LUẬN văn tốt NGHIỆP xác ĐỊNH KHẢ NĂNG gây BỆNH đục cơ của macrobrachium rosenbergii nodavirus và extra small virus TRÊN tôm CÀNG XANH (macrobrachium rosenbergii)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THANH TIẾN XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG GÂY BỆNH ĐỤC CƠ CỦA Macrobrachium rosenbergii Nodavirus Extra Small Virus TRÊN TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Theo kết nghiên cứu năm gần cho thấy bệnh đục tôm xanh ngày gia tăng, gây thiệt hại không nhỏ cho người ni tơm xanh Cần Thơ nói riêng nước nói chung Do việc xác định khả gây bệnh đục Macrobrachium rosenbergii Nodavirus (MrNv) Extra small virus (XSV) tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) thực nhằm tìm hiểu khả gây bệnh đục MrNV XSV Kết nghiên cứu thực mẫu tơm thí nghiệm thăm dị xác định LD50 tơm giống.Và theo phương pháp mô học RT-PCR -1- LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Tôi xin cảm ta Đặng Thị Hồng Oanh, anh Hồng Tuấn, anh Lê Hữu Thơi hướng dẫn tận tình tơi thực đề tài giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Xin trân trọng cảm tạ quí thầy phụ trách phịng thí nghiệm tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận văn Để có kết ngày hơm nay, tơi xin chân thành cảm ơn tất q thầy Trường, Khoa Thủy Sản, Bộ môn Sinh học Bệnh Thủy Sản giáo dục, truyền đạt kiến thức cần thiết cho thân để em thực đề tài Lời cảm tạ cuối xin dành cho ngoại mẹ nuôi dưỡng, bảo bọc tạo điều kiện để tơi tiếp thu giáo dục tốt có thành ngày hôm NGUYỄN THANH TIẾN Đại học Cần Thơ, niên khóa 2005 - 2009 -2- LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG I GIỚI THIỆU Thủy sản ngành kinh tế mũi nhọn Việt Nam nói chung Đồng Bằng Sơng Cửu Long (ĐBSCL) nói riêng Trong vịng 10 năm từ 1995 đến 2005, diện tích ni trồng thủy sản vùng ĐBSCL tăng 2,37 lần sản lượng tăng vọt 3,68 lần Đây khu vực có nhiều điều kiện thuận lợi cho việc phát triển nuôi trồng thủy sản, tổng diện tích ni thủy sản nước nước lợ vào khoảng 685.000 ha, sản lượng gần 1,5 triệu tấn/năm, chiếm 70% sản lượng thủy sản nuôi nước (riêng cá tra, cá basa diện tích ni toàn vùng gần 5.000ha, tổng sản lượng năm 2007 khoảng triệu tấn) với nhiều loại hình canh tác khác Bên cạnh đối tượng phổ biến thị trường ngày như: cá tra, basa số lồi tơm biển xanh đối tượng ý tới Diện tích ni tơm xanh tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long tăng nhanh năm gần đạt gần 5.000ha, tăng gấp 10 lần so với thời điểm năm trước Việc tăng nhanh diện tích mật độ nuôi tôm xanh Cần Thơ tạo điều kiện cho nhiều bệnh phát triển Một số bệnh thường gặp tơm xanh như: bệnh đóng rong, đen mang, bệnh mềm vỏ, bệnh đốm nâu, bệnh phồng mang… đặc biệt bệnh đục gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm Cần Thơ Bệnh đục tôm xanh Cần Thơ ngày diễn biến phức tạp Để tìm nguyên nhân phương pháp phòng bệnh nhằm giảm thiệt hại kinh tế cho người nuôi tôm Cần Thơ Để góp phần ổn định suất chất lượng giống đề tài “Xác định khả gây bệnh đục Macrobrachium rosenbergii Nodavirus (MrNv) Extra small virus (XSV) tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii)“ cấp thiết nhằm mục tiêu: Tìm hiểu khả gây bệnh đục MrNV XSV Nội dung đề tài: Thực thí nghiệm thăm dò xác định khả gây bệnh đục MrNV XSV phân lập từ tôm xanh bị bệnh đục Xác định LD50 MrNV XSV tôm xanh -3- LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU Tình hình ni tơm xanh Việt Nam có nhiều tiềm để phát triển nuôi trồng thuỷ sản khắp miền đất nước nuôi biển, nuôi nước lợ nuôi nước Đến năm 2003, sử dụng 612.778 nước mặn, lợ 254.835 nước để ni thuỷ sản Trong