Chuẩn đoán vi khuẩn e coli nhóm SIEC bằng kỹ thuật gen

Sinh viên : Lương Thế Thịnh MSSV : 05126112 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com I ĐẶT VẤN ĐỀ Vi sinh vật nói chung vi khuẩn nói riêng giữ vai trò quan trọng hệ sinh thái Chúng tồn khắp nơi thể sinh vật khác Đa số loài vi khuẩn có lợi ứng dụng sản xuất chế phẩm phục vụ cho vật nuôi người Một số lại nguyên nhân gây bệnh Điều thúc đẩy kỹ thuật chẩn đoán vi khuẩn đời Thông thường chẩn đoán vi khuẩn thường áp dụng kỹ thuật nuôi cấy phân lập số môi trường chuyên biệt xác định vi khuẩn thông qua phản ứng sinh hóa… Quy trình chẩn đoán xét nghiệm có ưu điểm đơn giản lại không đảm bảo tính xác kết không cho thấy mối liên hệ mặt di truyền, biến chủng vi khuẩn theo thời gian Các kỹ thuật sinh học phân tử, kỹ thuật gen, kỹ thuật chẩn đoán dựa cấu trúc gen vi khuẩn kỹ thuật PCR, Real-time PCR, PCR-RFLP… với ưu điểm trội nhanh, nhạy, xác thay tốt cho phương pháp chẩn đoán cổ điển trường hợp xảy ổ dịch, loại vi khuẩn khó nuôi cấy chẩn đoán vi khuẩn lao, Leptospira… vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm Salmonella, E Coli nhóm STEC LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com II TỔNG QUAN II.1 Trực khuẩn Escherichia coli: Escherichia coli loại trực khuẩn sống thường xuyên ruột người số động vật Eschrich phát từ năm 1885 Chúng chiếm tới 80% vi khuẩn hiếu khí sống ruột Bình thường chúng không gây bệnh, thể suy yếu số chủng có khả gây bệnh Vi khuẩn E Coli thuộc họ trực trùng đường ruột (Enterobacteriacae) Ở ruột chúng sống đối kháng với số vi khuẩn khác Salmonella Shigella (Thương hàn lỵ) nhờ có khả tạo loại chất ức chế có tên Colixin Chúng có khả tổng hợp số vitamin thuộc nhóm B, E K Vì không gây bệnh chúng có lợi cho đường ruột nhờ hạn chế số vi khuẩn gây bệnh khác, giữ cân sinh thái ruột sinh tổng hợp sốvitamin E Coli thải môi trường theo phân, chiếm tới 80% vi khuẩn hiếu khí ruột giữ cân sinh thái nên E Coli chọn làm vi sinh vật thị ô nhiễm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com II.1.1 Đặc điểm sinh học E Coli: a) Đặc điểm hình thái & cấu tạo: E Coli có hình que, hai đầu tròn, kích thước dài ngắn khác nhau, thường từ – micromet x 0,5 micromet Thường đứng riêng rẽ tế bào, có ghép đôi một, có kết với thành đám chuỗi ngắn Thường có tiêm mao mọc khắp bề mặt,có khả di động Không có khả hình thành bào tử, có khả hình thành giáp mạc (vỏ nhày) gặp môi trường dinh dưỡng tốt Nhuộm gram âm b) Tính chất nuôi cấy: Dễ nuôi cấy, pH thích hợp – 7,2, nhiệt độ thích hợp 37oC E Coli có phản ứng đỏ Methyl dương tính E Coli có khả sinh Indol c) Sức đề kháng: E Coli dễ bị tiêu diệt thuốc sát trùng thông thường, sức đề kháng yếu E Coli thường bị tiêu diệt nhiệt độ 60oC 30 phút Dễ bị tiêu diệt thuốc sát trùng thông thường LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com II.1.2 Khả gây bệnh: Bình thường E Coli sống ruột người không gây bệnh Khi thể suy yếu số chủng trở nên gây bệnh E Coli gây bệnh đường ruột tiêu chảy, kiết lỵ mà gây số bệnh khác viêm đường tiết niệu, viêm gan, viêm phế quản, viêm màng phổi, v…v… Độc tố E Coli thuộc loại nội độc tố, có khả chịu nhiệt Đặc biệt có số chủng đột biến có khả sinh ngoại độc tố, có khả tác động lên tế bào thần kinh Cái tên EHEC áp dụng Vi khuẩn Verotoxigenic E Coli (VTEC), có liên quan đến bệnh viêm thành ruột kết người Verotoxin độc tố E Coli gây chết tế bào Vero Những độc tố gần giống với độc tố Shiga, tạo từ Shigella dysenteriae, chúng gọi độc tố giống Shiga (Shiga-like toxin) Độc tố Verotoxin chứa nhóm: VT-1 (Shiga-like toxin I [SLT-I]) VT-2 (Shiga-like toxin II [SLT-II]) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Yếu tố độc lực nhóm STEC bao gồm enzyme haemolysin phá hủy hồng cầu (gen Hly), yếu tố kết bám Intimin (gen eae), độc tố SLT-I hay VT1 stx1 (gen stx1), độc tố SLT-II hay VT2 stx2 (gen stx2), độc