quy trình sản xuất chế phẩm hóa sinh xử lý môi trường cho sinh vật thủy sinh

Vi ệc sử dụng kháng sinh, các hóa chất bừa bãi đã gây nên sự kháng thuốc ở vi sinh vật đồng thời triệt tiêu những quần thể vi sinh vật có lợi cho môi trường ao nuôi và cũng là một trong

1 TÍNH C ẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

G ần đây việc tôm, cá chết hàng loạt trên các ao nuôi thủy sản đã gây thiệt hại lớn về kinh t ế cho người dân, các doanh nghiệp cũng như các cơ sở nuôi trồng và chế biến thủy sản Nguyên nhân chính là do m ất cân bằng sinh thái môi trường ao nuôi gây ra

Trong nuôi tr ồng thủy sản, thức ăn không ăn hết, chất thải và sự chuyển hóa dinh dưỡng

là ngu ồn gốc chủ yếu của sự ô nhiễm nước nuôi thủy sản Người ta đã quan sát, thấy rằng trong h ệ thống thâm canh tôm thì chỉ có 15 - 20% thức ăn được dùng vào phát triển mô động

v ật, có tới 15% tổng lượng thức ăn hao hụt do không ăn hết và thất thoát, chỉ có 40 - 45% là được sử dụng trong quá trình chuyển hóa bình thường

Nitrit, sulphurit và photpho là nh ững yếu tố chủ yếu bắt nguồn từ thức ăn Việc cho thức

ăn quá nhiều, thức ăn dễ tan, thức ăn khó hấp thu sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới sinh trưởng và phát tri ển của sinh vật đang nuôi đồng thời sẽ là những điều kiện thuận lợi cho hệ vi sinh phát tri ển nhất là hệ vi sinh không có lợi Đây cũng chính là những yếu tố gây nên các bệnh về tôm, cá khi ến tôm, cá chết hàng loạt trên diện rộng Người ta ước tính rằng, có khoảng 63 - 78% nitơ và 76 - 80% photpho cho tôm, cá ăn bị thất thoát vào môi trường Các nguồn khác

c ủa chất thải hữu cơ là mảnh vụn thực vật phù du hoặc tảo dạng sợi (lab-lab) và chất lắng đọng hoặc chất hữu cơ hoà tan, huyền phù là do nước lấy vào mang theo

Khi hàm lượng nitơ, photpho và các chất dinh dưỡng khác trong ao nuôi gây nên sự phú dưỡng và dẫn tới tăng sức sản xuất ban đầu và nở rộ của vi khuẩn Sự có mặt của các hợp chất

h ữu cơ sẽ làm giảm ôxy hoà tan và tăng BOD, COD, sulfit hydrogen, ammoniac và hàm lượng methan (CH4) trong môi trường ao nuôi Đây cũng chính là những điều kiện bất lợi cho sinh trưởng và phát triển của vật nuôi

Vi ệc sử dụng kháng sinh, các hóa chất bừa bãi đã gây nên sự kháng thuốc ở vi sinh vật đồng thời triệt tiêu những quần thể vi sinh vật có lợi cho môi trường ao nuôi và cũng là một trong nh ững yếu tố gây mất cân bằng hệ sinh thái ao nuôi

S ự phát triển của các khu công nghiệp đã thải vào môi trường nước những yếu tố bất lợi gây nên s ự ô nhiễm nguồn nước, làm ảnh hưởng nhiều đến sinh trưởng và phát triển của động

v ật nuôi đồng thời phá vỡ sinh thái môi trường

T ừ những thực trạng trên nên việc đưa các chế phẩm sinh học – sinh hóa áp dụng trong nuôi th ủy sản là một trong những giải pháp mang tính sinh thái, bền vững và cần thiết Giống

vi khu ẩn lactobacillus đặc biệt là nhóm probiotic(nhóm vi khuẩn sinh acid lactic) sẽ kích thích

vi ệc hấp thu và sử dụng thức ăn của vật nuôi triệt để hơn Nhóm vi khuẩn này còn giúp cân

b ằng hệ vi sinh vật đường tiêu hóa của vật nuôi, tăng miễn dịch cho co thể, chống chọi với các y ếu tố môi trường khác tốt hơn Kết hợp với vi khuẩn nhóm Bacillus, nitrobacter xử lý cải thi ện chất lượng nước ao nuôi phía bên ngoài sẽ giúp hệ sinh thái ao nuôi trở nên cân bằng