đó, đối tượng ni chủ lực tơm với diện tích 580.465 Diện tích ni tôm xanh tỉnh Đồng sông Cửu Long tăng nhanh năm gần đạt gần 5.000ha, tăng gấp 10 lần so với thời điểm năm trước Diện tích ni tơm xanh tập trung lớn tỉnh hai bên bờ sông Tiền sông Hậu An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Bến Tre Thành phố Cần Thơ Năm 2007 diện tích ni thuỷ sản Thành Phố Cần Thơ 15.245 gồm cá ao, cá tra, cá ruộng tôm xanh, tăng 5% so với năm 2006 Sản lượng thu hoạch 175.083 tấn, cá tra đạt 154.564 vượt kế hoạch 14,4%, tơm xanh 268 Tình hình dịch bệnh ni trồng thủy sản 2.2.1 Tình hình dịch bệnh tôm xanh Theo tổng hợp nhiều nghiên cứu bệnh tôm xanh khu vực ĐBSCL, kết cho thấy số bệnh xuất tôm xanh như: An giang, bệnh sinh vật bám 44%, bệnh đen mang 28%, bệnh có đốm nâu 28 % Bệnh nguyên sinh động vật: Epistylis, Zoothamnium, Vorticella, Acineta, mang 32 %, bề mặt thể 32%, chân bơi 31% Ngồi bệnh cịn có thêm số sinh vật kí sinh khác tìm thấy tỉnh lân cận Đồng Tháp, Trà Vinh Cần Thơ, sinh vật bám gây bệnh nhiều mơ hình ni tơm lúa ln canh (Dat and Oanh, 2002) Bên cạnh tơm xanh bị bệnh số lồi vi khuẩn thuộc nhóm sau: Vibrio gây chết tôm giai đoạn post-larve với tỉ lệ chết từ 18-80% 48 giờ, ngồi cịn có nhóm vi khuẩn thuộc Aeromonas, Speudomonas,… 2.2.2 Một số bệnh vi khuẩn tôm xanh 2.2.2.1 Bệnh vi khuẩn Vibrio Tác nhân gây bệnh thường vi khuẩn :Vibrio anguillarium, V.alginolyticus, V.parahacmolyticus, V harveyi loài khác Khi nuôi -4- LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com mật độ dày, cho ăn nhiều quản lý môi trường ao nuôi không tốt làm bệnh xuất Ở Thái Lan bệnh vi khuẩn gây ảnh hưởng nặng nề đến trại giống, tỉ lệ chết lên đến 100% bệnh xuất hầu hết trại sản xuất tơm giống bị thất bại hồn tồn (AAHRI,1997 trích dẫn Phạm Minh Trúc 2009 ) Ở Trung Quốc, theo Xianle and Huang (2003) tỉ lệ chết thường 30-50% tôm giai đoạn hậu ấu trùng Nếu giai đoạn giống bị nhiễm bệnh gây tổn thất nặng hay trắng Do vậy, trại giống thường sử dụng thuốc kháng sinh để ngăn chặn bệnh xảy điều làm xuất nhiều dịng vi khuẩn kháng thuốc 2.2.2.2 Bệnh đốm nâu Nguyên nhân gây bệnh liên kết nhiều tác nhân: hóa học, dinh dưỡng, lý học Vi khuẩn nấm tác nhân lây nhiễm thứ hai Các vi khuẩn gồm: Aeromonas sp., Pseudomonas sp Tơm bị bệnh có dấu hiệu bị hoại tử, sưng viêm đốm đen thân phụ tỉ lệ chết không đáng kể làm giảm giá trị kinh tế tôm, theo Sandifer Smith (1995) bệnh thường xảy ao nuôi tôm đặc biệt hệ thống nuôi tôm công nghiệp mật độ dày 2.2.2.3 Bệnh hoại tử vi khuẩn (Bacterial Necrosis) Bệnh ảnh hưởng đến ấu trùng tôm xanh giai đoạn 4-5 gây tỉ lệ chết 100% vòng 48h Taihiti Dấu hiệu bệnh lý bệnh thể tôm xanh đổi màu, ruột trắng ấu trùng yếu lắng xuống đáy bể , có đốm nâu anten phụ (Aquacop, 1977 trích dẫn Phạm Minh Trúc 2009 ) 2.2.2.4 Bệnh vi khuẩn dạng sợi Bệnh thường vi khuẩn dạng sợi: Leucothrix sp., Thiprix sp., Flexibacter sp., Cytophaga sp., Flavobacterium sp gây Nhiễm bệnh vào tất giai đoạn phát triển tôm Bệnh gây chết 80% hay vài ngày đến vài tuần Ở ấu trùng tôm bột vi khuẩn phát triển bề mặt thể, lông phụ Ở tôm lớn, vi khuẩn diện lông tơ chân bụng, chân ngực, chân đuôi, vảy râu, phụ miệng mang Tôm nhiễm nặng, mang xuất màu vàng đến xanh Vi khuẩn dạng sợi gây cản trở hô hấp, lột vỏ, bắt mồi, gây chậm lớn hay gây chết tôm (Từ Thanh Dung, 2008) 2.2.3 Bệnh dinh dưỡng môi trường 2.2.3.1 Bệnh đen mang -5- LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Nguyên nhân gây bệnh đen mang đáy ao nuôi bị nhiễm bẩn Khi kiểm tra thấy khí độc (Ammonia) đáy ao cao có nhiều bùn đáy vật chất hữu dư thừa ( thức ăn thừa - thức ăn