Chuẩn đoán vi khuẩn pasteurella multocida bằng kỹ thuật gen

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuẩn đốn vi khuẩn Pasteurella multocida kỹ thuật gen Giáo viên phụ trách: TS Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Nguyễn Trung Tuyến MSSV: 06126179 Khoa: Công Nghệ Sinh Học -1- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com I ĐẶT VẤN ĐỀ Sinh học phân tử môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật mức độ phân tử Phạm vi nghiên cứu mơn có phần trùng lặp với ngành khác sinh học đặc biệt di truyền học hóa sinh Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác hệ thống cấu trúc khác tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại trình tổng hợp DNA, RNA protein tìm hiểu cách thức điều hòa mối tương tác Sinh học phân tử mơn khoa học cịn non trẻ có nhiều bước tiến vượt bậc tác động toàn diện đến nhiều ngành khoa học, đến sản xuất đời sống Ngành kinh tế chăn nuôi gặp nhiều nguy đe dọa q trình phát triển Trong đó, dịch bệnh ảnh hưởng lớn lợi nhuận, trình sản xuất, tình hình chăn ni gia cầm giới Vì vậy, việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào việc chẩn đoán, điều trị bệnh vật nuôi tất yếu Ngày 02 tháng 10 năm 2009 -2- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com II TỔNG QUAN II.1 Bệnh tụ huyết trùng Tụ huyết trùng bệnh nhiễm khuẩn có độc lực cao gia súc gia cầm, vi khuẩn Pasteurella multocida gây Bệnh chủ yếu gây nhiễm khuẩn huyết Vi khuẩn cơng vào quan tiêu hố, hạch quan hô hấp Bệnh lưu hành địa phương, thành dịch lớn trâu, bò, dê, cừu, thỏ, gia cầm Bệnh gia cầm gọi hoắc loạn gà Bệnh trâu, bò, lợn gọi nhiễm khuẩn huyết xuất huyết Bệnh trâu gọi bacbon (barbone) Bệnh thường xảy thời tiết thay đổi, thường phát vào mùa nóng ẩm vùng ẩm thấp, thể thú nuôi giảm sức đề kháng, bệnh thường lây qua đường hơ hấp, tiêu hố, vết thương ngồi da tiếp xúc với nguồn bệnh II.2 Vài nét lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng II.2.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng giới Năm 1875, Bollinger người phát bệnh tụ huyết trùng bò Đức Năm 1879, Tousain phát hiên bệnh tụ huyết trùng gà Gà bị bệnh vi khuẩn Pasteurell amultocida -3- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Năm 1880, Louis Pasteur, nhà vi trùng học người Pháp phát vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng gà (Fowl cholera) Năm 1881, Gaffky phát bệnh thỏ đặt tên bệnh bại huyết (Septicaemia disease) Năm 1886, Loeffer phát bệnh lợn Hueppe, nhà giải phẫu bệnh lý học người Đức phát thấy tương đồng triệu chứng, bệnh tích gà, bị thỏ mắc bệnh tụ huyết trùng Năm 1887, Oroste Armani phát bệnh trâu đặt tên Barbone Bò chết bệnh tụ huyết trùng Trevissan đề nghị đặt tên chung cho nhóm vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng Pasteurella để tưởng nhớ đến nhà bác học Louis Pasteur, người phát bệnh tụ huyết trùng gà Từ người ta vào đặc tính sinh bệnh loài vất, chia Pasteurella thành loài khác nhau: Pasteurella gây bệnh cho bò là: P boviseptica Pasteurella gây bệnh cho trâu là: P bubaliseptica Pasteurella gây bệnh cho lợn là: P suiseptica Pasteurella gây bệnh cho gia cầm là: P aviseptica Năm 1939, Rosenbusch Merchant đề nghị đặt tên chung cho vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng Pasteurella multocida để thể khả gây bệnh cho nhiều loài vật vi khuẩn -4- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Vi khuẩn Pasteurella multocida kính hiển