b ền vững và có lợi cho vật nuôi

2 M ục tiêu đề tài

− Xây d ựng quy trình sản xuất men vi sinh và quy trình sản xuất chế phẩm hóa sinh

x ử lý môi trường cho sinh vật thủy sinh

− S ản xuất thử nghiệm chế phẩm

− Đánh giá hiệu quả của sản phẩm trên thực địa

3 Cách ti ếp cận, phương pháp nghiên cứu, phạm vi nghiên cứu

Cách tiếp cận:

H ệ thống ao nuôi thủy sản phải là một hệ sinh thái bền vững Điều này có thể điều chỉnh

t ới trạng thái cân bằng nhờ hệ vi sinh vật có lợi cho môi trường ao nuôi Nghiên cứu được

ti ến hành trực tiếp và đánh giá bằng thực nghiệm, từ đó chọn lọc và đưa ra những chủng vi khu ẩn có lợi nhất cho việc sản xuất những chế phẩm thích hợp

Phương pháp nghiên cứu:

S ử dụng các phương pháp lên men để thu sinh khối từ vi sinh vật Từ đó kết hợp với các nhóm tác nhân gây b ệnh ở môi trường ao nuôi nhằm tạo ra những dòng sản phẩm thích hợp ứng dụng trong môi trường nuôi trồng thủy hải sản

Ph ạm vi nghiên cứu:

− Các loài thu ộc giống Lactobacillus (L acidophillus; L sporogenes,…)

− Các loài thu ộc giống Bacillus (Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis,… )

− Saccharomyces cerevisiae

− Nitrobacter, Nitrosomonas

− Tá dược hấp phụ đường zeolite

− Thử nghiệm chế phẩm trên môi trường nuôi thủy sản tỉnh Bình Thuận

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Probiotic và một số ứng dụng

Probiotic là thu ật ngữ có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp bao gồm hai từ: pro- vì, biosis – sự

s ống Probiotic là chế phẩm chứa các vi sinh vật sống đã được chọn lọc mà khi đưa vào cơ thể qua đường miệng với lượng lớn sẽ ảnh hưởng có lợi đến sức khoẻ vật chủ Khái niệm này bắt ngu ồn từ giả thiết của nhà bác học Nga Metchinikoff (1845-1916) cho rằng người nông dân Bulgari luôn s ống rất khoẻ mạnh là vì họ thường xuyên dùng sữa chua có chứa vi khuẩn lactic, chúng ảnh hưởng tới hệ vi sinh vật đường ruột và làm giảm tác động gây độc của vi sinh v ật gây hại

Các vi sinh v ật dùng làm probiotic thường có các đặc điểm sau:

 Có kh ả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa của vật chủ;

 D ễ nuôi cấy;

 Không sinh ch ất độc và không gây bệnh cho vật chủ;

 Có kh ả năng tồn tại trong một thời gian dài;

 Có kh ả năng sinh các enzyme, chất kháng sinh hoặc các sản phẩm cuối cùng mà

v ật chủ có thể sử dụng được;

 Ch ịu được pH thấp ở dạ dày và muối mật ở ruột non;

 Bi ểu hiện hiệu quả có lợi đối với vật chủ

Ảnh hưởng của các chế phẩm probiotic có thể trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua khu hệ

vi sinh v ật đường ruột Nhiều chế phẩm loại này rất có lợi cho sức khỏe con người Chúng được sản xuất ở ba dạng: dạng viên, bột hoặc nước Tác dụng có ích của probiotic có rất nhi ều, có thể nêu một số như: [6,16]

 Tăng cường tiêu hóa lactose và hoạt động của các enzyme khác

 Ch ữa tiêu chảy do kháng sinh: sử dụng kháng sinh, đặc biệt là clindamycine, cephalosporine, penicilline d ễ dẫn đến tiêu chảy do mất cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột

 Ch ữa viêm đường tiêu hóa do virus rota Các virus này xâm nhập vào các tế bào

ở đỉnh nhung mao ruột, phá hủy nhung mao, làm mất khả năng hấp thu chất dinh dưỡng và chất điện giải