nhiều tôm ăn không hết, từ tảo chết v.v ) Bệnh thường xuất ao nuôi với mật độ cao, ao nuôi theo hệ thống khơng thay nước thay nước Khi tơm mắc bệnh mang xuất màu đen đôi lúc có chất hữu vơ bám vào mang tôm Nếu không xử lý kịp thời làm tơm nhiễm bệnh từ vi khuẩn Bình thường bệnh đen mang xảy lúc tôm lớn (tôm hai tháng rưỡi tới ba tháng trở lên) ( ) 2.2.3.2 Bệnh sinh vật bám Nguyên nhân bệnh Zoothamnium, Epistylis, Vorticella, Acineta, loại Protozoa bám vỏ mang tôm làm tôm stress bị nặng thường tôm lột vỏ Kiểm tra tơm sàn ăn (vó), thấy vỏ tơm bị bẩn giống có nhớt bám vỏ tơm nhiều thấy có rong tảo bám vỏ tôm, vỏ tôm không Sau bị nhiễm bệnh, tôm giảm ăn, từ từ yếu đi, nằm vùi đống bùn ao Nếu không trị kịp thời tôm chết nhiễm tác nhân gây bệnh hội (vi khuẩn) Ở trung Quốc, bệnh thường nghiêm trọng vào mùa sản xuất giống Các lồi kí sinh trùng công vào ao ương, chúng sinh sản cách nhanh chóng gây chết tơm giống Nếu gặp môi trường xấu, giàu chất dinh dưỡng tỉ lệ chết lên đến 60-80% (Xianle Huang, 2003) Các nghiên cứu bệnh đục 2.3.1 Tình hình nghiên cứu nước Theo tổng hợp nhiều nghiên cứu bệnh tôm xanh nước nói chung ĐBSCL nói riêng Ngồi bệnh thường gặp tơm xanh cịn bị bệnh số lồi vi khuẩn thuộc nhóm: Vibrio gây chết tôm giai đoạn Post-larve với tỉ lệ chết 18-80% 48 ngồi cịn có nhóm vi khuẩn thuộc Aeromonas, Speudomonas,… Theo Bùi Quang Tề (2003) cho tác nhấn gây bệnh đục tôm xanh vi khuẩn Lactoccocus garvieae Bệnh đục Thành phố Cần Thơ từ năm 2004 đến ngày gia tăng Năm 2004 bệnh đục gây thiệt hại 10ha diện tích ni tơm xanh Cờ Đỏ gây hao hụt từ 60-70% Năm 2005, bệnh đục gây thiệt hại số mơ hình ni Cờ Đỏ, mức độ hao hụt từ 70-100% Từ đầu năm 2006 đến nay, tình hình bệnh đục lại xuất số trại giống địa bàn -6- LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Thành phố Cần Thơ gây hao hụt lớn cho ao nuôi thịt tỷ lệ hao hụt lên đến 70-100% sau tuần thả nuôi Thành phố Cần Thơ, nơi tập trung nhiều trại giống tôm xanh nơi có vùng ni tơm thương phẩm tương đối lớn gần 400ha 2.3.2 Tình hình nghiên cứu nước Nash et al (1987) cho bệnh hoại (trắng cơ) có dấu hiệu bệnh mơ học tương tự bệnh đục gây hao hụt lên đến 60% tôm bột 28 ngày tuổi (PL-28) hệ thống ương thâm canh Thái Lan Tôm bệnh có vùng trắng đục (Akiyama et al 1982; Nash et al 1987; Broch, 1988) Tơm chết có liên quan đến hoại tử khắp thể tôm Bệnh phát sinh nhiều trại giống điều kiện mơi trường thay đổi đột ngột Ngồi bệnh hoại tử xảy 1-2 ngày sau thả nuôi thịt Chen et al.(2001) cho bệnh đục tôm xanh xảy Đài Loan năm 1999, tỷ lệ chết 30-75% Tác giả cho tác nhân gây bệnh vi khuẩn Lactoccocus garvieae Bệnh đục vi khuẩn gây có liên quan đến sốc mơi trường nhiệt độ pH Trung Quốc nước có diện tích sản lượng tơm xanh lớn giới với 33.000ha nuôi sản lượng đạt 100.000 năm 2001 (Qian et al, 2003) Trong năm gần nghề nuôi tôm quốc gia bị thiệt hại nặng nề ảnh hưởng bệnh đục cơ, tỷ lệ hao hụt lên đấn 100% ỏ trại giống bệnh phát triển nhanh chóng đến vùng nuôi tôm cua Trung Quốc (Qian et al, 2003) Theo Qian et al (2003) có loại virus tác nhân gây bệnh đục Yang et al (2003) cho tôm xanh lồi nhạy cảm với bệnh đục cơ, bệnh trắng hay bệnh hoại tử bệnh xuất Trung Quốc từ nguồn tôm giống nhập từ Thái Lan Bệnh đục xuất Quảng Đơng sau lây sang tỉnh khác với tỷ lệ nhiễm từ 60-90% tỷ lệ chết >50% cỡ tôm 2-8cm Bệnh thường xuất từ tháng đến tháng năm chủ yếu ấu trùng Tôm bị đục có biểu ban đầu xuất đốm trắng đuôi, tôm ngừng lột xác, bỏ ăn, giảm vận động, phần bị đục, sau tồn thân có màu trắng (cả đầu) chết hoại tử Nguyên nhân gây bệnh ký sinh trùng, vi khuẩn dinh dưỡng Điều kiện môi trường xấu nguyên nhân gây bệnh đục (Yang et al, 2003) Sahul Hameed et al, (2004) mô tả chi tiết tác nhân gây bệnh đục loại virus Macrobrachium rosenbergii Nodavirus (MrNV) Extra small -7- LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com virus (XSV) Tuy nhiên tác nhân gây bệnh đục loại virus chưa rõ Ngoài ra, tác giả cịn trình bày phương pháp chẩn đốn bệnh đục phương pháp RT-PCR Theo Pillai et al, (2005) tơm xanh lồi có giá trị kinh tế nuôi thâm canh miền Nam Ấn Độ Nền công nghiệp nuôi tôm bị thiệt hại kinh tế năm gần bệnh đục với tỷ lệ hao hụt lên đến 100% trại giống ao ương dấu hiệu bệnh xuất đốm trắng thể, đặc biệt đuôi (Sahul Hameed et al, 2004) Phương pháp phòng trị bệnh đục 2.4.1 Các biện pháp phòng bệnh đục virus Theo Sahul Hameed et al (2004) cho biện pháp để quản lý bệnh đục với tác nhân virus kiểm sốt chất lượng tơm mẹ tơm giống Tác giả khuyến cáo thường xuyên vệ sinh trại sản xuất giống, ao nuôi, dụng cụ sản xuất, nước thải…Bên cạnh kiểm sốt chặt chẽ quy trình sản xuất giống quy trình ni thương phẩm Theo Singh Kumar (2005), chưa có biện pháp xử lý hữu hiệu bệnh đục Thực hành quản lý tốt trại giống ao ni góp phần giảm thiểu lây lan mầm bệnh Theo Bonami Winada (2005), khơng có biện pháp xử lý tác nhân gây bệnh virus, trại sản xuất giống ao nuôi nên thực hành quản lý tốt để giảm thiểu lây lan tác động bệnh đục 2.4.2 Các biện pháp phòng trị bệnh đục vi khuẩn Phịng bệnh: khơng để tơm bị sốc mơi trường ni xấu; nhiệt độ ao để biến thiến ngày 30C, thiếu oxy vào buổi sáng, pH=7.5-8.5; H2S=0,01mg/l Bón vơi CaCO3 với liều lượng 1-2kg/100m3 nước ao Cho ăn vitamin C với liều lượng 2-3g/kg thức ăn, tháng đợt, đợt tuần (Bùi Quang Tề, 2003) Trị bệnh: cho ăn số kháng sinh Amikacin Ciprofloxancin liều lượng 100mg/kg tôm/ngày thứ từ ngày thứ 2-7 cho ăn liều 50mg/kg tôm/ngày (Bùi Quang Tề, 2003) -8- LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu - Thời gian : từ tháng đến tháng năm 2009 Địa điểm : Khoa Thủy Sản – Đại Học Cần Thơ 3.2 Dụng cụ hóa chất Dụng cụ - Bể Composite 100 lít, 500lít, 1000 lít Máy sục khí, ống dẫn khí,… Kim tiêm, cối sứ Kẹp, kéo, bi nghiền mẫu, găng tay Ống eppendorf 0,2 ml/0,5 ml, 1,5 ml Hộp đầu cone đầu cone 10 µl, 200 µl, 1000 µl Pipet, micropipette 0,5 - 10 µl / - 20 µl, - 200 µl, 100 - 1000 µl Ống đong 100 ml, chai chịu nhiệt 250 ml, cốc 250 ml Máy ủ nhiệt, máy ly tâm, máy nghiền mẫu, máy so màu quang phổ, máy luân nhiệt, tủ âm, nồi áp suất Cân điện tử, lị vi sóng, điện di, máy chụp hình gel Lamella, lame, kính hiển vi Hoá chất - Dung dịch Davidson’s AFA Dung dịch TN buffer Cồn tuyệt đối, xylen, parafin, sáp ong Hematoxylin, acid alcohol, Eosin, nước cất, nước máy Canada balsam TRIzol reagent, Chloroform, Isoamylalcohol, Ethanol, TE buffer Agarose, dung dịch TAE 0,5 X, Ethidium bromide (10 mg/ml), dung dịch nạp mẫu (6X Loading Dye), thang ADN Enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase), PCR buffer (10mM TrisHCl, pH 8,8, 50mM KCl, 1,5mM MgCl2, 0,1% Trixton X-100), 10 mM dNTPs mix (dNTA, dNTT, dNTG, dNTC), Taq ADN polymerase, mồi -9- LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Điều kiện phản ứng 500C 15 phút 950C phút Sau 950C 20 giây 550C 30 giây 720C phút Lặp lại chu kỳ 35 lần 720C phút Giữ 200C Chuẩn bị phản ứng - Việc chuẩn bị hỗn hợp cho phản ứng RT-PCR thực dựa theo số lượng mẫu cần phân tích Mỗi lần chuẩn bị mẫu cần tính thêm đối chứng dương đối chứng âm - Trộn hóa chất theo thành phần bảng - Cho 49 µl hỗn hợp vào ống eppendorf ghi tên - Thêm µl RNA mẫu đối chứng vào phản ứng - Thực phản ứng PCR với chu kỳ nhiệt nêu - Sau phản ứng