vi II.2.2 Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng Viêt Nam Ở Việt Nam, bệnh tụ huyết trùng trâu, bò phát lần năm 1798 Từ đó, bệnh thấy khắp vùng nước Năm 1994, Dương Thế Long đánh giá hiệu biện pháp phòng trị bệnh tụ huyết trùng Sơn La giai đoạn 1990-1993, khảng định: tiêm phòng bệnh tụ huyết trùng biện pháp hiệu quả, kinh tế quan trọng hàng đầu Tiêm phòng bệnh tụ huyết trùng biện pháp hiệu quả, kinh tế quan trọng hàng đầu Năm 1995, Nguyễn Ngã nghiên cứu tính kháng nguyên độc lực vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò khu vực miền trung nhằm chọn giống vi khuẩn -5- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com địa phương thích hợp có khả kết hợp với giống vi khuẩn nước ngồi để chế tạo vắc-xin có hiệu lực cao Năm 1996, Hoàng Đạo Phấn nghiên cứu tác động thực khuẩn thể đặc hiệu khuẩn Pasteurella multocida phân lập từ gia súc gia cầm Năm 1996, Nguyễn Thu Thiên Nguyễn Ngã phân lập xác định type huyết Pasteurella multocida trâu bị ni miền trung Việt Nam Năm 2000, Đinh Duy Kháng Lê Văn Phan ứng dụng kỹ thuật PCR để định type vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập miền trung Việt Nam HB1, HB2 HS1, HS2 hai cặp mồi dung để xác định Pasteurella multocida gây bại huyết, xuất huyết II.3 Vi khuẩn Pasteurella multocida II.3.1 Đặc tính sinh vật học vi khuẩn Pasteurella multocida Vi khuẩn Pasteurella nằm Eubacteriales, thuộc họ Parvobacteriaceae, thuộc giống Pasteurella chia làm ba lồi, có lồi gây bại huyết, xuất huyết cho gia súc, gia cầm là: Passteurella multocida Pasteurella haemolytica II.3.2 Đặc tính hình thái vi khuẩn Pasteurella multocida Pasteurella multocida cầu trực khuẩn nhỏ, có kích thức 0,25 -0,4 × 0,4 -1,5 μm Vi khuẩn có giáp mơ, khơng sinh nha bào, khơng lơng, không di động Trong canh khuẩn thường thấy vi khuẩn hình trứng, hình cầu, đứng riêng lẻ thành chuỗi ngắn Trong canh khuẩn già, vi khuẩn suy yếu, biến dạng, thay đổi hình thái hình gậy, dùi cui, đấm, kích thước lớn bình thường, có dài 2-3 μm hay Vi khuẩn Pasteurella multocida -6- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com II.3.3 Tính bắt màu vi khuẩn Pasteurella multocida Pasteurella multocida bắt màu Gram âm với thuốc nhuộm gram, vi khuẩn thường dễ bắt màu với thuốc nhuộm aniline, tốt Methylen blue, đỏ Fucsin, thấy dùng phương pháp nhuộm Giemsa Wright Các chủng có hình thành giáp mơ dùng phương pháp nhuộm Hiss Zilnelson Trong thể gia súc mắc bệnh (máu phủ tạng) môi trường nuôi cấy, vi khuẩn Pasteurella nhuộm màu có tượng bắt màu sẫm hai đầu, cịn khơng bắt màu bắt màu nhạt so với hai đầu, nên người ta gọi Pasteurella vi khuẩn lưỡng cực Năm 1919, Manninger giải thích tính lưỡng cực vi khuẩn tế bào vi khuẩn giai đoạn phân chia, vi khuẩn tăng lên kích thước, độc lực nguyên sinh chất, nguyên sinh chất dung giải dồn hai đầu tế bào II.3.4 Đặc tính sinh hóa vi khuẩn Pasteurella multocida Đặc tính sinh hóa vi khuẩn Pasteurella multocida nhà nghiên cứu khảo sát dựa nguyên lý: vi khuẩn tế bào sống nên nuôi môi trường dinh dưỡng, trình trao đổi chất diễn tế bào vi khuẩn tạo sản phẩm làm thay đổi pH mơi trường Khi dựa vào chất thị màu người ta xác định đặc tính sinh hóa chúng -7- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com II.3.5 Đặc tính kháng nguyên vi khuẩn Pasteurella multocida Đặc tính kháng nguyên Pasteurella multocida phức tạp cấu trúc loại kháng nguyên thay đổi Kháng nguyên Pasteurella multocida có loại kháng