1 MỞ ĐẦU Mức độ gia tăng dân số nhanh chóng đẩy tồn nhân loại phải đối mặt với thách thức lớn lao, khắc phục đói nghèo Vấn đề để tăng sản lượng nông nghiệp, cung cấp lương thực ổn định cho người mối quan tâm đặc biệt nhiều quốc gia giới Tình hình lương thực bấp bênh phổ biến nhiều nơi Bên cạnh ngun nhân nơng nghiệp chưa coi trọng mức, đất đai chưa sử dụng hợp lý, sâu bệnh, đặc biệt trùng, tác nhân gây thiệt hại chủ yếu cho mùa màng Theo thống kê Dean & Adang [65.], Oerke & đtg [154.], tổn thất mùa màng nghiêm trọng toàn cầu sâu bệnh gây ước tính chiếm từ 35 đến 42% tổng sản lượng nơng nghiệp hàng năm, thiệt hại trùng chiếm từ 13-16% Mức độ thiệt hại có lên tới 70% trồng không áp dụng biện pháp bảo vệ Hiện nay, nhiều loại thuốc trừ sâu hoá học sử dụng để phịng trừ sâu bệnh với chi phí tốn kém, gây ô nhiễm môi trường gây độc hại cho sức khoẻ người, vật ni Để cải thiện tình hình này, cần ứng dụng kỹ thuật tiên tiến bảo vệ trồng nhằm xây dựng nông nghiệp sạch, bền vững Việc tạo giống trồng biến đổi di truyền (Genetically Modified Crops, GMOs) có khả kháng sâu bệnh trùng nói riêng nhờ kỹ thuật tạo dịng phân tử, kỹ thuật chuyển gen thực vật quan tâm nghiên cứu ứng dụng thực tiễn nhằm nâng cao suất trồng đem lại lợi ích tối đa cho nông nghiệp Hơn nữa, tiến đạt khắc phục hạn chế sử dụng biện pháp trừ sâu hoá học biện pháp sinh học truyền thống, nâng mức độ an tồn cho người, vật ni cải thiện mơi trường sinh thái Bằng kỹ thuật di truyền này, triển vọng tạo giống trồng mang đặc tính mong muốn thời gian tương đối ngắn trở thành thực Đến hàng loạt gen mã hố protein có hoạt tính diệt trùng gây hại (gen LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com kháng côn trùng) gen cry vi khuẩn Bacillus thuringiensis, gen mã hoá chất ức chế proteaza ỏ-amylaza… chuyển vào thực vật nhờ phương pháp thích hợp với sản phẩm trồng có khả tự kháng sâu bệnh Trên giới, nhiều phương pháp chuyển gen thực vật nghiên cứu áp dụng thành công, phương pháp vi tiêm, sử dụng súng bắn gen, xung điện Trong đó, phương pháp có giá trị thực tiễn cao sử dụng rộng rãi phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens Với ưu điểm tốn kém, dễ áp dụng đối tượng trồng nên phương pháp phù hợp với điều kiện nước phát triển Việt Nam [1.] Nhiều nơi giới, kỹ thuật chuyển biểu gen kháng côn trùng nói riêng gen có lợi nói chung vào trồng thông qua phương pháp cơng cụ hỗ trợ chọn giống thực vật Ở nước ta, nghiên cứu chuyển gen thực vật bắt đầu, chủ yếu phịng thí nghiệm Viện Công nghệ Sinh học Viện Sinh học Nhiệt đới (thuộc Trung tâm Khoa học Tự nhiên Công nghệ Quốc gia), Viện Di truyền Nông nghiệp Viện Nghiên cứu Lúa đồng sông Cửu Long (thuộc Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn) Hầu hết nghiên cứu sử dụng gen thị số gen khác vectơ plasmit thiết kế sẵn Tuy nhiên, phần lớn vectơ tái tổ hợp kết cấu gen nhà sáng chế công ty/ quan đăng ký sở hữu trí tuệ dạng sáng chế giải pháp hữu ích Về khía cạnh sở hữu trí tuệ, để quyền sử dụng thành phần vectơ tái tổ hợp, thông thường người nhận phải liên lạc với nhà sáng chế, quan công ty sở hữu để ký hợp đồng chuyển giao nguyên liệu (Material Transfer Agreement, MTA) Qua hợp đồng này, thường sử dụng nguyên liệu cho mục đích nghiên cứu với nhiều ràng buộc khía cạnh xuất bản, sản phẩm nghiên cứu, sở hữu, chuyển giao Rõ ràng, để có vectơ mang gen tái tổ hợp có giá trị nước ngồi thiết kế, bên cạnh chi phí lớn, cịn có nhiều khó khăn phức tạp chuyển giao nguyên liệu công nghệ Do vậy, yêu cầu cấp bách đặt phải tự thiết kế vectơ chuyển gen thực vật nói chung vectơ mang đoạn khởi động đặc hiệu để LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com điều khiển biểu gen kháng trùng nhằm mục đích chuyển biểu gen đối tượng trồng nước ta Trên sở ý nghĩa lý luận thực tiễn hướng nghiên cứu này, tiến hành đề tài: “Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào trồng”, với mục đích nội dung nghiên cu chớnh sau õy: Mục đích nghiên cứu Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử công nghệ gen để nghiên cứu đoạn khởi động đặc hiệu thực vật gen có hoạt tính kháng côn trùng Trên sở đó, thiết kế vectơ Ti-plasmit tạo chủng A tumefaciens phục vụ công nghệ chuyển gen nhằm mục đích nâng cao tính kháng sâu bệnh trồng Nội dung nghiên cứu Su tập phân lập đoạn khởi động đặc hiệu thực vật gen có hoạt tính kháng côn trùng Thiết kế vectơ Ti-plasmit mang gen kháng côn trùng dới điều khiển đoạn khởi động định đoạn khởi động đặc hiệu thực vật tế bào E coli Tạo chủng A tumefaciens mang vectơ Ti-plasmit chứa gen kháng côn trùng để chuyển vào trồng Thiết kế vectơ biểu gen kháng côn trùng tế bào E coli Tạo kháng thể kháng protein có hoạt tính diệt côn trùng phục vụ cho nghiên cứu giám định chuyển gen Những đóng góp luận án LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bản luận án có đóng góp khoa học thực tiễn nh sau: Đà nhân, tạo dòng đọc trình tự đoạn khởi động gen mà hoá sucroza synthaza (sucrose synthase) ë gièng lóa C71 cã kh¶ điều khiển biểu gen đặc hiệu bó mạch Đây đoạn khởi động gen đợc phân lập đọc trình tự từ giống lúa Việt Nam Trình tự đoạn khởi động đà đợc đăng ký Ngân hàng trình tự gen quốc tế Đà tạo đợc kết cấu gen gen cryIA(c) dới điều khiển đoạn khởi động đặc hiệu bó mạch C71S-P nhằm mục đích chuyển vào giống lúa Việt Nam tạo khả kháng sâu đục thân lúa Đà thiết kế thành công vectơ Ti-plasmit mới, cung cấp nguyên liệu cho nghiên cứu chuyển gen vào trồng nghiên cứu đoạn khởi động Trong đó, gen cryIA(c) dới điều khiển đoạn khởi động Ubiquitin đoạn khởi động gen mà hoá sucroza synthaza giống lúa C71 đà đợc đa vào vectơ Ti-plasmit cải tiến vectơ chuyển gen hệ sử dơng hƯ thèng chän läc tÝch cùc (Positive Selection System) Đà hoàn thiện sử dụng phơng pháp xung điện phơng pháp phối ba bố mẹ để tạo chủng A tumefaciens mới, sở chủng LBA4404 EHA105, mang vectơ Ti-plasmit chứa gen kháng côn trùng để chuyển vào trồng Lần điều kiện Việt Nam đà thành công việc biểu gen cryIA(c) tổng hợp hoá học vi khuẩn E coli Protein CryIA(c) tái tổ hợp sau tinh chế đà đợc dùng để sản xuất kháng thể kháng CryIA(c) nhằm mục đích sử dụng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com làm công cụ kiểm tra có mặt sản phẩm gen cryIA(c) trồng đợc chuyển gen Các vectơ Ti-plasmit đà đợc Viện Công nghệ Sinh học chuyển vào lúa loại trồng quan trọng khác Ngoài ra, chủng A tumefaciens đà đợc chuyển giao cho Viện Nghiên cứu Ngô (thuộc Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn) nhằm triển khai nghiên cứu hợp tác chuyển gen cry vào ngô Việt Nam LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chơng Tổng quan tài liệu 1.1 Vi khuẩn đất A tumefaciens phơng pháp chuyển gen vào trồng 1.1.1 A tumefaciens tợng biến nạp gen thực vật tự nhiên Những năm đầu kỷ 20, Smith Townsend đà phát số hai mầm xuất khối u tác nhân gây bệnh vi khuẩn đất A tumefaciens Đến cuối năm 1960, mối quan hệ khối u vật liệu di truyền loài vi khuẩn đà đợc Braun Schilperoort khám phá A tumefaciens có khả xâm nhiễm thực vật, kích thích tạo khối u vết thơng chủ Trong tự nhiên, A tumefaciens chủ yếu công hai mầm, đặc biệt nhóm thực vật có hoa Một vài loài mầm thuộc họ hành tỏi thuỷ tiên mẫn cảm yếu với A tumefaciens [34.] Hoàn toàn khác với mô tế bào thực vật bình thờng, khối u A tumefaciens sinh phát triển mạnh ®iỊu kiƯn thiÕu hoocmon sinh trëng (auxin vµ cytokinin) Së dĩ nh A tumefaciens đà chuyển đoạn ADN (Transfer DNA - T-ADN) sang tÕ bµo thùc vËt T-ADN điều khiển trình sinh tổng hợp hợp chất Ngoài ra, khối u sinh tổng hợp opin axit amin (amino acid - aa) đặc biệt dẫn xuất đờng Dạng opin đợc tổng hợp nopalin, octopin, agrocinopin, mannozapin vµ agropin phơ thc vµo tõng chđng Agrobacterium Trong đó, octopin nopalin hai dạng opin phổ biến Opin đợc vi khuẩn sử dụng thay cho nguồn cacbon nitơ LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com nhờ hoạt động gen chuyển hoá opin plasmit g©y khèi u thùc vËt (Tumour inducing plasmid - Ti-plasmit) [44.], [109.] Cơ chế phân tử hình thành khối u đà đợc quan tâm nghiên cứu nhằm tìm phơng thức phòng trừ bệnh cho Tuy nhiên, phát Ti-plasmit khả tự chuyển T-ADN vào genom thực vật, ngời ta đà đặc biệt ý khai thác khả sử dụng chúng nh vectơ tự nhiên để chuyển gen quan tâm vào thực vật nhằm tạo trồng mang tính trạng mong muốn [34.], [37.], [54.] 