tố SLTIie hay VT2e stx2e (gen stx2e)… loại độc tố STEC có tính chất sinh học tương đối giống nhau, có khả phá hủy tế bào Vero việc phân biệt chúng không đơn giản, đòi hỏi phương tiện chẩn đoán đại: Nuôi cấy tế bào ELISA xác định độc tố stx; PCR, lai xác định gen eae, VT1, VT2…; RFLP, PFGE phân biệt kiểu gen… II.1.3 Các phương pháp chẩn đoán E Coli: Cũng giống vi khuẩn Salmonella, phân loại chẩn đoán vi khuẩn E Coli theo type kháng nguyên phức tạp,dựa theo loại kháng nguyên bề mặt là: Kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông roi H kháng nguyên capsul K Trong phân lập vi khuẩn STEC, người ta thường sử dụng môi trường sorbito-MacConkey agar (SMAC) môi trường SMAC bổ sung cefixime potassium tellurite (CT-SMAC) Tuy nhiên việc phân lập vi khuẩn môi trường cho phép phát chủ yếu vi khuẩn STEC thuộc serotype O157, không STEC không thuộc serotype O17 có tính chất lên men đường sorbitol biến đổi Kết phân lập STEC môi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com trường SMAC CT-SMAC phù hợp từ 30-80% kết chẩn đoán độc tố stx môi trường tế bào Vero Xét tính chất sinh hóa, vi khuẩn O157:H7 STEC phần lớn không sản sinh enzyme β-D-glucuronidase, dùng tính chất để sơ đánh giá nhiễm O157:H7 STEC Có thể chẩn đoán E Coli O157 kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp với việc sử dụng kháng thể đa dòng kháng O157 gắn fluorescein isothiocyanate với thời gian xét nghiệm cần khoảng Kỹ thuật ELISA trực tiếp cho phép phát vi khuẩn E Coli O157 mẫu với thời gian ngắn, vòng Tuy kỹ thuật: Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp ELISA trực tiếp có độ nhạy tương đương với việc phân lập môi trường SMAC CT-SMAC cần phải khẳng định diện độc tố stx mẫu Điều thực qua kỹ thuật PCR-RFLP LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com II.2 Phương pháp: II.2.1 Nhận diện STEC (VTEC) kỹ thuật PCR: a) Xử lý mẫu: Mẫu phân lọc nước xử lý với phosphate-buffered saline (PBS) kiểm tra độ loãng để đảm bảo hoạt tính độc tố có tác dụng lớp đơn tế bào Vero b) Quá trình thực hiện: ™ Primers Qua việc xác định gen độc lực nhóm STEC (gen stx), người ta nhận diện chúng Kỹ thuật sử dụng cặp mồi tương ứng khuyếch đại cho gen VT-1 VT-2: ) Theo báo cáo Karam Ramotar cộng năm1995: VT-1 Primer VT-2 Primer Trong đó: GAAGAGTCCGTGGGATTACG AGCGATGCAGCTATTAATAA TTAACCACACCCACGGCAGT GCTCTGGATGCATCTCTGGT VT-1 Primers dùng khuyếch đại 130 cặp Nu (Từ Nu 1191 – 1320 gen VT-1) VT-2 Primers dùng khuyếch đại 346 cặp Nu (Từ Nu 426 – 771 cuûa gen VT-2) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ) Theo báo cáo L Mansouri-Najand M Khalili năm 2007: ™ Vật liệu: Hỗn hợp thực PCR chứa: -5 μl Buffer - 50 mM KCL - 0,01 % gelatin - 10 mM Tris-HCL (pH 8.3) - 2,5 mM MgCl2 - 0,2 mM loại dNTP - 0,001 mM loại Primers - μl ADN khuôn - Phản ứng PCR bắt đầu với 2.5 U Tag polymerase LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ™ Phản ứng: - Khởi đầu biến tính ADN 95oC phút - 40 chu kì sau diễn với chu trình nhiệt: 94oC phuùt, 55oC phuùt, 72oC phút - Chu kì cuối giữ 72 oC phút Sản phẩm khuyếch đại từ phản ứng PCR sau điện di gel Agarose 2% nhuộm với Ethidium bromide LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com II.2.2 Ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP chẩn đoán vi khuẩn E.Coli nhóm STEC (Shiga-like toxin Escherichia coli): Sản phẩm khuếch đại phản ứng PCR sử dụng để dùng kỹ thuật RFLP để xác định chủng nhóm STEC Kỹ thuật RFLP tiến hành sở sử dụng enzyme cắt khác kết hợp với trình tự ADN cắt khác (trình tự ADN khác sản phẩm phản ứng PCR trước đó) Kết thu nhận sản phẩm cắt khác (mang tính đa hình) Và cho phép phân biệt cá thể với Thông thường kỹ thuật PCR để chẩn đoán vi khuẩn nhóm STEC người ta sử dụng cặp mồi xác định gen stx1 stx2, nhiên để chẩn đoán số vi khuẩn đặc biệt thuộc nhóm STEC người ta sử dụng thêm cặp mồi cho phép