ngun vỏ K kháng nguyên thân O Việc tìm hiểu cấu trúc kháng nguyên vi khuẩn Pasteurella multocida có vai trị quan trọng khơng phân loại vi khuẩn Pasteurella multocida mà nghiên cứu đặc tính sinh miễn dịch chúng khả chế tạo vắc-xin phịng bệnh Một vắc-xin có hiệu lực tốt phải bao gồm kháng nguyên tương ứng với serotype chủng phân lập vùng hay khu vực Pasteurella multocida có tính kháng ngun giao hỗ (tương đồng kháng nguyên) tức có khả miễn dịch chéo giũa chủng, tính chất nhiều hay phụ thuộc vào chủng II.3.5.1 Kháng nguyên vỏ K (Kapsular antigen) Kháng nguyên vỏ K bao xung quanh thân vi khuẩn, che chở cho kháng nguyên O khỏi bị thực bào tác động Đồng thời kháng nguyên K ngăn cản tiếp xúc kháng nguyên O với kháng thể O Do đó, muốn phát kháng nguyên O phải phá hủy kháng nguyên K Kháng nguyên K có vi khuẩn P multocida tạo khuẩn lạc dạng S, khơng có vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng nhầy (M) xù xì (R) Có type kháng nguyên thân A, B, D, E F II.3.5.2 Kháng nguyên thân O (Somatic antigen) Kháng nguyên O có hai nhóm, đặc hiệu khơng đặc hiệu Các chủng vi khuẩn khác khác kháng nguyên O Chỉ có serotype B đồng thuộc nhóm kháng nguyên O Kháng nguyên O có hai hệ thống phân loại: + Phân loại Namioka Murata (1961) kháng nguyên O có 12 yếu tố + Phân loại Heddleston (1972) kháng nguyên O có 16 yếu tố, đánh dấu từ 1-16 Do tầm quan trọng vi khuẩn Pasteurella multocida bệnh học thú y, người ta giải trình tự xác định 104 gene có liên quan đến khả gây bệnh Pasteurella multocida, chiếm khoảng 7% gene Đại diện số nhóm gene pfh (Pasteurella filamentous hemagglutinin, pfh) Nhóm -8- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com gene có kích thước 24 kb, bao gồm gene liên quan đến khả gây bệnh Pasteurella multocida gene pfhB1 (tổng hợp protein 2615aa) pfhB2 (3919aa) Nhóm gene có đặc điểm quan trọng sau: - Đầu amino gene pfhB1 pfhB2 theo mơ hình N(P/Q)NG(I/M), mơ hình liên quan đến tiến trình tiền phiên mả va tính hiệu ngoại bào - Vùng trung tâm có chứa vùng quy định khà bám dính vi khuẩn vào bề mặt tế bào Điều giúp vi khuẩn cơng vơ tế bào gây bệnh cho vật chủ - Đầu carboxy chứa vùng có cấu trúc tương tự protein kháng huyết p76 Haemophilus somnus (có 66% amino acid tương tự) Khả giúp cho Pasteurella multocida tăng khả sống sót thể vật chủ từ tăng cường khả gây bệnh vi khuẩn II.3.5.3 Xác định type kháng nguyên vi khuẩn Pasteurella multocida Vi khuẩn Pasteurella multocida mọc dễ dàng mơi trường nhân tạo việc chuẩn đốn vi khuẩn khơng có khó khăn đặc biệt Tuy nhiên để xác định xác type kháng nguyên vi khuẩn lại phức tạp sử dụng kỹ thuật thông thường Việc xác định type kháng nguyên vi khuẩn Pasteurella multocida chủ yếu thực phương pháp ngưng kết nhanh phiến kính, ngưng kết ống nghiệm, kỹ thuật kết tủa khuếch tán thạch (agar gel precipitation test, AGP) phản ứng ngưng kết hồng cầu Ngày nay, việc giám định vi khuẩn thực nhờ trợ giúp kỹ thuật phân tử như: kỹ thuật PCR, kỹ thuật RT-PCR, kỹ thuật phân tích thành phần protein vi khuẩn gel… III PHƯƠNG PHÁP – VẬT LIỆU III.1 Giám định vi khuẩn Pasteurella multocida serotype B kỹ thuật PCR Trong quy trình chuẩn đoán người ta sử dụng cặp mồi - Cặp mồi HSB -9- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KTT72 5’-AGGCTCGTTTGGATTATGAAG-3’ KTSP61 5’-ATCCGCTAACACTCTC-3’ (Townsend cs., 1998) - Cặp mồi B capsule type (CAPB) CAPB-FWD 5’-CATTTATCCAAGCTCCACC-3’ CAPB-REV 5’-GCCCGAGAGTTTCAATCC-3’ (Townsend