MỘT số kỹ THUẬT CHẨN đoán VI KHUẨN LEPTOSPIRA

Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ mơn Cơng nghệ sinh học Lớp DH06SH Bài tiểu luận: MỘT SỐ KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LEPTOSPIRA Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: MSSV: Nguyễn Ngọc Hải Lý Sơn Tùng 06126178 Thành phố Hồ Chí M Trang LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải LỜI MỞ ĐẦU Vi sinh vật tác nhân nhiều nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu không trước đây, mà cịn tương lai Điều có lẽ ba lí do: thứ đa dạng vi sinh vật, thứ hai lợi ích to lớn mà chúng mang lại cho người nhiều lĩnh vực, cuối chúng tác nhân gây nhiều bệnh nguy hiểm cho người vật nuôi Từ xưa người biết sử dụng vi sinh vật việc lên men để tạo nhiều ăn có giá trị dinh dưỡng cao, sau phát triển chúng nhiều lĩnh vực khác phân vi sinh, probiotic, xử lí chất thải,… Những ứng dụng to lớn vi sinh vật phủ nhận, nhiên, khả gây bệnh vi sinh vật vấn đề đáng quan tâm Các tác nhân gây bệnh vi khuẩn, virus hay kí sinh trùng,… Virus có lẽ tác nhân nguy hiểm tác nhân để lại hậu định công tác chăn nuôi sức khỏe người Nhiều kỹ thuật đời, phát triển khơng ngừng hồn thiện để đáp ứng u cầu chẩn đốn phát nhóm vi sinh vật gây bệnh Trong lĩnh vực chăn nuôi, nhà khoa học ý đến loại xoắn khuẩn Leptospira Xoắn khuẩn có khả gây bệnh động vật lây sang người Bệnh xoắn khuẩn gây gọi bệnh vàng da, gây ảnh hưởng đến quan gây sẩy thai thú ni Cách phịng bệnh tiêu hủy ổ dịch để tránh lây nhiễm Vì vậy, cần có kỹ thuật để phát nhanh xoắn khuẩn để tránh lây lan gây thiệt hại lớn Trước đây, cách phát Leptospira sử dụng phương pháp ni cấy, sau kỹ thuật Microscopic agglutination test (MAT) đời sử dụng rộng rãi chẩn đốn bệnh Tiếp theo đó, khoa học phát triển, kỹ thuật đời hy vọng khắc phục nhược điểm MAT thay Hai kỹ thuật nhắc đến nhiều ELISA khuếch đại gene PCR Bài tiểu luận giới thiệu qua bệnh xoắn khuẩn Leptospira kỹ thuật nuôi cấy, MAT, ELISA PCR việc chẩn đoán Leptospira Trang LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải TỔNG QUAN I Leptospira Phân loại học Theo Noguchi, 1917: Giới: Monera Ngành: Spirochaetes Họ: Leptospiraceae Giống: Leptospira Các lồi gồm có: L alexanderi, L biflexa, L broomii, L borgpetersenii, L fainei, L inadai, L interrogans, L kirschneri, L licerasiae, L meyeri, L weilii, L noguchii, L santarosai, L wolbachii, L kmetyi, L wolffii, L genomospecies 1, L genomospecies 3, L genomospecies 4, L genomospecies Trong số đó, người ta phân thành lồi gây bệnh, khơng gây bệnh loài trung gian Các loài gây bệnh Leptospira interrogans Leptospira kirschneri Leptospira noguchii Leptospira alexanderi Leptospira weilii Leptospira genomospecies Leptospira borgpetersenii Leptospira santarosai Leptospira kmetyi Các loài trung gian Leptospira inadai Leptospira fainei Leptospira broomii Leptospira licerasiae Leptospira wolffii Các lồi khơng gây bệnh Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachii Leptospira genomospecies Leptospira genomospecies Leptospira genomospecies Trang LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Đặc điểm sinh vật học Hình thể: mảnh, đường kính 0,1- 0,2µm, dài 5- 25µm, di động mạnh Thường nhuộm theo phương pháp nhuộm thấm bạc Fontana-Tribondeau phát vi khuẩn, vi khuẩn nhìn thấy mảnh sợi tóc, hai đầu cong móc câu Dưới kính hiển vi điện tử phóng đại khoảng x 10.000 lần thấy vòng xoắn nhỏ, sát Tính chất ni cấy: xoắn khuẩn ni cấy điều kiện hiếu khí Thường ni mơi trường lỏng có thêm huyết động vật (thỏ) tươi (sản xuất theo Terskich Korthoff); pH 7.2- 7.5; nhiệt độ 28-300C giàu oxy Leptospira mọc chậm, sau 6- 10 ngày phát triển tốt (đặc điểm nuôi cấy làm vẩn nhẹ môi trường khói thuốc lá) Sức đề kháng: nói chung Leptospira có sức đề kháng yếu, song cao