CHẨN đoán VI KHUẨN LISTERIA BẰNG kỹ THUẬT GEN

Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene Trường Đại Học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Lớp DH06SH Tiểu luận: CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC GIA CẦM CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LISTERIA BẰNG KỸ THUẬT GEN GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Phạm Ngọc Hà MSSV: 06126033 Phạm Ngọc Hà LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene I ĐẶT VẤN ĐỀ Trong số sáu loại Listeria biết đến Listeria monocytogenes Listeria ivanovii tác nhân gây bệnh Nhưng Listeria ivanovii gây bệnh cho người động vật, trái lại Listeria monocytogenes lại gây bệnh Listeriosis phổ biến người động vật Đây loại bệnh thực nguy hiểm dẫn đến tử vong, đặc biệt người có hệ miễn dịch yếu phụ nữ có thai, trẻ sơ sinh, người già yếu Mặc khác Listeria monocytogenes lại tồn thực phẩm nên dễ lây nhiễm cho người địi hỏi phải có cơng tác kiểm nghiệm thực phẩm khắt khe vi khuẩn Thông thường chuẩn đoán vi khuẩn thường áp dụng kỹ thuật nuôi cấy phân lập số môi trường chuyên biệt xác định vi khuẩn thông qua phản ứng sinh hóa… Nhưng đối tượng thao thác thực phẩm nên sử dụng phương pháp truyền thống khó khăn, tốn thời gian Nhờ mà kỹ thuật gene với ưu điểm trội nhanh, nhạy, xác sử dụng để chuẩn đoán Listeria monocytogenes II TỔNG QUAN: II.1 Đôi nét Listeria: Giống vi khuẩn Listeria thuộc tộc Lactobacilleae gồm trực khuẩn nhỏ, không sinh bào tử, có lơng đầu nên di động, gam dương, có phản ứng catalase dương tính, oxydase âm tính Hiếu khí yếm khí tùy ý có khả lên men đường Giống gồm nhiều loài gây bệnh cho gia súc người, có lồi Listeria monocytogenes lồi gây bệnh sảy thai truyền nhiễm cừu làm tăng số bạch cầu đơn nhân máu nhiều loài động vật bò, ngựa, dê, cừu, heo, chuột, kể người II.1.1 Phân loại: giống Listeria bao gồm loài Listeria monocytogenes L innocua L ivanovii L seeligeri L welshimeri L grayi II.2 Giới thiệu chung Listeria motocytogenes Phạm Ngọc Hà LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene II.2.1 Đồng nghĩa lịch sử Listeria monocytogenes phân lập từ mẫu bệnh phẩm động vật năm 1926 Prior, lúc chưa có đủ đặc tính xác để xác định Cũng năm L monocytogenes khám phá E.G.D Murray, Wenn Swam năm 1926 từ chuột lang thỏ bị viêm gan hoại tử có tên Bacterium monocytogenes.Năm 1927, vi sinh vật Pirie phân lập từ gan bi bệnh chuột nhảy (tatera tobengulae) nam Châu Phi, đặt tên Listeria hepalolytica Khi tồn vi sinh vật xác minh, L monocytogenes thức Bergay đặt tên vào năm 1957 II.2.2 Phân bố cách lây lan L monocytogenes phân bố rộng rãi, có đất, nước, phân, dịch tiết đường sinh dục niêm mạc mũi động vật khỏe…Rau củ nhiễm khuẩn từ đất từ phân bón Súc vật nơng trại nhiễm khuẩn mà khơng có triệu chứng thực phẩm từ động vật thịt, thịt gia cầm sản phẩm sữa bị nhiễm khuẩn Theo Sở giám sát an toàn thực phẩm thuộc Bộ nông nghiệp, trường hợp bệnh Listeriosis Mĩ liên quan đến thực phẩm xúc xích nhỏ xơng khói, thịt hộp tươi ngon, patê lạnh, xúc xích Ý, phát mềm Pháp, mát mềm kiểu Mêhicô, tôm, bơ, rau tươi sữa chưa tiệt trùng Trận dịch bệnh bùng phát liên quan đến sị hến tơm cua, cá tươi, thủy sản xơng khói, lưỡi heo, kem, xà lách gạo, xà lách cải bắp patê thịt Do đó, người có nguy nhiễm khuẩn L monocytogenes cao với loại thực phẩm chưa nấu chín kỹ trước ăn loại thức ăn làm sẵn Bệnh thể nhiều dạng lây truyền vi khuẩn có khác Nếu dạng phủ tạng, lây nhiễm qua đường ăn uống Nếu dạng thần kinh chủ yếu