 Ngăn ngừa việc viêm nhiễm âm đạo Nhiều nghiên cứu cho thấy khi uống hàng ngày 109-1010 vi khu ẩn Lactobacillus rhamnosa GR-1 và Lactobacillus fermentum RC-14 s ẽ tránh viêm nhiễm âm đạo,

1.2 Các chủng vi sinh vật sử dụng trong chế phẩm men tiêu hóa và chế phẩm xử lý môi trường ao nuôi thủy hải sản

1.2.1 Chi Lactobacillus

1.2.1.1 Lactobacillus acidophilus

Lactobacillus acidophilus là nh ững trực khuẩn G (+), không tạo bào tử không có khả năng

di động

Lactobacillus acidophilus có nhi ều trong sữa chua, pho mát và các sản phẩm lên men lactic khác Ở cơ thể người Lactobacillus acidophilus có nhiều ở ruột, âm đạo, miệng

1.2.1.2 Lactobacillus sporogenes

Lactobacillus sporogenes l ần đầu tiên được phân lập và mô tả vào năm 1993 bởi các nhà khoa h ọc Nga LM Horowitz-Wlassowa và NW Nowotelnow (Zentbl F Bakt., 1933) L sporogenes là m ột trong các vi sinh sản xuất ra acid lactic, acid hoá đường ruột và ngăn ngừa được sự phát triển của các vi khuẩn gây thối rữa, có khả năng sinh bào tử được ứng dụng trong s ản xuất men tiêu hóa và các sản phẩm khác

1.2.2 Chi Bacillus

H ầu hết các vi khuẩn thuộc chi Bacillus là vi khuẩn dinh dưỡng hóa hữu cơ, thu năng

lượng dự trữ từ quá trình acid hóa các hợp chất hữu cơ và chúng có thể phát triển với carbondioxide ho ặc carbonmonoxide nhưng nguồn cacbon là năng lượng duy nhất

V ề mặt dinh dưỡng B subtilis thuộc loại nguyên dưỡng, trong khi các loài khác như B.cereus và B.sphaericus đòi hỏi về chất hữu cơ tối thiểu như amino acid hay vitamin dư

th ừa

Khi có m ặt của không khí phần lớn các vi khuẩn Bacillus đều có thể phát triển và sinh

bào t ử Phần lớn trong chúng có enzyme catalase

Các thành viên c ủa nhóm Bacillus ít phát triển kị khí khi không có các chất nhận điện tử

ngo ại sinh B subtilis được xem là một vi khuẩn hiếu khí hoàn toàn nhưng chúng có thể phát

tri ển trong điều kiện không có oxygene và sản sinh acetoin, acetate, các acid và 2,3-butadiendiol t ừ pyrovate thông qua acetolactate B subtilis có thể phát sinh NAD+

t ừ sự biến đổi acetoin thành butanectiol, do đó nó có thể phát triển kị khí mạnh hơn và cạnh tranh với

B.cereus và B.licheniformis

1.2.3 Nitrosomonas

Nitrosomonas có d ạng hình cầu hoặc hình bầu dục ngắn, kích thước từ 1-2 x 3 µm, G (-), có màng nh ầy, không sinh bào tử, có tiêm mao dài nên có thể chuyển động được Phát tri ển mạnh nhất ở pH= 7,0 - 8,6

Vi khu ẩn này thuộc nhóm hóa tự dưỡng, chúng sử dụng năng lượng tạo ra để khử CO2

t ạo ra các hợp chất hữu cơ Trong quá trình nitrat hóa Nitrosomonas đóng vai trò oxy hóa

amonium thành nitrit [3]

Nitrosomonas Nitrobacter

NH3 NO2- NO3-

1.2.4 Nitrobacter

Nitrobacter là vi khu ẩn G (-), sống tự dưỡng bắt buộc không sinh bào tử, khuẩn lạc trong su ốt, bé (khoảng 0.2 µm) Nitrobacter có hình que, hình lê hoặc đa hình, di động hoặc

không di động Nhiệt độ phát triển tối ưu là 370

C, pH=7.3 - 7.5, ch ết ở nhiệt độ lớn hơn 490

C

ho ặc bé hơn 00

C

M ột số loài Nitrobacter: Nitrobacter winogradskyi, Nitrobacter hamburgensis, Nitrobacter vulgaris