xoắn khuẩn khác; chết nhanh mơi trường acid Leptospira sống tự đất, nước môi trường mặn (sống hàng tháng) có ánh sáng mặt trời nhanh chết Cấu tạo kháng nguyên: dựa vào cấu trúc kháng nguyên mà phân loại Leptospira chia làm 20 nhóm, nhóm có nhiều type huyết Ở Việt Nam thường gặp 12 type huyết sau: L australis L ictero- haemorrhagiae L canicola L ponoma L autumnalis L mitis L grippothyphosa L saxkoebing L bataviae L poi L hebdomalis L sejroe Khả gây bệnh Leptospira gây bệnh xoắn khuẩn, gọi Leptospirosis Xoắn khuẩn có loại động vật (chuột, lợn, chó, sói, nhím) Súc vật thường khơng có triệu chứng bệnh Người bị lây trực tiếp qua da bị xây xát, qua niêm mạc mắt mũi miệng, phận sinh dục tiếp xúc Người bị lây gián tiếp qua mơi trường (đất cát, nước, rau ) bị nhiễm xoắn khuẩn nước tiểu súc vật thải Đặc điểm chung bệnh: có thương tổn gan hay thận có biến chứng mắt, gây sẩy thai động vật người Trang LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Bệnh phổ biến khắp giới, có nhiều vùng khí hậu nóng ẩm, đất kiềm có nhiều mặt nước Các bệnh lí: 1) Bệnh lí bị thường L pomona L grippotyphosa Đã thấy nhiều vật có kháng thể đặc hiệu khơng phát bệnh lâm sàng 2) Bệnh lí chó L icterohaemorrhagiae Chuột mơi giới truyền bệnh; lây từ chó sang chó 3) Bệnh lí lợn L pomona, L mitis L icterohaemorrhagiae Bệnh lợn thường tiềm ẩn, phát thể giảm nhẹ 4) Bệnh lí ngựa L grippotyphosa, L pomona, L canicola 5) Bệnh lí người nhiều type L icterohaemorrhagiae, L grippotyphosa, L canicola, L pomona gây (bệnh L pomona tip Leptospira phổ biến lợn gây ra) Ổ chứa bệnh thường xuyên loài gậm nhấm (như chuột), chúng đào thải Leptospira Ổ chứa bệnh không thường xuyên gia súc, trâu bò, ngựa,… Về lâm sàng, thấy biến loạn nặng màng não, gan, thận, sốt cao Leptospira vào thể gây bệnh diễn biến qua giai đoạn: - Giai đoạn I: sốt cao đột ngột sau thời gian ủ bệnh 1-2 tuần, máu có nhiều vi khuẩn, sốt thường kéo dài từ đến ngày - Giai đoạn II: sốt trở lại quan, gan thận bị tổn thương (biểu lâm sàng vàng da, xuất albumin niệu); có hội chứng màng não thần kinh trung ương bị tổn thương; mao mạch dãn (có thể xuất huyết) đau Xoắn khuẩn nằm lại thận đào thải theo nước tiểu Cơ chế sinh bệnh: Sau xâm nhiễm, Leptospira máu nhân lên mạnh mẽ gây bại huyết sau chúng đến định vị quan ưa thích, gan, thận Leptospira giai đoạn bại huyết đến quan sinh dục gây xáo trộn sinh sản Đặc điểm bệnh Leptospirosis động vật người Chuột môi giới truyền bệnh cho lồi động vật khác người, đặc biệt chuột lang Ngồi nhiễm nguồn nước thức ăn a Bệnh Leptospirose chó (thường xảy chó đực) (21) Dạng cấp tính: Bại huyết phát triển nhanh sau vài nhiễm, sốt cao 40-410C suy nhược nặng Có thể chia làm thể: Trang LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải - Thể thương hàn: biểu xuất huyết trầm trọng viêm kết mạc mắt với nhũng điểm xuất huyết da niêm mạc, ói máu phân sậm màu có máu, thú bị nước nhanh chết 24 ngày với giảm thấp thân nhiệt, thường thấp bình thường - Thể hồng đản : Chó bệnh có biểu viêm kết mạc mắt, hồng đản, vàng da khó thở tăng dần với ăn, ói mửa, không chữa trị giai đoạn cuối chó có tăng cao nhiệt độ khó thở, thở hôi Tiêu chảy xuất huyết biểu viêm não trước hắt hơi, thú chết khoảng 5-8 ngày mắc bệnh Hình Chó bị tiêu chảy máu Thể bán cấp tính mãn tính: - Thể tương ứng với phát triển hội chứng sinh urea huyết hậu viêm thận mà biểu chứng tiểu nhiều, chứng khát nước nhiều với ói mửa tiêu chảy Sau thời gian hôn mê urea huyết chó chết - Thể thở khó có mùi urea miệng xáo trộn hô hấp –viêm màng móng mắt, viêm cơ… b Bệnh lợn nghệ (24) Thể lâm sàng: biểu triệu chứng lâm sàng thấy xét nghiệm huyết học phổ biến, có bị đàn lợn vỗ béo lợn hậu bị Thể cấp tính: lúc đầu lợn bỏ ăn, nằm chỗ, sốt 40 – 40,5oC, ỉa chảy khơng có triệu chứng vàng da hay đái