lây nhiễm qua đường mắt mũi II.2.3 Hình thái nhuộm màu L monocytogenes gồm trực khuẩn ngắn, hai đầu trịn, Gram dương Trong mơi trường ni cấy, tế bào cịn non L.monocytogenes tìm thấy dạng trực khuẩn Nhưng trễ dạng hỡnh cu (0,5àmì1-2 àm) li chim u th, ụi vi khuẩn xếp thành chuỗi ngắn(dễ nhầm với Streptococcus), lúc chiêm mao dài 6-20 µm Vi khuẩn khơng sinh bào tử, khơng tạo giáp mơ, có khả di động Ở 20-250C vi khuẩn di động mạnh Ở 370C vi khuẩn di động nhờ chiêm mao đầu Phạm Ngọc Hà LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene Khi nhuộm từ mô bệnh dịch ni cấy, đơi vi khuẩn có dạng hình cầu xếp chuỗi dễ nhầm với Streptococci Trong trường hợp dùng phản ứng Catalase để phân biệt Trong canh 3-6 370C vi khuẩn có dạng trực, ni cấy 3-5 ngày vi khuẩn có dạng dài 6-20 µm hay hơn(đặc biệt chủng R) Sự di động Listeria dùng để phân biệt với Erysipelothrix II.2.4 Đặc tính ni cấy u cầu tăng trưởng Vi khuẩn phát triển điều kiệm yếm khí Nhiệt độ thích hợp 30-370C, pH 7,2-7,4 phát triển mơi trường thường sử dụng môi trường thạch máu điều kiện 5-10% CO2 cho khuẩn lạc trịn bóng, màu trắng, đường kính 0,5-1mm gây dung huyết Trên mơi trường Trytose agar tạo khóm sáng, trắng mờ có màu xanh lam (màu bluegreen) quan sát ánh sáng nghiêng Trên mơi trường LSA (Listeria selective agar) tạo vịng đen quanh khóm phân giải Esculin sau 24-48 Môi trường Gelatin không gây tan chảy II.2.5 Đặc tính sinh hóa Lên men chậm loại đường glucose, rhamnose, salicin, levulose Không lên men mannitol, xylose, lactose, saccarose Phản ứng Catalaza dương tính II.2.6 Sức đề kháng Khi tiến hành phân tích chẩn đốn Listeriosis khảo sát nguồn nhiễm khuẩn thấy vi khuẩn tồn thời gian dài lâu 90 ngày từ ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn xuất triệu chứng Thời gian trung bình từ nhiễm khuẩn vào thể đến phát bệnh khoảng 30 ngày Phạm Ngọc Hà LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene Vi khuẩn bền Nó kháng nhiệt (mặc dầu nhiệt độ khơng cao, 600C), muối, nitrite acid, sống sót điều kiện lạnh đơng chí sinh sôi phát triển chậm chạp tủ lạnh(ở khoảng 40C) Vi khuẩn bị diệt 600C 30 phút 720C 15 giây Vi khuẩn đề kháng với khơ hạn Có thể sống sót thực phẩm đất bị diệt chất sát trùng thông thường Nhay cảm với nhiều loại kháng sinh tetracycline cho kết tốt Người ta kết hợp Trimethoprim với Sulphamethazol điều trị, vi khuẩn kháng lại với Quinolones Erythromycine, ampicillin dùng điều trị bệnh cho người II.2.7 Cấu trúc kháng nguyên độc tố Cấu trúc kháng nguyên L.monocytogenes phức tạp, chia thành 16 serotype dựa kháng nguyên O H Kháng nguyên O: Bền với nhiệt chia thành 14 loại, ký hiệu 1-14 Kháng nguyên H: Không bền với nhiệt, chia làm loại:a, b, c, d Hiện có chủng nguyên nhân gây bệnh có cấu trúc kháng ngun là: 1/2a; 1/2b; 4b SEROTYPE ANTIGENS O(HEAT STABLE) H(HEAT LABILE) 1a I, II, (III) A, B 1b I, II, (III) A, B, C I, II, (III) B, D 3a II, (III), IV A, B 3b II, (III), IV A, B, C 4a (III), (V), VII, IX A, B, C 4b (III), V, VI A, B, C 4ab (III), V, VI, VII, IX A, B, C 4c (III), V, VII A, B, C 4d (III), VI, VIII A, B, C 4e (III), V, VI, VIII, IX) A, B, C Độc tố Vi khuẩn sản sinh men hemolysinase có tính kháng ngun protein Cytolysin có tác dụng diệt tế bào Trên bề mặt tế bào vi khuẩn cịn có lipo-polysaccharid độc thỏ II.2.8 Khả lây bệnh Trong tự nhiên vi khuẩn gây bệnh Listeriosis dạng thần kinh đơi gọi bệnh quay mịng(circling disease) phổ biến động vật nhai lại bị, cừu đặc biệt vào mùa đơng đầu mùa xuân với lứa tuổi Đối với