giúp đỡ em thời gian thực tập tốt nghiệp ThS Hà Đình Tuấn tồn thể cán Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Mía Đường tỉnh Bình Dương giúp đỡ em hồn thành tốt đề tài Anh Nguyễn Đình Trường tận tình giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn anh Trưởng, anh Khoa, anh Nam, anh Phương chị Hưng, chị Dung hết lịng giúp đỡ em để em hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Cảm ơn bạn lớp Công nghệ Sinh học K29 đồng hành, chia sẻ vui buồn, động viên giúp đỡ suốt thời gian học tập làm đề tài Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2007 Hồ Bửu Thông iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TĨM TẮT KHĨA LUẬN Hồ Bửu Thơng, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng / 2007 “Xây dựng qui trình PCR phát nấm Ustilago scitaminea gây bệnh than mía.” đề tài thực từ tháng đến tháng năm 2007 Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hố Sinh thuộc Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Công nghệ Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Giáo viên hƣớng dẫn: PGS TS Bùi Cách Tuyến Nội dung nghiên cứu  Nuôi cấy, phân lập, tách đơn bào tử nhân sinh khối nấm Ustilago scitaminea  Xây dựng qui trình PCR phát trực tiếp DNA sợi nấm Ustilago scitaminea Kết đạt đƣợc  Phân lập, tách đơn bào tử nhân sinh khối 11 dịng nấm Ustilago scitaminea từ 11 giống mía khác Bình Dương  Xây dựng qui trình PCR phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm để phát nấm Ustilago scitaminea v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com SUMMARY Ho Buu Thong studying at Nong Lam University and finishing the thesis on 8th, 2007 The thesis entitled “Establishing a protocol PCR to detect Ustilago scitaminea causing sugarcane smut” This research was conducted from 5th, 2007 to 8th, 2007 at the laboratory of biotechnology and chemistry of Nong Lam University Board of scientific instruction: Prof.Dr BUI CACH TUYEN The content of research:  Culturing, isolating, demorphisming the spore and multiplying the living mass of Ustilago scitaminea  Establishing a protocol PCR to detect Ustilago scitaminea The results obtained from this study:  Culturing, isolating, demorphisming the spore and multiplying the living mass of 11 Ustilago scitaminea clonies  A protocol PCR for detecting Ustilago scitaminea was established vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC PHẦN TRANG LỜI CẢM TẠ iv TÓM TẮT v SUMMARY vi MỤC LỤC .vii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT x DANH SÁCH CÁC BẢNG xi DANH SÁCH CÁC HÌNH xii Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Cơ sở tiến hành ý nghĩa nghiên cứu 1.2 Nội dung nghiên cứu 1.3 Yêu cầu 1.4 Giới hạn đề tài Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược mía 2.1.1 Lịch sử phát 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Nguồn gốc phân bố 2.1.4 Nhân giống 2.1.5 Sản lượng 2.1.6 Chế biến sử dụng 2.1.7 Vị trí kinh tế mía 2.1.8 Sản xuất protein tái tổ hợp từ mía 2.1.9 Bệnh mía 2.2 Bệnh than 2.2.1 Nguồn gốc phân bố 2.2.2 Triệu chứng 2.2.3 Tác nhân gây bệnh 2.2.4 Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh 10 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.2.5 Thiệt hại kinh tế 11 2.2.6 Biện pháp phòng trừ 11 2.3 Các phương pháp xác định bệnh than 11 2.3.1 Dựa vào triệu chứng 11 2.3.2 Phương pháp chẩn đoán cách nhuộm mắt mầm soi kính hiển vi huỳnh quang 12 2.3.3 Phương pháp ELISA 12 2.3.4 Phương pháp PCR 12 2.4 Tình hình nghiên cứu bệnh than 21 2.4.1 Trên giới 21 2.4.2 Trong nước 23 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 Nội dung nghiên cứu 24 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 24 3.3 Vật liệu nghiên cứu 24 3.4 Phương pháp tiến hành 24 3.4.1 Phương pháp lấy mẫu 24 3.4.2 Phương pháp phân lập 25 3.4.3 Phương pháp tách đơn bào tử 25 3.4.4 Phương pháp nhân sinh khối nấm 26 3.4.5 Phương pháp ly trích DNA tổng số nấm Ustilago scitaminea 26 3.4.6 Tinh sản phẩm ly trích 28 3.4.7 Phương pháp PCR phát nấm Ustilago scitaminea 29 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Phân lập, tách đơn bào tử nhân sinh khối nấm Ustilago scitaminea 32 4.1.1 Kết phân lập 32 4.1.2 Kết tách đơn bào tử 33 4.1.3 Kết nhân sinh khối 34 4.2 Kết ly trích tinh DNA sợi nấm 36 4.2.1 Kết ly trích 36 4.2.2 Kết tinh 37 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.3 Phát DNA Ustilago scitaminea kỹ thuật PCR 39 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Đề nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC 47 ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT bp : base pair BLAST : Basic Local Alignment Search Tool ctv : cộng tác viên dNTP : deoxyribonucleotide – – triphosphate EDTA : Ethylene Diamine Tetracetic Acid ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay Kb : kilo base m : micro mol M : micro mol/lít ng : nano gram NST : nhiễm sắc thể Nu : Nucleotide PCR : Polymerase Chain Reaction PGA : Potato glucose agar RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism SDS : Sodium dodecyl sulphate TAE : tris acetic EDTA Taq : Thermus aquaticus TE : tris EDTA Tm : melting temperature UI : unit international UV : Ultraviolet x LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com bình tam giác chứa môi trường PGA* lỏng lắc 160 vòng/phút, nhiệt độ 28 0C Sau ngày, sinh khối đạt lượng cần thiết ta tiến hành thu sinh khối (Hình 4.5) Hình 4.5: Sinh khối nấm sau ngày lắc Tuy theo dõi ngày trình lắc lắc liên tục nên khó phát bị nhiễm khuẩn lắc Để đảm bảo không bị nhiễm khuẩn, trước thu sinh khối ta tiến hành quan sát dịch lỏng kính hiểu vi quang học để kiểm tra có mặt vi khuẩn (chỉ phương pháp tương đối) Thông thường, mẫu bị nhiễm khuẩn bị đục lắc Kết nhân sinh khối thể Bảng 4.2 Bảng 4.2: Khối lượng sợi nấm sau ngày lắc mơi trường PGA* lỏng Dịng nấm Us1 Us2 Us3 Us4 Us5 Us6 Us7 Us8 Us9 Us10 Us11 Nguồn Comus F 156 H 39 – 3633 Ja 60 – K 84 – 200 My 55 – 14 VĐ 86 – 368 R 570 ROC 10 ROC 16 VN 84 – 4137 Khối lượng (g) 3,24 2,86 2,57 3,31 2,87 2,64 2,14 3,02 2,43 2,53 2,65 35 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhận xét: Qua Bảng 4.2 cho thấy tất dòng nấm thí nghiệm có khả tạo sợi nấm mơi trường PGA* lỏng Dịng nấm Us4 cho sinh khối cao với khối lượng 3,31 g Dòng nấm Us7 cho sinh khối thấp với