quy trình sản xuất chế phẩm hóa sinh xử lý môi trường cho sinh vật thủy sinh

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Gần việc tôm, cá chết hàng loạt ao nuôi thủy sản gây thiệt hại lớn kinh tế cho người dân, doanh nghiệp sở ni trồng chế biến thủy sản Ngun nhân cân sinh thái môi trường ao nuôi gây Trong nuôi trồng thủy sản, thức ăn khơng ăn hết, chất thải chuyển hóa dinh dưỡng nguồn gốc chủ yếu ô nhiễm nước nuôi thủy sản Người ta quan sát, thấy hệ thống thâm canh tơm có 15 - 20% thức ăn dùng vào phát triển mơ động vật, có tới 15% tổng lượng thức ăn hao hụt khơng ăn hết thất thốt, có 40 - 45% sử dụng trình chuyển hóa bình thường Nitrit, sulphurit photpho yếu tố chủ yếu bắt nguồn từ thức ăn Việc cho thức ăn nhiều, thức ăn dễ tan, thức ăn khó hấp thu ảnh hưởng trực tiếp tới sinh trưởng phát triển sinh vật nuôi đồng thời điều kiện thuận lợi cho hệ vi sinh phát triển hệ vi sinh khơng có lợi Đây yếu tố gây nên bệnh tôm, cá khiến tôm, cá chết hàng loạt diện rộng Người ta ước tính rằng, có khoảng 63 78% nitơ 76 - 80% photpho cho tơm, cá ăn bị thất vào môi trường Các nguồn khác chất thải hữu mảnh vụn thực vật phù du tảo dạng sợi (lab-lab) chất lắng đọng chất hữu hoà tan, huyền phù nước lấy vào mang theo Khi hàm lượng nitơ, photpho chất dinh dưỡng khác ao nuôi gây nên phú dưỡng dẫn tới tăng sức sản xuất ban đầu nở rộ vi khuẩn Sự có mặt hợp chất hữu làm giảm ôxy hoà tan tăng BOD, COD, sulfit hydrogen, ammoniac hàm lượng methan (CH4) môi trường ao nuôi Đây điều kiện bất lợi cho sinh trưởng phát triển vật nuôi Việc sử dụng kháng sinh, hóa chất bừa bãi gây nên kháng thuốc vi sinh vật đồng thời triệt tiêu quần thể vi sinh vật có lợi cho môi trường ao nuôi yếu tố gây cân hệ sinh thái ao nuôi Sự phát triển khu công nghiệp thải vào môi trường nước yếu tố bất lợi gây nên ô nhiễm nguồn nước, làm ảnh hưởng nhiều đến sinh trưởng phát triển động vật nuôi đồng thời phá vỡ sinh thái môi trường Từ thực trạng nên việc đưa chế phẩm sinh học – sinh hóa áp dụng ni thủy sản giải pháp mang tính sinh thái, bền vững cần thiết Giống vi khuẩn lactobacillus đặc biệt nhóm probiotic(nhóm vi khuẩn sinh acid lactic) kích thích việc hấp thu sử dụng thức ăn vật ni triệt để Nhóm vi khuẩn giúp cân hệ vi sinh vật đường tiêu hóa vật ni, tăng miễn dịch cho co thể, chống chọi với yếu tố môi trường khác tốt Kết hợp với vi khuẩn nhóm Bacillus, nitrobacter xử lý cải thiện chất lượng nước ao ni phía bên ngồi giúp hệ sinh thái ao ni trở nên cân bền vững có lợi cho vật nuôi Mục tiêu đề tài − Xây dựng quy trình sản xuất men vi sinh quy trình sản xuất chế phẩm hóa sinh xử lý mơi trường cho sinh vật thủy sinh − Sản xuất thử nghiệm chế phẩm − Đánh giá hiệu sản phẩm thực địa Cách tiếp cận, phương pháp nghiên cứu, phạm vi nghiên cứu Cách tiếp cận: Hệ thống ao nuôi thủy sản phải hệ sinh thái bền vững Điều điều chỉnh tới trạng thái cân nhờ hệ vi sinh vật có lợi cho môi trường ao nuôi Nghiên cứu tiến hành trực tiếp đánh giá thực nghiệm, từ chọn lọc đưa chủng vi khuẩn có lợi cho việc sản xuất chế phẩm thích hợp LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng phương pháp lên men để thu sinh khối từ vi sinh vật Từ kết hợp với nhóm tác nhân gây bệnh mơi trường ao ni nhằm tạo dịng sản phẩm thích hợp ứng dụng mơi trường ni trồng thủy hải sản Phạm vi nghiên cứu: − Các loài thuộc giống Lactobacillus (L acidophillus; L sporogenes,…) − Các loài thuộc giống Bacillus (Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis,… ) − Saccharomyces cerevisiae − Nitrobacter, Nitrosomonas − Tá dược hấp phụ đường zeolite − Thử nghiệm chế phẩm môi trường ni thủy sản tỉnh Bình Thuận CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Probiotic số ứng dụng Probiotic thuật ngữ có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp bao gồm hai từ: pro- vì, biosis – sống Probiotic chế phẩm chứa vi sinh vật sống chọn lọc mà đưa vào thể qua đường miệng với lượng lớn ảnh hưởng có lợi đến sức khoẻ vật chủ Khái niệm bắt nguồn từ giả thiết nhà bác học Nga Metchinikoff (1845-1916) cho người nông dân Bulgari sống khoẻ mạnh họ thường xuyên dùng sữa chua có chứa vi khuẩn lactic, chúng ảnh hưởng tới hệ vi sinh vật đường ruột làm giảm tác động gây độc vi sinh vật gây hại Các vi sinh vật dùng làm probiotic thường có đặc điểm sau:  Có khả bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa vật chủ;  Dễ ni cấy;  Không sinh chất độc không gây bệnh cho vật chủ;  Có khả tồn thời gian dài;  Có khả sinh enzyme, chất kháng sinh sản phẩm cuối mà vật chủ sử dụng được;  Chịu pH thấp dày muối mật ruột non;  Biểu hiệu có lợi vật chủ Ảnh hưởng chế phẩm probiotic trực tiếp gián tiếp thơng qua khu hệ vi sinh vật đường ruột Nhiều chế phẩm loại có lợi cho sức khỏe người Chúng sản xuất ba dạng: dạng viên, bột nước Tác dụng có ích probiotic có nhiều, nêu số như: [6,16]  Tăng cường tiêu hóa lactose hoạt động enzyme khác  Chữa tiêu chảy kháng sinh: sử dụng kháng sinh, đặc biệt clindamycine, cephalosporine, penicilline dễ dẫn đến tiêu chảy cân hệ vi sinh vật đường ruột  Chữa viêm đường tiêu hóa virus rota Các virus xâm nhập vào tế bào đỉnh nhung mao ruột, phá hủy nhung mao, làm khả hấp thu chất dinh dưỡng chất điện giải  Ngăn ngừa việc viêm nhiễm âm đạo Nhiều nghiên cứu cho thấy uống hàng ngày 109-1010 vi khuẩn Lactobacillus rhamnosa GR-1 Lactobacillus fermentum RC-14 tránh viêm nhiễm âm đạo, LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 1.2 Các chủng vi sinh vật sử dụng chế phẩm men tiêu hóa chế phẩm xử lý môi trường ao nuôi thủy hải sản 1.2.1 Chi Lactobacillus 1.2.1.1 Lactobacillus acidophilus Lactobacillus acidophilus trực khuẩn G (+), không tạo bào tử khả di động Lactobacillus acidophilus có nhiều sữa chua, mát sản phẩm lên men lactic khác Ở thể người Lactobacillus acidophilus có nhiều ruột, âm đạo, miệng 1.2.1.2 Lactobacillus sporogenes Lactobacillus sporogenes lần phân lập mô tả vào năm 1993 nhà khoa học Nga LM Horowitz-Wlassowa NW Nowotelnow (Zentbl F Bakt., 1933) L sporogenes vi sinh sản xuất acid lactic, acid hoá đường ruột ngăn ngừa phát triển vi khuẩn gây thối rữa, có khả sinh bào tử ứng dụng sản xuất men tiêu hóa sản phẩm khác 1.2.2 Chi Bacillus Hầu hết vi khuẩn thuộc chi Bacillus vi khuẩn dinh dưỡng hóa hữu cơ, thu lượng dự trữ từ q trình acid hóa hợp chất hữu chúng phát triển với carbondioxide carbonmonoxide nguồn cacbon lượng Về mặt dinh dưỡng B subtilis thuộc loại nguyên dưỡng, loài khác B.cereus B.sphaericus đòi hỏi chất hữu tối thiểu amino acid hay vitamin dư thừa Khi có mặt khơng khí phần lớn vi khuẩn Bacillus phát triển sinh bào tử Phần lớn chúng có enzyme catalase Các thành viên nhóm Bacillus phát triển kị khí khơng có chất nhận điện tử ngoại sinh B subtilis xem vi khuẩn hiếu khí hồn tồn chúng phát triển điều kiện khơng có oxygene sản sinh acetoin, acetate, acid 2,3butadiendiol từ pyrovate thông qua acetolactate B subtilis phát sinh NAD+ từ biến đổi acetoin thành butanectiol, phát triển kị khí mạnh cạnh tranh với B.cereus B.licheniformis 1.2.3 Nitrosomonas Nitrosomonas