máu Sau xuất triệu chứng điển hình nặng vàng da, đái máu, xuất huyết triệu chứng thần kinh quỵ nửa thân sau, viêm màng não, phù đầu nặng, tỷ lệ chết cao Thể rối loạn sinh sản cho thấy lợn bị sẩy thai, hay chết lưu thai, tỷ lệ sơ sinh chết cao với sốt, sữa vàng da lợn nái Sẩy thai sau nhiễm vi khuẩn – ngày c Bệnh bò (20) Thể cấp tính: Bị thường yếu sốt 40 – 410C, uể oải, biếng ăn, sản lượng sữa giảm đột ngột thường có xuất huyết niêm mạc Lơng thú xù xì khơng bóng mượt, mắt lờ đờ, mệt Niêm mạc, da vàng sẩm tiểu huyết sắc tố Trong vài trường hợp có viêm khớp viêm da hoại tử có viêm não, sảy thai bò Thể nhẹ: Sốt khoảng 39 – 400C, giảm sản lượng sữa, biếng ăn, vàng da, niêm mạc, nhịp tim tăng, nước tiểu màu Ở mi mắt, mơi, hàm… có tượng phù thủng Con dễ bị xảy thai sau nhiễm khoảng tháng Nếu khơng chăm sóc tốt thú chết tượng thiếu máu Thể mãn tính: thường xảy ra, thấy triệu chứng, triệu chứng hay gặp ỉa chảy, nước tiểu vàng hay sẫm, gây sẩy thai thú đẻ yếu ớt, đẻ non gây khơng thụ thai Trang LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Nơi chứa nhiều vi khuẩn thận đường sinh dục (của đực cái) Thú bệnh thể mãn thành mang trùng suốt đời, trùng qa nước tiểu, dịch âm đạo d Bệnh người Thông tư liên y tế, lao động – thương binh xã hội, tổng liên đoàn lao động Việt Nam số 29/TT-LB (25/12/1991) xếp bệnh Leptospira nghề nghiệp gây bảo hiểm (18) Những công việc gây bệnh: - Cơng việc hầm mỏ, hầm hào, hang hố, cống rãnh - Công việc lò sát sinh, đặc biệt người giết, mổ súc vật - Công việc nhà máy sản xuất thịt, cá hộp, chế biến sữa phomát - Công việc phải tiếp xúc với súc vật như: chăn nuôi, thú y - Công việc nhà máy sản xuất bia, rượu - Công việc hàng thịt, hàng cá - Công việc vùng đầm lầy, suối, ruộng, ao hồ - Công việc ngành lâm nghiệp: đào mương, kênh, làm thuỷ lợi Các nguồn lây bệnh cho người (19) Về lâm sàng, bệnh chia thành thể (23): Thể vàng da xuất huyết: Đây thể nặng với biểu hiện: sốt dao động, da sung huyết, mắt đỏ ngầu, đau nặng (chủ yếu bắp co bóp) Có ban xuất huyết thưa lưng ngực (vào ngày thứ hay thứ 7), thiếu máu huyết tán Vàng da niêm mạc Một số người bị sưng đau gan Đa số người tiểu hay vơ niệu Có thể có biến chứng: viêm màng não dịch, suy thận cấp, xuất huyết đường tiêu hóa hô hấp, viêm tim, rối loạn ý thức , bị sảy thai Tỷ lệ tử vong thể cao từ – 10% Trang LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Thể không vàng da: Là thể nhẹ với biểu hiện: sốt dao động, da sung huyết, mắt đỏ ngầu, đau nặng (chủ yếu bắp chân, co bóp) Một số người có hạch sưng, đau, khơng nóng đỏ Hội chứng vàng da hội chứng gan khơng rõ Thể khơng có tử vong Phòng chữa bệnh Leptospira (19) Phòng bệnh: Phịng bệnh khơng đặc hiệu cách cắt đứt dây chuyền dịch tễ diệt chuột, phòng bệnh cho gia súc chủ yếu phòng hộ lao động cho đối tượng thường phải tiếp xúc với nguồn lây, đối tượng nguy công nhân làm việc trại gia súc, công nhân vệ sinh cầu cống, làm việc hầm mỏ, Nói chung, để có hiệu cần triển khai nhiều khâu với phối hợp đa ngành chức được; Phòng bệnh đặc hiệu vaccin chết, song cho đối tượng phải tiếp xúc với nguồn lây Vấn đề phòng bệnh dựa nguyên tắc an toàn vệ sinh lao động biện pháp đơn giản mang giày cổ cao lội ruộng, bùn sình Mang thêm găng tay phải dùng đến tay để thao tác Diệt chuột, vệ sinh chất thải loại thú nuôi Không sử dụng nước tắm gội vùng nghi ô nhiễm Leptospira Chữa bệnh: Sử dụng kháng sinh đặc trị để điều trị Leptospira Kháng sinh cần điều trị sớm, kháng sinh nhạy cảm với vi khuẩn liều lượng II Các kỹ thuật phát Leptospira Ni cấy Leptospira a Quy trình thực Lấy mẫu: Tuỳ theo thời kỳ giai đoạn bệnh mà có cách lấy bệnh phẩm chẩn đốn thích hợp: • Giai đoạn I: lấy máu đem nuôi cấy tiêm truyền vào chuột lang, sau xác định định danh vi khuẩn • Giai đoạn II: Có thể lấy nước