1.1.1.1 Cấu trúc chức Ti-plasmit Zaenen & đtg, Đại học Ghent (Bỉ) nhóm tác giả phát hiƯn A tumefaciens mang mét cÊu tróc di trun ngoµi nhiễm sắc thể chứa hầu hết gen liên quan đến hình thành khối u Tuy nhiên, họ nghĩ loại virut xâm nhiƠm vi khn Thùc tÕ, u tè di trun nµy plasmit khổng lồ với kích thớc khoảng 200 kb Các chủng vi khuẩn có quan hệ gần gũi, nh vi khuẩn tạo nốt sần rễ (Rhizobium trifolii) (Phyllobacterium myrsinacearum) có khả hình thành khối u thực vật bị nhiễm Ti-plasmit Điều khẳng định vai trò quan trọng yếu tố lây nhiễm nằm Ti-plasmit hình thành khối u chủ [54.] Ti-plasmit (hình 1.1) đợc tìm thấy tất chủng A tumefaciens gây nhiễm tồn bền vững nhiệt độ dới 300C Đây phân tử ADN mạch vòng, sợi kép tồn tế bào nh đơn vị chép độc lập Phân tích di truyền cho thấy, Ti-plasmit dạng octopin dạng nopalin hai dạng phổ biến nhất, có vùng tơng đồng, vùng T-ADN vùng gây độc (Virulence Region - vïng VIR), liªn quan trùc tiÕp tíi sù LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com h×nh thành khối u thực vật Hai vùng lại chøa gen m· ho¸ cho viƯc chÐp plasmit (Origin of replication) chuyển nạp (Conjugative transfer) [34.] Trên Ti-plasmit, có vùng T-ADN đợc chuyển từ vi khuẩn sang genom bị bệnh tồn bền vững [87.] Tuy nhiên, vùng lại không mà hoá sản phẩm làm trung gian cho trình chuyển T-ADN mà cần có trợ giúp đặc biệt gen gây khối u nằm vùng VIR nhiễm sắc thể vi khuẩn (chv genes) Vùng VIR dài khoảng 40 kb đảm nhận chức gây nhiƠm ë Ti-plasmit d¹ng octopin, vïng VIR chøa tíi 24 gen gây độc Sản phẩm protein gen mà hoá đà kích thích tách biệt T-ADN, bao bäc che chë vµ gióp chóng tiÕp cËn víi genom chủ Ngoài gen vir, gen nhiễm sắc thể A tumefaciens (nh chvA chvB) đóng vai trò quan trọng trình xâm nhËp cđa A tumefaciens vµo thµnh tÕ bµo thùc vËt [34.], [109.] LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 1.1 Bản đồ Ti-plasmit dạng octopin 1.1.1.2 Cấu trúc chức đoạn T-ADN Trong genom bị khối u, số lợng T-ADN dao động từ vài đến 10 Chúng nằm locut tách rời gắn với vùng khác genom thực vật cách ngẫu nhiên cà chua, đoạn T-ADN đà gắn vào nhiễm sắc thể thực vật, Crepis capillaris, T-ADN đợc tìm thấy nhiễm sắc thể [109.] Kết phân tích trình tự gen T-ADN Ti-plasmit khác cho thấy, T-ADN đợc giới hạn đoạn trình tự lặp lại gần nh hoàn toàn từ khoảng 25 bp gọi đoạn biên Chúng dấu hiệu nhận biết cho trình chuyển xâm nhập TADN vào tế bào thực vật đoạn biên phải (Right Border - RB) có yếu tố điều khiển cis cần cho trình chuyển T-ADN Đoạn biên trái (Left Border - LB) gián tiếp tham gia vào trình chuyển TADN dấu hiệu để trình kết thúc bình thờng [147.], [152.] Ti-plasmit dạng nopalin, T-ADN xâm nhập vào genom thực vật dạng đoạn liên tục dài 22 kb Trong khi, Tiplasmit dạng octopin, đoạn T-ADN dài 13 kb số mô thực vật, khối u lại chứa đoạn ADN kÝch thíc kb [208.] TADN mang rÊt nhiỊu gen nh: (1) Các gen mà hoá enzym cần thiết cho trình sinh tổng hợp opin; (2) Các gen gây khối u nh tms1, tms2, tmr mà hoá cho enzym liên quan đến trình sinh tổng hợp auxin cytokinin [34.], [109.] LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 10 1.1.1.3 Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật Các tế bào bị tổn thơng tiết hợp chất dẫn dụ ho¸ häc vi khn nh acetosyringon, α-hydroxy-acetosyringon Díi t¸c dơng hợp chất này, A tumefaciens nhận biết bám vào thành tế bào chủ chuyển T-ADN vào tế bào thực vật Quá trình đợc trợ giúp đặc biệt gen vir đoạn biên phải, trái [32.], [34.] Cũng hợp chất này, với vai trò cảm ứng, giúp cho gen vùng VIR hoạt động tăng cờng biểu Khi vi khuẩn xâm nhiễm tế bào thực vật qua vết thơng, sản phẩm gen virA nhận biết có mặt tơng tác với phân tử acetosyringon truyền thông tin ngoại bào vào tế bào dẫn đến hoạt động protein VirG Tiếp theo, VirG lại kích hoạt gen gây độc khác nh virB, virC, virD virE nh tăng cờng mức ®é phiªn m· cđa virG [34.], [44.], [144.] Sau ®ã, virD hỗ trợ trình tách T-ADN thành hai sợi đơn Một sợi chuyển sang tế bào thực vật với đầu 5' trớc Sợi đơn lại làm khuôn để tổng hợp nên sợi ADN bổ sung Trong trình di chuyển, sợi ADN đơn đợc gắn với protein VirE để chui qua nhiều màng trớc vào đợc đến nhân tế bào thực vật Protein VirB nằm màng tế bào vi khuẩn có nhiệm vụ chuyển trực tiếp T-ADN sợi đơn sang tế bào