kết thúc, sản phẩm khuếch đại điện di gel agarose 1% hiệu điện 100V khoảng thời gian từ 60 phút Điện di đọc kết Chuẩn bị gel - Quá trình điện di thực với dung dịch TAE 0,5X thạch (1% agarose) - Đun nóng dung dịch agarose lị vi sóng agarose tan hồn tồn Sau đó, để dung dịch agarose nguội khoảng 50-600C, cho Ethidium bromide (nồng độ 10 mg/ml) vào đổ từ từ agarose vào khay đựng gel chuẩn bị trước Thể tích gel tuỳ thuộc vào khay gel (Nếu thể tích gel 30 ml cho µl Ethidium bromide, thể tích gel 120 ml cho 5µl Ethidium bromide) - 12 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com - Khi gel đặc lại, cẩn thận gỡ lược gel keo dán bên khỏi khay đựng gel Gel điện di Điện di - Đầu tiên, đặt gel vào bồn điện di (phân tử ADN di chuyển từ cực âm sang cực dương ADN mang điện tích âm), thêm dung dịch điện di TAE 0,5X vào bồn dung dịch vừa bao phủ gel - Dùng pipette hút 10 μl mẫu cần phân tích trộn với giọt dung dịch nạp mẫu cho vào giếng - Phải dùng thang ADN cho gel để xác định trọng lượng phân tử mẫu phân tích - Sau đó, nối bồn điện di với nguồn điện di, điều chỉnh dịng điện 100V thực q trình điện di Ngừng điện di màu xanh đậm di chuyển đến khoảng 1/2 đến 2/3 gel Sau tiến hành đọc kết Đọc kết Sản phẩm khuếch đại đặc hiệu MrNV 425 bp XSV 500 bp 3.4.5 Gây cảm nhiễm thăm dò Dùng kim tiêm rút 50 µl dung dịch có chứa virus chuẩn bị sẵn tiêm vào cá thể tơm bố trí Tơm tiêm đốt thứ tơm Sau quan sát 10 ngày Mỗi ngày cho tôm ăn lần (sáng 6h30, chiều 17h00) Khoảng 4-5 ngày shiphone bể lần cấp nước vào Cách quan sát lần, ghi nhận số lượng tôm chết dấu hiệu bệnh lý tôm 3.4.6 Xác định LD50 3.4.6.1 Chuẩn bị vi-rút 3.4.6.2 Bố trí thí nghiệm gây cảm nhiễm tơm giống Chuẩn bị bể bố trí thí nghiệm - Các bể dụng cụ thí nghiệm tiệt trùng Chlorine nồng độ 100-200 ppm - Sau đó, nước lấy vào 10 bể 20 lít, bể khoảng lít nước, sử dụng Chlorine cho vào bể với nồng độ 30ppm sục khí liên tục 4-5 ngày cho hết Chlorine - Nước thử lại test Chlorine để xem Chlorine hay không (nước lấy vào cốc 10ml nhỏ 2-3 giọt dung dịch test để phút, - 13 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com thấy có màu vàng cam nước cịn Chlorine thấy nước khơng đổi màu Chlorine hết, tơm thả vào) - Sau tơm thu từ trại giống trữ bể 1m3 để khoảng 2-3 ngày Trước tôm thả vào bể kiểm tra tôm lại chọn cá thể khỏe không nhiễm MrNV va XSV (xác định RT-PCR mô học) để gây cảm nhiễm - Tôm bố trí vào 10 bể 20 lít chuẩn bị trước Sau ngày tiến hành gây cảm nhiễm Cách bố trí thí nghiệm - Tơm bố trí 100 PL/bể bố trí vào 10 bể - Tơm bố trí ngẫu nhiên, chọn bể làm đối chứng - Bể đối chứng không ngâm dịch vi-rút, bể lại ngâm dịch virút theo nồng độ giảm dần (1/5000; 0,5/5000; 0,25/5000; 0,125/5000, đơn vị tính: ml) Các tiêu thu thập - Ghi nhận số tôm chết 10 ngày - Phát MrNV XSV từ tơm bệnh RT-PCR Hình 2: Bể bố trí thí nghiệm tơm giống - Tính LD50 theo phương pháp Reed & Muench, 1938 (Tỷ lệ nhiễm (chết)>50%) – 50% Index = (Tỷ lệ nhiễm (chết)>50%) – (Tỷ lệ nhiễm (chết) 5mm < 5mm < 3mm 10’ 20’ 30' 10’ 20’ 60’ 10’ 30’ 30’ 20’ 40’ 60’ 20’ 40’ 180’ 20’ 40’ 180’ 30’ 60’ 180’ 20’ 20’ 30’ 20’ 30’ 30’ 20’ 60’ 60’ 30’ 60’ 60’ 30’ 60’ 60’ < 1mm 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ Sau hoàn thành bước cài đặt chương trình xử lý mơ tiến hành cho sọt chứa mẫu mô tôm vào lọ số cho chương trình cài đặt vận hành c Đúc khối Sau q trình xử lý, chuyển khn nhựa sang vị trí số máy đúc khối Để khối mơ parafin khoảng 30 phút, sau tiến hành đúc khối Mẫu mô đặt khung cố định inox tiến hành đúc khối parafin nóng chảy 650C Định hướng mẫu mơ cho đúng, cẩn thận cho mẫu parafin nóng chảy vào khn Để đảm bảo mẫu giữ vị trí cho khuôn đúc qua khu vực làm lạnh nhanh để cố định vị trí mẫu khn Khi mẫu mơ tẩm vào parafin, đặt khuôn nhựa xử lý có ký hiệu mẫu lên Tiếp theo đặt khn mẫu qua ngăn làm lạnh nhanh để parafin rắn lại, sau tách parafin khỏi khn d Cắt lát mẫu mô Chuẩn bị máy cắt đặt dao vào máy cắt, vặn ốc thật chặt Độ lệch lưỡi dao với mặt cắt khối mẫu tạo thành góc khoảng 15-300 Khối mẫu cắt thành lát cắt tay quay máy xoay tròn, sau vịng xoay có lát cắt hình thành - 16 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Cắt mẫu Trước tiến hành cắt mẫu, phải điều chỉnh độ dày lát cắt Có thể bắt đầu lát cắt 12-16 µm Khi cắt đạt đến vị trí mong muốn, điều chỉnh độ dày lát cắt theo yêu cầu cụ thể loại mẫu mô mục đích nghiên cứu Dán lát cắt vào phiến kính (lame) Chuẩn bị dụng cụ dung dịch - Phiến kính (lame) - Nước ấm nhiệt độ khoảng 400C - Bàn sấy nhiệt độ khoảng 500C Phương pháp dán mẫu Sử dụng nước ấm khoảng 400C, cho lát cắt vào chậu nước ấm Sau lát cắt giãn thẳng chậu nước, nhúng phiến kính vào bên lát cắt, cẩn thận đính đầu lát cắt vào phiến kính, điều chỉnh lát cắt hướng, từ từ rút phiến kính khỏi mặt nước, lát cắt dán chặt vào phiến kính Sau dán lát cắt, tiến hành làm khô tiêu bàn sấy nhiệt độ 500C để loại bỏ paraffin e Nhuộm màu Phương pháp nhuộm màu Hematoxylin Eosin (H&E) Bảng 3.4: Qui trình cài đặt máy nhuộm mẫu mô tự động sau: STT 10 11 12 13 Hóa chất sử dụng Xylen Xylen Xylen Cồn 100% Cồn 100% Cồn 70% Nước cất Hematoxylin Nước máy 1% acid alcohol Nước máy Eosin Cồn 95% Thời gian phút phút phút phút phút phút phút phút phút 10 giây phút phút phút - 17 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 14 15 16 17 phút phút phút phút Cồn 100% Cồn 100% Xylen Xylen Sau cài đặt, cho phiến kính có chứa mẫu vào giá cho vào máy nhuộm với chương trình cài đặt Với phương pháp nhuộm này, nhân tế bào bắt màu xanh dương Vùng tế bào chất với lưới nội chất (tế bào gan, tuyến tụy ngoại tiết) có màu xanh nhạt hay tím Phần tế bào chất lại dao động quanh màu hồng sậm Sử dụng keo để dán tiêu vĩnh viễn Nhỏ giọt keo lên “slide” dán “lamella” lên vùng có miếng mơ Thao tác cần làm nhanh để tránh xâm nhập nước khơng khí vào miếng mơ - 18 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết thí nghiệm thăm dị Sau tôm tiêm theo dõi tuần tơm chết ít, tơm bệnh biểu bệnh rõ Tôm ăn, hoạt động chậm chạp, phần đuôi chuyển màu trắng đục (thường vệt màu trắng đục, đưa tôm ánh sáng mặt trời thấy rõ vết trắng đục) sau lan dần lên phía đầu ngực, tôm bệnh nặng chuyển sang màu trắng đục Sau quan sát cá thể tơm có biểu bệnh đục cơ, cá thể xét nghiệm phương pháp RT-PCR Và kết sau: 500bp 425bp 500bp 400bp 100bp Hình 4.2: Hình RT-PCR phát MrNV XSV Giếng 1: đối chứng ( - ); Giếng 2: đối chứng ( + ); Giếng 3: mẫu 1; Giếng 4: mẫu 2; Giếng 5: mẫu 3; Giếng 6: mẫu Trong mẫu kiểm tra mẫu dương tính với vi-rút MrNV XSV G5 (mẫu 1), G8 (mẫu 4) nhiễm XSV, G6 (mẫu 2) nhiễm MrNV G7 mẫu 3) nhiễm MrNV XSV Theo Cheng& Chen (1998a) bệnh đục tơm xanh vi khuẩn gây giống với kết luận Bùi Quang Tề (2003) công bố - 19 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Chen et al.