có dạng hình cầu hình bầu dục ngắn, kích thước từ 1-2 x µm, G (-), có màng nhầy, khơng sinh bào tử, có tiêm mao dài nên chuyển động Phát triển mạnh pH= 7,0 - 8,6 Vi khuẩn thuộc nhóm hóa tự dưỡng, chúng sử dụng lượng tạo để khử CO2 tạo hợp chất hữu Trong trình nitrat hóa Nitrosomonas đóng vai trị oxy hóa amonium thành nitrit [3] Nitrosomonas Nitrobacter NO2NO3NH3 1.2.4 Nitrobacter Nitrobacter vi khuẩn G (-), sống tự dưỡng bắt buộc không sinh bào tử, khuẩn lạc suốt, bé (khoảng 0.2 µm) Nitrobacter có hình que, hình lê đa hình, di động không di động Nhiệt độ phát triển tối ưu 370C, pH=7.3 - 7.5, chết nhiệt độ lớn 490C bé 00C Một số loài Nitrobacter: Nitrobacter winogradskyi, Nitrobacter hamburgensis, Nitrobacter vulgaris LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nitrobacter đóng vai trị quan trọng chu trình nitơ chúng oxy hóa nitrit, nitrat sử dụng lượng cho hoạt động sống thay phải sử dụng nguồn lượng cacbon [3,24] 1.2.5 Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae thường dùng công nghiệp cồn etylic, men bánh mì, sinh khối Protein sản xuất rượu, bia Chúng có hai hình thức sinh sản: vơ tính hữu Hình thái tế bào Saccharomyces cerevisiae có dạng hình ovan, đơi hình trịn (phụ thuộc điều kiện ni cấy) Kích thước trung bình 4-6 µm Khơng bào thay đổi rõ rệt q trình ni cấy Kích thước khơng bào thay đổi tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy tuổi tế bào Trong tế bào trẻ không bào không thấy, tế bào già không bào chiếm tới 80% [11,13] CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Các chủng vi sinh vật - Vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus (L acidophillus, L sporogenes,…) - Vi khuẩn chi Bacillus (B megaterium, B licheniformis, B subtilis,… ) - Vi khuẩn phân giải nitơ (Nitrobacter sp., Nitrosomonas sp.) - Nấm men Saccharomyces cerevisiae Các chủng giống sử dụng sản xuất chế phẩm bảo quản dạng đông khô Chủng lưu giữ phịng thí nghiệm Cơng nghệ vi sinh thuộc khoa Sinh học trường Đại học Đà Lạt 2.1.2 Đối tượng thử nghiệm Các hồ nuôi Tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) Công ty TNHH Anh Việt, xã Phước Thể, huyện Tuy Phong, tỉnh Bình Thuận 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu - Thời gian từ tháng 3/2010 đến tháng 12/2011 - Phịng thí nghiệm Cơng nghệ vi sinh – Khoa Sinh học Trường Đại học Đà Lạt - Công ty TNHH Anh Việt, xã Phước Thể, huyện Tuy Phong, tỉnh Bình Thuận 2.3 Mơi trường hóa chất 2.3.1 Mơi trường ni cấy kiểm tra độ sống sản phẩm Môi trường MRS lỏng, môi trường MRS đặc (phụ lục 1, 2), môi trường Hansen (phụ lục 3), Môi trường Vinogratxkii (Phụ lục 4) 2.3.2 Môi trường kiểm tra độ tạp nhiễm Môi trường MRS đặc, pH = 6,8-7,2 sau hấp (Phụ lục 2) Môi trường Hansen đặc, pH=6,2 sau hấp (phụ lục 3) Môi trường Sabouraud, pH = 5,6 sau hấp (Phụ lục 5) Môi trường tổng hợp pha sẵn TCBS (Merck, Đức): Kiểm tra vi khuẩn Vibrio 2.3.3 Nước muối sinh lý 0,9% (Phụ lục 6) 2.3.4 Thuốc nhuộm Gram (Phụ lục 7) 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp sản xuất chế phẩm men vi sinh chế phẩm sinh hóa xử lý mơi trường nước Mơ tả quy trình: Phục hồi chủng: Khui riêng rẽ giống đông khô cấy vào môi trừơng MRS lỏng, Hansen lỏng, Vinogratxkii lỏng, ủ ấm 37oC/4 – 6h vi khuẩn, 290C nấm men LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chế phẩm Elacmen, Elacvit sử dụng chủng: B.subtilis, L.acidophilus, L.sporogenes, S.cerevisiae Chế phẩm Biozeo sử dụng chủng: B.subtilis, B.megaterium, B.licheniformis, Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp Nhân giống: Nhân giống riêng chủng môi trường lỏng, ủ ấm 37o C vi khuẩn, 290C nấm men sau 48h Kiểm tra độ khiết loại trước cấy Cấy chủng: Cấy riêng chủng Roux chứa môi trường đặc hấp vô trùng Mỗi Roux cấy 5ml canh chủng giống Ủ ấm 37oC vi khuẩn Bacillus, Lactobacilus, 290C nấm men, tiến hành lên men 48h Gặt sinh khối: Dùng nước muối sinh lí để gặt sinh khối, ly tâm 4000 vòng/phút, thời gian 30 phút Làm khô sinh khối: Làm khô sinh khối tủ ấm 40oC, có quạt hút Thu bột gốc: Xay bột gốc khô, kiểm tra độ sống bột gốc theo phương pháp Koch Trộn bán thành phẩm: Sử dụng tá chất phối trộn: chế phẩm Elacmen (sử dụng đường lactose, bột mì), chế phẩm Elacvit (sử dụng tá chất gồm đường lactose, bột mì bổ sung thêm viatmin PP, B2, B6), Chế phẩm Biozeo (Zeolite, đường lactose), sau trộn với bột gốc tương ứng (sinh khối vi sinh vật) Chế phẩm sau trộn phải đảm bảo thành phần trộn đều, nồng độ vi sinh vật theo tiêu chuẩn sở (TCCS) Kiểm tra độ sống, độ khiết bán thành phẩm: Trước đưa đóng gói lơ bán thành phẩm phải lấy mẫu theo nguyên tắc trên, dưới, trái, phải để kiểm tra độ đồng đều, độ sống, độ khiết Nếu kết kiển tra đạt lơ bán thành phẩm đưa qua đóng gói Đóng gói: Việc đóng gói thực phòng sạch, đảm bảo độ ẩm nhỏ 60% thực nhiệt độ phòng 2.4.2 Phương pháp phục hồi chủng nhân giống cấp I 2.4.3 Phương pháp lên men - Sử dụng phương pháp lên men bề mặt môi trường đặc - Dùng micropipette hút ml giống cấp bơm vào hộp Roux (có sẵn mơi trường tương ứng cho chủng sản xuất hấp khử trùng), trải Đem ủ ấm 37o C vi khuẩn, 290C nấm men 48-72 2.4.4 Phương pháp phối chế sản phẩm 2.4.5 Phương pháp nhuộm Gram 2.4.6 Phương pháp định tính định lượng mẫu sản phẩm 2.4.6.1 Định tính vi sinh vật sản phẩm 2.4.6.2 Định lượng vi sinh vật sản phẩm 2.4.7 Kiểm tra tạp nhiễm sản phẩm 2.4.7.1 Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn 2.4.7.2 Kiểm tra tạp nhiễm vi nấm 2.4.8 Phương pháp kiểm tra độ ẩm sản phẩm 2.4.9 Phương pháp lấy mẫu chế phẩm lấy mẫu nước ấu trùng tôm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.4.10 Phương pháp bố trí thí nghiệm ao ni thả tôm giống Nước đầu vào Xử lý thô Post1 – Post xuất Chăm sóc T.ăn + men vi sinh Cấp vào trại Chế phẩm xử (các bể nuôi) lý mơi trường Mysis 1-3 Thả Naupli Chăm sóc T.ăn + men vi sinh Zoea 1-3 2.4.10.1 Xử lý nước nuôi tôm giống chế phẩm xử lý môi trường (Biozeo) 2.4.10.2 Ni tơm giống có bổ sung chế phẩm men vi sinh Dùng bể thử nghiệm, dung tích bể bố trí thí nghiệm ≥ 9m3, diện tích bề mặt 9m2, cao 1.2m Lượng nước cấp vào cho bể 7m3/bể Mật độ bố trí bể bể 250 Nauplius/lít Bể 1: Cho ăn chế phẩm Elacmen Bể 2: Cho ăn chế phẩm Biofish Bể 3: Bể đối chứng không sử dụng men vi sinh Mỗi ngày cho ăn lần vào sáng Liều lượng sử dụng chế phẩm: Trong suốt q trình ni từ giai đoạn Zoea đến Post xuất cân chế phẩm sục vào nước 15-30 phút trộn thức ăn vào, để yên 15 phút cho tôm ăn 2.4.11 Phương pháp đo pH 2.4.12 Phương pháp xác định nitrate, nitric (NO3 , NO2) 2.4.13 Phương pháp xác định amonium (NH4+) 2.4.14 Phương pháp kiểm tra vi khuẩn Vibrio haveyi 2.4.15 Phương pháp theo dõi sinh trưởng tôm giống 2.4.16 Phương pháp xử lý số liệu - Sử dụng phần mềm Excel 2010 để xử lý kết - Cách tính số lượng ấu trùng: Dùng cốc thủy tinh có dung tích lít đưa vào bể múc điểm khác bể nhằm đảm bảo độ xác mật độ phân bố ấu trùng Đếm hết số ấu trùng lần múc, ta tính trung bình số ấu trùng lít Tiếp theo đưa số liệu có vào cơng thức sau ta tính tỉ lệ sống ấu trùng lại bể a: tỉ lệ sống