khối lượng 2,14 g 4.2 Kết ly trích tinh DNA sợi nấm 4.2.1 Kết ly trích Các dịng nấm Ustilago scitaminea sau nhân sinh khối thu nhận sợi nấm tiến hành li trích DNA tổng số DNA sợi nấm li trích theo qui trình Lee Taylor (1990) DNA tổng số kiểm tra chất lượng cách điện di gel agarose 0,8 %.Kết li trích DNA tổng số thể Hình 4.6 DNA tổng số Hình 4.6: Kết li trích DNA 11 dịng nấm Ghi chú: L1: Us1 L4: Us4 L7: Us7 L10: Us10 L2: Us2 L5: Us5 L8: Us8 L11: Us11 L3: Us3 L6: Us6 L9: Us9 Kết ly trích cho thấy DNA tổng số khơng tinh hồn tồn Ngồi DNA tổng số cịn có thêm đoạn DNA bị đứt gãy, RNA protein mà q trình ly trích khơng thể loại bỏ 36 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nguyên nhân tạo sản phẩm tạp  Quá trình nghiền chưa tốt hóa chất phenol, chloroform  Thời gian cho phenol để phá hủy lớp vỏ, lớp màng nhân, loại bỏ protein Nếu thời gian dài gây nên đứt gãy DNA lượng đáng kể  Ly tâm (tốc độ, thời gian, thao tác): - Ly tâm với thời gian ngắn, tốc độ thấp phân lớp chưa tốt phần dịch chứa DNA, lớp xác tế bào, lớp phenol - Ly tâm với thời gian dài phenol phá huỷ nhiều DNA gây nhiều đoạn đứt gãy - Ly tâm với tốc độ cao thời gian dài DNA bị gãy nhiều 4.2.2 Kết tinh Để phản ứng PCR tối ưu sản phẩm DNA li trích cần phải tương đối tạp chất Khi DNA khn cịn lẫn protein, DNA gãy, hiệu phản ứng PCR giảm tỉ lệ thuận với độ tinh DNA khuôn (Khuất Hữu Thanh, 2003) Vì vậy, để có DNA khn tốt hơn, chúng tơi tiến hành tinh DNA tổng số Kết tinh kiểm tra cách điện di gel agarose 0,8 % (Hình 4.7) DNA tổng số Hình 4.7: DNA tổng số tinh Ghi chú: L1: Us1 L4: Us4 L7: Us7 L10: Us10 L2: Us2 L5: Us5 L8: Us8 L11: Us11 L3: Us3 L6: Us6 L9: Us9 37 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sau tiến hành tinh sạch, thu DNA tổng số tương đối tốt, lượng tạp nhiễm giảm nhiều DNA tổng số thu từ qui trình tinh sử dụng để làm khn cho phản ứng PCR Pha lỗng DNA tổng số Khi dùng để khuếch đại vùng mục tiêu từ DNA tổng số phản ứng PCR, lượng DNA sử dụng thường khoảng từ 10 – 100 ng cho phản ứng Nếu lượng DNA sử dụng khơng đủ số lượng khn DNA cho q trình tổng hợp Kết sản phẩm PCR khơng đủ số lượng mong muốn Cịn số lượng DNA khn q nhiều tạo nhiều sản phẩm phụ không mong muốn (Khuất Hữu Thanh, 2003) Nhưng DNA tổng số li trích có hàm lượng lớn Vì vậy, trước thực phản ứng PCR, chúng tơi tiến hành pha lỗng DNA gốc TE 1X Tùy vào lượng DNA tổng số mà mẫu pha loãng theo nồng độ khác DNA khn mẫu sau pha lỗng điện di kiểm tra gel agarose 0,8 % ghi nhận hình ảnh điện di thơng qua máy chụp DNA phần mềm Gel doc (Hình 4.8) DNA tổng số Hình 4.8: DNA tổng số sau pha loãng Ghi chú: L1: Us1 L4: Us4 L7: Us7 L10: Us10 L2: Us2 L5: Us5 L8: Us8 L11: Us11 L3: Us3 L6: Us6 L9: Us9 38 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.3 Phát DNA Ustilago scitaminea kỹ thuật PCR Sử dụng primer bE4 bE8 Albert, H H Schenck, S (1996) thiết kế cho vùng gene bE nấm Ustilago scitaminea, sản phẩm khuếch đại có kích thước khoảng 442 bp Dùng quy trình nhiệt cặp primer Albert, H H Schenck, S (1996) thiết kế, khuếch đại đoạn DNA có kích thước khoảng 442 bp (Hình 4.9) Tạp1 Sản phẩm PCR Tạp2 Hình 4.9: Sản phẩm PCR theo