xác định gen eae, stx2e … biến thể chúng Những dịng E Coli tìm thấy tạo độc tố verotoxin (VT) Shiga-like toxin (SLT) Có loại riêng biệt: VT-1 (SLT-1), VT-2 (SLT-2), Vte (là biến thể VT-2: SLT-IIv) Dòng E Coli O91:H21 nghiên cứu sản xuất độc tố Sau giải trình tự dịng hóa dịng vi khuẩn này, ta xác định gen riêng biệt mã hóa cho độc tố đặc tính tương tự VT-2 Gen thứ gọi vtx2ha mã hóa cho độc tố VT2v-a, gen thứ hai gọi vtx2hb mã hóa cho độc tố VT2v-b 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ™ Cách thực hiện: Chẩn đốn gen tiểu phần B biến thể Verotoxin loại (VT2v-b): B1: Chọn dòng vi khuẩn bảng sau: 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com B2: Thực phản ứng PCR trình bày thêm số cặp mồi: Trong đó: VT2-c & VT2-d primers đặc trưng cho VT2 biến thể VT2; VT2v-1 & VT2v-2 primers đặc trưng cho biết thể VT2 B3: Sử dụng Enzyme cắt giới hạn: Đối với chủng O157 dùng RE: XbaI, AvrII, SpeI 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com B4: Điện di: Những trình tự ADN khuyếch đại sau phản ứng PCR sau cắt enzyme cắt giới hạn tạo nhiều trình tự ADN nhỏ đặc trưng cho loại xác định qua phương pháp điện di gel agarose 2% RFLP sản phẩm PCR chẩn đoán gen VT2 (stx2) (A) Dùng enzyme cắt HaeIII (B) Dùng enzyme cắt RsaI (C) Dùng enzyme cắt Nci a: Thang chuaånI b, c, d, e, f, g: chủng E.Coli 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com B5: Nhuộm bạc theo phương pháp Sambrook cộng thu nhận kết ™ Ưu điểm kỹ thuật PCR-RFLP: - Do tính chất chuyên biệt cao enzyme cắt nên kỹ thuật cho phép xác định tương đồng khác biệt nhỏ dòng vi khuẩn virus - Có thể xác định nguồn gốc bệnh ổ dịch không phạm vi vùng mà toàn giới - Có thể kết hợp với kỹ thuật lai chẩn đoán tác nhân gây bệnh ™ Khuyết điểm: - Kỹ thuật không cho phép phân biệt chủng vi sinh vật biến đổi gen chúng xảy vị trí cắt đặc hiệu 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com III KẾT LUẬN: Chẩn đoán vi khuẩn E.Coli nhóm STEC kỹ thuật PCR-RFLP thông qua gen độc tố chủng Xác định biến thể độc tố vi khuẩn nhóm STEC 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com IV TÀI LIỆU THAM KHẢO Công nghệ Sinh học thú y (Nguyễn Ngọc Hải) Giáo trình Vi sinh vật học môi trường (Trần Cẩm Vân) Identification of Verotoxin Type Variant B Subunit gens in E.Coli by PCR and RFLP (S.D Styler vaø cộng - Tập 29, số 7) Direct Detection of Verotoxin-Producing Escherichia coli in Stool Samples by PCR (KaRam Ramotar cộng – Tập 33, số 3) Typing of Bovine Attaching and Effacing Escherichia coli by Multiplex in vitro amplification of Virulence-Associated genes (Bernard China et al – Taäp 62, soá 9)  http://www.scribd.com/doc/17465542/Phan-loi-vi-sinh-bng-Sinh-Hc-Phan-T  http://www.ncbi.nlm.nih.gov 16 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com I ĐẶT VẤN ĐỀ II TỔNG QUAN II.1 Trực khuẩn Escherichia coli E Coli II.1.1 Đặc điểm sinh học E Coli .4 II.1.2 Khả gây bệnh II.1.3 Các phương pháp chẩn đoán E Coli II.2 Phương pháp II.2.1 Nhận diện STEC (VTEC) kỹ thuật PCR .8 II.2.2 Ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP chẩn đoán vi khuẩn E.Coli nhoùm STEC (Shiga-like toxin Escherichia coli) 11 III KẾT LUẬN IV TÀI LIỆU THAM KHẢO 17 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... pháp II.2.1 Nhận diện STEC (VTEC) kỹ thuật PCR .8 II.2.2 Ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP chẩn đoán vi khuẩn E. Coli nhóm STEC (Shiga-like toxin Escherichia coli) 11 III KẾT LUẬN IV TÀI... bào ELISA xác định độc tố stx; PCR, lai xác định gen eae, VT1, VT2…; RFLP, PFGE phân biệt kiểu gen? ?? II.1.3 Các phương pháp chẩn đoán E Coli: Cũng giống vi khuẩn Salmonella, phân loại chẩn đoán vi. .. lực nhóm STEC bao gồm enzyme haemolysin phá hủy hồng cầu (gen Hly), yếu tố kết bám Intimin (gen eae), độc tố SLT-I hay VT1 stx1 (gen stx1), độc tố SLT-II hay VT2 stx2 (gen stx2), độc tố SLTIie