PHÂN lập nấm fusarium moniliforme gây BỆNH löa VON và xác ĐỊNH DÕNG nấm tạo GIBERELIN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP NẤM Fusarium moniliforme GÂY BỆNH LÖA VON VÀ XÁC ĐỊNH DÕNG NẤM TẠO GIBERELIN Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khố: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: DIỆP TUYẾT CHÂU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP NẤM Fusarium moniliforme GÂY BỆNH LÖA VON VÀ XÁC ĐỊNH DÕNG NẤM TẠO GIBERELIN Giáo viên hƣớng dẫn TS LÊ ĐÌNH ĐƠN Sinh viên thực DIỆP TUYẾT CHÂU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập trường Các thầy cô Bộ môn Công nghệ sinh học thầy trực tiếp giảng dạy ln tận tình hướng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ động viên suốt bốn năm qua TS Lê Đình Đơn khơng tận tình hướng dẫn, dạy dỗ trong nghiên cứu khoa học mà thầy dạy nhiều học quí giá sống Những lời thầy nói, thầy dạy học mà nhớ Anh Nguyễn Kinh Long, Nguyễn Văn Lẫm giúp đỡ, động viên, chia vui buồn suốt trình thực đề tài Chị Vy, chị Kiều chị Vân phòng Bảo Vệ Thực Vật (Phòng 118, 105) khu Phượng Vỹ Trường Đại học Nơng Lâm TP.HCM nhiệt tình giúp đỡ tơi vượt qua giai đoạn đầu trình thực đề tài Chị Ly, anh Điền, anh Khang, anh Hưởng phụ trách phịng Hóa Lý anh chị phụ trách phịng Hóa Sinh thuộc Viện Cơng Nghệ Sinh Học Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM tận tình giúp đỡ tơi thời gian làm đề tài Toàn thể lớp CNSH 29 giúp đỡ, chia động viên suốt thời gian làm đề tài Thành kính ghi ơn ba mẹ nuôi nấng, dạy bảo điều hay lẽ phải cho động viên, hỗ trợ tinh thần, vật chất để hồn thành tốt khóa luận Ba mẹ nguồn động viên người tạo thêm sức mạnh để vượt qua khó khăn trở ngại sống Tp Hồ Chí Minh ngày 01 tháng 09 năm 2007 Diệp Tuyết Châu i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT LUẬN VĂN DIỆP TUYẾT CHÂU, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 08/2007 “Phân lập nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von xác định dòng nấm tạo giberelin” Giáo viên hướng dẫn: TS Lê Đình Đôn Thời gian thực đề tài từ tháng 03/2007 đến tháng 08/2007, Phịng bệnh cây, Bộ mơn Bảo vệ Thực vật, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM Viện Công Nghệ Sinh Học Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM Cây lúa gắn liền với lịch sử hình thành phát triển nước ta Cùng với trình phát triển lúa loại dịch bệnh hình thành gây hại ngày nghiêm trọng Đặc biệt bệnh lúa von xuất trở lại hai năm gần ruộng lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long làm giảm suất đáng kể Để hiểu rõ nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von tác nhân làm cho lúa phát triển cao lên giberelin nên tiến hành nghiên cứu sau: Phân lập tách đơn bào tử dòng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von ruộng lúa số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long Phát vùng gen tef nấm Fusarium moniliforme kỹ thuật PCR Ni cấy dịng nấm Fusarium moniliforme mơi trường sản xuất GA3 định tính GA3 TLC Các kết đạt được: Phân lập 20 dòng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von Khuếch đại thành cơng vùng tef 14 dịng nấm cặp mồi ef1-ef2 kỹ thuật PCR Trong 20 dòng nấm, chưa phát dòng sản xuất GA3 môi trường 20% ICI TLC ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com SUMMARY The title of graduation thesis is “Isolation the causal agent of bakanae disease, Fusarium moniliforme, and identification isolates’ production of gibberellin” This thesis was conducted by Dr LE DINH DON from 03/2007 to 08/2007 at Nong Lam university In recent years, bakanae disease has broken out and caused the loss of yields In order to understand clearly the fungi causing bakanae disease in different geographic regions in Mekong Delta, we based on symptoms and morphological characteristics to isolate 20 samples However, one of the greatest impediments to study of Fusarium has been the incorrect and confused application of species names to toxigenic and pathogenic isolates, owing in large part to intrinsic limitations of morphological species recognition Thus, we used molecular technique as PCR to make the base inferre the relationships among well-defined Fusarium as well as showing a great deal of species diversity that was vastly under-estimated by all previous morphological treatments We sucessfully amplified tef gene region of 14 isolates with ef1 and ef2 primers Moreover, we cultured 20 isolated Gibberella fujikuroi in gibberrellin-produced medium (20% ICI) Then we used TLC method to identify GA3 but our experiment did not go as well as planned iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Lời cảm tạ i Tóm tắt luận văn ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng, hình, sơ đồ viii Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Nội dung nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu bệnh lúa von 2.1.1 Phân bố thiệt hại 2.1.2 Triệu chứng 2.1.3 Tác nhân 2.1.4 Hình dạng kích thước 2.1.5 Đặc tính sinh lý 2.1.6 Điều kiện phát sinh phát triển 2.2 Đại cương nấm Gibberella fujikuroi 2.2.1 Phân loại học 2.2.2 Sơ lược Gibberella fujikuroi 2.2.3 Sinh tổng hợp giberelin Gibberella fujikuroi 2.3 Giới thiệu gen tef 10 2.4 Tổng quát giberelins 11 2.4.1 Đại cương chất giberelins 11 2.4.2 Chức vai trị sinh hóa 13 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.4.2.1 GAs kích thích phát triển thân lùn hoa thị 13 2.4.2.2 GAs điều hịa chuyển hóa sang giai đọan trưởng thành 14 2.4.2.3 GAs ảnh hưởng giai đọan bắt đầu hoa xác định giới tính 14 2.4.2.4 GAs đẩy mạnh “fruit set” 14 2.4.2.5 GAs thúc đẩy nảy mầm hạt 14 2.4.3 Ứng dụng GAs thương mại 15 2.4.3.1 Trong trồng trọt 15 2.4.3.2 Sản xuất bia 15 2.4.3.3 Tăng sản lượng mía 15 2.4.3.4 Sử dụng chọn giống thực vật 16 2.5 Sắc ký lớp mỏng 16 2.5.1 Tổng quát sắc ký lớp mỏng 16 2.5.2 Ưu điểm sắc ký lớp mỏng 20 2.5.3 Một số ứng dụng thông thường TLC 20 2.6 Ứng dụng kỹ thuật PCR 20 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 21 3.1 Thời gian địa điểm thực 22 3.1.1 Thời gian nghiên cứu 22 3.1.2 Địa điểm thực 22 3.2 Vật liệu nghiên cứu 23 3.3 Vật liệu phương pháp thí nghiệm 23 3.3.1 Phân lập, tách đơn bào tử thu sinh khối nấm 23 3.3.1.1 Dụng cụ hóa chất thí nghiệm 24 3.3.1.2 Phương pháp phân lập nấm 25 3.3.1.3 Phương pháp cắt đơn bào tử 25 3.3.1.4 Phương pháp nhân sinh khối 25 3.3.2 Phương pháp ly trích DNA nấm 26 3.3.2.1 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 26 3.3.2.2 Phương pháp ly trích DNA 26 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.3.2.3 Định tính DNA 27 3.3.2.4 Tinh sản phẩm ly trích 28 3.3.3 Khuếch đại vùng tef 28 3.3.3.1 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 28 3.3.3.2 Thực phản ứng 29 3.3.3.3 Đánh giá sản phẩm PCR 29 3.4 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phát GA3 29 3.4.1 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 