Tiểu luận kĩ thuật PCR

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÀI TIỂU LUẬN KĨ THUẬT PCR Giảng viên: TS Nguyễn Huy Thuần Sinh viên: Đỗ Thị Hào Lớp: 43 CNSH Khoa: CNSH&CNTP Năm học: 2013- 2014 I Giới thiệu SVTH: Đỗ Thị Hào Page LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PCR chữ viết tắt cụm từ Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp – phản ứng khuếch đại gen) Đây kỹ thuật sinh học phân tử cho phép nhân đoạn DNA mong muốn từ hệ gen DNA thể sinh vật thành nhiều sao, kỹ thuật nhà khoa học người Mỹ – Kary Mullis cộng phát minh năm 1985 công ty Cetus; nguyên tắc mô tả chi tiết trước thập niên Khorana ctv., (Kleppe ctv., 1971; Panet ctv., 1974), giới thiệu lần Hội thảo lần thứ 51 Cold Spring Harbor vào năm 1986 ông nhận giải thưởng Nobel Hoá sinh học vào năm 1993 Kể từ tạo nên tác động to lớn nghiên cứu sinh học toàn giới Hình Karry mullis II Nguyên lý Nguyên lý nhân gen tế bào: DNA vật chất di truyền thể sống quy định lên đặc tính thể (ngoại trừ số loại virus có vật chất di truyền RNA) Đối với sinh vật có cấu trúc tế bào nhân chuẩn, SVTH: Đỗ Thị Hào Page LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com phân tử DNA tồn dạng kết hợp với protein thành nhiễm sắc thể nhân tế bào Ngoài ra, quan tử ty thể lạp thể (ở thực vật) chứa DNA dạng plasmid Các phân tử DNA tế bào hoạt động bình thường nhân lên trình phân bào nguyên nhiễm Để thực q trình này, địi hỏi phải có mặt enzim DNA polymerase, tham gia đoạn mồi có trình tự bổ sung gắn vào vào sợi DNA khuôn dNTPs làm nguồn cung cấp nucleotit Trong trình phân bào nguyên nhiễm, sợi DNA kép mở xuắn tách thành sợi DNA sợi đơn Dưới tác dụng enzim DNA polymerase, trình tổng hợp DNA xảy theo cách gắn nucleotit vào đoạn mồi để kéo dài chuỗi theo nguyên tắc bổ sung với DNA khuôn Nguyên lý kỹ thuật PCR: Kỹ thuật tổng hợp DNA thể tuân thủ nguyên tắc chép DNA thể có khác biệt: + Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzim helicase + Kết hợp với enzim DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp DNA môi trường thích hợp + Hệ thống điều nhiệt thích hợp với đoạn mồi thiết kế chuyên biệt, chủ động SVTH: Đỗ Thị Hào Page LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phương pháp PCR cho phép tổng hợp nhanh xác đoạn DNA riêng biệt Ðây thực phương pháp đại thuận tiện cho việc xác định có mặt gen tế bào với độ xác cao Phương pháp dựa khám phá hoạt tính sinh học nhiệt độ cao DNA polymerase tìm thấy sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống suối nước nóng) Phần lớn DNA polymerase làm việc nhiệt độ thấp Nhưng nhiệt độ thấp, DNA xoắn chặt DNA polymerase khơng có nhiều khả làm biến tính phần lớn phần phân tử Nhưng polymerase chịu nhiệt hoạt động nhiệt độ cao, lên đến 100 C Ở nhiệt độ DNA bị biến tính (DNA dạng xoắn duỗi dạng thẳng) Một phản ứng PCR chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, chu kỳ gồm ba giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp, giai đoạn kéo dài III Máy PCR Trước đây, chưa có máy chu kỳ nhiệt, để thực phản ứng PCR nhà khoa học gặp trở ngại lớn: + Lúc đầu enzim Klenow polymerase sử dụng bị phân hủy 950C nên phải thêm enzim vào ống nghiệm sau chu kỳ giai đoạn phân tách chuỗi DNA + Để thay đổi chu kỳ nhiệt nhà khoa học phải sử dụng water baths nhiệt độ khác Khi đếm thay đổi 30 đến 35 chu kỳ nhiệt phiền phức, dễ gây sai sót Việc tìm enzim Taq polymerase máy PCR tự động thay đổi chu kỳ nhiệt làm cho kỹ thuật phát triển nhanh ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực nghiên cứu (McPherson ctv., 1992) Một cách tổng quát, máy PCR gồm phận sau : SVTH: Đỗ Thị Hào Page LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com + Một bàn phím đơn giản để lập chương trình chu kỳ nhiệt mệnh lệnh để máy thực + Một vi xử lý để ghi nhớ chương trình nạp vào máy, thực mệnh lệnh ghi nhận cách thay đổi nhiệt độ buồng ủ PCR chu kỳ nhiệt để điều chỉnh cho với chương trình thực Buồng ủ PCR nơi mà chu kỳ nhiệt thực qua điều khiển vi xử lý Trong chu kỳ nhiệt, nhiệt độ buồng ủ PCR đưa lên cao hay hạ xuống thấp thời gian ngắn Ðể làm thay đổi nhiệt độ buồng ủ PCR, có hai phương pháp : (1) Liên tục thổi lên buồng ủ luồng khí nóng sinh từ đèn phát nhiệt, hay luồng khí lạnh sinh từ hệ thống máy làm lạnh Với phương pháp này, máy luân nhiệt tương đối cồng kềnh, đắt tiền máy hoạt động âm ồn (2) Phương pháp thứ hai hoạt động dựa theo hiệu Peltier ngược Hiệu Peltier nguyên tắc máy đo nhiệt độ điện tử : Khi áp hai mãnh kim loại vào có cách biệt nhiệt độ hai mãnh kim loại sinh dịng điện lưu thơng dịng điện đo lường phản ánh cách biệt nhiệt độ hai mãnh kim loại Hiệu Peltier ngược lại vận hành theo kiểu ngược lại, nghĩa tạo dòng điện hai mãnh kim loại tạo cách biệt nhiệt độ hai mãnh : bên nóng, bên lạnh Khi thay đổi chiều dịng điện nhiệt độ hai mãnh thay đổi ngược lại: bên lạnh, bên nóng Các máy chu kỳ nhiệt chế tạo dựa theo phương pháp thứ hai này, nhờ mà máy trở nên gọn nhẹ, giá thành rẽ gấp nhiều lần so với trước SVTH: Đỗ Thị Hào Page LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình Một số hình ảnh máy PCR IV Chuẩn bị mẫu DNA Mẫu DNA đối tượng cần nghiên cứu ly trích tinh sạch, sau trữ mẫu – 200C V Thiết kế mồi - Mồi đoạn oligonucleotide (17-30 base) bổ sung với trình tự DNA, gồm có mồi xi mồi ngược:   Mồi xuôi (sense primer Forward) bắt cặp với mạch khuôn DNA kéo dài theo chiều phiên mã Mồi ngược (anti sense primer Reverse) bắt cặp với mạch mã DNA kéo dài ngược theo chiều phiên mã + Trình tự mồi thiết kế cho khơng có bắt cặp mồi xi mồi ngược, kể cấu trúc kẹp tóc + Nhiệt độ gắn mồi mồi xuôi mồi ngược không chênh lệch xa (Không nên nhiều G C nối tiếp nhau, thường tỷ lệ G, C nằm khoảng 30%< G+C