cs., 2001) Với cặp mồi HSB CAPB sản phẩm DNA tương ứng tạo có kích thước tương ứng 620 bp 720 bp (Townsend cs., 2001) Với cặp mồi HSB nhận diện hầu hết chủng vi khuẩn Pasteurella multocida, cặp mồi CAPB cho phép phân biệt chủng Pasteurella multocida serotype B (B:2, B:5, B:2,5) Ngoài để xác định vi khuẩn Pasteurella multocida serotype D người ta sử dụng cặp mồi CAPD (đặc hiệu cho vi khuẩn P multocida serogroup D) (Townsend cs., 2001) Do chủng Pasteurella multocida dương tính lúc với cặp mồi HSB CAPB HSB CAPD, nên để xác định vi khuẩn Pasteurella multocida serotype B serotype D cần thiết phải sử dụng đồng thời cặp mồi HSB CAPB HSB CAPD Kết PCR có tính xác cao nhanh chóng, sử dụng chúng chuẩn đoán nghiên cứu dịch tễ bệnh Pasteurella multocida gia súc gia cầm III.2 Xác định serotype vi khuẩn Pasteurella multocida phương pháp nested-PCR Trong phương pháp người ta sử dụng cặp mồi: cặp mồi chung cho loài cặp mồi riêng cho vùng mã hóa chuyên biệt serotype Cặp - 10 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com mồi chung thiết kế dựa vào vùng bảo tồn lồi Pasteurella multocida, khơng chun biệt cho serotype - Sp6 promoter: 5’-TATTTAGGTGAGACTATAG-3’ - T7 promoter: 5’-TAATACGACTCACTAT-3’ Và cặp mồi riêng cho serotype Dưới cặp mồi cho serotype B: - KMT1SP61: 5’-ATCCGCTAACACACTCTC-3’ - KMT1T72: 5’-AGGCTCGTTTGGATTATGAAG-3’ Đầu tiên với cặp mồi Sp6 promoter T7 promoter, đoạn gene vùng bảo tồn nhân lên với số lượng định lần chạy PCR thứ Ở lần chạy PCR thứ hai, với cặp mồi KMT1SP61 KMT1T72, đoạn gene chuyên biệt serotype B khuếch đại cho phép xác định serotype vi khuẩn Trong kỹ thuật người ta sử dụng cặp mồi sau: Cặp mồi thứ cặp mồi chung thiết kế áp dụng cho vùng bảo tồn - PmCapComAni-F: 5’-TATTTTATGGCTTGTTGTGA-3’ - PmCapComAni-R: 5’-CTTTTTGTTTCATTTGGACTG-3’ Cặp mồi thứ hai chuyên biệt cho serotype Pasteurella multocida - KMT1T7: 5’-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3’ - 11 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - KMT1SP6: 5’-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3’ III.3 Phân tích thành phần protein vi khuẩn Việc phân tích thành phần protein vi khuẩn thực gel SDS-PAGE Các chủng vi khuẩn pha thành dung dịch huyền phù có nồng độ khoảng 5x109 cfu/ml, trộn với dung dịch đệm 15% β-mecapthoethanol Điện di protein vi khuẩn P multocida thạch Polyacrylamide 10% Cột 8: Trọng lượng protein chuẩn Cột đến 7: Dịch chiết protein chủng vi khuẩn Pasteurella multocida Việc phân tích thành phần protein vi khuẩn cho phép ta nhận biết chủng Pasteurella multocida Những nghiên cứu Lugtenberg cộng (1984) cho thấy có loại protein màng ngồi khác kí hiệu chúng I, II, III Các protein thay đổi trọng lượng phân tử từ 28.000 đến 48.000 daltons Tuy protein màng - 12 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com dường khơng có mối liên quan tuyệt chủng gây bệnh, theo tác giả chủng Pasteurella multocida có lớp protein màng ngồi thuộc loại I chủng gây bệnh Trong thuộc loại II chủng không gây bệnh III.4 Sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP việc chuẩn đoán phân biệt Pasteurella multocida serotype A:1, A:3, B:2 Đây kết hợp kỹ thuật PCR kỹ thuật cắt phân đoạn đa hình RFLP Kỹ thuật PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) kỹ thuật mà trình tự ADN biến thể xác định cách khuếch đại thông qua kỹ thuật PCR Tiếp theo sản phẩm q trình PCR phân cắt endonuclease hạn chế Các phân đoạn DNA khác kích thước