Nitrobacter đóng vai trò quan trọng trong chu trình nitơ bởi vì chúng oxy hóa nitrit, nitrat s ử dụng năng lượng cho hoạt động sống thay vì phải sử dụng nguồn năng lượng cacbon [3,24]

1.2.5 Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae thường được dùng trong công nghiệp cồn etylic, men bánh

mì, sinh kh ối Protein và sản xuất rượu, bia Chúng có cả hai hình thức sinh sản: vô tính và

h ữu

Hình thái t ế bào

Saccharomyces cerevisiae có d ạng hình ovan, đôi khi hình tròn (phụ thuộc điều kiện nuôi c ấy) Kích thước trung bình 4-6 µm Không bào thay đổi rõ rệt trong quá trình nuôi cấy Kích thước không bào có thể thay đổi tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy và tuổi của tế bào Trong t ế bào trẻ các không bào hầu như không thấy, ở các tế bào già không bào đôi khi chiếm

t ới 80% [11,13]

CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Các chủng vi sinh vật

- Vi khu ẩn thuộc chi Lactobacillus (L acidophillus, L sporogenes,…)

- Vi khu ẩn chi Bacillus (B megaterium, B licheniformis, B subtilis,… )

- Vi khu ẩn phân giải nitơ (Nitrobacter sp., Nitrosomonas sp.)

- N ấm men Saccharomyces cerevisiae

Các ch ủng giống sử dụng trong sản xuất chế phẩm được bảo quản dưới dạng đông khô Ch ủng được lưu giữ tại phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh thuộc khoa Sinh học trường Đại học Đà Lạt

2.1.2 Đối tượng thử nghiệm

Các h ồ nuôi Tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) tại Công ty TNHH Anh Việt, xã Phước Thể, huyện Tuy Phong, tỉnh Bình Thuận

2.2 Th ời gian và địa điểm nghiên cứu

- Th ời gian từ tháng 3/2010 đến tháng 12/2011

- Phòng thí nghi ệm Công nghệ vi sinh – Khoa Sinh học Trường Đại học Đà Lạt

- Công ty TNHH Anh Vi ệt, xã Phước Thể, huyện Tuy Phong, tỉnh Bình Thuận

2.3 Môi trường và hóa chất

2.3.1 Môi trường nuôi cấy và kiểm tra độ sống của sản phẩm

Môi trường MRS lỏng, môi trường MRS đặc (phụ lục 1, 2), môi trường Hansen (phụ

l ục 3), Môi trường Vinogratxkii (Phụ lục 4)

2.3.2 Môi trường kiểm tra độ tạp nhiễm

Môi trường MRS đặc, pH = 6,8-7,2 sau hấp (Phụ lục 2)

Môi trường Hansen đặc, pH=6,2 sau hấp (phụ lục 3)

Môi trường Sabouraud, pH = 5,6 sau hấp (Phụ lục 5)

Môi trường tổng hợp pha sẵn TCBS (Merck, Đức): Kiểm tra vi khuẩn Vibrio

2.3.3 Nước muối sinh lý 0,9% (Phụ lục 6)

2.3.4 Thuốc nhuộm Gram (Phụ lục 7)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp sản xuất chế phẩm men vi sinh và chế phẩm sinh hóa xử lý môi trường nước

Mô t ả quy trình:

Ph ục hồi chủng: Khui riêng rẽ từng giống đông khô và cấy vào môi trừơng MRS lỏng,

Hansen l ỏng, Vinogratxkii lỏng, ủ ấm 37o

C/4 – 6h đối với vi khuẩn, 290C đối với nấm men

Ch ế phẩm Elacmen, Elacvit sử dụng các chủng: B.subtilis, L.acidophilus, L.sporogenes, S.cerevisiae

Ch ế phẩm Biozeo sử dụng các chủng: B.subtilis, B.megaterium, B.licheniformis, Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp

Nhân giống: Nhân giống riêng từng chủng trên môi trường lỏng, ủ ấm 37o C đối với vi khu ẩn, 290C đối với nấm men sau 48h Kiểm tra độ thuần khiết của từng loại trước khi cấy

C ấy chủng: Cấy riêng từng chủng trên các Roux chứa môi trường đặc đã hấp vô trùng