tiểu bệnh nhân, ly tâm, tiêm vào phúc mạc chuột lang non lấy máu tim chuột nuôi cấy tìm vi khuẩn Ni cấy (2, 11): • Mơi trường: môi trường Ellinghausen, McCullough, Johnson, and Harris – EMJH có bổ sung 3% huyết thỏ 0.1% agarose ống 5ml Trang LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải • Tiêm vào ống mơi trường ni cấy Leptospira: ống nhận giọt whole blood (máu không bị biến đổi ngoại trừ bổ sung chất chống đông tụ anticoagulant), cịn ống giọt • Một mẫu xét nghiệm huyết cho phép việc khảo sát huyết học chống lại kháng thể Leptospira • Chú ý không làm lạnh mẫu xét nghiệm Mẫu xét nghiệm phải thực vận chuyển xung quanh nhiệt độ khoảng 130C Giữ mẫu qua đêm 20C giết chết Leptospira • Nếu mơi trường ni cấy giữ lạnh cần ủ môi trường nhiệt độ phịng trước sử dụng • Mẫu xét nghiệm tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng (tia cực tím phá hủy mơ) b Kết Một thí nghiệm nhằm tối ưu hóa việc nuôi cấy Leptospira sử dụng bốn loại phương pháp lấy mẫu khác Đó là: whole blood, surface plasma (huyết tương bề mặt), deposit from spun plasma clotted blood (máu ngưng đọng lại) (2) Kết thí nghiệm cho bảng sau (2): Kết nuôi cấy Leptospira Leptospira Research Laboratory (26) Kết cho thấy sử dụng whole blood cho tỉ lệ phát cao (81.3%) Tuy nhiên, Leptospira máu thường tồn 7-15 ngày nên việc lấy mẫu máu tốt cho nuôi cấy vào khoảng ngày thứ nhiễm bệnh Trang LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lý Sơn Tùng c GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Nhận xét Ưu điểm: thường sử dụng công tác nghiên cứu bệnh học phịng thí nghiệm Nhược điểm: • Mất thời gian (khoảng 20 – 30 ngày để nhận kết dương tính) • Độ nhạy thấp, khả thành công không cao nuôi cấy Sau ngày nhiễm bệnh thứ 14, thu khuẩn lạc • Có thể gây nhiễm cho người thí nghiệm • Thường không sử dụng xét nghiệm bệnh Kỹ thuật Microscopic agglutination test (MAT) Được mô tả Galton et al (1965) sửa đổi Cole et al (1973) Kỹ thuật MAT phép kiểm tra chứng minh chấp nhận việc chuẩn đoán, phát kháng thể Leptospira huyết động vật người Hiện nay, kỹ thuật sử dụng thơng dụng chuẩn đốn bệnh Leptospirosis Nguyên tắc chung: Sự ngưng kết đọc trực tiếp kính hiển vi tối (3) a Quy trình thực (được cho Cole et al – 1973)(4) • Thiết bị chuẩn độ (microtiter equipment) gồm: đĩa vi chuẩn độ (microtitration plate), đĩa truyền (transfer plates), khay đựng đĩa truyền (transfer plate holder), nắp khay đựng (transfer plate lids), đĩa đỡ (base plate), dụng cụ làm loãng mẫu độ xác đến 0.025 ml, vật kính • Kháng nguyên Leptospira sống (chứa 108 Leptospires/ml) nuôi cấy – ngày môi trường nuôi cấy thích hợp Hình ảnh dụng cụ kỹ thuật MAT (3) Trang 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Hình ảnh đĩa đỡ chứa đĩa truyền vật kính kính hiển vi (3) • Mẫu huyết lấy từ gia súc pha loãng ban đầu (1/25) với phosphate buffer saline (PBS) pH 7.2 đĩa vi chuẩn độ tạo thành dịch pha lỗng huyết • Khoảng 25µl PBS đặt vào giếng đĩa lượng dịch pha loãng huyết đồng cho vào hàng (qui ước hàng A) đĩa • Dịch pha lỗng huyết (1/50) pha loãng dần (2 lần) từ hàng A n hng H ca a ã Sau ú, 25àl khỏng nguyên sống thêm vào giếng • Đĩa lắc nhẹ 15 – 20s để trộn thành phần, che lại nắp đậy để tránh vật lạ ngăn bay Sau ủ đĩa nhiệt độ 320C – 370C • Kết đọc từ đĩa truyền giọt từ giếng vật kính kính hiển vi − Phương pháp thơng dụng (Cole et al – 1973): Dịch pha loãng huyết hỗn hợp kháng nguyên/ huyết đĩa chuẩn độ truyền chuyển lên vật kính pipette (3) − Phương pháp cải tiến (Philip L Carter Terence J Ryan – 1975): Đặt đĩa truyền, đĩa chứa mẫu, vật kính lên đĩa đỡ Các giọt mẫu chảy xuyên qua đĩa truyền lên vật kính Sau đó, vật kính lấy khỏi đĩa đỡ, tránh làm nghiêng khiến giọt hòa vào (3) • Đọc kết kính hiển vi (X200), khô, với tụ sáng tối (4) b Kết Kết dương