phân tách gel agarose / gel acrylamide.Việc phân biệt serotype Pasteurella multocida dựa khác biệt nucleic acid serotype Pasteurella multocida Kiến thức serotype Pasteurella multocida tham gia vào ổ dịch điều cần thiết để tạo nên biện pháp kiểm sốt hiệu Đặc tính kháng nguyên Pasteurella multocida thực serogrouping capsular serotyping soma Tuy nhiên kỹ thuật lại thực phịng thí nghiệm tham khảo Điều thường dẫn đến chậm trễ việc xác định serotype cô lập Kỹ thuật gene dựa cho khác biệt nucleic acid serotypes thay cho kỹ thuật thơng thường Một kỹ thuật PCR-REA (Polymerase chain reaction-restriction enzyme analysis) chuẩn hóa để phân biệt Pasteurella multocida serotype A: 1, A: B: Vật liệu phương pháp: Pasteurella multocida chủng DP1 FP1 cô lập Kerala, Ấn Độ serotyped A: Viện Nghiên cứu thú y, Izatnagar, Ấn Độ cung cấp Pasteurella multocida chủng LKO serotypes A: 3, B: Viện Nghiên cứu thú y, Izatnagar, Ấn Độ cung cấp nhằm hình thành chủng tham khảo cho nghiên cứu Hai oligonucleotides dựa theo trình tự P multocida X-73 ompH gene, U50907 (Luo et al , 1997) thiết kế cách sử dụng phần mềm Primer3 - 13 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Mồi tổng hợp cách tuỳ chỉnh M / s Bangalore Genei Ấn Độ Trình tự hai mồi sau: - OmpH 1: 5'-GCG TTT CAT TCA AAG CAT CTC-3' - OmpH 2: 5'-ATG ACC GCG TAA CGA CTT TC -3' Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi để khuếch đại đoạn trình tự OmpH gen Pasteurella multocida Enzyme giới hạn phân tích sản phẩm OmpH-PCR: Các sản phẩm PCR khuếch đại phân cắt enzym cắt hạn chế Dra I Hinf I (ở 370C hai giờ, sau bất hoạt men tiêu hóa 800C 20 phút) Điện di kết enzyme cắt giới hạn tiến hành gel acrylamide 8% Gels xem transilluminator chụp ảnh Kết quả: Các cặp mồi OmpH OmpH 2, thiết kế để khuếch đại gen OmpH Pasteurella multocida thành công với tất serotypes A:1, A:3 B: Các sản phẩm khuếch đại có kích thước khoảng 1000bp Đặc trưng mồi: Cặp primer OmpH OmpH chuyên biệt cho đoạn OmpH vi khuẩn Pasteurella multocida - 14 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phân tích hạn chế sản phẩm khuếch đại serotypes A: 1, A: B: tiến hành cách sử dụng enzyme cắt giới hạn Dra I Hinf I Enzyme Hinf I tạo mơ hình tương tự A: B: khác biệt từ A: 1, Dra I cho cấu hình khác biệt với cho ba serotypes - 15 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com REA sản phẩm khuếch đại OmpH-PCR với Dra I tạo cấu hình riêng biệt cho ba serotypes A: 1, A: B: 2, Enzyme Hinf I tạo mơ hình tương tự A: B: khác biệt A: Vì vậy, REA sản phẩm khuếch đại OmpH-PCR với Dra I cung cấp kỹ thuật lý thuyết cho khác biệt serotype Pasteurella multocida Nếu mơ hình cho tất serotypes xác định cách tương tự có kỹ thuật serotyping đơn giản, nhanh chóng thực phịng thí nghiệm có lực để thực PCR Sự phát triển ADN dựa kỹ thuật cho biết khác biệt serotypes cung cấp thay cho hệ thống quy ước serotyping Tuy nhiên, nghiên cứu phải tiếp tục thực với tất serotypes khác để biết hồ sơ cho serotype thu được, trước kỹ thuật đặt để sử dụng thường lệ - 16 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com IV KẾT LUẬN Bệnh tụ huyết trùng bệnh nhiễm khuẩn có độc lực cao gia súc gia cầm, vi khuẩn Pasteurella multocida gây Bệnh gây thiệt hại lớn cho kinh tế chăn ni tồn giới Ngày với kỹ thuật sinh học phân tử đại, đặc biệt kỹ thuật gene phát triển chuẩn đốn vi khuẩn Pasteurella multocida (tác nhân gây bệnh tụ cầu huyết) khơng cịn khó khăn Một số kỹ thuật