thực vật (hình 1.2) [209.], [210.] Quá trình chuyển T-ADN gần giống với trình tiếp hợp vi khuẩn, protein VirB tơng đơng với yếu tố F, hoạt động nh cầu nối chuyển gen Sau T-ADN qua màng tế bào, chúng thẳng vào nhân kết hợp với genom thực vật vị trí ngẫu nhiên Tại đó, gen T-ADN, nhờ điều khiển gen thực vật, bắt đầu hoạt động sản sinh auxin, cytokinin opin gây nên phát triển thái hàng loạt tế bào lân cận dẫn đến hình thành khèi u LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 154 1995: The first decade of crop biotechnology”, ISAAA Briefs 1, pp 1-31 115 James C (1997), “Global status of transgenic crops in 1997”, ISAAA Briefs 5, pp 1-27 116 James C (2000), “Preview: Global review of commercialized transgenic crops: 2000”, ISAAA Briefs 21, pp 1-15 117 James C (2001), “Preview: Global review of commercialized transgenic crops: 2001”, ISAAA Briefs 24, pp 1-20 118 Jang I.C., Choi W.B., Lee K.H., Song S.I., Nahm B.H., Kim J.K (2002), “High level and ubiquitous expression of the rice cytochrome c gene OsCc1 and its promoter activity in transgenic plants provides a useful promoter for transgenesis of monocots”, Plant Physiology 129, pp 14731481 119 Jefferson R.A., Kavanagh T.A., Bevan M.W (1987), “GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants”, The EMBO Journal 6, pp 3901-3907 120 Jouanin L., BonadÐ-Bottino M., Giard C., Morrot G., Giband M (1998), “Transgenic plant for insect resistance”, Plant Science 131(1), pp 1-11 121 Kaur S (2000), “Molecular approaches towards development of novel Bacillus thuringiensis biopesticides”, World Journal of Microbiology and Biotechnology 16, pp 781-793 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 155 122 Kay R., Chan A., Daly M., McPherson J (1987), “Duplication of CaMV 35S promoter sequences creates a strong enhancer for plant genes”, Science 236, pp.1299-1302 123 Knowles B.H., Dow J.A.T (1993), “The crystal δ-endotoxin gene of Bacillus thuringiensis: Modes of action on the insect gut”, BioEssays 15, pp 469-476 124 Komari T., Hiei Y., Saito Y., Murai N., Kumashiro T (1996), ”Vectors carrying two separate T-DNAs for co- transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers”, The Plant Journal 10(1), pp.165-174 125 Koziel M.G., Beland G.L., Bowman C., Carozzi N.B., Crenshaw R., Crossland L., Dawson J., Desai N., Hill M., Dadwell S., Lewis K., Maddox D., McPherson K., Meghji R., Merlin E., Rhodes R., Warren G.W., Wright M., Evola S.V (1993a), “Field performance of elite transgenic maize plant expressing an insecticidal protein derived from Bacillus thuringiensis”, Bio/Technology 11, pp 194-200 126 Koziel M.G., Caozi N.B., Curier T.C., Warren G.W., Evola S.V (1993b), “The insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis: Past, present and future use”, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 11, pp 171-228 127 Krattiger A.F (1997), “Insect resistance in crops: A case study of Bacillus thuringiensis and its transfer to developing countries”, ISAAA Briefs 2, pp 1-42 128 Laemmli U.K (1970), “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4”, Nature 227, pp 680-685 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 156 129 Laporte M.M., Galagan J.A., Prasch A.L., Vanderveer P.J., Hanson D.T., Shewmaker C.K., Sharkey T.D (2001), “Promoter strength and tissue specificity effects on growth of tomato plants transformed with maize sucrose-phosphate synthase”, Planta 212(5-6), pp 817-822 130 Larkin J.C., Oppenheimer D.G., Pollock S., Marks M.D (1993), “Arabidopsis Glabrous1 gene requires downstream sequences for function”, The Plant Cell 5, pp 1739-1748 131 Last R.L., Rose A.B (1999), “Methods & compositions for enhancing the expression of genes in plants”, Patent US5861277 132 Lazzeri P.A (1998), “Techniques for the development of transgenic crops in crop protection”, BCPC Symposium proceedings 71: Biotechnology in crop protection: Facts and fallacies, pp 3-9 133 Lewin B (1997), Genes VI, Oxford University Press, OxfordNew York- Tokyo 134 Li J., Caroll J., Ellar D.J (1991), “Crystal structure of insecticidal -endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5∑ resolution”, Nature 