dạng phủ tạng thường gặp động vật dày đơn Bệnh gây sảy thai ngựa Ngoài vi khuẩn gây bệnh cho gia cầm cá Ở người thường gặp sảy thai, thai chết viêm não Ở vài động vật thể gia tăng bạch cầu đơn nhân Trong phịng thí nghiệm: Dùng thỏ chuột lang Chuột nhạy cảm, chết sau tiêm nhiễm 48 với bệnh tích hoại tử gan Dùng test ANTON gây viêm kết mạc mắt Một bệnh L.monocytogenes Phạm Ngọc Hà LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene Viêm màng não mủ, hay viêm màng não nhiễm khuẩn, tượng viêm màng bao bọc quanh hệ thần kinh trung ương (não tủy sống) diện vi khuẩn gây bệnh khoang dịch não tủy Sự viêm nhiễm gây nên tình trạng sinh mủ bên hệ thống thần kinh trung ương Những bệnh nhân suy giảm miễn dịch người già, trẻ sơ sinh, bệnh nhân điều trị thuốc ức chế miễn dịch, AIDS thường có nguy bị bệnh Viêm màng não mủ sơ sinh tác nhân thường nằm bối cảnh nhiễm trùng huyết nặng Các dấu hiệu nghi ngờ lâm sàng là: mẹ thường có sốt, sinh non khơng rõ ngun nhân, thai có tổn thương hạt II.2.9 Cơ chế gây bệnh Từ lâu nhà khoa học phát vi khuẩn Listeria lây lan từ tế bào sang tế bào khác thể người Vi khuẩn lớn lên tế bào di chuyển nhanh chóng tạo thành cấu trúc theo hình ngón tay nhơ từ tế bào đẩy sang tế bào liền kề Khi vi khuẩn tiếp tục gây bệnh cho tế bào liền kề Phạm Ngọc Hà LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene Hamon et al Nature Reviews Microbiology 4, 423–434 (June 2006) | doi:10.1038/nrmicro1413 a | L monocytogenes vào tế bào thể thực bào b | Vi khuẩn bên không bào (Được biết thể thực bào) c,d | Màng không bào bị phá vỡ tiết hai loại phospholipases: PlcA PlcB, and độc tố listeriolysin O Vi khuẩn giải phóng tế bào chất, nơi chúng nhân lên nhiều lần bắt đầu với trùng hợp actin) e | Sự trùng hợp actin cho phép vi khuẩn tạo thành cấu trúc theo hình ngón tay nhơ từ tế bào vào tế bào chất tế bào liền kề f |Trong tế bào bên cạnh, vi khuẩn diện màng kép khơng bào từ chúng khỏi trì chu kỳ Giáo sư Ireton nhóm ơng phát trình thứ hai hỗ trợ việc lây lan vi khuẩn sang tế bào khỏe mạnh mà trước chưa biết đến Phạm Ngọc Hà LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene Quá trình làm suy yếu khả tự vệ khỏi việc nhiễm bệnh tế bào thứ hai xuất lần xuất tuần tạp chí khoa học Nature Cell Biology Vi khuẩn Listeria di chuyển qua tế bào chất tế bào thể người sử dụng phần khung tế bào gọi sợi actin, Vi khuấn Listeria có mày xanh sợi actin màu đỏ Qua ảnh nhận thấy sợi actin hình thành cấu trúc dạng phía sau vi khuẩn Những sợi actin có tác dụng đẩy Vi khuẩn Listeria qua tế bào chất tế bào thể người Những mũi tên ảnh cho thấy vi khuẩn chuyển động tế bào chất (Ảnh: Keith Ireton) Màng tế bào, hay lớp tế bào khỏe mạnh thông thường căng Tình trạng căng kỳ vọng có tác dụng ngăn chặn vi khuẩn không lây lan sang tế bào chưa nhiễm bệnh liền kề Tuy nhiên, phịng thí nghiệm giáo sư Ireton phát loại pro-tê-in vi khuẩn Listeria gọi InIC xuất làm giảm độ căng màng tế bào tế bào nhiễm bệnh, điều làm cho việc di chuyển vi khuẩn để xuyên thủng màng tế bào sau lây lan sang tế bào khỏe mạnh liền kề dễ dàng Phịng thí nghiệm giáo sư Ireton đưa báo cáo cho thấy cách mà InIC làm giảm độ căng ngăn chặn chức protein Tuba thể người Thông thường, chức Tuba tế bào người không nhiễm bệnh tạo độ căng màng tế bào Protein InIC vi khuẩn Listeria khống chế hoạt động Tuba, làm giảm độ căng giúp vi khuẩn lây lan sang tế bào liền kề II.2.10 Miễn dịch Cơ thể thú hình thành miễn dịch sau nhiễm Miễn dịch trung gian tế bào chủ yếu Hiện có hai