M ỗi Roux cấy 5ml canh chủng giống Ủ ấm 37oC đối với vi khuẩn Bacillus, Lactobacilus,

290C đối với nấm men, tiến hành lên men 48h

Gặt sinh khối: Dùng nước muối sinh lí để gặt sinh khối, ly tâm 4000 vòng/phút, thời

gian 30 phút

Làm khô sinh kh ối: Làm khô sinh khối trong tủ ấm ở 40o

C, có qu ạt hút

Thu b ột gốc: Xay bột gốc khi đã khô, kiểm tra độ sống của bột gốc theo phương pháp

Koch

Tr ộn bán thành phẩm:

S ử dụng tá chất phối trộn: chế phẩm Elacmen (sử dụng đường lactose, bột mì), chế

ph ẩm Elacvit (sử dụng tá chất gồm đường lactose, bột mì và bổ sung thêm viatmin PP, B2,

B6), Ch ế phẩm Biozeo (Zeolite, đường lactose), sau đó trộn với bột gốc tương ứng (sinh khối

vi sinh v ật)

Ch ế phẩm sau khi trộn phải đảm bảo các thành phần được trộn đều, đúng nồng độ vi sinh v ật theo tiêu chuẩn cơ sở (TCCS)

Ki ểm tra độ sống, độ thuần khiết của bán thành phẩm: Trước khi đưa ra đóng gói thì

lô bán thành ph ẩm đó phải được lấy mẫu theo nguyên tắc trên, dưới, trái, phải để kiểm tra độ đồng đều, độ sống, độ thuần khiết Nếu kết quả kiển tra đạt thì lô bán thành phẩm đó mới được đưa qua đóng gói

Đóng gói: Việc đóng gói được thực hiện trong phòng sạch, đảm bảo độ ẩm nhỏ hơn

60% và th ực hiện ở nhiệt độ phòng

2.4.2 Phương pháp phục hồi chủng và nhân giống cấp I

2.4.3 Phương pháp lên men

- S ử dụng phương pháp lên men bề mặt trên môi trường đặc

- Dùng micropipette hút 4 ml giống cấp 1 bơm vào mỗi hộp Roux (có sẵn môi trường tương ứng cho các chủng sản xuất đã được hấp khử trùng), trải đều Đem ủ ấm 37o

C đối với vi khuẩn, 290C đối với nấm men trong 48-72 giờ

2.4.4 Phương pháp phối chế sản phẩm

2.4.5 Phương pháp nhuộm Gram

2.4.6 Phương pháp định tính và định lượng mẫu sản phẩm

2.4.6.1 Định tính vi sinh vật trong sản phẩm

2.4.6.2 Định lượng vi sinh vật trong sản phẩm

2.4.7 Ki ểm tra tạp nhiễm của sản phẩm

2.4.7.1 Ki ểm tra tạp nhiễm vi khuẩn

2.4.7.2 Ki ểm tra tạp nhiễm vi nấm

2.4.8 Phương pháp kiểm tra độ ẩm sản phẩm

2.4.9 Phương pháp lấy mẫu chế phẩm và lấy mẫu nước ấu trùng tôm

2.4.10 Phương pháp bố trí thí nghiệm ao nuôi và thả tôm giống

2.4.10.1 Xử lý nước nuôi tôm giống bằng chế phẩm xử lý môi trường (Biozeo)

2.4.10.2 Nuôi tôm giống có bổ sung chế phẩm men vi sinh

Dùng 3 b ể thử nghiệm, dung tích mỗi bể bố trí thí nghiệm là ≥ 9m3

, di ện tích bề mặt 9m2, cao 1.2m Lượng nước cấp vào cho mỗi bể là 7m3/bể Mật độ bố trí của các bể 1 và bể 2

là 250 Nauplius/lít

B ể 1: Cho ăn chế phẩm Elacmen

B ể 2: Cho ăn chế phẩm Biofish

B ể 3: Bể đối chứng không sử dụng men vi sinh

M ỗi ngày cho ăn một lần vào 6 giờ sáng

Li ều lượng sử dụng chế phẩm: Trong suốt quá trình nuôi từ giai đoạn Zoea 1 đến khi Post xu ất cân chế phẩm sục vào nước 15-30 phút rồi trộn thức ăn vào, để yên 15 phút rồi cho tôm ăn