353, pp 815-821 135 Luehrsen K.R., Walbot V., (1991), “Intron enhancement of gene expression and the splicing efficiency of introns in maize cells”, Molecular and General Genetics 225, pp, 8193 136 Luehrsen K.R., Walbot V., (1994), “Addition of A-and U-rich sequence increases the splicing efficiency of a deleted form of a maize intron”, Plant Molecular Biology 24, pp 449-463 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 157 137 Ma H., Yanofsky M.F., Klee H.J., Bowman J.L., Meyerowitz E.M (1992), “Vectors for plant transformation and cosmid libraries”, Gene 117, pp 161-167 138 Malone L.A., Giacon H.A., Burgess E.P.J., Maxwell J.Z., Christeller J.T., Laing W.A (1995), “Toxicity of trypsin endopeptidase inhibitors to honey bees (Hymenoptera: Apodae)”, Journal of Economic Entomology 88, pp 46-50 139 Mascarenhas J.P., Hamilton D.A (1992), “Artifacts in the localization of GUS activitiy in anthers of petunia transformed with CaMV 35S- GUS construct”, The Plant Journal 2(3), pp 405-408 140 McBride K.E., Summerfelt K.R (1990), “Improved binary vectors for Agrobacterium - mediated plant transformation”, Plant Molecular Biology 14, pp 269-276 141 McCormac A.C., Elliott M.C., Chen D.F (1998), “A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation”, Molecular Biotechnology (2), pp 155-159 142 McCormac A.C., Elliot M.C., Chen D.F (1999), “pBECKS2000: a novel plasmid series for the facile creation of complex binary vectors, which incorporates "clean-gene" facilities”, Molecular and General Genetics 261, pp 226-235 143 McElroy D., Zhang W., Cao J., Wu R (1990), “Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation”, The Plant Cell 2, pp 163-171 144 McLean B.G., Greene E.A., Zambryski P.C (1994), “Mutants of Agrobacterium VirA that active vir gene expression in the LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 158 absence of the inducer acetosyringone”, The Journal of Biological Chemistry 269 (4), pp 2645-2651 145 Merritt C.R (1998), “The commercialization of transgenic crops-the Bt experience”, BCPC Symposium Proceedings 71: Biotechnology in crop protection: Facts and fallacies, pp 7986 146 Michaud D (1997), “Avoiding protease-mediated resistance in herbivorous pests”, Trends in Biotechnology 15, pp 4-6 147 Mooney P.A., Goodwin P.B., Dennis E.S., Liewellyn D.J (1991), “Agrobacterium tumefaciens-gene transfer into wheat tissues”, The Journal of Plant Cell Tissue and Organ Culture 25, pp.209-218 148 Moreno J., Altabella “Characterization of T., Chrispeels α-amylase- M.J inhibitor, a (1990), lectin-like protein in the seeds of Phaseolus vulgaris”, Plant Physiology 92, pp 703-709 149 Muramatsu M., Fukazawa C (1993), “A high-order structure of plant storage proprotein allows its second conversion by an asparagine-specific cysteine protease, a novel proteolytic enzyme”, European Journal of Biochemistry 215, pp 123132 150 Murray M.G., Thompson W.F (1980), “Rapid isolation of high molecular weight plant DNA”, Nucleic Acids Research 8, pp 4321-4325 151 Nayak P., Basu D., Das S., Basu A., Ghosh D., Ramakrishnan N.A., Ghosh M., Sen S K (1997), “Transgenic elite indica rice plants thurigiensis expressing are CryIAc resistant -endotoxin against yellow of Bacillus stem borer LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 159 (Scirpophaga incertular)”, Agricultural Sciences 94, pp 2111-2116 152 Negrotto D., Jolley M., Beer S., Wench A.R., Hansen G (2000), “The use of phosphomannozase-isomerase as a selectable marker to recover transgenic maize plants (Zea mays L.) via Agrobacterium transformation”, Plant Cell Reports 19, pp 798-803 153 Odell J.T., Knowlton S., Lin W., Mauvais C.J (1988), “Properties of an isolated transcription stimulating sequence derived from the cauliflower mosaic virus 35S promoter”, Plant Molecular Biology 10, pp 263-272 154 Oerke E.C., Dehne H.W., Schonbeck F., Weber A (1994), Crop production and crop protection: Estimated losses in major food and cash crops, Elsevier, Amsterdam 155 Olhoft P.M., Somers D.A (2001), “L-cysteine increases Agrobacterium-mediated T-DNA delivery into soybean cotyledonary-node cells”, Plant Cell