(2001) cho bệnh đục tôm xanh xảy Đài Loan năm 1999, tỷ lệ chết 30-75% Tác giả cho tác nhân gây bệnh vi khuẩn Lactoccocus garvieae Theo Hameed 2004, lồi virus khơng gây chết tơm trưởng thành mà gây chết tôm PL Nhưng với kết thí nghiệm thực thử phương pháp RT-PCR cho thấy lồi vi-rút MrNV (500bp) XSV (425bp) tác nhân gây bệnh tôm xanh Và từ kết ta tiếp tục thực thí nghiệm LD50 tơm giống 4.2 Kết thí nghiệm LD50 tơm giống Tơm giống bố trí 10 bể, ngâm dịch vi-rút (trong có bể đối chứng không ngâm) theo dõi 10 ngày 70 1ml 0.5 ml 60 Tỉ lệ tôm chết (%) 0.25 ml 0.125 ml 50 Đối chứng 40 30 20 10 10 Số ngày sau gây cảm nhiễm Hình 4.3: Đồ thị biểu số tôm chết Theo đồ thị số tơm chết ngày tăng đến ngày thứ 10 tơm thu trữ -80oC Từ lúc bắt đầu ngâm dịch vi-rút đến ngày thứ bể 1,2 (nồng độ vi-rút 1ml/5lit) có tỷ lệ chết > 50%, đến ngày thứ bể 5,6 (nồng độ vi-rút 0,25ml/5lit) có tỷ lệ chết >50%, đến ngày thứ bể 3,4 (nồng độ vi-rút 0,5ml/5lit) có tỷ lệ chết >50% LD50 = 5*103.167 - 20 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Tiếp đó, mẫu tôm xét nghiệm phương pháp RT-PCR Ta có kết sau: 425bp 500bp 400bp 200bp 100bp Hình 4.4: Hình PCR tơm giống Giếng : mẫu (tôm giống bể với độ pha lỗng 1ml/5lit) Giếng : mẫu (tơm giống bể với độ pha loãng 1ml/5lit) Giếng : mẫu (tôm giống bể với độ pha loãng 0,5ml/5lit) Giếng : mẫu (tơm giống bể với độ pha lỗng 0,5ml/5lit) Giếng : mẫu (tôm giống bể với độ pha loãng 0,25ml/5lit) Giếng : mẫu (tôm giống bể với độ pha lỗng 0,25ml/5lit) Giếng : mẫu (tơm giống bể với độ pha loãng 0,125ml/5lit) Giếng : mẫu (tôm giống bể với độ pha loãng 0,125ml/5lit) Giếng : mẫu (tôm giống bể (bể đối chứng)) Giếng 10 : đối chứng (+) Giếng 11 : đối chứng (-) Trong mẫu kiểm tra RT-PCR có mẫu dương tính XSV G5 (mẫu 5), G6 (mẫu 6), G7(mẫu 7) Kết mô học Các mẫu tôm sau nhuộm dán keo xong, đọc kết mơ kính hiển vi Có mẫu xuất hiện tượng hoại tử Trên sở kiểm tra - 21 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com phương pháp RT-PCR khẳng định mẫu nhiễm bệnh đục (MrNV, XSV) Chức giúp thể vận động bảo vệ nội quan bên thể ( trích dẫn theo Lightner 1996 ) Theo Bùi Quang Tề 2003, thấy rõ ổ hoại tử bao quanh tế bào máu (X400) Hình 4.5: Mơ (mẫu 3) (X40) Hình 4.6: Mơ (mẫu 4) (X40) Trên hình có dấu mũi tên phần bị hoại tử Và từ kết cho thấy quan đích lồi virus MrNV XSV phần tôm - 22 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận : Qua thí nghiệm thăm dị ta thấy mẫu tơm nhiễm MrNV XSV có mẫu nhiễm MrNV, XSV Từ kết cho ta biết vi-rút MrNV XSV nguyên nhân gây bệnh đục Sau thí nghiệm LD50 thực mẫu có mẫu bị nhiễm XSV Và từ kết giúp ta nhận giai đoạn tơm giống bị bệnh đục vi-rút gây Đề xuất : Cần nghiên cứu sâu bệnh đục tìm ngun nhân gây bệnh để đưa chẩn đốn xác nhằm ngăn chặn kịp thời xử lý để tránh tổn thất cho người dân - 23 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG VI TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Quang Tề.,2006 Bệnh học thủy sản Nhà xuất Nông Nghiệp, 439 trang Lightner , D.V 1996 A handbook of pathology and Diagnostic Procedures for disease of Penaed shimp World Aquaculture Society Kalidoss Yoganandhan, Manee Leartvidhas, Supanas Sriwongpok, Chales Limsuwan 2006 White tail disease of giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii in Thailand Mai Văn Tài, Tống Hoài Nam, Lý Thị Thanh Loan, Phạm Văn Tình…2004 Điều tra đánh giá trạng loại thuốc, hóa chất chế phẩm sinh học dung ni trồng thủy sản nhằm đề xuất giải pháp quản lý Báo cáo đề tài khoa học, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 24 trang Nguyễn Thị Đẹp, Chi cục thuỷ sản Cần Thơ OIE, 2008 pathogee Information White Tail Disease Phạm Minh Trúc, 2009 Xác định tiêu sinh hóa khả kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn phân lập từ huyết tương tôm xanh bị bệnh đục nuôi thành phố Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp đại học Khoa Thủy Sản – Đại học Cần Thơ Phạm Trần Ngun Thảo, 2007 Mơ bệnh tơm Trình duyệt PowerPoint, giáo trình Bệnh Học Thủy Sản Đại Học Cần Thơ Sahul Hameed.A.S (2005) White Tail Disease – disease card Developd to support the NACA/FAO/OIE regional quarterly aquatic animal disease (QAAD) reporting system in the Asia-Pacific NACA, Bangkok, Thailand, 7pp 10 Sahul Hameed A.S., K Yoganandhan, J Sri Widada, J.R Bonami., 2004 Experimental transmission and tissue tropismof Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and its associated extra small virus (XSV) DISEASE OF AQUATIC ORGANISMS pp 191-196 - 24 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 11 Shih-Chu Chen1,*, Yu-De Lin1, Li-Ling Liaw2, Pei-Chi Wang1 Lactococcus garvieae infection in the giant freshwater prawn Macrobranchium rosenbergii confirmed by polymerase chain reaction and 16S rDNA sequencing 12 Tài liệu hứơng dẫn thực tập giáo trình chuyên môn Bệnh học thùy sản 2008 13 Tài liệu hướng dẫn thực tập giáo trình chun mơn bệnh học thủy sản 14 Từ Thanh Dung 2008 Bệnh vi khuẩn động vật thủy sinh Khoa thủy sản – Đại Học Cần Thơ 15 Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hồng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa 2005 Giáo trình Bệnh Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản- Trường Đại Học Cần Thơ 16 Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản I.1998 17 Wang C.S, J S Chang, H H Shih and S N Chen, 2007 RT-PCR amplification and sequence analysis of extra small virus associated with white tail disease of Macrobrachium rosenbergii (de Man) cultured in Taiwan Journal of Fish Disease 2007, 30, 127-132 18 Yoganandhan K, J.Sri Widada, J.R.Bonami, and A.S Sahul Hameed., 2005 Simultaneousdetection of Macrobrachium rosenbergii nodavirus and extra small virus by asingle tube, one-step multiplex RT-PCR assay Journal of Fish Disease 2005, 28, pp.65-69 19 Xianle, Y and Huang, Y 2003 The status and treatment of serious disease of freshwater prawn and crabs in China 20 http://agriviet.com/nd/841-tong-quan-benh-duoi-trang-o-tom-cangxanh/ (ngày truy cập 01/07/2009) 21 http://eds.mofi.gov.vn/uni/home/index.php?lang=en&block_id=&disp_ id=44&sub_index=5&ma_vatchu=2 (ngày truy cập 25/06/2009) 22 http://translate.google.com.vn/translate?hl=vi&sl=en&u=http://www.s pc.int/aquaculture/site/publications/documents/Pages%2520from%252 0REDUCEDCOPY2Pathogen%2520Ecological%2520Macrobrachium %2520rosenbergiiFJCKp26_58.pdf&ei=kKdlSq_lI9OAkQWO6bXND g&sa=X&oi=translate&resnum=9&ct=result&prev=/search%3Fq%3D WTD%2Bnash%2Bet%2Bal%2B1987%26hl%3Dvi (ngày truy cập 06/07/2009) - 25 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com PHỤ LỤC Số tơm chết thí nghiệm LD50 tôm giống: Nồng độ Ngày 1000 1000 500 500 250 250 125 125 DC DC 16 13 18 1 25 18 11 12 28 6 33 28 18 20 30 13 12 14 9 48 40 28 33 48 25 22 22 13 15 58 44 36 39 57 32 30 27 19 22 68 51 42 48 68 37 36 35 24 28 71 61 54 54 77 42 41 39 26 31 71 61 54 54 77 42 41 39 26 31 71 61 54 54 77 42 41 39 26 31 10 71 61 54 54 77 42 41 39 26 31 - 26 - LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com ... đề tài ? ?Xác định khả gây bệnh đục Macrobrachium rosenbergii Nodavirus (MrNv) Extra small virus (XSV) tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) “ cấp thiết nhằm mục tiêu: Tìm hiểu khả gây bệnh đục MrNV... thấy bệnh đục tôm xanh ngày gia tăng, gây thiệt hại không nhỏ cho người ni tơm xanh Cần Thơ nói riêng nước nói chung Do việc xác định khả gây bệnh đục Macrobrachium rosenbergii Nodavirus (MrNv) Extra. .. (MrNv) Extra small virus (XSV) tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) thực nhằm tìm hiểu khả gây bệnh đục MrNV XSV Kết nghiên cứu thực mẫu tơm thí nghiệm thăm dị xác định LD50 tơm giống .Và theo phương