tính 50% kháng nguyên hay có phản ứng ngưng kết Điểm cuối chuẩn độ xác định giếng cuối mà 50% kháng nguyên hay có phản ứng ngưng kết quan sát thấy (4) Sự ngưng kết phương pháp thông thường phương pháp cải tiến thu (3) Phương pháp cải tiến đề nghị sử dụng thay phương pháp thông dụng (1975) sử dụng phương pháp khơng có mẫu chảy qua lỗ đĩa chuyển Trong đó, sử dụng pipette thường có rị rỉ mẫu khơng hút tồn dịch mẫu (3) Trang 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Darkfield microscopy of leptospiral microscopic agglutination test (This image is in the public domain and thus free of any copyright restrictions Courtesy of the Centers for Disease Control/Mrs M Gatton) (27) c Nhận xét Đây kỹ thuật sử dụng từ lâu việc chẩn đốn Leptospira Nó dụng rộng rãi nhiều nước (theo Thiermann Garrett, 1983; Ellis, 1986), đặc biệt phịng thí nghiệm Ưu điểm: • • • Đơn giản Tiết kiệm thời gian so với ni cấy tế bào Thích hợp cho kiểm tra bệnh nhóm đàn gia súc (ít 30 10% số đàn lớn) với nhiều lứa tuổi khác Nhược điểm: • • • • Vẫn nhiều thời gian Cần lượng mẫu lớn Không phân biệt độ chuẩn sau tiêm vaccin độ chuẩn sau nhiễm trùng tự nhiên chuẩn độ lượng giống Có thể cảy phản ứng chéo nhóm huyết giống Ví dụ: nhiễm trùng L balcanica (Mackintosh et al., 1981) L medanensis tạo phản ứng L hardjo dương tính giả Kỹ thuật indirect Enzyme-Linked-Immunosorbent Serologic Assay (ELISA gián tiếp) Đây kỹ thuật kiến nghị thay cho phương pháp MAT Ngồi chẩn đốn thơng thường, cịn thực test nhanh để phát Leptospira Nguyên tắc chung (1): kháng nguyên biết gắn lên giá thể, dung dịch mẫu chuẩn đối chứng cho vào giếng, ủ điều kiện nhiệt độ thời gian xác định (tùy theo KIT nhà sản xuất), sau mẫu ủ rửa cho tác dụng với kháng kháng thể có gắn enzyme, lại ủ mẫu điều kiện nhiệt độ thời gian định, rửa mẫu cuối chất tương ứng với enzyme cho vào mẫu Phản ứng enzyme chất tương ứng xảy Trang 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải tạo màu cường độ màu tỉ lệ thuận với lượng kháng thể có mẫu đặc hiệu với kháng nguyên biết a Quy trình thực Có nhiều kỹ thuật ELISA khác sử dụng chẩn đoán Leptospira Đây quy trình thực đưa WJ Terpstra et al (1980) El Jalii et al (2002) (4) • • • • • • • • • • • • Phản ứng ELISA thực đĩa vi chuẩn (đĩa ELISA) thường gồm 96 giếng đồng Kháng nguyên sử dụng ELISA kháng nguyên đặc trưng cho lồi (lipopolysaccharide) thu từ ni cấy Leptospira đun sôi (đã giết chết Leptospira) Chuẩn bị đối chứng mẫu huyết biết dương tính (lấy từ gia súc người bị bệnh) âm tính (lấy từ ngân hàng máu) Chuẩn bị mẫu huyết từ động vật hay người nghi nhiễm Đầu tiên ta phủ lớp khoảng 100µl kháng nguyên (đã pha loãng khoảng 1/1600 chất đệm (buffer) carbonate/bicarbonate pH 9.6) vào giếng, sau đem ủ 40C qua đêm (cũng tiến hành 370C giờ) Sau tiến hành rửa lần với buffer rửa có chứa 0.05% Tween 20 PBS pH 7.0 Tiếp theo, thêm vào giếng 100µl BSA/PBS để ngăn kết dính khơng đặc hiệu, tiến hành ủ 370C Sau rửa lần đĩa ELISA, 100µl dung dịch mẫu chẩn đốn đối chứng chuẩn bị thêm vào giếng, ủ 370C Rửa đĩa lần, thêm vào 100µl kháng kháng thể có gắn enzyme (thường peroxidase) vào giếng Enzyme gắn với IgG hay IgM PBS Tween 20, sau ủ 370C Rửa đĩa lần, thêm vào 100µl dung dịch vào giếng (theo thí nghiệm 2,2azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) hydrogen peroxide chất đệm citrate pH 4.0) Tiến hành ủ tối nhiệt độ phòng 10 phút Kết đọc nhờ máy đo quang phổ bước sóng 405nm b Kết ELISA cho kết dương tính mật độ quang (OD) đọc mẫu cao mật độ quang đọc đối chứng âm cộng với sai số (4) Cũng dựa vào tỉ số S/P (Sample value related to Positive Control value) để đọc kết quả: S/P = Kết quả: (10) - Trang Âm tính: huyết ≤ 0.05, sữa ≤ 0.03 Nghi ngờ: 0.05 < huyết ≤ 0.12, 0.03 < sữa ≤ 0.10 Dương tính: huyết > 0.12, sữa > 0.10 