29 3.4.2 Phương pháp sản xuất GA3 30 3.4.3 Phương pháp trích GA3 30 3.4.4 Định tính GA3 TLC 31 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Kết thu mẫu bệnh lúa von ĐBSCL 32 4.2 Kết phân lập tách đơn bào tử 33 4.3 Kết nhân sinh khối 35 4.4 Kết ly trích tinh DNA nấm 36 4.5 Kết PCR 38 4.6 Kết định tính GA3 TLC 39 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 5.1 Kết luận 41 5.2 Đề nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AcOH: acid acetic AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism BVTV: bảo vệ thực vật bp: base pair CHCl3 : chloroform dNTPs: deoxyribonucleotide-5-triphosphate ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long EtOAc: ethyl acetate HPLC: high performance liquid chromatography ITS: Internal Transcribed Spacer GAs: giberelins GA3: acid giberelic Gf: Gibberella fujikuroi MP: mating population PCR: polymerase chain reaction PDA: potato dextrose agar RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA rDNA: ribosome Deoxynucleotide acid Rf: ratio of fronts STT: số thứ tự TAE: TrisAcetic Ethylene diamine tetra acetate TE: Tris Ethylene diamine tetra acetate tef : translation elongation factor TLC: thin-layer chromatography Tm: melting temperature UV: ultra violet WA: water agar vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, BẢNG Hình 2.1 Ruộng lúa Trà Vinh bị nhiễm bệnh lúa von Hình 2.2 Bào tử nấm thân lúa bệnh Hình 2.3 Chu kỳ gây bệnh nấm Fusarium moniliforme Hình 2.4 Cấu tạo axít giberelic 11 Hình 2.5 Cấu tạo ent-Kaurene 11 Hình 2.6 Cấu tạo ent-Gibberellane 12 Hình 2.7 GA3 kích thích bắp cải hoa phát triển cao 13 Hình 2.8 Ảnh hưởng GA3 đến giống nho không hạt Thompson 15 Hình 2.9 Sơ đồ bước thực TLC 19 Hình 4.1 Ruộng lúa bị nhiễm bệnh lúa von Càng Long – Trà Vinh 33 Hình 4.2 Mẫu bệnh sau ngày ủ môi trường WA 33 Hình 4.3 Khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme sau ngày cấy 34 Hình 4.4 Màu khuẩn lạc môi trường PDA sau ngày cấy 34 Hình 4.5 Đại bào tử Fusarium moniliforme 35 Hình 4.6 Tiểu bào tử Fusarium moniliforme 35 Hình 4.7 Kết ly trích DNA theo qui trình 36 Hình 4.8 Kết ly trích DNA 20 dịng nấm theo qui trình 37 Hình 4.9 Sản phẩm PCR vùng tef 39 Hình 4.10 Kết sắc ký 40 Sơ đồ 2.1 Con đường sinh tổng hợp GA3 Gibberella fujikuroi Sơ đồ 2.2 Bản đồ vùng gen tef Fusarium 10 Sơ đồ 3.1 Qui trình trích GA3 30 Sơ đồ 3.2 Qui trình TLC phát GA3 31 Bảng 3.1 Các dòng nấm thu thập giống lúa tỉnh ĐBSCL 23 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 29 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 31 Sơ đồ 3.1 Qui trình trích GA3 3.4.4 Định tính GA3 TLC Qui trình định tính GA3 xây dựng theo phương pháp MacMillan (1963) thay đổi hệ dung môi giải ly cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm: Chấm mẫu lên sắc ký có chất hấp thụ Silicagel Ly giải hệ dung môi CHCl3:EtOAc:AcOH [60:40:5] Phun EtOH:H2SO4[95:5] Sấy 120oC phút Phát GA3 đèn UV (365nm) Sơ đồ 3.2 Qui trình TLC phát GA3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 32 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết thu mẫu bệnh lúa von Đồng Bằng Sông Cửu Long Bệnh lúa von nấm gây ra, có giai đoạn vơ tính Fusarium moniliforme giai đoạn hữu tính Gibberella fujikuroi (B.Tudzynski, 1999) Trong q trình sinh trưởng phát triển nấm tạo GAs làm cho lúa phát triển chiều cao gây triệu chứng đặc trưng bệnh lúa von Dựa vào triệu chứng đặc trưng mạ bị nhiễm bệnh vươn dài cao hẳn lúa bình thường, có mỏng màu xanh vàng, thối rễ bị chết Ở giai đoạn đẻ nhánh, bị bệnh nở bụi, gầy cao, địng có màu xanh vàng dễ nhận biết cao lên hẳn phía tầng bình thường ruộng, lóng phát triển dài ra, thường mọc nhiều rễ phụ đốt (rễ gió) thấy lớp phấn trắng phớt hồng bao quanh đốt thân vị trí xung quanh đốt thân Chúng thu thập 20 mẫu bệnh thuộc giống Jasmine 85, OM 2517, OM 2514, OM 4655, OM 2518, OM 4698, OM 504 dòng tỉnh biểu thị Bảng 3.1 Trong nhiều vụ lúa vừa qua, bệnh lúa von phát triển nặng số giống lúa Jasmine 85, OM 2517, IR42 An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ, Sóc Trăng, Trà Vinh (http://www.congtyhai.com) Thực tế thu mẫu cho thấy giống lúa Jasmine 85 OM 2517 bị nhiễm bệnh lúa von nhiều giống khác (Hình 4.1a Hình 4.1b) Cả hai ruộng lúa Huyện Càng Long Tỉnh Trà Vinh thời điểm 01/05/2007 bị nhiễm bệnh lúa von Hình 4.1a ruộng trồng với giống OM 4698 (nhiễm ít) cịn ruộng Hình 4.1b trồng giống OM 2517 (nhiễm nhiều) Vậy để hạn chế lúa bị nhiễm bệnh nên tiến hành biện pháp phòng trừ sau: gieo cấy giống lúa mẫn cảm với bệnh; khơng dùng hạt giống từ hạt bị bệnh; xử lý hạt giống nước nóng 54oC thuốc hóa học trừ nấm có hiệu việc phòng trừ LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 33 bệnh lúa von (Phạm Văn Biên ctv., 2003) Ngoài ra, theo S.H.Ou (1985) bào tử nấm Fusarium moniliforme tồn đất tháng nên xử lý đất sau thu hoạch trồng cách vụ để hạn chế tối đa phát sinh mầm bệnh (a) (b) Hình 4.1 Ruộng lúa bị nhiễm bệnh lúa von Càng Long – Trà Vinh ngày 01/05/2007 (a) giống OM 4698 bị nhiễm nấm F.moniliforme; (b) giống OM 2517 bị nhiễm nấm F.moniliforme Ghi chú: mũi tên lúa nhiễm bệnh lúa von 4.2 Kết phân lập tách đơn bào tử Sau – ngày đặt mẫu bệnh (3 mm x mm) môi trường WA (môi trường nghèo dinh dưỡng nên loại tạp nhiễm mẫu bệnh), từ mẫu bệnh xuất sợi nấm mọc lên mẫu lan môi trường (Hình 4.2) Mẫu bệnh Sợi nấm mọc mẫu bệnh Hình 4.2 Mẫu bệnh sau ngày ủ mơi trƣờng WA LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 34 Dùng que cấy lấy sợi nấm mẫu bệnh sang môi trường WA, sau – ngày sợi nấm mọc lan môi trường Tiến hành tách phần mơi trường có sợi nấm sang đĩa mơi trường PDA (mơi trường để tạo dịng dòng nấm dùng để định danh nấm dựa vào hình thái), tiếp tục ni cấy nhiệt độ phịng Sau – ngày thu khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme có đặc điểm (Hình 4.3) : màu trắng nhạt, mọc tỏa theo cấu trúc hình tròn, bề mặt khuẩn lạc xốp kết tương tự với nghiên cứu Trần Tùng (2005) Hình 4.3 Khuẩn lạc nấm F.moniliforme sau ngày cấy Theo Lester W Burgess ctv (1994), khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme ni cấy mơi trường PDA có màu sắc đa dạng không màu, cam nhạt (bright organe hay pale organe), xám tím (violet grey), tím đậm (dark violet) đỏ đậm (dark magenta) Trong 20 dịng nấm phân lập thu 18 dịng có khuẩn lạc màu cam nhạt dịng có màu đỏ đậm Hình 4.4 Màu khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme môi trƣờng PDA sau ngày cấy LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 35 Để khẳng định mẫu nấm thu Fusarium moniliforme tiếp tục xem bào tử kính hiển vi Kết nhận thấy đại bào tử (Hình 4.5) tiểu bào tử (Hình 4.6) Hình 4.5 Đại bào tử F.moniliforme (xem vật kính 40X) Hình 4.6 Tiểu bào tử F.moniliforme (xem vật kính 40X) Quan sát đại bào tử tiểu bào tử dòng nấm phân lập kính hiển vi vật kính 40X chúng tơi ghi nhận đặc điểm giống mô tả (Vũ Triệu Mân ctv., 1998): đại bào tử nấm Fusarium moniliforme mảnh, dài, hai đầu nhọn, cong hình lưỡi liềm hay gần thẳng có móc đỉnh có – vách ngăn tiểu bào tử có hình trứng dẹt, khơng có có vách ngăn Sau thu dịng nấm có khuẩn lạc thuần, tiến hành tách đơn bào tử với mục đích tạo khuẩn lạc đồng mặt di truyền (Trích Ngơ Quang Hưởng, 2006) hạn chế đột biến q trình ni cấy (Paul E Nelson, 1992) Dựa vào đặc điểm tiến hành tách đơn bào tử theo Mục 3.3.1.3 Và tách thành công đơn bào tử 20 dòng nấm phân lập 4.3 Kết nhân sinh khối Bào tử thu sau tách đơn bào tử phát triển thành khuẩn lạc Dùng dao cấy cắt mẫu thạch chứa sinh khối nấm (mỗi mẫu kích thước khoảng mm2) đĩa petri sang bình tam giác để tăng nhanh sinh khối Các bình tam giác chứa môi trường nhân sinh khối lắc 160 vòng/phút, nhiệt độ 28 C Nấm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 36 nhân sinh khối môi trường lỏng nhằm tạo điều kiện cho khuẩn lạc nấm tiếp xúc với môi trường nhiều từ tăng nhanh sinh khối Sau khoảng – ngày, sinh khối đạt lượng cần thiết ta tiến hành thu sinh khối Vấn đề thường gặp giai đoạn dễ bị nhiễm khuẩn, đặc biệt ngày thứ thứ hai Tuy theo dõi ngày trình lắc lắc liên tục nên khó phát bị nhiễm khuẩn lắc Để đảm bảo không bị nhiễm khuẩn, trước thu sinh khối ta tiến hành quan sát kỹ dịch lỏng, thông thường mẫu bị nhiễm khuẩn bị đục lắc 4.4 Kết ly trích DNA nấm Sợi nấm thu nhận sau nhân sinh khối dòng nấm tiến hành ly trích DNA tổng số theo qui trình nêu Mục 3.3.2.2 Kết ly trích thể Hình 4.7 Tạp Hình 4.7 Kết ly trích DNA theo qui trình Sản phẩm điện di DNA tổng số ly trích theo qui trình có q nhiều tạp, chúng tơi tiến hành ly trích DNA theo qui trình thay bước xử lý phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) chloroform/Isoamyl alcohol (24:1) hạn chế lượng DNA đứt gãy (Hình 4.8) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 37 10 11 DNA tổng số Phần tạp 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hình 4.8 Kết ly trích DNA 20 dịng nấm Fusarium moniliforme theo qui trình Ghi chú: (1) FM1; (2) FM2; (3) FM3; (4) FM4; (5) FM5; (6) FM6; (7) FM7; (8) FM8; (9) FM9; (10) FM10; (11) FM11; (12) FM12; (13) FM13; (14) FM14; (15) FM15; (16) FM16; (17) FM 17; (18) FM18; (19) FM19; (20) FM20 Thời gian lần ly tâm qui trình Lee Taylor cải tiến 10 – 15 phút tăng thời gian để phá hủy lớp vỏ tế bào, lớp màng nhân, loại bỏ protein giúp cho phân lớp phần dịch tế bào chứa DNA, lớp xác tế bào protein tốt loại bỏ nhiều tạp q trình ly trích qui trình khơng dùng proteinase K để loại bỏ protein RNase để loại bỏ RNA Bên cạnh đó, phenol làm đứt gãy DNA Do tiến hành ly trích với qui trình chúng tơi thu kết tối ưu qui trình Theo Hình 4.8, DNA dịng FM12, FM13, FM14, FM17, FM19 có lượng tạp nên tiến hành LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 38 chạy PCR sau pha loãng 10 lần TE 1X nước khử ion DNA dòng nấm lại lượng tạp tương đối nhiều nên phải tiến hành tinh lại 4.5 Kết PCR Theo David ctv (2004) trở ngại lớn nghiên cứu Fusarium việc định danh lồi dựa vào hình thái, độc tố khả gây bệnh đặc điểm phân chia lồi dựa vào hình thái chưa rõ ràng đồng thời có nhiều biến đổi đột biến q trình ni cấy Để giải vấn đề tác giả tạo Fusarium ID.v.1.0 – liệu trình tự DNA vùng tef để xác định nhanh xác nấm tạo độc tố trichothecene loại B phức hệ loài Gibberella fujikuroi; Fusarium oxysporum; Fusarium solani Vùng gen tef phân biệt nhóm với hay lồi nhóm Vùng tef nghiên cứu nhiều chứa trình tự DNA đặc trưng cho nhóm lồi (Trích Lại Hà Tố Hoa, 2006) Đặc biệt Fusarium vùng gen tef mã hóa protein thiết yếu q trình dịch mã hữu ích để xác định nguồn gốc phát sinh loài Ngoài gen đơn bền vững Fusarium cho mức độ đa hình cao lồi có quan hệ gần gũi từ tef trở thành cơng cụ định danh Fusarium dựa locus đơn Trên sở sử dụng cặp mồi ef1 ef2 thiết kế O‟Donnell ctv (1998) để khuếch đại vùng gen tef 20 dòng nấm Fusarium spp gây bệnh lúa von tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long Kết thu sản phẩm khuếch đại 14 dịng nấm có kích thước gần 700 bp rõ tạp Kết tương tự với nghiên cứu David ctv (2004) Bên cạnh kết PCR (Hình 4.9) cho thấy sản phẩm PCR dòng nấm Fusarium moniliforme thu thập giống lúa tỉnh ĐBSCL có kích thước vùng tef Hạn chế đề tài chưa tiến hành PCR hết tất dòng nấm phân lập LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com M 10 11 12 13 14 39 700bp Hình 4.9 Sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại từ DNA dòng Fusarium moniliforme cặp primer ef1-ef2 (1) DNA khuếch đại từ dòng nấm FM1; (2) FM2; (3) FM3; (4) FM4; (5) FM5; (6) FM7; (7) FM8; (M) ladder; (8) FM9; (9) FM11; (10) FM12; (11) FM14;(12) FM15; (13) FM16; (14) FM18 4.6 Kết định tính GA3 TLC GAs nhóm hormon thực vật quan trọng thứ hai sau nhóm auxin ứng dụng đa dạng sinh trưởng, phát triển sinh sản trồng kích thích kéo dài đốt, phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ hạt xác định phái tính hoa (Lincoln Taiz ctv., 2002) Hiện nay, nhà khoa học phát 136 loại giberelins tiết từ vi khuẩn, nấm thực vật (http://www.plant-hormones.info) Trong đó, nấm Gibberella fujikuroi gây bệnh lúa von sản xuất nhiều GA3 Vì chúng tơi tiến hành ni 20 dịng nấm Fusarium moniliforme phân lập môi trường sản xuất GA3 – 20% ICI ngày máy lắc 200 vòng/phút/28oC (Stefan Malonek ctv., 2005) Sau tiến hành trích GA3 Mục 3.4.3 thực TLC theo Mục 3.4.4 Kết ni 20 dịng nấm Fusarium moniliforme mơi trường 20% ICI tốt, khơng bị nhiễm q trình ni cấy Để kiểm tra giới hạn phát GA3 chuẩn tiến hành TLC chất chuẩn nồng độ 1, 5, 10, 50 100 ppm Kết chuẩn nồng độ ppm thấy khơng vết quan sát đèn UV, cịn chuẩn 10 50 ppm vết mờ chúng tơi chọn chuẩn 100 ppm để tiến hành với mẫu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 40 Trong 20 mẫu nấm sau nuôi cấy, trích GA3 tiến hành TLC hệ dung môi chloroform: ethyl acetate: acid acetic (60:40:5) nghi ngờ dịng nấm FM2, FM5 FM15 tạo GA3 mơi trường ni cấy (Hình 4.10) Các dung dịch ni cấy 17 dịng cịn lại khơng vết vị trí có Rf tương đương với chuẩn Theo Hình 4.10 nhận thấy vết TLC từ lên dung dịch nuôi cấy dòng nấm FM2, FM5 FM15 tương ứng với vị trí số 1, 2, có giá trị Rf tương đương với vết GA3 chuẩn 100 ppm vị trí số (Rf=0,12) Hình 4.10 Kết TLC dịch nấm sau ni cấy dịng nấm F.moniliforme môi trƣờng 20% ICI Ghi chú: (1); (2); (4) tương ứng dung dịch ni cấy dịng nấm FM2, FM5 FM15 (3) chuẩn GA3 100 ppm Tuy nhiên tiến hành hệ dung môi chloroform:methanol:acid acetic (85:15:5) (Đỗ Thị Di Thiện, 2005) phân cực hệ dung môi cũ nhằm khẳng định Rf vết từ dung dịch nấm có tương đương với vết chuẩn GA3 hay không Kết thu Rf mẫu thấp Rf chất chuẩn Ngoài dựa vào Hình 4.10, vết khác mẫu giberelins khác nấm tiết q trình ni cấy Thật vậy, theo tác giả Nguyễn Văn Uyển (1989), dung dịch nuôi cấy số chủng nấm lúa von Gibberella fujikuroi phát tồn 25 loại giberelin Từ kết nhận thấy qui trình thực 20 dịng nấm không hiệu số nguyên nhân sau: điều kiện ni cấy nấm, qui trình trích GA3 chưa tối ưu nồng độ GA3 dung dịch nuôi cấy nấm thấp LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 41 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Đã phân lập tách đơn bào tử 20 dòng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von ruộng lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long Có thể áp dụng qui trình Mục 3.3.2.2 để tiến hành ly trích DNA nấm Fusarium moniliforme Qui trình PCR mục 3.3.3.2 ổn định cho sản phẩm rõ khơng có tạp nên dùng để phân tích PCR vùng tef nấm Fusarium moniliforme Đã chạy thành cơng 14/20 dịng nấm phân lập Trong 20 dòng nấm, chưa phát dòng sản xuất GA3 môi trường 20% ICI TLC 5.2 Đề nghị Tiến hành thí nghiệm chủng nấm in vitro từ xác định dịng nấm có độc tính mạnh có nghĩa tìm dịng nấm tạo nhiều GA3 Tiến hành đọc trình tự sản phẩm PCR đem kết đọc trình tự so sánh với trình tự Genbank để xác định rõ lồi gây bệnh Tìm điều kiện ni cấy thích hợp quy trình trích giberelin hiệu để nấm Gibberella fujikuroi có khả sản xuất giberelin LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nƣớc Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyến, Nguyễn Mạnh Chinh, 2003 Cẩm nang sâu bệnh gây hại trồng, 1, lương thực, thực phẩm, hoa cảnh Nhà xuất nông nghiệp Trang 123 – 125 Bùi Chí Bửu, Ngyễn Thị Lang, 2004 Di truyền phân tử Nhà xuất nông nghiệp Trang 331 – 348 Nguyễn Xuân Dũng Phạm Hùng Việt, 1985 Các phương pháp sắc ký Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội Trang 225 – 297 Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998 Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục Lại Hà Tố Hoa, 2006 Định danh nấm Trichoderma dựa vào trình tự vùng ITS-rDNA vùng tef Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ sinh học, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Đào Văn Hoằng, 2005 Kỹ thuật tổng hợp hóa chất bảo vệ thực vật Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội Trang 317 – 320 Ngô Quang Hưởng, 2006 “Phân tích đa dạng di truyền quần nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei gây bệnh cao su (Hevea brasiliensis Muell Arg.) Lai Khê (Bến Cát – Bình Dương) kỹ thuật RFLP – PCR” Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Cơng nghệ sinh học, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Vũ Triệu Mân Lê Lương Tề, 1998 Bệnh nông nghiệp Nhà xuất nông nghiệp Hà Nội Trang 82 – 84 Đỗ Thị Di Thiện, 2005 Khảo sát ảnh hưởng vi khuẩn Methylobacterium sp lên ảnh hưởng Hông (Paulownia fortunai) thuốc (Nicotiana tabacum L cv samsum) ni cấy invitro Khóa luận cử nhân khoa học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên 10 Trần Tùng, 2005 Bệnh hại hạt lúa giống sau thu hoạch ảnh hưởng biện pháp xử lý thuốc hóa học đến tác nhân gây bệnh, chất lượng hạt giống Luận án thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 43 11 Nguyễn Kim Phi Phụng Các phương pháp nhận danh , trích ly cô lập hợp chất hữu Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên 2000 – 2001 Trang – 25 12 Nguyễn Văn Uyển, 1989 Các chất sinh trưởng nông nghiệp Nhà xuất TP.HCM Trang 18 – 49 13 Tài liệu qui trình phân tích hormon thực vật Phịng Hóa Lý, Viện Cơng Nghệ Sinh Học Công Nghệ Môi Trường, Đại Học Nông Lâm TP.HCM Tài liệu nƣớc 14 A.R.Pokalsky, W.R.Hiatt, N.Ridge, R.Rasmussen, C.M.Houck and C.K.Shewmaker, 1989 Structure and expression of elongation factor in tomato 15 B.Tudzynski, 1999 Biosynthesis of gibberellins in Gibberella fujikuroi: biomolecular aspects Appl Microbiol Biotechnol 52: 298 – 310 16 David M Geiser, María del Mar Jiménez-Gasco, Seogchan Kang, Izabela Makalowska, Narayanan Veeraraghavan, Todd J.Ward, Ning Zhang, Gretchen A Kuldau and Kerry O‟Donnell, 2004 FUSARIUM-ID v 1.0: A DNA sequence database for identifying Fusarium European Journal of Plant Pathology 00 17 Hiroshi Harada and Antom Lang, 1964 Effect of some (2-Chloroethyl) trimethylammonium chloride analogs and other growth retardants on gibberellin biosynthesis in Fusarium moniliforme 18 Hiroshi Kawaide Biochemical and molecular analyses of gibberellin biosynthesis in fungi. 19 Kamel A Abd-Elsalam, Ibrahim N Aly, Mohmed A Abdel-Satar, Mohmed S Khalil and Joseph A Verreet, 2003 PCR identification of Fusarium genus based on nuclear ribosomal-DNA sequence data Africa journal of iotechnology vol.2 p82 – 85 20 Kurt Weising, Hilde Nybom, Kirsten wolff and Wieland Meyer, 1995 DNA fingerprinting in plants and fungi.CRC Press 322 pages 21 Lester W Burgess, Brett A Summerell, Suzanne Bullock, Kathryn P Gott, and David Backhouse, 1994 Laboratory manual for Fusarium research 3rd edition University of Sydney LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 44 22 Lincoln Taiz and Eduardo Zeiger, 2002 Plant Physiology 3rd edition p509 – 540 23 MacMillan J and Suter P.J, 1963 Thin layer chromatography of the gibberellins Nature 197: 790 24 Paul E Nelson, 1992 Taxonomy and biology of Fusarium moniliforme Mycopathologia 117: 29 – 36 25 Reyes Candau, Javier Avalos and Enrique Cerdá-Olmedo, 1992 Regulation of gibberellin biosynthesis in Gibberella fujikuroi Plant Physiol 100: 1184 – 1188 26 S.H.Ou, 1985 Rice diseases Second edition Commonwealth mycological institute p262 – 272 27 Stefan Malonek, Christiane Bomke, Erich Bornberg-Bauer, María C Rojas, Peter Hedden, Paul Hopkins, Bettina Tudzynski, 2005 Distribution of gibberellin biosynthesis genes and gibberellin production in the Gibberella fujikuroi species complex Phytochemistry 66: 1296 – 1331 Tài liệu internet 28 http://en.wikipedia.org/wiki/Gibberellic_cid 29 http://www.ctu.edu.vn/coursewares/khoahoc/sinhhocdc_a2/phan1/ch3.htm#II.2 30 http://beta.uniprot.org/taxonomy/5127 31 http://www.knowledgebank.irri.org/riceDoctor_MX/projectImages/image1.gif 32 http://www.planthealthaustralia.com.au/project_documents/uploads/review4.pdf 33 http://www.wellesley.edu/Chemistry/chem211lab/Orgo_Lab_Manual/Appendix/ Techniques/TLC/thin_layer_chrom.html 34 http://www.plantsciences.ucdavis.edu/uccerice/NEWS/RiceNL_mar2003.pdf 35 http://www.laodong.com.vn/Home/kinhte/2007/2/23593.laodong LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Phụ lục 1: Bình sắc ký Phụ lục 2: Cơng thức tính Rf Rf = b/a Trong đó: a: Khoảng đường di chuyển dung mơi b: Khoảng đường di chuyển hợp chất LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP NẤM Fusarium moniliforme GÂY BỆNH LÖA VON VÀ XÁC ĐỊNH DÕNG NẤM TẠO GIBERELIN. .. nấm Fusarium moniliforme kỹ thuật PCR Ni cấy dịng nấm Fusarium moniliforme mơi trường sản xuất GA3 định tính GA3 TLC Các kết đạt được: Phân lập 20 dòng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von. .. 08/2007 ? ?Phân lập nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von xác định dòng nấm tạo giberelin? ?? Giáo viên hướng dẫn: TS Lê Đình Đơn Thời gian thực đề tài từ tháng 03/2007 đến tháng 08/2007, Phịng bệnh