ấu trùng b: trung bình số ấu trùng đếm lần đếm c: số ấu trùng bố trí ban đầu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Đặc điểm sinh học chủng vi sinh vật sản xuất chế phẩm Sau hồn ngun chủng giống mơi trường canh thang dinh dưỡng ủ tủ ấm nhiệt độ 37oC (đối với chủng vi khuẩn), môi trường Hansen lỏng nhiệt độ 29oC (đối với nấm Saccharomyses) - tất ống giống gây đục môi trường Cấy ria hộp petri chứa môi trường thạch MRS chủng (L acidophillus, L sporogenes,B megaterium, B licheniformis, B subtilis ), môi trường Winogratskii cho chủng (Nitrosomonas, Nitrobacter) ủ 370C, nuôi cấy nấm men môi trường thạch Hansen 29oC 18 - 24 giờ, tiến hành khảo sát đặc điểm khuẩn lạc, làm tiêu quan sát hình thái tế bào Kết khảo sát đặc điểm chủng giống thể qua bảng sau: Bảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc hình thái tế bào chủng giống STT Chủng vi sinh vật Đặc điểm khuẩn lạc Hình thái tế bào Khuẩn lạc dạng R, sần sùi, Trực khuẩn Gram dương, nối nhầy, bờ riềm không thành chuỗi nằm riêng L acidophillus nhăn nheo, có màu rẽ Kích thước ngắn, tương đối trắng sữa, núm to nhô đồng hình thể, hai đầu cao trịn Khuẩn lạc dạng R, đường Dạng trực khuẩn, xếp riêng rẽ, kính sau 24h nuôi cấy 4- xếp thành chuỗi ngắn, Gram L sporogenes 4,5 mm, xám nâu, dương, hai đầu tù hai đầu bắt mướt, núm lồi màu đậm Khuẩn lạc dạng R, tròn, Trực khuẩn Gram dương Tế bào bờ riềm khơng đều, có xếp thành đôi hay màu vàng nhạt chuyển dần B subtilis chuỗi ngắn chuỗi dài, sang xám, xù xì, khơ, bề số phân tán riêng lẻ tập mặt khuẩn lạc nhăn trung thành đám có núm lồi Khuẩn lạc dạng R, hình Trực khuẩn G (+), hình que ngắn, trịn đều, lượn sóng, tế bào dạng đơn, đơi, hai đầu nhẵn, thường có vịng trịn kích thước x1,2 -5 x tròn đồng tâm bề mặt, 1,5 µm Tế bào cịn non đứng B megaterium có màu trắng sữa riêng lẻ, tế bào già trịn nhẵn chuyển sang màu kem, có hơn, đơi có hình thoi, tù hai màu nâu nhạt có ánh đầu mờ, đục Khuẩn lạc dạng R, trịn, Vi khuẩn Gram dương, hình que to, có núm lồi lên dài tương đối đồng hai đầu có màu vàng nhạt vng tạo thành chuỗi từ - vi B licheniformis khuẩn, kích thước x 0,5 – x 1,5 µm Khuẩn lạc khơ, hình trịn, Hình que, Gram (-), sinh trưởng có nhiều nếp nhăn màu riêng rẽ, cặp tế bào Nitrobacter sp trắng bề mặt tạo thành chuỗi ngắn Nitrosomonas sp Khuẩn lạc khơ, hình trịn, Dạng hình que ngắn hình LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com S cerevisiae màu trắng, xuất vịng trịn có màu trắng bề mặt khuẩn lạc, khơng có nếp nhăn Khuẩn lạc trịn, dạng giọt, đồng nhất, có màu trắng đục, bề mặt khuẩn lạc trơn bóng bầu dục, kích thước từ 1-2 x µm, Gram âm, có màng nhầy, có tiêm mao dài Dạng hình ovan, đơi hình trứng, nảy chồi Kích thước trung bình 4-6 µm 3.2 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố pH, nhiệt độ, tỷ lệ giống (%) đến trình lên men - Các nhóm vi khuẩn sinh trưởng phát triển mạnh pH = 7, nấm men thích hợp giá trị pH = - Nhiệt độ yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến khả tăng trưởng vi sinh vật Qua khảo sát nhận thấy nhóm vi khuẩn phát triển tốt khoảng nhiệt độ 35370C, nấm men tăng trưởng mạnh 290C - Lượng giống bổ sung vào trình lên men khoảng 5% thích hợp để thu sinh khối tế bào 3.3 Khảo sát khả tăng trưởng chủng giống Qua trình khảo sát, hầu hết giống sản xuất tăng trưởng mạnh thời gian từ 30 đến 48 Sau thời gian 50 pha suy tàn biểu rõ rệt Do vậy, cần phải tiến hành thu sinh khối giống với khoảng thời gian cụ thể sau: • L acidophilus từ 30 đến 36giờ • L sporogenes