loại vaccine chết nhược độc đem lại kết Vaccine thường sử dụng: 1a 4b đạt kết phòng bệnh cừu Phạm Ngọc Hà LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene II.2.11 Chẩn đoán phương pháp truyền thống Bệnh phẩm: gan, lách, não, thai bi sảy… Nuôi cấy môi trường LSA Nhuộm Gram Chọn khuẩn lạc Tiêm não thỏ (chết sau 2-3 ngày) Test ANTON Kiểm tra máu thỏ(Bạch cầu đơn nhân tăng 420-820/mm3) Thỏ bị nhiễm Listeria Như biết sử dụng phương pháp thời gian( 10 ngày), đặc biệt cơng tác phịng chống dịch bệnh hay xác định nguyên nhân gây bệnh người dịch bệnh bùng phát Măc khác L monocytogenes dễ nhầm lẫn với Erysipelothrix, để xác đinh xác vi khuẩn phải tiếp tục sử dung phản ứng sinh hóa như: Đặc tính Listeria Erysipelothrix Di dộng Catalase Phân giải Exculin Sản sinh H2S Thạch máu Giết chết bồ câu + + + + - + + II.2.12: Tình hình dịch bệnh Listeriosis Ca bệnh Listeriosis nói đến cách 70 năm, phải đợi đến năm 1980 vi khuẩn L monocytogenes thức xác nhận tác nhân gây bệnh ngộ độc từ thực phẩm Từ tháng đến tháng tám năm 1985, Mỹ có đợt bùng phát khác với 142 ca nhiễm bệnh Listeriosis Vào năm 1990, Bộ Nông nghiệp Mĩ cho biết có trận dịch bệnh từ bánh mì kẹp xúc xích nóng cửa hàng bán thịt ngon dẫn đến 101 người bị bệnh khiến 15 người lớn tử vong thai nhi bị sinh non Năm 1999, loài L monocytogenes đặc biệt cực độc tiến triển báo động viên chức y tế họ buộc nhà sản xuất thực phẩm phải giải vấn đề Phạm Ngọc Hà LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene Năm 2002, đợt bùng phát dịch bệnh Listeriosis nhiều bang Mỹ – bệnh nguy hiểm vi khuẩn Listeria gây -đã xác nhận có 46 ca nhiễm bệnh, ca tử vong ca hỏng bào thai Mặc dù “quy định tạm thời” sản phẩm thịt thịt gia cầm chế biến sẵn phát hành năm 2003 giúp kiểm soát bùng phát vi khuẩn, rõ ràng loại bỏ bệnh hoàn toàn Theo Trung tâm y tế dự phịng CDC, ước tính 2.500 người bị bệnh Listeriosis nặng năm, số có 500 người tử vong Người có nguy cao mắc bệnh sau ăn thực phẩm chí nhiễm vài vi khuẩn Năm 2008 ổ dịch Listeriosis Canada nguyên nhân từ nhà máy Maple Leaf Foods Toronto, Ontario làm hai mươi hai người chết có tổng số 57 trường hợp nhiễm bệnh III CÁC KỸ THUẬT THƯỜNG SỬ DỤNG ĐỂ CHUẨN ĐOÁN L.MONOCYTOGENES III.3.1 Giới thiệu kỹ thuật PCR , Real-Time PCR Multiplex PCR PCR (Polymerase Chain Reaction) phản ứng nhân trình tự DNA quan tâm test tube K. Mullis đã phát minh ra PCR vào năm 1985  Ch  8 năm sau, K. Mullis đã nhân gi i Noben cho phát minh này  Nguyên tắc: PCR kỹ thuật invitro dùng để khuếch đại trình tự DNA dựa nguyên tắc phản ứng sinh hóa nhờ hoạt động enzyme polymerse Phạm Ngọc Hà 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene ADN đích 1 Biến tính (94o C) 2 Bắt cặp (55-65o C) 3 Kéo dài (72o )C) n Nguyên liệu:DNA quan tâm, enzyme tổng hợp DNA chịu nhiệt, đoạn mồi nucleotide, loại dNTP, dung dịch đệm cho phản ứng, Mg2+ Các bước thực hiện: - Giai đoạn 1: biến tính (denateration), nhiệt độ 94-950C 30-60s - Giai đoạn 2: bắt cặp (annealation), nhiệt độ 40-700C - Giai đoạn 3: kéo dài (elongation), nhiệt độ 720C 1-2 phút Qui trình th c hi n xét nghi m PCR  Chu n b  m u, ly trích DNA/RNA  Ly tâm đun nóng     Th c hi n ph n  ng PCR trong máy luân nhi t    Phạm Ngọc Hà 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene Chọn chương trình chu kỳ nhiệt   Phát hi n s n ph m khu ch đ i  Điện di,quan sát chụp ảnh   Một phản ứng PCR bình thường không vượt 40 chu kỳ tốt phản ứng PCR, sản phẩm tạo theo cấp số nhân sở sản phẩm ban đầu nên số chu kỳ khuếch