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Phản ứng xảy tạo màu (26) Hiện nay, chuẩn đoán bệnh Leptospirosis, người ta thường sử dụng kỹ thuật IgM hay IgG ELISA, kỹ thuật dot – ELISA với KIT (Ví dụ: KIT Panbio Ustralia sử dụng cho kỹ thuật ELISA Dip – S – TickTM (dot – ELISA)) thiết kế phù hợp ELISA sử dụng KIT ứng dụng chẩn đoán nhanh bệnh Leptospirosis Sau bảng kết so sánh ELISA dot-ELISA sử dụng KIT Panbio (7): c Nhận xét Ưu điểm: • • • • • Phương pháp bán tự động, dễ thực dễ theo dõi kết Có thể sử dụng KIT để chuẩn đốn nhanh, lúc thực nhiều test KIT Có khả phát sớm phương pháp nêu trước Độ nhạy, độ đặc hiệu cao (theo bảng trên), độ xác tương đối cao Sử dụng kháng nguyên giết nên không gây nhiễm cho người q trình thao tác Nhược điểm: • • Cần thời gian để kháng thể xuất Có cần thực xét nghiệm lần liên tiếp Sử dụng IgM ELISA cần xét nghiệm lần (1) • Có thể xảy tượng âm tính giả hay dương tính giả (1) Kỹ thuật Polymerase chain reaction (PCR) Kỹ thuật khuếch đại gene (PCR) Kary Mullis (giải Nobel năm 1993) phát minh năm 1980 Kỹ thuật xem kỹ thuật phịng thí nghiệm đơn giản (1) Trang 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Nguyên tắc chung (1): thực dựa sở đặc điểm hồi tính, biến tính kéo dài chuỗi DNA điều kiện nhiệt độ chất xúc tác thích hợp • • • Giai đoạn 1: biến tính chuỗi DNA nhiệt độ 950C phút Giai đoạn 2: nhân gene với khoảng 20 – 30 chu kì Giai đoạn 3: hồn thành 720C – 10 phút Mỗi chu kì gồm bước: biến tính DNA (950C 30 giây đến phút), bắt cặp đoạn mồi với DNA khuôn mẫu (30 – 650C 30 – 45 giây), kéo dài chuỗi DNA (65 – 720C – phút) • • • • • • a Quy trình thực Tách chiết DNA: thường từ tế bào mô thận, máu hay nước tiểu động vật người PCR thực với cặp primer (mồi) thiết kế đặc biệt cho việc phát DNA Leptospira Hỗn hợp phản ứng bao gồm Tris-HCl, loại deoxynucleoside triphosphates (dNTP), primers, DNA mẫu với MgCl DNA polymerase (Taq polymerase) Thời gian thực PCR Leptospira thường 35 chu kì Tổng thời gian chạy PCR thường khoảng 30 phút Sản phẩm PCR thu đem diện di gel agarose Đọc kết điện di b Kết Dưới số hình ảnh kết điện di sản phẩm PCR: Kết PCR từ mẫu nước tiểu heo (13): L.pomoma L.grippothiphosa L.ballum E.coli B melitensis S aureus L patoc S abortus ovis M bovis 10 L infantum K-no DNA tamplate M-thang 100bp Trang 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Kết PCR từ mẫu nước tiểu người (14): L interrogans (đối chứng dương) 14 Markers phân tử đánh dấu DIG đến 10 Mẫu nước tiểu từ người bệnh 11 đến 13 Mẫu nước tiểu người khỏe mạnh Kết PCR từ mẫu từ khỉ (23): Thang DNA 100pb Nước tiểu Thận Thận (1:10) Đối chứng dương Đối chứng âm c Nhận xét Kết PCR từ tinh dịch bò (15): Marker pGem Đối chứng từ bị khơng nhiễm Đối chứng từ bò tiền nhiễm Nhiễm ngày thứ Nhiễm ngày thứ 10 Nhiễm ngày thứ 14 Nhiễm ngày thứ 21 Nhiễm ngày thứ 28 Nhiễm ngày thứ 35 10 Nhiễm ngày thứ 42 Hiện nay, phương pháp PCR ứng dụng nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm, giải mã di truyền, nghiên cứu tiến hóa sinh vật mức độ phân tử,… Kỹ thuật PCR ứng dụng test nhanh bệnh Leptospirosis Nhiều KIT sản xuất để phục vụ tốt cho kỹ thuật (Ví dụ: Fast DNA Kit từ Q BIO GENE (13)) Trang 16 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Ưu điểm: • Đơn giản, nhanh, nhạy, đặc hiệu • Chi phí thấp Nhược điểm: • Có thể xảy tượng dương tính giả III So sánh kỹ thuật Bệnh Leptospirosis có ảnh hưởng nguy hiểm đến người vật ni, nhiều người quan tâm đến Nhiều nghiên cứu thực nhằm tìm phương pháp tốt cho việc chẩn đoán xoắn khuẩn Leptospires Các kỹ thuật thông dụng kỹ thuật MAT, ELISA PCR Kỹ thuật MAT đưa ra, áp dụng từ 1965 dùng ngày Kỹ thuật ELISA PCR đời sau MAT có ưu điểm định việc chẩn đốn nhanh Leptospira Hai kỹ thuật ược nghiên cứu nhằm phát triển hoàn chỉnh để thay