từ 36 đến 42 • B subtilis B megaterium từ 30 đến 36 • B licheniformis từ 42 đến 48 • Nitrosomonas Nitrobacter từ 30 đến 36giờ • Sacharomyces cerevisiae từ 30 đến 36giờ 3.6 Quy trình sản xuất chế phẩm Sau kiểm tra số đặc tính chủng giống Chúng tơi tiến hành cấy chuyền, nhân giống sản xuất tiến hành lên men thu sinh khối hai sản phẩm men tiêu hóa (Elacmen), chế phẩm xử lý môi trường ao nuôi thủy sản (Biozeo), với thông số lên men cụ thể sau: - Môi trường lên men: Sử dụng môi trường MRS cho chủng thuộc chi (Lactobacillus, Bacillus), môi trường Vinogratxkii chủng nitrate hóa, Mơi trường Hansen cho nấm men - pH môi trường: vi khuẩn (pH = 7.0), nấm men (pH = 6.0) - Nhiệt độ lên men: vi khuẩn (t0C = 370C), nấm men (t0C = 290C), - Thời gian lên men: • L acidophilus: 36giờ • L sporogenes: 42 • B subtilis B megaterium: 36 • B licheniformis: 48 • Nitrosomonas Nitrobacter: 36giờ • Sacharomyces cerevisiae: 36giờ LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.6.1 Quy trình sản xuất chế phẩm men vi sinh Elacmen, Elacvit Chủng đông khô M.trường lỏng, t0, thời gian Phục hồi Cấy phân vùng M trường rắn, t0, thời gian Nhân giống cấp M trường lỏng, t0, thời gian Lên men M trường rắn, t0, thời gian Gặt thu sinh khối tế bào Ly tâm Cố định tế bào Chất mang Thành phẩm Elacmen, Elacvit Bột gốc Xay mịn Kiểm nghiệm Kiểm nghiệm cuối Bao bì, nhãn mác, đóng gói Phối trộn Vitamin PP, B2, B6 Tá chất + chủng VSV Bán thành phẩm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.6.2 Quy trình sản xuất chế phẩm xử lý môi trường Biozeo Chủng đông khô M.trường lỏng, t0, thời gian Phục hồi Cấy phân vùng M trường rắn, t0, thời gian Nhân giống cấp Lên men M trường rắn, t0, thời gian Gặt thu sinh khối tế bào Ly tâm Cố định tế bào Chất mang Thành phẩm Biozeo Bột gốc Xay mịn Kiểm nghiệm Bao bì, nhãn mác, đóng gói Phối trộn Biozeo Kiểm nghiệm cuối Tá chất + chủng VSV Bán thành phẩm 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.7 Kết kiểm tra chất lượng sản phẩm Elacmen, Elacvit, Biozeo Bảng 3.8 Kết kiểm tra chất lượng chế phẩm men vi sinh Elacmen Sản phẩm kiểm tra Lô sản xuất Tiêu chuẩn sở Tên chế Thành phần 070710 080710 090810 phẩm B.subtilis 5.108 5.108 4.108 L.acidophilus 5.108 6.108 3.108 ≥ 106 CFU/g Elacmen 9 L.sporogenes 4.10 5.10 5.10 7 S.cerevisiae 5.10 6.10 8.107 Khơng có vi sinh vật tạp Âm tính Âm tính Âm tính Tạp nhiễm vi sinh vật nhiễm Độ ẩm ≤ 6% Độ ẩm 4,5 Bảng 3.9 Kết kiểm tra chất lượng chế phẩm men vi sinh Elacvit Lô sản xuất Kiểm tra Tiêu chuẩn sở 070810 120910 091010 B.subtilis 5.108 4.108 4.108 L.acidophilus 5.108 6.108 4.108 ≥ 106 CFU/g CFU/g L.sporogenes 5.109 4.109 5.109 S.cerevisiae 6.106 6.106 7.106 Vitamine B2 1,4 1,2 1,5 1,0-1,5 mg/g Vitamine B6 1,3 1,0 1,2 1,0-1,5 mg/g mg/g Vitamine PP 5,0 4,8 4,6 4,5-5,0 mg/g Khơng có vi s i n h Âm tính Âm tính Âm tính Tạp nhiễm ( ≥ 10-3) t ạp nhi ễm 4 Độ ẩm ≤ 6% Độ ẩm (%) Bảng 3.10 Kết kiểm tra chất lượng chế phẩm Biozeo Sản phẩm kiểm tra Lô sản xuất Tên chế Thành phần 050610 060610 070810 phẩm B.subtilis 4.106 6.106 7.106 6 B.megaterium 9.10 8.10 6.106 Biozeo B.licheniformis 3.106 2.106 5.106 Nitrosomonas sp 4.106 2.106 3.106 Nitrobacter sp 3.106 5.106 3.106 Tạp nhiễm vi sinh vật Độ ẩm (%) Tiêu chuẩn sở ≥ 106 CFU/g Âm tính Âm tính Âm tính Khơng có vi sinh tạp nhiễm Độ ẩm ≤ 6% Nhận xét: Kết kiểm tra độ sống lô sản xuất: 070710; 080710; 090810 chế phẩm Elacmen sau: Độ sống trung bình B subtilis qua lần kiểm tra 4.67108 CFU/g, L acidophilus 4.6 x 108 CFU/g, L sporogenes 