đại lớn làm cho sản phẩm bị sai lệch so với sản phẩm ban đầu Real Time PCR phản ứng PCR mà trình nhân DNA diễn theo chu trình nhiệt theo dõi trực tiếp Thực chất, hệ thống Real Time PCR gồm máy luân nhiệt (PCR) nối với máy quang phổ huỳnh quang máy vi tính Máy vi tính Quang phổ huỳnh quang Máy luân nhiệt Real Time PCR gồm hai trình diễn đồng thời: nhân DNA phản ứng PCR đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành Phạm Ngọc Hà 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene Qui trình th c hi n Real‐ time PCR  Ch n b  m u, ly trích DNA/RNA  Ly tâm đun nóng         Th c hi n ph n  ng PCR và phân tích báo cáo k t qu  trên h  th ng real time PCR  Chọn chương trình real-time PCR iCycler iQ    Các khái niệm: Chu kỳ ngưỡng (Ct)là chu kỳ mà sản phẩm khuếch đại tạo đủ để tín hiệu huỳnh quang phát Melt-curve: đường cong nóng chảy Bằng cách để có tín hiệu Real- Time PCR, để biết phản ứng PCR xảy ra: Phẩm nhuộm chèn vào sợi đôi DNA phát huỳnh quang mạnh khhi trạng thái tự Ethidium bromide –sáng gấp 25 lần SYBR green – sáng 200 lần Probe đặc hiệu có gắn chất phát huỳnh quang phát sang có bắt cặp với trình tự đích.: Beacon, Taqman… Phạm Ngọc Hà 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene SYBR GREEN Là thuốc nhuộm liên kết DNA sử dụng rộng rãi nay,liên kết không đặc hiệu với DNA mạch đôi SYBR Green I phóng thích lượng nhỏ tín hiệu huỳnh quang dung dịch, tín hiệu huỳnh quang tăng gấng 1000 lần liên kết với DNA mạch đơi Như vậy, tín hiệu huỳnh quang tổng từ phản ứng tỷ lệ với lượng DNA mạch đôi diện, gia tăng trình tự mục tiêu khuếch đại Thuốc nhuộm liên kết DNA phản ứng Real-Time PCR Tín hiệu huỳnh quang gia tăng rõ rệt phân tử thuốc nhuộm liên kết với DNA mạch đôi Những ưu điểm khoa học thực tiễn thúc đẩy bạn cố gắng thực phản ứng multiplex, phản ứng khuếch đại nhiều mục tiêu ống phản ứng đơn Hiện nay, ta khuếch đại định lượng nhiều mục tiêu ống phản ứng với ưu điểm là: Giảm lượng mẫu cần thiết ban đầu, điều quan trọng lượng mẫu ban đầu hạn chế Giảm tượng âm tính giả, mẫu đối chứng khuếch đại mẫu Gia tăng số lượng thí nghiệm thực đồng thời giảm tiêu tốn hóa chất phản ứng Giảm đếm mức thấp việc tác động đến mẫu nguy lây nhiễm phòng thí nghiệm III.3.2 Giới thiệu kỹ thuật miễn dịch từ phân tách (Immunomagnetic separation-IMS) Nguyên tắc phương pháp IMS: Các hạt nhựa đồng dạng, siêu thuận từ, phân tán riêng rẽ bao bọc với phối tử đặc hiệu với mục tiêu đặc biệt Ví dụ kháng thể với bề mặt kháng nguyên Phạm Ngọc Hà 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene Các hạt di động gắn với mục tiêu, nhờ từ tính chúng, tạo thành phức hợp mục tiêu-hạt Mục tiêu dễ dàng phân lập từ mẫu sử dụng hạt từ tính tập trung (MPC) Tính linh động: IMS biểu hỗn hợp mẫu cung cấp mẫu thích hợp xử lý trước như: Thực phẩm Nước Phân Máu Đất Tính linh hoạt:IMS sử dụng với nhiều hệ thống xác định Môi trường tế bào PCR ELISA ATP Luminometry(máy đọc huỳnh quang) Microscopy(kính hiển vi) Các bước thực IMS: Chuẩn bị mẫu trước Cho 1ml dung dịch mẫu 20µl hạt từ vào ống ly tâm Ủ 10 phút nhiệt độ phòng Thực phân tách miễn dịch với hạt từ tính tập trung MPC-S Rửa với dung dịch đệm PPS Tween Thu hồi hạt từ 100 µl dung dịch từ Ngồi ta sử dụng AIMS, tất bước tự động ta cần cho mẫu vào cho máy hoạt động III.4 Chuẩn đoán Listeria monocytogenes kỹ thuật gene Các lồi Listeria có gene chung: gene DTH-18 ( Miêu tả Wernars et al), gene listeriolysin O (hly A) iap Gen iap mã hóa cho protein p60, thường gặp tất loài