Reports 20, pp 706711 156 Panbangred W., Panjaisee S., Tantimavanich S (2000), “Expression of the mosquitocidal cryIVB gene under the control of different promoters in Bacillus sphaericus 2362 and acrystalliferous Bacillus thuringiensis subsp israelensis c4Q2-72”, World Journal of Microbiology and Biotechnology 16, pp 163-169 157 Perlak F.J., Deaton R.W., Amstrong T.A., Fuchs R.L., Sims S.R., Greenplate J.T., Fischhoff D.A (1990), “Insect resistant cotton plants”, Bio/Technology 8, pp 939-943 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 160 158 Perlak F.J., Fuchs R.L., Dean D.A., McPherson S.L., Fischhoff D.A (1991), “Modification of the coding sequence enhances plant expression of insect control protein genes”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 88, pp 3324-3328 159 Plesse B., Criqui M-C., Durr A., Parmentier Y., Fleck J., Genschik P (2001), “Effects of the polyubiquitin gene Ubi.U4 leader intron and first ubiquitin monomer on reporter gene expression in Nicotiana tabacum”, Plant Molecular Biology 45, pp 655-667 160 Purcell J.P., Greenplate J.T., Jennings M.G., Ryers J.S., Pershing J.C., Sims S.R., Prinsen M.J., Corbin D.R., Tran M., Sammons R.D., Stonard R.J (1993), “Cholesterol oxidase: A potent insecticidal protein active against bollweevil larvae, Biochemical and Biophysical Research Communications 196, pp 1406-1413” 161 Rajamohan F., Cotrill J.A., Gould F., Dean D.H (1996), “Role of domain II, loop residues of Bt CryIAb δ-endotoxin in reversible and irreversible binding to Manduca sexta and Heliothis virescens”, Journal of Biological Chemistry 271, pp 2390-2397 162 Rajamohan F., Dean D.H (1996), “Chapter Molecular biology of bacteria on biologicial control of insects”, In: Molecular biology of the biological control of pests and diseases of plants, Gunasekaran M., Weber D.J (Eds.),CRC Press, Boca Raton, Florida, pp 105-122 163 Rao K.V., Rathore K.S., Hodges T.K., Fu X., Stoger E., Sudhakar D., Williams S., Christou P., Bharathi M., Bown LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 161 D.P., Powell K.S., Spence J., Gatehouse A.M., Gatehouse J.A (1998), “Expression of snowdrop lectin (GNA) in transgenic rice plants confers resistance to rice brown planthopper”, Plant Jounal 15(4), pp 469-477 164 Rasul N.M., Mohammad K., Islam M.R., Seraj Z.I (1997), “Tranformation of an indica rice cultivar Binnatoa with Agrobacterium tumefaciens”, Plant Tissue Culture 7(2), pp 71-80 165 Reeck G.R., Kramer K.J., Baker J.E., Kanost M.R., Fabrick J.A., Behnke C.A (1997), “Proteinase inhibitors and resistance of transgenic plants to insect In: Advance in insect control: The role of transgenic plant, Carozzi N., Koziel M (Eds.), Taylor and Francis, London, pp 157-183 166 Riazuddin S., Husnain T., Khan E., Karim S., Khanum M., Altosaar I (1996), “Transformation of indica rice with Bt pesticidal genes”, In: Rice Gentics III, pp 730-734 167 Robert L (1998), “Flower-specific promoters”, PBI Bulletin, Http://www.pbi.nrc.ca/cgi-bin/bulletin/may98.sh? promoters.html 168 Rose A.B., Beliakoff J.A (2000), “Intron-mediated enhancement of gene expression independent of unique intron sequence and splicing”, Plant Physiology 122, pp 535-542 169 Roush R.T (1994), “Managing pests and their resistance to Bacillus thuringiensis: Can transgenic crops be better than sprays?” Biocontrol Science and Technology 4, pp 501-516 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 162 170 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T (1989), Molecular cloning I, III: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, I (1.21-1.67), III (Appendix A, B) 171 Sanchis V.D., Lereclus G., Menou G., Chaufaux J., Lecadeet M.-M (1988), “Multiplicity of delta-endotoxin genes with different insecticidal specificities in Bacillus thuringiensis aizawai 7.29”, Molecular Microbiology 2, pp 393-404 172 Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R (1977), “DNA sequencing with chain termination inhibitors”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 74, pp 54635467 173 Sardana R., Altosaar I (1996), “Identification and use of specific promoters and synthetic Bacillus thuringiensis toxin genes in rice biotechnology”, In: Rice Genetics III, pp 723729 174 Sardana R., Dukiandjiev S., Giband M., Cheng X., Cowan K., Sauder C., Altosaar I (1996), “Construction and rapid testing of synthetic and modified toxin gene sequences CryIA (b&c) by expression in maize endosperm culture”, Plant Cell Reports 15, pp 677-681 175 Sarma K.S., Sunilkumar G., Balamani V., Veluthambi K (1995), “GUS activity and generation of transformed shoot buds are highly correlated in Agrobacterium- transformed tobacco”, Plant Molecular Biology Reporter 13(3), pp 377382 176 Schledzewski K., Mendel R (1994), “Quantitative transient gene expression: Comparison of the promoters for maize polyubiquitin 1, rice actin 1, maize derived Emu and CaMV LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 163 35S in cells of barley, maize and tobacco”, Transgenic Research 3, pp 249-255 177 Schnepf H.E., Whitely H.R (1981), “Cloning and expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 78, pp 2893-2897 178 Shewry P.S., Lucas J.A (1997), “Plant proteins that confer resistance to pests and pathogens”, Advances in Botanical Research 26, pp 1351-1392 179 Shimamoto K (1991), “Transgenic rice plants”, In: Molecular approachs to crop improvement, Dennis E.S., Llewellyn D.J (Eds.), Springer- Verlag, Wien, NewYork, pp 1-15 180 Smith R.H., Hood E.E.(1995), “Agrobacterium tumefaciens transformation of monocotyledons”, Crop Science 35(2), pp 301-309 181 Stewart C.N., Adang M.J., All J.N., Boerma H.R., Cardineau G., Tucker D., Parrott W.A (1996), “Genetic transformation, recovery, and characterization of fertile soybean transgenic for a synthetic Bacillus thuringiensis cryIA(c) gene”, Plant Physiology 112, pp 121-129 182 Stewart S.D., Adamczyk J.J., Knighten K.S., Davis F.M (2001), “Impact of Bt cottons expressing one or two insecticidal proteins of Bacillus thuringensis Berliner on growth and survival of noctuid (Lepidoptera) larvae”, Journal of Economic Entomology 94(3), pp 752- 760 183 Studier F.W., Rosenberg A.H., Dunn J.J., Dubendorff J.W (1990), “Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes”, Methods in Enzymology 185, pp 60-89 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 164 184 Sudhakar D., Fu X., Stoger E., Williams S., Spence J., Brown D.P., Bharathi M., Gatehouse J.A., Christou P (1998), “Expression and immunolocalisation of the snowdrop lectin, GNA in transgenic rice plants”, Transgenic Research 7, pp 371-378 185 Sutton D.W., Havstad P.K., Kemp J.D (1992), “Synthetic cryIIIA gene from Bacillus thurigiensis improved for high expression in plants”, Transgenic Research 1, pp 228-236 186 Tabashnik B.E (1994), “Evolution of resistance to Bacillus thuringiensis”, Annual Review of Entomology 39, pp 47-79 187 TempÐ J., Goldmann A (1992), “Occurrence and biosynthesis of opine”, Molecular Biology of Plant Tumors, pp 427-449 188 Udayasuriyan Y., Nakamura A., Mori H., Masaki H., Uozumi T (1994), “Cloning of a new cryIA(a) gene from Bacillus thuringiensis strain FU-2-7 and analysis of chimaric CryIA(a) protein for toxicity”, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 58(5), pp 830-835 189 Ulmasov B., Folk W (1995), “Analysis of the role of 5’ and 3’ flanking sequence elements upon in vivo expression of the plant tRNATrp genes”, The Plant Cell 7(10), pp 1723-1734 190 Van Haute E., Joos H., Maes M., Warren G., Van Montagu M., Schell J (1983), “Intergenic transfer and exchange recombination of restriction fragments cloned in pBR322: A novel strategy for the reversed genetics of Ti-plasmids of Agrobacterium tumefaciens”, The EMBO Journal 2, pp 411417 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 165 191 Velten J., Schell J (1985), “Selection-expression plasmid vectors for use in genetic transformation of higher plants”, Nucleic Acids Research 13 (19), pp 6981-6999 192 Vijayachandra K., Palanichelvam K., Veluthambi K (1995), “Rice scutellum induces Agrobacterium tumefaciens vir genes and T-strand generation”, Plant Molecular Biology 29, pp 125-133 193 Voisey C.R., White D.W., Wigley P.J., Chilcott C.N., McGregor P.G., Woodfield D.R (1994), “Release of transgenic white clover plants expressing Bacillus thuringiensis genes: An ecological perspective”, Biocontrol Science and Technology 4, pp 475-481 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 166 194 Walden R., Koncz C., Schell J (1990), “The use of gene vectors in plant molecular biology”, Methods in Molecular and Cellular Biology 1(516), pp 175-194 195 Walden R (1993), “Cell culture, transformation and gene technology”, In: Plant Biochemistry and Molecular Biology, Lea P.J., Leegood R.C (Eds.), pp 276-295 196 Walden R., Wingender R (1995), “Gene - transfer and plant - regeneration techniques”, Trends in Biotechnology 13, pp 324-331 197 Walkerpeach C.R., Velten J (1994), “Agrobacterium mediated gene transfer to plant cells: cointegrate and binary vector systems”, Plant Molecular Biology, Manual B1, pp 1-19 198 Walter F.S., Slatin S.L., Kulesza C.A., English L.H (1993), “Ion channel activity of N-terminal fragments from CryIA(c) delta-endotoxin”, Biochemical and Biophysical Research Communications 196 (2), pp 921-926 199 Wang M.B., Boulter D., Gatehouse J.A (1992), “A complete sequence of the rice sucrose synthase-1 (RSs1) gene”, Plant Molecular Biology 19(5), pp 881-885 200 Wolfersberger (1996), “Site-directed mutations in the third domain of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin CryIAa affect its ability to increase the permeability of Bombyx mori midgut brush border membrane vesicles”, Applied and Environmental Microbiology 62 (1), pp 279-282 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 167 201 Wong E.Y., Hironaka C.M., Fischhoff D.A (1992), “Arabidopsis thaliana small subunit leader and transit peptide enhance expression of Bacillus thuringiensis proteins in transgenic plants”, Plant Molecular Biology 20, pp 81-93 202 Wu R (1998), “Chapter Discovery of transgenic plants”, In: Discoveries in plant biology, Kung S.D., Yang S.F (Eds.), World Scientific Publishing Co., Singapore, New Yersey, London, Hong Kong, pp 115-129 203 Xu D.P., Xue Q.Z., McElroy D., Mawal Y., Hilder V.A., Wu R (1996), “Constitutive expression of a cowpea trypsininhibitor gene, CpTI, in transgenic rice plants confers resistance to major rice insect pests”, Molecular Breeding 2, pp 167-173 204 Yang N.S., Russell D (1990), “Maize sucrose synthase-1 promoter directs phloem cell-specific expression of GUS gene in transgenic tobacco plants”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 87, pp 41444148 205 Yin Y., Chen L., Beachy R (1997), “Promoter elements required for phloem-specific gene expression from the RTBV promoter in rice”, The Plant Journal 12, pp 1179-1188 206 Yu W.P., Wang A.Y., Yuang R.H., Sung H.Y., Su J.C (1992), “ Isolation and sequences of rice sucrose synthase cDNA and genomic DNA”, Plant Molecular Biology 18(1), pp 139-142 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 168 207 Zambryski P., Joos H., Genetello C., Leemans J., Van Montagu M., Schell J (1983), “Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity”, The EMBO Journal 2, pp 2143-2150 208 Zhu J., Oger P.M., Schrammeijer B., Hooykaas P.J., Farrand S.K., Winans S.C (2000), “The bases of crown gall tumorigenesis”, Journal of Bacteriology 182 (14), pp 38853895 209 Zupan J., Zambryski P (1995), “Transfer of T-DNA from Agrobacterium to the plant cell”, Plant Physiology 107, pp 1041-1047 210 Zupan J., Muth T.R., Draper O., Zambryski P (2000), “The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights”, The Plant Journal 23, pp 11-28 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... tế bào E coli Tạo chủng A tumefaciens mang vectơ Ti-plasmit chứa gen kháng côn trùng để chuyển vào trồng Thiết kế vectơ biểu gen kháng côn trùng tế bào E coli Tạo kháng thể kháng protein có... đối tượng trồng nước ta Trên sở ý nghĩa lý luận thực tiễn hướng nghiên cứu này, tiến hành đề tài: ? ?Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào trồng? ??, với... phối ba bố mẹ để tạo chủng A tumefaciens mới, sở chủng LBA4404 EHA105, mang vectơ Ti-plasmit chứa gen kháng côn trùng để chuyển vào trồng Lần điều kiện Vi? ??t Nam đà thành công vi? ??c biểu gen cryIA(c)