quy trình Albert, H H Schenck, S Tuy nhiên, theo Hình 4.9 lượng sản phẩm tạp tương đối lớn Sản phẩm tạp nhiều nguyên nhân: Tạp 1: Là sản phẩm PCR khơng đặc hiệu, sản phẩm có kích thước lớn sản phẩm PCR cần khuếch đại, nguyên nhân do: primer, DNA mẫu, dNTPs, thời gian kéo dài chuỗi, hay Taq DNA polymerase cho phản ứng nhiều Để giảm sản phẩm tạp ta thay đổi kết hợp vài yếu tố sau:  Giảm thời gian bắt cặp  Tăng nhiệt độ bắt cặp  Giảm thời gian kéo dài  Giảm nhiệt độ kéo dài  Giảm primer, giảm DNA mẫu, giảm Taq DNA polymerase Tạp 2: Có thể lượng primer, Taq DNA polymerase, DNA mẫu cho phản ứng q nhiều DNA mẫu biến tính khơng tốt thời gian biến tính ngắn nhiệt độ biến tính thấp Chúng tiến hành thay đổi vài yếu tố phản ứng PCR để thu sản phẩm đặc hiệu, khơng có tạp 39 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Trường hợp tăng nhiệt độ bắt cặp khơng thể được, nhiệt độ nóng chảy mồi xuôi 53,6 0C mồi ngược 54,5 0C, nhiệt độ bắt cặp theo chu kỳ nhiệt 52 0C Thay đổi đầu tiên: Chúng giảm lượng DNA mẫu đưa vào, kết hợp với giảm Taq DNA polymerase (1,5 U/phản ứng), giảm primer (0,5 pmol/μl), thành phần phản ứng khác chu kỳ nhiệt không đổi, kết giảm bớt tạp (phần tạp khơng cịn nữa) (Hình 4.10) Sản phẩm PCR Hình 4.10: Sản phẩm PCR sau thay đổi Những thay đổi sau: Chúng giảm yếu tố Taq DNA polymerase, primer, dNTPs, MgCl2, thay đổi chu kỳ nhiệt cuối thiết lập nồng độ hóa chất chu kỳ nhiệt tối ưu để khuếch đại đặc hiệu sản phẩm vùng gene bE nấm Ustilago scitaminea (Bảng 4.3) Bảng 4.3: Nồng độ yếu tố phản ứng PCR thay đổi Nồng độ đầu Nồng độ cuối MgCl2 25 mM 2,5 mM Nồng độ cuối thay đổi mM dNTPs 10 mM 0,2 mM 0,15 mM Primer F 10 pmol/μl pmol/μl 0,4 pmol/μl Primer R 10 pmol/μl pmol/μl 0,4 pmol/μl U/μl 2,5 U 1U Hóa chất Taq DNA polymerase 40 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chu kỳ nhiệt thay đổi: Khởi động: 94 0C – phút 94 0C – 45 giây 52 0C – 30 giây 30 chu kỳ 72 0C – 30 giây Kết thúc: 72 0C – phút Cuối thu sản phẩm PCR đặc hiệu khơng cịn tạp (Hình 4.11) Sản phẩm PCR Hình 4.11: Sản phẩm PCR sau thay đổi nồng độ hóa chất chu kỳ nhiệt Sau xây dựng quy trình tối ưu, chúng tơi tiến hành khuếch đại DNA 11 dòng nấm phân lập Sản phẩm kiểm tra cách điện di gel agarose 1,2 % Kết cho thấy Hình 4.12 442 bp 400 bp Hình 4.12: Sản phẩm PCR theo quy trình 41 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Ghi chú: L1: Us1 L4: Us4 L7: Us7 L10: Us10 L2: Us2 L5: Us5 L8: Us8 L11: Us11 L3: Us3 L6: Us6 L9: Us9 M: Ladder 100 bp Như theo quy trình vừa tiết kiệm hóa chất, đặc biệt Taq DNA polymerase hóa chất đắt tiền, từ 2,5 U cho phản ứng giảm xuống U cho phản ứng, lại cho sản phẩm khuếch đại tốt Chúng BLAST trình tự khuếch đại sở liệu GenBank (phụ lục 1) 42 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận  Đã phân lập tách đơn bào tử 11 dòng nấm Ustilago scitaminea từ 11 giống mía khác Bình Dương  Nấm Ustilago scitaminea tăng sinh khối nhanh môi trường PGA* lỏng  Có thể áp dụng quy trình ly trích DNA tổng số nấm phổ biến giới để tiến hành ly trích DNA tổng số nấm Ustilago scitaminea  Áp dụng quy trình tinh (mục 3.4.6) để thu DNA tổng số nấm sau ly