Listeria, gene bảo tồn đặc hiệu cho loài P60 Listeria monocytogenes, cần thiết cho bám chặt sinh vật vào tế bào eukaryotic bảo vệ vi khuẩn Việc xác định diện vi khuẩn Listeria kỹ thuật PCR dựa nhân lên đặc hiệu đoạn gene Phân lập L.monocytogenes từ phô mai: Sử dụng phương pháp Magnetic ImmunoPolymerase Chain Reaction (MIPA), kết hợp IMS PCR Dựa gene DTH-18 listeriolysinO 25g phô mai đồng với 225ml dung dịch tăng sinh Listeria(LEB)-làm giàu mẫu lần => Lấy 0,1ml chuyển qua 10ml canh Fraser (Oxoid) ủ 24 300C – làm giàu mẫu lần 2=>thu nhận tế bào IMS => Lấy 10µl để thực phản ứng PCR Sử dụng primer chọn từ vị trí gen listeriolysin O (gene có phần nhỏ trình tự Streptolysin pneumolysin) Primer 1: 5’-CTAATCAAGACAATAAAATC-3’ Giữa vị trí 536bp 555bp Phạm Ngọc Hà 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene Primer 2: 5’-GTTAGTTCTACATCACCTGA-3’ Giữa vị trí 1037bp 1056bp Hỗn hợp phản ứng PCR 100µl bao gồm 10nM Tris HCl (pH=8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl, 0.001% (Wt/vol) gelatin, 100µM loại dNTP, 0.5µM primer 1.25U Taq polymerase Phản ứng PCR thực 30 chu kỳ, chu kỳ bao gồm bước biến tính 940C/1 phút, bắt cặp 500C/1 phút, kéo dài 720C/1 phút Sản phẩm tạo thành điện di gel agarose 1% nhuộm ethidium bromide lọc Z-probe(Bio-Rad) lai với DNA probe mã hóa cho gene DTH-18 Probe listeriolysin O đánh dấu sử dụng PCR Điều kiện tương tự miêu tả ngoại trừ 100µl thể tích phản ứng chứa 90µM dNTP 10µM digoxigenin-dUTP PCR dựa gene listeriolysin O dùng để xác định kiểu huyết 4a Phạm Ngọc Hà 16 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene Sản phẩm phản ứng khuếch đại PCR từ mẫu phô mai có chứa Listeria monocytogenes sau làm giàu mẫu (A) 1µl mẫu (lane đến lane 4), 2µl mẫu (lane đến lane 11) từ dung dịch làm giàu mẫu (B) kết PCR sau thực miễn dịch từ phân tách(IMS) 100µl mẫu Listeria (lane đến lane 4) Trước làm giàu mẫu, 25g phơ mai phân tích chứa (Bảng A,lane Bảng B, lane 1), 0.4 (Bảng A, lane Bảng B, lane 2), (Bảng A, lane 10 Bảng B, lane 3), 40 ( Bảng A, lane 11 Bảng B, lane 4) CFU/g phô mai Lane không chứa L monocytogenes Sự kiểm tra khẳng định chứa 0,05µg DNA L.monocytogenes tinh khiết (lane 5) Phage lambda DNA Pst I sử dụng làm chất thị phân tử (lane7) Phạm Ngọc Hà 17 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene Sản phẩm phản ứng khuếch đại PCR từ mẫu phô mai làm giàu lần (A) 1µl mẫu (lane đến lane 4), 2µl mẫu (lane đến lane 11) từ dung dịch làm giàu mẫu lần (B) Kết thực PCR sau IMS 100µl mẫu Listeria (lane đến 4) Trước làm giàu mẫu, 25g phơ mai phân tích chứa (Bảng A,lane 11 Bảng B, lane 4), (Bảng A, lane 10 Bảng B, lane 1), 10 (Bảng A, lane Bảng B, lane 2), 100 ( Bảng A, lane Bảng B, lane 3) CFU/g phô mai Lane không chứa L monocytogenes Sự kiểm tra khẳng định chứa 0,05µg DNA L.monocytogenes tinh khiết (lane 5) Phage lambda DNA Pst I sử dụng làm chất thị phân tử (lane7) Tuy nhiên, theo Wernors et al, trình tự 300bp gene DTH-18 khơng xác định L.monocytogenes kiểu huyết 4a-kiểu huyết không thường phát trận dịch bệnh Listeriosis Vậy phương pháp MIPA để xác định L.monocytogenes Xác định L.monocytogenes kỹ thuật lọc, IMS Real-Time PCR Sử dụng hai dịng để nghiên cứu: dịng có độc lực cao có serotype 4b(CCUG 3998) phân lập từ dịch thần kinh tủy sống người dịng có độc lực thấp hơn, phân lập từ cá hồi xông khói Tế bào vi khuẩn phát triển qua đêm canh brain heart infusion(BHI)(Oxoid, London, England) 300C Thu nhận tế bào L.monocytogenes ly tâm 7000vòng/phút Phạm Ngọc Hà 18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene rửa dung dịch phosphate buffer saline(PBS) có chứa 150mM NaCl 10mM Na2SO4 pH=7.2=>Pha loãng 10 lần dung dịch NaCl 0.9% Tế bào đếm trải 100µl đĩa chromogenic Listeria agar( mơi trường hình thành sắc tố)(OCLA, Oxoid, Basingstoke, England) ủ 48 370C Phân lập chọn lọc tập trung L.monocytogenes môi trường tự nhiên sử dụng IMS Trong môi trường BHI với nồng độ L.monocytogenes giảm dần (10^8, 10^7, 10^6, 10^5, 10^4, 10^3, 10^2, 10^1 CFU/ml) thu nhận hạt từ Dynabeads antiListeria (DynalBiotech, Oslo, Norway)(Uyttendaele et al, 2000) 20µl hạt Anti-Listeria thêm vào 1ml dung dịch chứa tế bào vi khuẩn, ủ 10 phút nhiệt độ phịng có khuấy trộn nhẹ Mẫu đặt hỗn hợp hạt từ tập trung(Dynal MPC-M, Dynal Biotech) phút=> rửa giải non-bufferred peptone water (0,1% peptone-0,85%NaCl), không rửa chuyển qua môi trường OCLA để đếm khuẩn lạc L.monocytogenes Hiệu IMS tính bằng so sánh số tế bào chứa sau IMS tổng số tế bào bám vào hạt từ Lọc thực IMS L.monocytogenes cá hồi Chia túi cá hồi xơng khói lấy vào thời điểm khác siêu thị cắt miếng 5g(20-30 miếng/con) Mẫu cá giữ đĩa petri khử trùng trữ -200C sử dụng 200µl L.momocytogenes phát triển qua đêm lậy nhiễm vào miếng cá, mức độ tập trung từ 8×10^0 đến 8×10^5 cfu/mẫu Mẫu đối chứng khơng gây nhiễm thêm vào non-buffer peptone water vô trùng Cả mẫu đối chứng mẫu lây nhiễm L monocytogenes ủ 40C 24 hay ngày để vi khuẩn phát triển bề mặt giữ điều kiện lạnh Sau ủ mẫu cá được(5g) chuyển vào túi lọc màng lọc(Interscience, Bois des Arpents, St Nom, France) đồng với 15ml nonbuffered peptone water phút, lọc qua màng lọc tiêu chuẩn(đường kính lỗ >20µm, dày 100m; Duni, Duni AB Helmstad,Sweden) Thu nhận L.monocytogenes mẫu lọc ước lượng phương pháp đếm đĩa OCLA môi trường BHI agar Sau qua lưới lọc, 2ml phần lọc ly tâm 10000 vòng/ phút 70C Kết thu nhận lại 1ml PBS vô trùng ống ly tâm vô trùng sau thực IMS để thu nhận tế bào vi khuẩn Ly giải tế bào vi khuẩn cho PCR Dịch huyền phù L.monocytogenes môi trường tự nhiên hay lây nhiễm cho cá ly tâm 13000 vòng/phút thu cụm tế bào vi khuẩn=> cho vào 100µl proteinase K trộn với 100µl dung dịch ly giải Tz(Abolmaaty et al, 2000)( 2% TritonX-100 2,5mg/ml sodium ozide 0,1 Tris-HCl buffer pH=8) 100µl saline magnesium sulphate solution(2×TZ 0,85%NaCl, 0,001M MgSO4) ống ly tâm nhỏ 1,5ml Tế bào vi khuẩn ly giải nhiệt ống nấu sôi 20 phút Ống xử lý nhiệt làm mát nhiệt độ phịng ly tâm 10000 vịng/ phút=>50µl dịch tan nguyên chuyển 9,5µl sử dụng làm mẫu PCR Sự định lượng L.monocytogenes với SYBR Green/Real-Time PCR Assay.Gen listeriolysin(hly A) chọn làm mục tiêu để xác định L.monocytogenes Mồi xuôi: 5’-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’ Mồi ngược: 5’-CACTGCATCTCCGTGGTACTAA-3’ Phạm Ngọc Hà 19 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene Được sử dụng để khuếch đại đoạn 113bp gene hly A(Nogva et al,2000) Định lượng Real-Time PCR thực máy luân nhiệt M×3005(Stratagene, La Jolla, CA, USA) 25µl thể tích cuối chứa 9,5µl mẫu DNA, 300mM mồi xuôi mồi ngược(DNA Technology, Arhus, Denmark) v 12,5àl 2ìHigh power SWBR Green PCR Master M(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) PCR bao gồm 45 chu kỳ, chu kỳ có bước biến tính 950C/15 giây,bắt cặp/ kéo dài 600C-60 giây Phân tích melt-curve 55-950C để kiểm tra đặc hiệu phản ứng khuếch đại Tất mẫu kiểm tra lần Đường cong chuẩn xây dựng từ nồng độ pha loãng tế bào vi khuẩn quan sát chu kỳ ngưỡng Ct Xác định phân tích khác lồi Listeria