cho MAT Giữa ELISA MAT, thí nghiệm thực I.M El Jalii (2008) 170 mẫu huyết bò cho kết sau (4): − 27.7% mẫu dương tính với MAT, với ELISA 56.5% − Tất mẫu dương tính với MAT dương tính với ELISA − Khơng có mẫu dương tính MAT mà âm tính với ELISA 28.8% dương tính với ELISA âm tính với MAT Như kỹ thuật ELISA nhạy phát nhóm huyết Leptospira gây bệnh nhiều kỹ thuật MAT Thí nghiệm cơng bố năm 1998 Eliete C Romero ctv (8) (mẫu từ dịch não tủy cerebrospinal fluid (CSF) 103 bệnh nhân) so sánh ba kỹ thuật với nhau, cho kết sau: Trang 17 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Như độ nhạy PCR cao hẳn kỹ thuật khác, nhiên số mẫu cho kết âm tính chúng có kết dương tính hai kỹ thuật cịn lại Cũng thí nghiệm này, kỹ thuật PCR kết hợp thêm với lai phân tử (Hybridization) để làm tăng độ nhạy phát kỹ thuật PCR (8) Tóm lại, kỹ thuật PCR nhạy nhiều so với kỹ thuật MAT ELISA, thuận lợi việc chẩn đoán nhanh Leptospira, nhiên MAT, ELISA ni cấy tế bào có vai trị quan trọng nghiên cứu phịng thí nghiệm Trang 18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải KẾT LUẬN Như trình bày trên, Leptospira loại xoắn khuẩn gây bệnh gọi Leptospirosis (hay bệnh vàng da) Nguồn lây bệnh cho người vật nuôi chủ yếu chuột, thường tiếp xúc với đất cát nguồn nước có xoắn khuẩn Cách phịng bệnh tiêu hủy vật ni mang bệnh sử dụng kháng sinh thích hợp để chữa bệnh Các kỹ thuật chẩn đoán Leptospira đưa tiểu luận gồm có ni cấy, MAT, ELISA PCR Cả bốn kỹ thuật có ưu nhược điểm Nhưng nhìn chung, kỹ thuật PCR có nhiều ưu việt ba kỹ thuật cịn lại Kỹ thuật nuôi cấy nhiều thời gian việc phát lại có tầm quan trọng nghiên cứu bệnh học Leptospira Kỹ thuật MAT sử dụng rộng rãi từ lâu với độ nhạy cao khơng cho phép việc chẩn đốn nhanh Kỹ thuật ELISA PCR cho phép chẩn đoán nhanh bệnh Leptospirosis có độ nhạy cao hẳn so với MAT Trong bốn kỹ thuật ni cấy, MAT, ELISA xác định mẫu dương tính mẫu lấy từ sau ngày 14 trình nhiễm Chỉ có kỹ thuật PCR cho kết tương mẫu Tuy nhiên, ưu điểm vượt trội PCR có nhược điểm tượng dương tính giả Để khắc phục điều sử dụng kỹ thuật PCR cải tiến phát triển Về so sánh kỹ thuật PCR cho kết tốt nhanh Trang 19 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải TÀI LIỆU THAM KHẢO Công nghệ sinh học thú y – Nguyễn Ngọc Hải, nhà xuất nông nghiệp Optimization of Culture of Leptospira from Humans with Leptospirosis - Vanaporn Wuthiekanun ctv, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, tháng 4/2007, trang 1363 –1365 New Microtechnique for the Leptospiral Microscopic Agglutination Test - Philip L Carter Terence J Ryan, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, tháng 8/1975, trang 474 – 477 Comparison between ELISA and the Microscopic Agglutination Test for the Diagnosis of Bovine Leptospirosis - I.M El Jalii, Revue Élev Méd vét Pays trop., 2008, số 61(2) trang 73-75 Bayesian inference for within-herd prevalence of Leptospira interrogans serovar Hardjo using bulk milk antibody testing - FRASER I LEWIS, GEORGE J GUNN, Biostatistics Advance Access tháng 7/2009, trang – 10 ELISA for the detection of Human Leptospirosis – Ana Fuentes ctv, Mem Inst Oswaldo Cruz, tháng 9/1994, số 89, trang 365 Leptospirosis: diagnose with confidence – Panbio diagnostics, www.panbio.com Detection of Leptospira DNA in Patients with Aseptic Meningitis by PCR - ELIETE C ROMERO, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, tháng 5/1998, trang 1453–1455 Two Test Strategy for the Diagnosis of Leptospirosis - Vaishali B Dohe ctv, Bombay Hospital Journal, Vol 51,(2009) 10 Linnodee Leptospira Hardjo ELISA – LINNODEE, www.linnodee.com 11 Handbook for the Collection, Storage and Transport of Pathology Specimens in Rural and Remote Queensland – Queensland Health, tháng 12/2007, mục 9.9 trang 38 – 39 