trích tốt  Qua nghiên cứu xây dựng quy trình PCR tương đối tốt, phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm để khuếch đại đoạn gen bE nấm Ustilago scitaminea 5.2 Đề nghị  Xây dựng qui trình PCR để phát trực tiếp nấm Ustilago scitaminea xâm nhiễm vào mía, từ chẩn đốn sớm bệnh than  Cần có nghiên cứu rộng hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa nấm Ustilago scitaminea để đánh giá xác tình trạng nhiễm bệnh mía Việt Nam  Nghiên cứu sâu sử dụng phương pháp RFLP, RAPD, AFLP… để đánh giá mức độ khác biệt di truyền dòng nấm Ustilago scitaminea Việt Nam  Tiến hành giải trình tự vùng gene bE so sánh để đánh giá xác khác biệt gene nấm 43 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com  Tiến hành nghiên cứu độc tố nấm để đề biện pháp ngăn ngừa điều trị bệnh TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1999 Di truyền phân tử Nhà xuất nông nghiệp Lê Song Dự, Nguyễn Thị Quí Mùi, 1997 Cây mía Nhà xuất Nơng nghiệp Tp Hồ Chí Minh Vũ Triệu Mân, 2003 Chẩn đoán bệnh hại thực vật Nhà xuất Nông nghiệp Nguyễn Thị Lang, 2002 Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học Nhà xuất Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh Trần Văn Sỏi, 2003 Cây mía Hà Đình Tuấn, 2004 Điều tra thành phần hại mía số giống nhập nội khảo sát diễn biến bệnh hại quan trọng vùng mía nguyên liệu vùng Đông Nam Bộ Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Phan Gia Tân, 1990 Cây mía Tủ sách ĐH Nông Lâm Nguyễn Văn Tuất, 2002 Kỹ thuật chẩn đoán giám định bệnh hại trồng Nhà xuất Nơng nghiệp TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGỒI Albert, H, H., Schenck, S., 1996 PCR amplification from a homolog of the bE mating – type gene as a sensitve the presence of Ustilago scitaminea DNA Plant Dis 80: 1189 – 1192 10 Braithwaite K S., Bakkeren G., et al., 2004 Genetic variation in a worldwide collection of the sugarcane smut fungus Ustilago scitaminea Australian Society of Sugar Cane Technologists 47: 233 – 235 44 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 11 Comstock J C., and Lentini R.S., 2006 Sugarcane Smut Disease http://edis.ifas.ufl.edu/SC008 12 Croft B J., and Braithwaite K S., 2006 Management of an incursion of sugarcane smut in Australia Australasian Plant Pathology 35: 113 - 122 13 Engelke J H., Egan B T., et al., 2001 Sugarcane smut: successful management in the Ord Crop Protection 22: 45 – 49 14 Grisham M P., 2001 An international project on genetic variability within sugarcane smut International Society of Sugar Cane Technologists 45: 459 461 15 Gupta V.P., 2006 Sugarcane smut http://www.apsnet.org/online/Archive/2003/IW000024.asp 16 Martinez M I., Medina, et al., 2000 Changes of some chemical parameters, involved in sucrose recovery from sugarcane juices, related to the susceptibility or resistance of sugarcane plants to smut (Ustilago scitaminea) International Sugar Journal 102: 445 - 448 17 Miz Y., Martínez B., et al., 2004 Sugarcane smut (Ustilago scitaminea Sydow): diagnostic methods Revista de Protección Vegetal 19: 16 18 Naik G R., Jayaraj Y M., et al., 2002 Early detection of sugarcane smut infection by serological (ELISA) technique Indian Sugar 51: 801 - 805 19 Nallathambi P., Padmanaban P., et al., 2001 Standardization of an indirect ELISA technique for detection of Ustilago scitaminea Syd., causal agent of sugarcane smut disease Journal of Mycology and Plant Pathology 31: 76 - 78 20 Riley I T., Jubb T F., et al., 1999 First outbreak of sugarcane smut in Australia Proceedings of the XXIII ISSCT Congress 2: 333 - 337 21 Schenck S., 2003 New race of sugarcane Smut on Maui Pathology Report 69:13 22 Sharififar and Kazemi Q., 1999 Evaluation of five different fungicides on control of sugarcane smut (Ustilago scitaminea) in Iran Sugar Technologists' Association of India 79: 125 – 129 23 Singh N., Somai B.M., et al., 2005 In vitro screening of sugarcane to evaluate smut susceptibility Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80: 259 - 266 45 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 24 Singh N., Somai B.M., et al., 2004 Smut disease assessment by PCR and microscopy in inoculated tissue cultured sugarcane cultivars Plant Science 167 : 987 - 994 25 Sinky K V., 2000 The smut fungi on Saccharum and related grasses Australasian Plant Pathology 29: 26 Solas M T., Piñon D., et al., 1999 Ultrastructural aspects of sugarcane bud infection by Ustilago scitaminea teliospores Sugar Cane 2: 14 - 18 27 Wada A C., 2003 Control of sugarcane smut disease in Nigeria with fungicides Crop Protection 22: 45 - 49 28.Wada A C., Mian M W., et al., 1999 Control of sugarcane smut (Ustilago scitaminea Syd) disease in Nigeria and suggestions for an integrated pest management approach Sugar Tech 3: 48 - 53 29 Xu L., Que Y., et al., 2004 Genetic diversity of Ustilago scitaminea in Mainland China Sugar Tech 6: 267 - 271 30 Yadahalli K B., 2002 Evaluation of artificial inoculation techniques of sugarcane smut Ustilago scitamines Syd Cooperative Sugar 34: 33 - 35 ĐỊA CHỈ TRÊN WEB 31 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi 46 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Phụ lục 1: Trình tự đoạn khuếch đại gene bE nấm Ustilago scitaminea dùng cặp mồi bE4 bE8 sở liệu GenBank LOCUS 1996 DEFINITION ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM USU61291 442 bp DNA linear PLN 23-JUL- Ustilago scitaminea b East mating-type gene, partial cds U61291 U61291.1 GI:1438940 Sporisorium scitamineum Sporisorium scitamineum Eukaryota; Fungi; Basidiomycota; Ustilaginomycetes; Ustilaginomycetidae; Ustilaginales; Ustilaginaceae; Sporisorium REFERENCE (bases to 442) AUTHORS Albert,H.H and Schenck,S TITLE PCR amplification from a homolog of the bE mating-type gene as a sensitive assay for the presence of Ustilago scitaminea DNA JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 442) AUTHORS Albert,H.H and Schenck,S TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (19-JUN-1996) USDA ARS, Hawaii Agriculture Research Center, 99-193 Aiea Heights Dr., Aiea, HI 96701, USA FEATURES Location/Qualifiers source 442 /organism="Sporisorium scitamineum" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:49012" /note="plus mating-type" gene 442 /gene="b East mating-type gene" CDS 442 /gene="b East mating-type gene" /codon_start=2 /protein_id="AAB04128.1" /db_xref="GI:1438941" /translation="FINARRRSGWSNILREFARGDRSRMKVLMQAKMSSCGLSVPLHP GCSTPIRSVDDILCDNLNRPLTAADKKGFEEEWSSMISWIRYGVKEKIGDWVYDLVAA SKKPRKTGQARPVTTPVKRTPARKAATTQQAKPGRAKQRXSATPS" ORIGIN gttcatcaac gcgcgccgcc gttccggctg gtccaacatt ctccgcgaat ttgcacgggg 61 cgatcgttca cgaatgaaag ttctcatgca agccaagatg agctcttgcg gcttgtccgt 121 tcctttgcac ccgggctgct cgacgccaat tcggagcgtg gacgatatcc tttgcgacaa 181 cctcaatcga cctctcacag cagcagacaa gaaagggttc gaagaagaat ggagcagcat 241 gatcagctgg atcagatatg gcgtcaagga aaagatcgga gactgggtct acgatctcgt 301 tgcggcaagc aagaagccgc ggaaaactgg tcaagcgcgc ccagtcacca ctcctgtgaa 361 gcgcacacca gcacgcaaag cagccacgac tcagcaggcc aagcctggga gggctaagca 421 gagarcaagc gcgacacctt cc 47 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục 2: Cách pha số hóa chất Pha lysis buffer Lysis buffer có thành phần cụ thể sau: Tris HCl 50 mM, EDTA 50 mM, SDS %, - mercaptoethanol %  Cho vào becher thể tích nước khử ion gần với thể tích dung dịch buffer mong muốn  Lần lượt cho thành phần khác: Tris HCl, EDTA SDS vào dung dịch với lượng cho đảm bảo nồng độ cuối mong muốn  Khuấy cho hỗn hợp hòa tan, sau cho - mercaptoethanol vào  Khuấy chuẩn độ cho dung dịch lysis buffer đạt pH = Nếu sau chuẩn độ thể tích cuối chưa đạt mong muốn cần thêm nước khử ion vào cho đạt thể tích mong muốn Pha Phenol  Làm tan 100 g phenol (tinh thể) cách đặt bồn ủ nhiệt 65 0C (phải bịt kín dụng cụ đựng phenol hòa tan)  Sau phenol tan hoàn toàn, thêm vào 100 ml dung dịch Tris bazơ 0,5 M, pH =  Khuấy từ 10 phút, để yên nhiệt độ phòng hỗn hợp tách thành hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên cách cẩn thận Lưu ý thao tác nên thực tủ hood phải giữ phenol tối để tránh oxy hóa nguy hiểm đến sức khỏe  Tiếp tục cho vào 100 ml dung dịch Tris HCl 0,5 M, pH  Khuấy từ 10 phút, để yên nhiệt độ phòng dung dịch tách làm hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên  Lập lại chu kỳ lần Sau phủ lên dung dịch phenol thu lớp TE 1X (50 ml) 48 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com  Lưu ý phải bảo quản dung dịch phenol tối (dùng bình đựng có màu tối bịt kín bình giấy bạc) Pha dung dịch TE 1X  Thành phần gồm: 10 mM Tris HCl, mM EDTA, pH  Trước hết pha dung dịch Tris HCl stock, pH  Cho dung dịch Tris HCl EDTA vào nước khử ion  Khuấy chuẩn độ pH đến 49 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... Nghiên cứu Phát triển Mía Đường tỉnh Bình Dương, chúng tơi thực đề tài ? ?Xây dựng qui trình PCR phát nấm Ustilago scitaminea gây bệnh than mía? ?? Đề tài thực 11 dịng nấm từ 11 giống mía khác thuộc... MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ….  … XÂY DỰNG QUI TRÌNH PCR PHÁT HIỆN NẤM Ustilago scitaminea GÂY BỆNH THAN TRÊN MÍA Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS TS BÙI CÁCH TUYẾN HỒ BỬU THƠNG... phân lập, tách đơn bào tử nhân sinh khối nấm Ustilago scitaminea  Xây dựng qui trình PCR phát trực tiếp DNA sợi nấm Ustilago scitaminea gây bệnh than mía 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu  Đề