4.67108 CFU/g, S cerevisiae 6.3107 CFU/g 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Từ kết định lượng vi sinh vật sống cho thấy chế phẩm Elacvit có kết cao theo tiêu chuẩn sở, cụ thể: - L.sporogenes cao 4.109-5.109 CFU/g - B.subtilis L.acidophilus trung bình đạt từ 4.108- 6.108 CFU/g - S.cerevisiae thấp nằm khoảng yêu cầu chế phẩm trung bình đạt từ 6.106 - 7.106 CFU/g Thành phần vitamine B2, B6, PP tiêu chuẩn khác nằm ngưỡng tiêu chuẩn sở (TCCS) nhà sản xuất Trong chế phẩm Biozeo độ sống chủng vi sinh lô 050610; 060610; 070810 đạt ngưỡng so với tiêu chuẩn sở (≥106 CFU/g) Tất lô sản xuất không bị tạp nhiễm vi sinh vật lạ (âm tính), độ ẩm ln ngưỡng cho phép Qua kết kiểm tra cho thấy tất tiêu kiểm tra đạt tiêu chuẩn sở Điều chứng tỏ công đoạn sản xuất chế phẩm phù hợp tác động đến độ sống vi sinh vật chế phẩm Hạn sử dụng sản phẩm: 24 tháng kể từ ngày sản xuất Bảo quản sản phẩm nơi khô ráo, tránh ánh sáng trực tiếp 3.8 Kết thử nghiệm chế phẩm thực địa 3.8.1 Kết xử lý môi trường nước nuôi tôm thẻ chân trắng Biểu đồ Kết khảo sát giá trị NH4+ theo thời gian xử lý chế phẩm Biozeo Biểu đồ Kết khảo sát giá trị NO2- theo thời gian xử lýbằngchế phẩmBiozeo Biểu đồ Kết khảo sát giá trị NO3- theo thời gian xử lý chế phẩm Biozeo 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nước sau xử lý chế phẩm đạt tiêu sinh hóa để đưa vào ni tơm, q trình ni tiếp tục xử lý để tiêu sinh hóa ln giữ khoảng tốt cho phát triển ấu trùng tôm (theo tiêu chuẩn chất lượng nước nuôi thủy sản TCVN 5943-1995) 3.8.2 Kết kiểm tra vi khuẩn Vibrio Bảng 3.11 Kết kiểm tra Vibrio harveyitheo thời gian xử lý chế phẩm BIOZEO Khuẩn lạc xanh CFU/ml Khuẩn lạc vàng Ao CFU/ml Trước xử lý Sau xử lý Trước xử lý Sau xử lý Ao 140 60 290 20 Ao 110 50 60 40 Kết luận: Sau xử lý chế phẩm BIOZEO từ 24 – 96 lượng vi khuẩn Vibrio giảm mạnh Có thể nói việc bổ sung chủng vi sinh vật chế phẩm làm ức chế đượcmột số vi sinh vật gây bệnh, Vibrio harveyi Như Biozeo tác nhân làm giảm nguy gây phát sinh bệnh vi khuẩn Vibrio 3.8.3 Ảnh hưởng chế phẩm Elacmen đến phát triển vấn đề phịng bệnh tơm thẻ chân trắng Bảng 3.12 Dấu hiệu bệnh lý khả phòng bệnh chu kì ni Giai đoạn Sử dụng chế phẩm Elacmen Sử dụng chế phẩm Biofish Bể Bể Đường ruột N Bám bẩn Bệnh Pr - - Đường ruột Không sử dụng chế phẩm Bể Bám bẩn Bệnh Pr - - Đường ruột Bám bẩn Bệnh Pr - - Z1 Khá - - Khá - - Khá - - Z2 Khá + + Khá - - Bt + + Z3 Bt - + Bt - - Bt + + M1 Bt - - Bt - - Bt + + M2 Bt - - Bt - - Bt + + M3 Bt - - Bt - - Bt - + P1 Bt - - Bt - - Bt - + P2 Bt - - Bt - - Bt - - P12 Bt - - Bt - - Bt - - Ghi chú: - : Âm tính , +: Dương tính, Bt: Bình thường, Pr: Bệnh Protozoae; Z (giai đoạn Zoae); N (Nauplli); M (Mysis); P (Postlarvae); Bt: bình thường 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Dùng chế phẩm Elacmen để đối chứng với việc xử dụng loại men vi sinh khác, nhận thấy ấu trùng tôm thẻ chân trắng từ giai đoạn Zoae1- Postlarvae12 sinh trưởng tốt tất bể Điều phản ánh qua hệ đường ruột, khả tiêu hóa thức ăn, kháng bệnh, lột xác gia tăng khích thước tơm Riêng bể sử dụng chế phẩm Elacmen giai đoạn Zoae1- Postlarvae12 đường ruột ấu trùng sau sử dụng chế phẩm tốt: đường ruột không bị đứt quãng, to đồng đều, nhu động ruột tốt, chứa nhiều thức ăn, đường phân vàng đều, dài chứng tỏ ấu trùng ăn tiêu thụ hiệu thức ăn Hiện tượng ấu trùng tôm bám bẩn mắc bệnh protozoa giai đoạn Zoea chất lượng tảo cung cấp vào bể chưa tốt, lượng thức ăn cung cấp vào bể dư làm hàm lượng chất hữu tăng tiền đề cho