gene điển hình sử dụng chuẩn đoán vi khuẩn Pasteurella multocida: - PCR (Polymerase Chain Reaction) - nested-PCR - RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) - PCR-RFLP (PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism) - 17 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com V TÀI LIỆU THAM KHẢO Công nghệ sinh học thú y – Nguyễn Ngọc Hải, nhà xuất nông nghiệp JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY báo có liên quan Bài báo cáo tổng kết KHKT Đề tài KC.04.06, nghiên cứu hồn thiện cơng nghệ sản xuất vaccine nhược độc, vơ hoạt phịng bệnh cho gia súc, gia cầm kỹ thuật gene xác định type virus lở mồm long móng, chủ nhiệm đề tài: TS Tơ Long Thành 6102, 19/09/2006 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC30675/ http://vetscan.co.in/v4n1/differentation_of_closely_related_vaccinal_strain s_of_pasteurella_multocida_using_polymerase_chain_reaction.htm http://www.ispub.com/journal/the_internet_journal_of_veterinary_medicin e/volume_2_number_2_2/article/nucleic_acid_based_differentiation_of_pa steurella_multocida_serotypes.html www.aasp.org/shap/issues/v15n5/v15n5p279.htm http://scialert.net/fulltext/?doi=jbs.2008.1251.1254 http://world-rabbit-science.com/WRSA-Proceedings/Congress-2008Verona/Papers/P-PerezdeRozas1.pdf 10 www.google.com.vn ( từ khóa Pasteurella multocida, tụ huyết trùng, Fowl cholera, Septicaemia disease, PCR-Restriction Fragment Le 11 ngth Polymorphism…) - 18 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC I ĐẶT VẤN ĐỀ II TỔNG QUAN II.1 Bệnh tụ huyết trùng II.2 Vài nét lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng II.2.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng giới II.2.2 Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng Viêt Nam II.3 Vi khuẩn Pasteurella multocida II.3.1 Đặc tính sinh vật học vi khuẩn Pasteurella multocida II.3.2 Đặc tính hình thái vi khuẩn Pasteurella multocida II.3.3 Tính bắt màu vi khuẩn Pasteurella multocida II.3.4 Đặc tính sinh hóa vi khuẩn Pasteurella multocida II.3.5 Đặc tính kháng nguyên vi khuẩn Pasteurella multocida 10 II.3.5.1 Kháng nguyên vỏ K (Kapsular antigen) 10 II.3.5.2 Kháng nguyên thân O (Somatic antigen) 10 II.3.5.3 Xác định type kháng nguyên vi khuẩn Pasteurella multocida 11 III PHƯƠNG PHÁP – VẬT LIỆU III.1 Giám định vi khuẩn Pasteurella multocida serotype B kỹ thuật PCR 11 - 19 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com III.2 Xác định serotype vi khuẩn Pasteurella multocida phương pháp nested-PCR 12 III.3 Phân tích thành phần protein vi khuẩn 14 III.4 Sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP việc chuẩn đoán phân biệt Pasteurella multocida serotype A:1, A:3, B:2 15 IV KẾT LUẬN 19 V TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 - 20 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... vi? ??c giám định vi khuẩn thực nhờ trợ giúp kỹ thuật phân tử như: kỹ thuật PCR, kỹ thuật RT-PCR, kỹ thuật phân tích thành phần protein vi khuẩn gel… III PHƯƠNG PHÁP – VẬT LIỆU III.1 Giám định vi. .. mồi dung để xác định Pasteurella multocida gây bại huyết, xuất huyết II.3 Vi khuẩn Pasteurella multocida II.3.1 Đặc tính sinh vật học vi khuẩn Pasteurella multocida Vi khuẩn Pasteurella nằm Eubacteriales,... tụ huyết trùng Vi? ?t Nam II.3 Vi khuẩn Pasteurella multocida II.3.1 Đặc tính sinh vật học vi khuẩn Pasteurella multocida II.3.2 Đặc tính hình thái vi khuẩn Pasteurella multocida II.3.3