Multiplex PCR Sử dụng gen iap Thiết kế mồi khác để xác định loài Listeria Multiplex PCR sau điện di gel.Xác định mồi đặc hiệu cho loài Listeria mồi đặc hiệu cho L.monocytogenes, L.innocua, L.grayi, nhóm L.ivanovii, L.seeligeri L.welshimeri Các loại mồi sử dụng: Ino 2[5’-ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC-3’] Lis 1B[5’-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3’] Khuếch đại đoạn gene L.innocua dài 870bp Siwi 2[5’-TAACTGAGGTAGCGAGCGAA-3’] Lis 1B[5’-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3’] Khuếch đại đoạn gene nhóm L.ivanovii, L.seeligeri L.welshimeri dài 1,2kb Mono A[5’-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3’] Lis 1B[5’-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3’] Khuếch đại đoạn gene L.monocytogenes dài 660bp Primer Mugrad Lis 1B khuếch đại đoạn gene L.gayi L.murrayi dài 480bp Các loài Listeria khác khơng có sản phẩm Sản phẩm PCR L.monocytogenes với cặp mồi Mono A Lis 1B 30 chu kỳ(950C/15 giây,580C/30 giây, 720C/45 giây) với lane chuẩn Dựa thực Multiplex PCR với primer Ino 2, Lis 1B, Siwi 2, Mugrad, Mono A với tiến trình tương tự cho đoạn có kích thước khac khơng có phản ứng chéo Phạm Ngọc Hà 20 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene Xác đinh phân biệt loài Listeria dựa Multiplex PCR chứa primers MugraI, MonoA, Ino2, and Siwi2, and Lis1B (Lis-Mix) Thực phản ứng 30 chu kỳ (biến tính 95°C/15 giây, bắt cặp 58°C/30 giây, kéo dài 720C/45 giây) với lane chuẩn VI: Kết luận Càng ngày có nhiều nguy gây hại cho sức khỏe người vật nuôi, Listeriosis nguy nguy hiểm đáng quan tâm nguyên nhân xảy diện khắp nơi đặc biệt thức ăn người Sử dụng phương pháp truyền thống để nhận biết tồn Listeria đòi hỏi phải thực phản ứng sinh hóa lên men đường, CAMP…trong phịng thí nghiệm tiến trình cần thời gian tối thiểu ngày theo International Dairy Federation (IDF) tiêu chuẩn 143:1995 Điều không đáp ứng yêu cầu chẩn đoán bệnh bộc phát dịch bệnh Với đời cải tiến bước kỹ thuật PCR phương pháp nhanh, nhạy, xác để xác định vi khuẩn Listeria nói chung L.monocytogenes nói riêng Mặt khác hiệu PCR tăng lên nhiều lần sử dụng kết hợp với phương pháp IMS Thêm vào cải tiến PCR ta có Multiplex PCR phương pháp cho phép ta phân biệt rõ ràng lồi Listeria, cho dù có L.monocytogenes tác nhân gây bệnh thực nguy hiểm thực tế tồn lồi khơng nhiều có liên quan đến diện loài Listeria khác V Tài liệu tham khảo Http://www.khoahoc.vn.com Tô Minh Châu- Trần Thị Bích Liên(2001) Vi khuẩn nấm gây bệnh thú y Http://www.nature.com http://scholar.google.com.vn http://www.khoahoc.net/baivo/nguyenthuongchanh/130907-vikhuanlisteria.htm http://en.wikipedia.org/wiki http://www.pasteur-hcm.org.vn/tinchitiet.jsp?ma_bv=146 http://www.springerlink.com/content/100229/ William Burrows, Robert Murdoch Lewert, John Willarel Rippon(1968) Fex book of microbiology- The pathogenic Microorganisms Phạm Ngọc Hà 21 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com .. .Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene I ĐẶT VẤN ĐỀ Trong số sáu loại Listeria biết đến Listeria monocytogenes Listeria ivanovii tác nhân gây bệnh Nhưng Listeria ivanovii... vi? ?m kết mạc mắt Một bệnh L.monocytogenes Phạm Ngọc Hà LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene Vi? ?m màng não mủ, hay vi? ?m... trợ vi? ??c lây lan vi khuẩn sang tế bào khỏe mạnh mà trước chưa biết đến Phạm Ngọc Hà LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán vi khuẩn Listeria monocytogens kỹ thuật gene