protozoa phát triển Mức độ bám bẩn ấu trùng tôm xuất giai đoạn Z2 Z3 , nhiên sử dụng chế phẩm Elacmen xử lý Formaline 25 - 30 ppm bể giảm bớt dần hết, có bể khơng sử dụng chế phẩm dấu hiệu bệnh khơng giảm Trong q trình ni ấu trùng tơm bị bệnh Protozoa số bệnh khiến tôm bị chết nhiều sức đề kháng không tốt Ở giai đoạn Z2 Z3, bệnh xuất bể sử dụng chế phẩm Elacmen bể đối chứng khác Bệnh giảm hết sau đó, bể (đối chứng không sử dụng chế phẩm) bệnh tiếp tục đến giai đoạn Post1 nguyên nhân khiến bể đạt suất nuôi thấp Tỉ lệ sống(%) 150 sử dụng chế phẩm 100 đối chứng 50 đối chứng ĐC3 không sử dụng N Z giai đoạn M P Biểu đồ Biểu đồ so sánh tỉ lệ sống bể giống theo giai đoạn Nhận xét: Tỉ lệ sống ấu trùng tơm có khác giai đoạn bể nuôi Bể sử dụng chế phẩm men tiêu hóa Elacmen bể đối chứng sử dụng chế phẩm men tiêu hóa Biofish cho tỷ lệ sống giai đoạn post xuất cao (lớn 50%) Riêng bể đối chứng không sử dụng chế phẩm cho suất thấp (35%) Kết cho thấy việc sử dụng chế phẩm men vi sinh có ảnh hưởng lớn tới suất nuôi tôm 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Xây dựng quy trình sản xuất cho chế phẩm men vi sinh Elacmen, Elacvit sử dụng chủng giống: B.subtilis, L.acidophilus, L.sporogenes, S.cerevisiae chế phẩm sinh hóa xử lý mơi trường ni tơm (Biozeo) sử dụng chủng: B.subtilis, B.megaterium, B.licheniformis, Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp Thiết lập thơng số thích hợp cho trình lên men: - Yếu tố pH: Đối với vi khuẩn thích hợp 7.0, nấm men 6.0 - Yếu tố nhiệt độ: Đối với vi khuẩn 370C, Nấm men 290C - Tỷ lệ giống bổ sung cho trình lên men thu sinh khối: 5% - Thời gian lên men thu sinh khối: chủng L acidophilus, B subtilis, B megaterium, Nitrosomonas, Nitrobacter, Sacharomyces cerevisiae khoảng 30 -36 giờ, L sporogenes từ 36-42 giờ, B licheniformis từ 42 đến 48 Triển khai sản xuất kiểm tra tiêu chuẩn chất lượng 03 chế phẩm (Elacmen, Elacvit, Biozeo) gồm lô sản phẩm, tất lô sản xuất đạt tiêu chuẩn sở (TCCS) với số lượng tế bào sống >106 CFU/g Sử dụng chế phẩm sinh hóa Biozeo có chứa chủng vi sinh vật tá chất Zeolite để bổ sung vào ao ni có tác dụng làm giảm tác nhân gây ô nhiễm môi trường ao nuôi giảm NH3+, NO2-, NO3-, vi khuẩn phát sáng Đồng thời làm tăng khả cạnh tranh sinh học giúp môi trường ao nuôi bền vững hiệu Sản phẩm men vi sinh Elacmen đưa vào sử dụng cho ao nuôi tôm công ty TNHH Anh Việt cho kết quả: Giai đoạn tôm post xuất đạt tỉ lệ sống > 50% mức trung bình so với bể sử dụng chế phẩm khác cao so với bể không sử dụng chế phẩm (35%) Tỉ lệ sống đánh giá mức độ mục tiêu nuôi tôm giống Cty TNHH Anh Việt, xã Phước thể, huyện Tuy Phong, Bình Thuận 4.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu cải tiến quy trình để nâng cao chất lượng sản phẩm sản xuất quy mô lớn Cần đánh giá chất lượng, hiệu sản phẩm đối tượng thủy sản khác quy mô rộng 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... sống vi sinh vật chế phẩm Hạn sử dụng sản phẩm: 24 tháng kể từ ngày sản xuất Bảo quản sản phẩm nơi khô ráo, tránh ánh sáng trực tiếp 3.8 Kết thử nghiệm chế phẩm thực địa 3.8.1 Kết xử lý môi trường. .. thời gian xử lý chế phẩm BIOZEO Khuẩn lạc xanh CFU/ml Khuẩn lạc vàng Ao CFU/ml Trước xử lý Sau xử lý Trước xử lý Sau xử lý Ao 140 60 290 20 Ao 110 50 60 40 Kết luận: Sau xử lý chế phẩm BIOZEO... sinh lý 0,9% (Phụ lục 6) 2.3.4 Thuốc nhuộm Gram (Phụ lục 7) 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp sản xuất chế phẩm men vi sinh chế phẩm sinh hóa xử lý mơi trường nước Mơ tả quy trình: