Phân lập và tuyển chọn chủng probiotic sinh tổng hợp bacteriocin từ ruột tôm nước mặn tỉnh nam định để ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi tôm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KINH TẾ - KỸ THUẬT CÔNG NGHIỆP KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM - - BÙI THỊ HƯƠNG GIANG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG PROBIOTIC SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN TỪ RUỘT TÔM NƯỚC MẶN TỈNH NAM ĐỊNH ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN CHĂN NUÔI TÔM LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM HÀ NỘI, 2021 TRƯỜNG ĐẠI HỌC KINH TẾ - KỸ THUẬT CÔNG NGHIỆP KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM - - BÙI THỊ HƯƠNG GIANG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG PROBIOTIC SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN TỪ RUỘT TÔM NƯỚC MẶN TỈNH NAM ĐỊNH ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN CHĂN NUÔI TÔM LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 8540101 Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS Vũ Văn Hạnh Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS Hồ Tuấn Anh HÀ NỘI – 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực, chưa công bố tài liệu khác Đây cơng trình từ thành lao động nghiên cứu khoa học cá nhân với sự hỗ trợ giáo viên hướng dẫn PGS.TS Vũ Văn Hạnh PGS.TS Hồ Tuấn Anh Những thông tin ḷn văn có liên quan đến cơng trình, tác giả, quan, tổ chức khác thể phần Tài liệu tham khảo Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm theo quy định nghiên cứu khoa học nội dung luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2021 HỌC VIÊN Bùi Thị Hương Giang i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành ḷn văn tơi nhận sự giúp đỡ tận tình thầy cô, anh chị, bạn bè, đồng nghiệp người thân u gia đình tơi Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Vũ Văn Hạnh, PGS.TS Hồ Tuấn Anh trực tiếp hướng dẫn, động viên, quan tâm tạo điều kiện giúp đỡ, bảo tơi suốt q trình thực hồn thành cơng trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể thầy cô giáo cán nhân viên khoa Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Kinh tế - Kỹ thuật Công nghiệp tạo điều kiện tḥn lợi cho tơi q trình học tập nghiên cứu Tôi xin cảm ơn anh chị Phòng Các chất chức sinh học - Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ suốt trình thực luận văn Xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 HỌC VIÊN Bùi Thị Hương Giang ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG vii MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 Probiotics chăn nuôi tôm 1.2 Bacteriocin chăn nuôi tôm 1.3 Nuôi tôm công nghệ cao 1.4 Tổng quan cơng trình nghiên cứu, sản xuất bacteriocin nước 11 1.5 Cơ sở thực tiễn 17 CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 19 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG 20 VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Đối tượng nghiên cứu 20 3.1.1 Vật liệu 20 3.1.2 Dụng cụ máy móc, thiết bị, hố chất 20 3.1.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 20 3.2 Nội dung nghiên cứu 21 3.3 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật sử dụng 21 3.3.1 Phương pháp phân lập, làm chủng tuyển chọn vi sinh vật 21 3.3.2 Định danh chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp bacteriocin tuyển chọn 25 3.3.3 Nghiên cứu xác định thành phần môi trường dinh dưỡng điều kiện lên men phù hợp cho trình sinh tổng hợp bacteriocin 27 3.3.4 Nghiên cứu xây dựng phương pháp thu nhận sản phẩm bacteriocin qui mơ phịng thí nghiệm 28 3.4 Phương pháp xử lý số liệu 29 iii CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp bacteriocin từ ruột tôm nước mặn vùng biển Nam Định 30 4.2 Định danh đến loài chủng vi sinh vật tuyển chọn 39 4.3 Nghiên cứu xác định thành phần môi trường dinh dưỡng điều kiện lên men phù hợp cho trình sinh tổng hợp bacteriocin 42 4.3.1 Ảnh hưởng hoạt tính kháng khuẩn qua hệ ni cấy .42 4.3.2 Nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy chủng Bacillus subtilis N1.4 .42 4.3.2.2.Nghiên cứu điều kiện lên men cho trình sinh tổng hợp bacteriocin chủng Bacillus subtilis N1.4 .44 4.4 Nghiên cứu xây dựng phương pháp thu nhận sản phẩm bacteriocin quy mơ phịng thí nghiệm 46 4.4.1 Nghiên cứu quy trình thu nhận bacteriocin 46 4.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền bacteriocin 49 4.4.3 Ảnh hưởng pH đến độ bền dịch bacteriocin hoạt tính enzyme .51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO .54 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ Viết Tắt Từ Tiếng Anh Nghĩa Tiếng Việt GRAS Generally regarded as safe Vi sinh vật an toàn LAB Lactic Acid Bacteria Vi khuẩn lactic CMC Carboxymethylcellulose NTTS Nuôi trồng thuỷ sản LB Môi trường nuôi cấy LB FAO Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hợp Quốc v DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 3.1 Qui trình phân lập làm chủng thu từ 22 ruột tơm 10-4 Hình 3.2 Sơ đồ kiểm tra hoạt tính enzyme ngoại bào chủng 22 vi sinh vật phân lập Hình 3.3 Sơ đồ kiểm tra hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh 24 chủng vi sinh vật phân lập Hình 4.1 Khả sinh tổng hợp enzyme amylase, cellulase 34 protease Hình 4.2 Khả kháng các chủng vi khuẩn kiểm định 38 chủng vi khuẩn phân lập từ ruột tơm Hình 4.3 Trình tự đoạn gen rARN 16S chủng vi khuẩn chọn 40 lọc N1.4 Hình 4.4 Cây phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn chọn lọc N1.4 41 với trình tự gen GenBank có mức độ tương đồng cao Hình 4.5 Khả kháng các chủng vi khuẩn kiểm định 42 chủng phân lập qua hệ từ đến Hình 4.6 Qui trình chiết tách bacteriocin từ chủng N1.4 48 10 Hình 4.7 Khả kháng các chủng vi khuẩn kiểm định chủng 50 N1.4 môi trường LB khả sinh tổng hợp enzyme môi trường chứa chất đặc hiệu 11 Hình 4.8 Khả kháng các chủng vi khuẩn kiểm định chủng N1.4 môi trường 37°C vi 52 DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 3.1 Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu 26 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 27 Bảng 3.3 Chu trình phản ứng PCR 27 Bảng 4.1 Mật độ vi sinh vật từ mẫu tôm nước mặn 30 Bảng 4.2 Khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào 31 chủng phân lập từ ruột tôm Bảng 4.3 Khả kháng khuẩn chủng phân lập 35 từ ruột tôm Bảng 4.4 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến chủng 43 Bacillus subtilis N1.4 Bảng 4.5 Ảnh hưởng điều kiện lên men cho quá trình sinh 44 tổng hợp bacteriocin Bảng 4.6 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả kháng 45 khuẩn 10 Bảng 4.7 Ảnh hưởng thời gian lên men đến hoạt tính 46 enzyme thủy phân 11 Bảng 4.8 Khả chiết tách các dung môi khác đối 47 với bateriocins từ dịch 12 Bảng 4.9 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính kháng khuẩn 49 13 Bảng 4.10 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính kháng khuẩn 51 14 Bảng 4.11 Ảnh hưởng protease đến hoạt tính kháng khuẩn 52 bacteriocin vii MỞ ĐẦU Probiotic vi sinh vật sống mà tiêu thụ với lượng thích hợp mang lại tác động có ích cho vật chủ ( FAO) Việc sử dụng probiotic thức ăn bổ sung cho vật nuôi năm 1970 Probiotic trộn vào thức ăn để làm tăng sự tăng trưởng sức khỏe vật nuôi chúng giúp vật nuôi tăng khả kháng bệnh [21] De Vuyst nghiên cứu bacteriocin protein phức hợp protein có hoạt tính kháng khuẩn [16] Khác với hầu hết kháng sinh dùng y học, bacteriocin phân tử protein dễ bị phân hủy enzyme protease hệ tiêu hóa người Chúng hoạt động cần lượng nhỏ không gây độc Bacteriocin không gây tác dụng phụ, không gây phản ứng dị ứng thể người vấn đề sức khỏe Các bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn cao thậm chí nồng độ thấp, có đặc tính diệt khuẩn quan hệ tiêu hoá pH thấp, bacteriocin tương đối bền nhiệt độ cao không bị ảnh hưởng dung môi hữu Bảo quản sinh học thực phẩm với việc sử dụng vi sinh vật đối kháng hay sản phẩm trao đổi chất chúng (chất bảo quản sinh học) để ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật khơng mong muốn giải pháp có nhiều tiềm Ưu điểm bacteriocin bảo quản sinh học thực phẩm tăng thời hạn sử dụng, hạn chế sự truyền mầm bệnh chuỗi thức ăn, giảm thiệt hại kinh tế hư hỏng thực phẩm, hạn chế sử dụng chất bảo quản hóa học xử lý nhiệt Bacteriocin giúp bảo quản giá trị dinh dưỡng vitamin, thỏa mãn nhu cầu công nghiệp người tiêu dùng Một xu hướng công nghiệp thực phẩm Châu Âu hạn chế sử dụng chất phụ gia thành phần nhân tạo, đảm bảo an toàn, giữ nguyên chất lượng Những yêu cầu đáp ứng nhờ sử dụng bacteriocin Ngành thuỷ sản Việt Nam phát triển nhanh chóng, có định hướng đảm bảo nhu cầu tiêu dùng nước ổn định chất lượng cho xuất Nuôi tôm công nghệ cao phát triển nhiều tỉnh ven biển có Nam Định phụ gia (CaCl2, ZnSO4) cho hoạt tính bacteriocin cao (300 AU /ml) mật độ quang học (OD) đạt 2,7 q trình sinh trưởng chủng N1.4 Mơi trường LB có bổ sung khống chất CaCl2, ZnSO4 này sử dụng cho nghiên cứu 4.3.2.2 Nghiên cứu điều kiện lên men cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin chủng Bacillus subtilis N1.4 Thực thí nghiệm theo mơ tả mục 3.3.3, ảnh hưởng yếu tố nghiên cứu đến khả sinh kháng khuẩn bacteriocin chủng N1.4 trình bày bảng 4.5 Bảng 4.5 Ảnh hưởng điều kiện lên men cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin STT Yếu tố nghiên cứu AU giá trị nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng Tốc độ khuấy vòng/phút 140 150 160 170 180 200 220 AU/ml 80 140 200 280 300 280 240 pH môi trường 10 AU/ml 60 150 265 312 240 160 130 Nhiệt độ (oC) lên men 31 33 35 37 39 41 43 45 AU/ml 120 180 280 345 270 220 140 100 Mật độ giống (cfu/ml) 106 107 108 AU/ml 140 351 250 Thời gian lên men (giờ) AU/ml 24 48 72 96 220 381 280 240 * Thí nghiệm sau sử dụng giá trị tối ưu thí nghiệm nghiên cứu trước khơng giải thích thêm 44 Bảng 4.5 cho thấy, chủng B.subtilis N1.4 lên men môi trường chọn lọc kết hợp với điều kiện lên men cho kết sau: - Tốc độ khuấy 180 vịng/phút cho hoạt tính AU cao - Ở pH 7,0 cho hoạt tính cao nhất; - Ở nhiệt độ 37oC cho hoạt tính cao nhất; - Ở mật độ giống ban đầu 107 cfu/ml cho hoạt tính cao nhất; - Sau 48 lên men cho hoạt tính cao Như vậy, kết nghiên cứu điều kiện lên men cho thấy cho thấy, kết hợp yếu tố tối ưu môi trường tối ưu LB g/l ( pepton 10, cao thịt bị 10, NaCl 5) có bổ sung CaCl2, ZnSO4 loại mM, pH 7,0, nuôi lắc 180 vòng/phút, 37oC, 48 lên men, giống 107 cfu/ml cho hoạt tính cao 381 AU/ml 4.3.2.3 Ảnh hưởng thời gian lên men đến hoạt tính kháng khuẩn Thời gian lên men có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính kháng khuẩn chủng N1.4 chủng kiểm định (bảng 4.6) Bảng 4.6 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả kháng khuẩn Đường kính vịng ức chế (mm) Thời gian (giờ) E.coli Salmonella S.aureus V.harveyi V.paraheamolyticus 24 - - 48 - 13 15 - 14 72 - - 96 - + - 120 - + - + Từ kết đạt cho thấy, chủng N1.4 khơng có khả kháng E.coli V.harveyi, đó, hoạt tính kháng Salmonella V.paraheamolyticus giảm dần sau 48 lên men Hoạt tính kháng S.aureus đạt giá trị cao sau 48 (15mm) giảm dần sau 45 Sau 48 lên men, hoạt tính kháng khuẩn đạt cao nhất, thời gian lên men khác hoạt tính kháng khuẩn có giá trị thấp Thời gian 48 lên men lựa chọn cho nghiên cứu 4.1.1.1 Ảnh hưởng thời gian lên men đến hoạt tính enzyme thuỷ phân Thời gian lên men có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme thuỷ phân, sinh tổng hợp từ chủng N1.4 (bảng 4.7) Bảng 4.7 Ảnh hưởng thời gian lên men đến hoạt tính enzyme thủy phân Thời gian (giờ) Đường kính vịng phân giải chất (mm) Amylase Cellulase Protease 24 + 10 11 48 31 30 24 72 21 19 17 96 + 11 120 + 14 Sau 48 lên men hoạt tính enzyme thuỷ phân thu đạt cao Hoạt tính enzyme cellulase protease qua ngày lên men có sự khác khơng nhiều Thời gian 48 lựa chọn để lên men sinh enzyme cho chủng N1.4 4.4 Nghiên cứu xây dựng phương pháp thu nhận sản phẩm bacteriocin quy mơ phịng thí nghiệm 4.4.1 Nghiên cứu quy trình thu nhận bacteriocin Dịch sau lên men, dịch thu li tâm 10000 vòng/phút Li tâm 10 phút Dịch xử lý với dung môi khác etyl axetat chọn, n-butanol, n-hexan, diclometan để tìm dung mơi phù hợp Dịch chiết cô đặc cô quay sau hồn ngun đệm photphat 46 Bảng 4.8 Khả chiết tách các dung môi khác bateriocins từ dịch Dung môi hưu Salmonella, S.aureus ethyl axetat +++ ++++ n-butanol, - - n-hexan, - - diclometan - - Trong dung môi sử dụng nghiên cứu để tách bacteriocin, ethyl axetat cho khả tách bacteriocin tốt nhất, dung môi cho khả tách hoạt chất kháng khuẩn Salmonella S.aureus cao Do dung mơi sử dụng cho nghiên cứu 47 Chủng giống N1.4 Lên men 500 mL, li tâm thu dịch Lọc qua màng Minipore Tủa với muối sulfat amơn Thử hoạt tính Chiết với dung mơi ethyl acetate Thử hoạt tính Cơ đặc phân đoạn, hồn ngun PSB Bacteriocin thơ/thử hoạt tính Hình 4.6 Qui trình chiết tách bacteriocin từ chủng N1.4 Từ kết nghiên cứu trên, đưa phương pháp chiết tách bacteriocin gồm bước sau: Bước 1: Chủng chọn lọc lấy từ tủ âm -70oC, hóa lỏng điều kiện phịng, cấy chủng đĩa LB thạch, 37oC, ngày Bước 2: Lấy lượng sinh khối chủng vi khuẩn cấy vào môi trường lỏng LB tối ưu (500 ml), ni lắc 180 vịng/phút, ngày, 37oC Bước 4: Dịch lên men ly tâm 10,000 vòng/phút/10 phút Sinh khối tế bào trộn với tinh bột tan (1/2, phần sinh khối, phần tinh bột tan) làm khô 48 nhiệt độ 45oC Bổ sung thêm tinh bột tan để chế phẩm bột có mật độ (2x109 cfu/g) Phần dịch lọc qua minipore (0.45µm), thu dịch lọc chứa bacteriocin Bước 5: Dịch lọc thu tủa với muối sunfat amon 70% xử lý 4oC qua đêm, thẩm tích, thu dịch protein Bước 5: Dịch protein sau thẩm tích chiết với ethyl acetate tỷ lệ 1/1, lắc 30 phút, điều kiện phịng 25oC Bước 6: Phân đoạn dung mơi thu loại bỏ dung môi hệ thống máy cô quay (30 rpm) hút chân không 55oC, phần cặn cịn lại hồn ngun đệm phosphate để nghiên cứu tiếp Bước 7: Cặn pha lại đệm phốt phát pH7, thử hoạt tính nghiên cứu Sản phẩm bacteriocins có độ gấp 46 lần so với ban đầu 4.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền bacteriocin Dịch sau lên men chủng N1.4 ủ nhiệt độ khác dải từ 40-100°C Sau thực kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính enzyme Bảng 4.9 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính ức chế cịn lại (%) Nhiệt độ (oC) E.coli Salmonella S.aureus V.harveyi V.paraheamolyticus 100 100 100 40 100 100 75 50 100 100 75 60 100 100 75 70 100 100 75 80 75 100 50 90 75 100 50 100 50 100 Không xử lý nhiệt (đ/c 37oC) 49 Từ kết thí nghiệm cho thấy, sau xử lý với nhiệt nhiệt độ khác nhau, hoạt tính kháng chủng vi khuẩn kiểm định Salmonella V.paraheamolyticus giảm dần dải nhiệt độ ủ thấp đối chứng, hoạt tính kháng bắt đầu giảm từ > 80°C Dịch lên men chủng N1.4 có khả kháng mạnh chủng Salmonella, S.aureus V.paraheamolyticus, khơng có khả kháng hai chủng V.harveyi E.coli Khả kháng chủng vi khuẩn kiểm định chủng N1.4 môi trường LB khả sinh tổng hợp enzyme môi trường chứa chất đặc hiệu 37°C sau 24 thể hình 4.7 Với kết thử hoạt tính enzyme loại chất khác cho thấy, enzyme amylase protease hoạt tính >70°C, với cellulase 100°C Hoạt tính enzyme amylase trước sau ủ yếu Ở dải nhiệt độ 37-70°C, hoạt tính enzyme cellulase khơng có sự thay đổi so với đối chứng (không xử lý nhiệt) giảm dần từ 80°C Hình 4.7 Khả kháng các chủng vi khuẩn kiểm định chủng N1.4 môi trường LB khả sinh tổng hợp enzyme các môi trường chứa chất đặc hiệu 50 4.4.3 Ảnh hưởng pH đến độ bền dịch bacteriocin hoạt tính enzyme Dịch lên men chủng N1.4 điều chỉnh HCl NaOH 1N pH khác dải từ 3-12 37°C Sau giờ, dịch lên men trung hoà pH ban đầu đưa ly tâm 10000 rpm/min phút kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính enzyme (bảng 4.10) Bảng 4.10 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn lại (%) sau xử lý pH khác pH E.coli Salmonella S.aureus V.harveyi V.paraheamolyticus 75 100 0 75 100 0 75 100 40 75 100 75 (đ/c) 100 100 75 100 100 75 100 100 75 10 75 100 75 11 + 100 0 12 - 83,88 0 Từ kết nghiên cứu cho thấy, hoạt tính kháng chủng vi khuẩn kiểm định có sự khác chủng Sau xử lí dải pH từ 3-12, dịch lên men chủng phân lập có khả kháng S.aureus, Salmonella, V.paraheamolyticus hoạt tính giảm nhẹ pH khoảng 3-5 11-12 Ảnh hưởng enzyme thủy phân (protease) đến hoạt tính bacteriocin Dịch lên men chủng N1.4 ly tâm 10000 rpm/min phút thu dịch Sau đó, dịch xử lý enzyme khác Lysozyme, Amylase, Protease Trypsin nồng độ cuối 1g/L ủ 37°C h Dịch 51 sau xử lý dùng để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kết trình bày bảng 4.11 Bảng 4.11 Ảnh hưởng protease