12 Pcr detection of Leptospira DNA in rodents and insectivores from Tanzania - G.F Mgode ctv, Belg J Zool, tháng 12/2005, 135 (phần bổ sung) : 17-19 13 Polymerase chain reaction method for leptospirosis, analysis on samples from an autochthon swine population in Sicily, Italy - Dr Maria Vitale ctv, REV CUBANA MED TROP (2005), số 57(1): 25-27 14 Detection of Leptospires in Urine by PCR for Early Diagnosis of Leptospirosis A.E.Bal ctv, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, tháng 8/1994, trang 1894-1898 15 A Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of Leptospira spp in Bovine Semen - Saad A Masri ctv, Can J Vet Res (1997), số 61, trang 15-20 16 Application of Polymerase Chain Reaction Assay in detection of Leptospira icterohaemorrhagiae in experimentally infected mice – O Sharina ctv, Journal of animal and veterinary Advances (2007), trang 1197 – 1198 17 The development of a real-time PCR to detect pathogenic Leptospira species in kidney tissue - C Fearnley ctv, Research in Veterinary Science 85 (2008), trang 8–16 www.sciencedirect.com 18 THÔNG T Ư C Ủ A L I Ê N B Ộ Y T Ế , B Ộ L A O Đ Ộ N G - T H Ư Ơ N G B I N H V À X Ã HỘI, TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM SỐ 29/TT-LB NGÀY 25 THÁNG 12 NĂM 1991 BỔ SUNG MỘT SỐ BỆNH NGHỀ NGHIỆP 19 CN Nguyễn Thị Liên Hạnh, Ths.Bs Huỳnh Hồng Quang (Tổng hợp) - http://www.impeqn.org.vn/impe-qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1066&ID=2240 tháng 12/2008 Trang 20 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải 20 http://www.anova.com.vn/contents/article.asp?id=301&detail=16&ucat=43 21 http://www.anova.com.vn/contents/article.asp?id=315&detail=16&ucat=45 22 Leptospira spp detection by Polymerase Chain Reaction (PCR) in clinical samples of captive black-capped Capuchin monkey (Cebus apella) - Eliana Scarcelli, Brazilian Journal of Microbiology, tháng 6/2003 23 http://bsgdvn.com/y-hoc/benh-truyen-nhiem/1349-bnh-do-leptospira-va-cach-dungthuc.html 24 Báo NNVN - Số ngày 12/3/2009 25 Two Methods for Rapid Serological Diagnosis of Acute Leptospirosis - Paul N Levett ctv, Clin Diagn Lab Immunol, tháng 3/2001, số 8(2), trang 349–351 26 http://leptolab.ut.ac.ir/en.htm Leptospira Research Laboratory 27 http://open-site.org/viewedit.cgi?cat=&edit_id=68748 Trang web www.google.com.vn với từ khóa: Leptospira, Leptospirosis, ELISA Leptospira, PCR Leptospira, Microscopic agglutination test, Leptospira blood culture để tìm số hình ảnh báo có liên quan Trang 21 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải PHỤ LỤC Trang LỜI MỞ ĐẦU TỔNG QUAN I Leptospira Phân loại học Đặc điểm sinh vật học Khả gây bệnh Đặc điểm bệnh Leptospira động vật người Phòng chữa bệnh Leptospira II Các kỹ thuật phát Leptospira Nuôi cấy Kỹ thuật Microscopic agglutination test (MAT) 11 Kỹ thuật indirect Enzyme-Linked-Immunosorbent Serologic Assay (ELISA gián tiếp) 13 Kỹ thuật Polymerase chain reaction (PCR) 15 III So sánh kỹ thuật 18 KẾT LUẬN 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO 21 Chú thích: tài liệu tham khảo đánh số thích sau phần trích dẫn Trang 22 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... bệnh Các kỹ thuật chẩn đoán Leptospira đưa tiểu luận gồm có ni cấy, MAT, ELISA PCR Cả bốn kỹ thuật có ưu nhược điểm Nhưng nhìn chung, kỹ thuật PCR có nhiều ưu vi? ??t ba kỹ thuật cịn lại Kỹ thuật ni... thuật thông dụng kỹ thuật MAT, ELISA PCR Kỹ thuật MAT đưa ra, áp dụng từ 1965 dùng ngày Kỹ thuật ELISA PCR đời sau MAT có ưu điểm định vi? ??c chẩn đoán nhanh Leptospira Hai kỹ thuật ược nghiên... tính hai kỹ thuật cịn lại Cũng thí nghiệm này, kỹ thuật PCR kết hợp thêm với lai phân tử (Hybridization) để làm tăng độ nhạy phát kỹ thuật PCR (8) Tóm lại, kỹ thuật PCR nhạy nhiều so với kỹ thuật