đến hoạt tính kháng khuẩn bacteriocin Hoạt tính (%) kháng khuẩn lại sau xử lý protease Salmonella V.paraheamolytic S.aureus V.harveyi 100 100 - 100 83,33 83,33 - 100 Amylase 100 75 - 75 Protease K 100 75 - 100 Trypsin 100 100 - 100 Enzyme ĐC Lysozyme typhi us Hình 4.7 Khả kháng các chủng vi khuẩn kiểm định chủng N1.4 môi trường 37°C Từ kết thu cho thấy, enzyme khơng có ảnh hưởng lớn tới hoạt tính kháng chủng vi khuẩn kiểm định Kết sau xử lí có sự thay đổi khơng đáng kể so với mẫu đối chứng 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận: - Quá trình phân lập thu số chủng có khả kháng khuẩn cao từ ruột tơm nước mặn, chủng N1.4 chủng cho hoạt tính kháng khuẩn cao ổn định số 50 chủng phân lập - Kết phân tích phần trình tự nucleotide vùng V1-V9 16S RNA ribosomal chủng chọn lọc N1.4 có độ tương đồng cao (99%) so với loài Bacillus subtilis - Khi kết hợp yếu tố môi trường LB g/l ( pepton 10, cao thịt bị 10, NaCl 5) có bổ sung CaCl2, ZnSO4 loại mM, pH 7,0, nuôi lắc 180 vòng/phút, 37oC, 48 lên men, tỷ lệ tiếp giống 107 cfu/ml cho hoạt tính cao 381 AU/ml - Chủng N1.4 có khả sinh tổng hợp bacteriocin cao sau 48 lên men, kháng S.aureus ATCC 25923, Salmonella typhi, V.paraheamolyticus Bacteriocin ổn định khoảng nhiệt độ 37-70°C, pH 6-10 không nhạy cảm với protease (hoạt tính bacteriocin bền xử lý với Lysozyme, Amylase, Protease K, Trypsin), sau xử lý trì khả kháng vi khuẩn Salmonella typhi, S.aureus, V.paraheamolyticus Đề nghị: Tiếp tục thực nghiên cứu thu nhận chế phẩm bacteriocin quy mô pilot sản xuất qui mô công nghiệp Chế phẩm sinh học Bacteriocin sản xuất đóng gói, thương mại, ứng dụng rộng rãi thị trường, chủ động bổ sung trực tiếp vào thức ăn chăn nuôi tôm với lượng đủ để tăng cường tiêu hoá, giảm hại khuẩn, cân hệ vi sinh đường ruột, tăng cường sức khoẻ kháng bệnh cho tôm cách phù hợp hiệu quả, đáp ứng xu phát triển ngành nuôi trồng thuỷ sản phát triển kinh tế - xã hội Việt nam đảm bảo chất lượng để xuất tôm tất quốc gia giới 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn (2021) Hiệu mơ hình ni tơm siêu thâm canh cơng nghệ cao Lại Thúy Hiền (1998) “Một số đặc điểm sinh lí, sinh hóa số chủng vi khuẩn khử sulphat phân lập từ mỏ dầu Bạch Hổ”, Tạp chí sinh học, 8: 33-38 Lê Thị Trúc Linh (2016) “Xác định gen đích trực tiếp microRNA -144 tế bào chondrocyte”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 29(4), 133 – 139 Lê Văn Cát, Đỗ Thị Hồng Nhung, Ngô Ngọc Cát (2006), Nước nuôi thủy sản: Chất lượng biện pháp cải thiện chất lượng, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Ngô Tự Thành (2001), “Sự phân bố, sinh trưởng sinh tổng hợp protease ngoại bào Bacillus vùng Hà Nội”, Tạp chí sinh học 23: 153-157 Nguyễn Hữu Thọ (2001), “Biến động sulfite, ammonia, nitrite, BOD, COD, chlo hữu môi trường nước ảnh hưởng đến khả xảy bệnh đốm trắng, bệnh đàu vàng tơm ni Khánh Hịa” Tạp chí thủy sản, 43, Bộ Thủy sản - Trung tâm nghiên cứu thủy sản III: 5-15 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội Vũ Trung Tạng (2001), Cơ sở sinh thái học, Nhà xuất giáo dục, Hà Nội Austin, B.; Zhang, X.H., (2006), "Vibrio harveyi: a significant pathogen of marine vertebrates and invertebrates”, Lett Appl Microbiol., 43, 119–124 10 Balcázar, J.L.; Blas, I.d.; Ruiz-Zarzuela, I.; Cunningham, D.; Vendrell, D.; Múzquiz, J.L., (2006), “The role of probiotics in aquaculture” Vet Microbiol., 114, 173–186 11 Bomba, A.; Nemcová, R.; Mudronová, D.; Guba, P., (2002), “The possibilities of potentiating the efficacy of probiotics”, Trends Food Sci Technol., 13, 121–126 12 Boyd C E and Tucker C S (1998) “Pond aquaculture water quality Management”, Kluwer Academic Publishers, London, pp 54 13 Cabello, F.C., (2006), “Heavy use of prophylactic antibiotics in aquaculture: a growing problem for human and animal health and for the environment”, Environ Microbiol., 8, 1137–1144 14 Cahill, M.M (1990), “Bacterial flora of fishes: A review”, Microb Ecol., 19, 21– 41 15 Daba et al., (1991) “Detection and Activity of a Bacteriocin Produced by Leuconostoc mesenteroides”, Applied microbiology and biotechnology 15 (3): 228 - 233 16 De Vuyst, L (1994), “Nisin production variability between natural Lactococcus lactis subsp lactics strains”, Biotechnol Lett, 16: pp 287 – 292 17 Dorrington, T.; Gomez-Chiarri, M (2008), “Antimicrobial Peptides for Use in Oyster Aquaculture: Effect on Pathogens, Commensals, and Eukaryotic Expression Systems”, J Shellfish Res., 27, 365–374 18 Ercolini, D., G Moschetti, G Blaiotta, S Coppola (2001), “Behavior of variable V3 region from 16S rDNA of lactic acid bacteria in denaturing gradient gel electrophoresis”, Curr Microbiol 42, 199-202 19 Flegel, T.W., (2012), “Historic emergence, impact and current status of shrimp pathogens in Asia”, Journal of Invertebrate Pathology 110:166-173 20 Fooks, L.J., R Fuller, G.R Gibson (1999), Prebiotics, probiotics and human gut microbiol 22, 133-144 21 Fuller, R., (1989), “Probiotics in man and animals”, J Appl Microbiol., 66, 365– 378 22 Holzapfel, W.H., P.Haberer, R Geisen, J Bjorkroth, U Schillinger (2001) “Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food nutrition”, Am J Clin Nutr 73, 365S-373S 23 Joerger, R.D , (2003), “Alternatives to antibiotics: bacteriocin, antimicrobial peptides and bacteriophages”, Poult Sci., 82, 640–647 55 24 Karpiński T.M., A.K Szkaradkiewicz, (2016), Bacteriocin in Encyclopedia of Food and Health 25 Karthikeyan, V., S.W Santosh (2009) “Isolation and partila characterization of bacteriocin produced from Lactobacillus plantarum”, African Journal of Microbiology Research, Vol 3: pp 233 – 239 26 Kesarcodi-W, A.; Kaspar, H.; Lategan, M.J.; Gibson, L , (2008), “Probiotics in aquaculture: The need, principles and mechanisms of action and screening processes”, Aquaculture, 274, 1–14 27 Kurath, G (2008), “Biotechnology and DNA vaccines for aquatic animals”, Rev Sci Tech Off Int Epiz., 27, 175–196 28 Lightner, D.V., R M Redman, C R Pantoja, ph.D., B L Noble, Loc Tran, (2012), “Early Mortality Syndrome Affects Shrimp in Asia”, Global Aquaculture Advocate, January/February 2012:40 29 Loc Tran, L Nunan, R M Redman, L L Mohney, C R Pantoja, K Fitzsimmons, D V Lightner, (2013), “Determination of the infectious nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp”, Diseases of aquatic organisms 105: 45–55 30 Marcogliese, D , (2008), “The impact of climate change on the parasites and infectious diseases of aquatic animals”, Rev Sci Tech Off Int Epiz., 27, 467– 484 31 Moriarty, D.J.W , (1998), “Control of luminous Vibrio species in penaeid aquaculture ponds”, Aquaculture, 164, 351–358 32 Musa, H.H.; Wu, S.L.; Zhu, C.H.; Seri, H.I.; Zhu, G.Q (2009), “The Potential Benefits of Probiotics in Animal Production and Health”, J Anim Vet Adv., 8, 313–321 33 Parker, R.B., (1974), “Probiotics, the other half of the antibiotic story”, Anim Nutr Health, 29, 4–8 56 34 Parada, Carolina Ricoy Caron, Adriane Bianchi P Medeiros, Carlos Ricardo Soccol (2007), “Bacteriocins from lactic acid bacteria: purification, properties and use as biopreservatives”, Journal of food engineering 45 (2): 123-129 35 Reid, G.; Sanders, M.E.; Gaskins, H.R.; Gibson, G.R.; Mercenier, A.; Rastall, R.; Roberfroid, M.; Rowland, I.; Cherbut, C.; Klaenhammer, T.R (2003) “New Scientific Paradigms for Probiotics and Prebiotics”, J Clin Gastroenterol., 37, 105–118 36 Riaz, S., S K Nawaz and S Hasnain (2010), “Bacteriocin produced by L fermentum and L acidophilus can inhibit cephalosporin resistant E coli”, Brazilian J of Microb 41: pp 643 – 648 37 Salminen, S.; Ouwehand, A.; Benno, Y.; Lee, Y.K (1999), “Probiotics: how should they be defined”, Trends Food Sci Technol., 10, 107–110 38 Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed., Vols 1, and 39 Schillinger and Lucke (1989), “Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from meat”, J Clin Gastroenterol., 41, 267-273 40 Sirirat Dengripat et all (1998), “Effects of probiotic bacterium on black tiger shrimp Penaeus monodon survival and growth”, Aquaculture 167, 45-50 41 Tinh, N.; Dierckens, K.; Sorgeloos, P.; Bossier, P (2008), “A review of the functionality of probiotics in the larviculture food chain:, Mar Biotechnol., 10, 1– 12 42 Todorov, S.D., and M.T Dicks (2007), “Bacteriocin production by Lactobacillus pentosus ST712Bz isolated from Boza” Brazilian Journal of Microbiology 38: pp 166-172 43 Toranzo, A.E.; Magariños, B.; Romalde, J.L (2005), “A review of the main bacterial fish diseases in mariculture systems”, Aquaculture, 246, 37–61 44 Triona O'Keeffe, Colin Hill, (1999), Future Prospects for Bacteriocin in Food, in Encyclopedia of Food Microbiology 57 45 Vázquez, J A., M P González and M A Murado (2005), “Effects of lactic acid bacteria cultures on pathogenic microbiota from fish” Aquaculture, 245: pp 149 – 161 46 Verschuere, L.; Rombaut, G.; Sorgeloos, P.; Verstraete, W (2000), “Probiotic Bacteria as Biological Control Agents in Aquaculture”, Microbiol Mol Biol Rev., 64, 655–671 47.Wang-Xiang-Hong, LiJun, JiWei-Shang, Xu-Huai-Shu (2002), “Application of Probiotics in Aquaculture”, Ocean University of Chindo, China, May 20:145-147 58 ... BÙI THỊ HƯƠNG GIANG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG PROBIOTIC SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN TỪ RUỘT TÔM NƯỚC MẶN TỈNH NAM ĐỊNH ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN CHĂN NUÔI TÔM LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên... QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp bacteriocin từ ruột tôm nước mặn vùng biển Nam Định 30 4.2 Định danh đến loài chủng vi sinh vật tuyển. .. (probiotics) từ nguồn tơm sống tự nhiên có khả sinh tổng hợp bacteriocin, đề tài luận văn thạc sĩ xác định là: “ Phân lập tuyển chọn chủng probiotic sinh tổng hợp bacteriocin từ ruột tôm nước