2.4.11 Phương pháp đo pH

2.4.12 Phương pháp xác định nitrate, nitric (NO3 , NO2)

2.4.13 Phương pháp xác định amonium (NH4 +)

2.4.14 Phương pháp kiểm tra vi khuẩn Vibrio haveyi

2.4.15 Phương pháp theo dõi sự sinh trưởng của tôm giống

2.4.16 Phương pháp xử lý số liệu

- S ử dụng phần mềm Excel 2010 để xử lý kết quả

- Cách tính số lượng ấu trùng: Dùng một cốc thủy tinh có dung tích 1 lít đưa vào bể múc 5

điểm khác nhau trong bể nhằm đảm bảo độ chính xác mật độ phân bố của ấu trùng Đếm hết

số ấu trùng 5 lần đã múc, ta tính được trung bình số ấu trùng trong 1 lít Tiếp theo đưa số liệu

đã có vào công thức sau ta sẽ tính được tỉ lệ sống của ấu trùng còn lại trong bể

a: t ỉ lệ sống của ấu trùng b: trung bình s ố ấu trùng đếm được trong 5 lần đếm

c: s ố ấu trùng bố trí ban đầu

Nước đầu

vào

X ử lý thô

C ấp vào trại (các b ể nuôi) Th ả Naupli

Zoea 1-3 Mysis 1-3

Post1 – Post xu ất T.ăn + men vi sinh Chăm sóc

Ch ế phẩm xử

lý môi trường

Chăm sóc T.ăn + men vi sinh

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Đặc điểm sinh học các chủng vi sinh vật sản xuất chế phẩm

Sau khi hoàn nguyên ch ủng giống trong môi trường canh thang dinh dưỡng và ủ trong

t ủ ấm ở nhiệt độ 37oC (đối với các chủng vi khuẩn), trên môi trường Hansen lỏng ở nhiệt độ

29oC (đối với nấm Saccharomyses) trong 4 - 6 giờ tất cả các ống giống gây đục môi trường

C ấy ria trên các hộp petri chứa môi trường thạch MRS đối với các chủng (L acidophillus, L sporogenes,B megaterium, B licheniformis, B subtilis ) , môi trường

Winogratskii cho các ch ủng (Nitrosomonas, Nitrobacter) ủ ở 370

C, nuôi c ấy nấm men trên môi trường thạch Hansen ở 29o

C trong 18 - 24 gi ờ, tiến hành khảo sát đặc điểm khuẩn lạc, làm tiêu b ản quan sát hình thái tế bào Kết quả khảo sát đặc điểm của chủng giống được thể

hi ện qua bảng sau:

B ảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng giống

STT Ch ủng vi sinh vật Đặc điểm khuẩn lạc Hình thái t ế bào

1 L acidophillus

Khu ẩn lạc dạng R, sần sùi,

nh ầy, bờ riềm không đều

và nhăn nheo, có màu

tr ắng sữa, núm to và nhô cao

Tr ực khuẩn Gram dương, nối nhau thành chu ỗi hoặc nằm riêng

r ẽ Kích thước ngắn, tương đối đồng đều về hình thể, hai đầu hơi tròn

2 L sporogenes

Khu ẩn lạc dạng R, đường kính sau 24h nuôi c ấy 4-4,5 mm, hơi xám nâu, mướt, núm lồi ở giữa

D ạng trực khuẩn, xếp riêng rẽ, ít khi x ếp thành chuỗi ngắn, Gram dương, hai đầu tù và hai đầu bắt màu đậm

3 B subtilis

Khu ẩn lạc dạng R, tròn,

b ờ riềm không đều, có màu vàng nh ạt chuyển dần sang xám, xù xì, khô, b ề

m ặt khuẩn lạc hơi nhăn và

có núm l ồi ở giữa

Tr ực khuẩn Gram dương Tế bào

x ếp thành từng đôi hay từng chu ỗi ngắn hoặc chuỗi dài, một

s ố phân tán riêng lẻ hoặc tập trung thành đám

4 B megaterium

Khu ẩn lạc dạng R, hình tròn đều, hơi lượn sóng,

nh ẵn, thường có các vòng tròn đồng tâm trên bề mặt,

có màu tr ắng sữa và chuy ển sang màu kem, có khi màu nâu nh ạt có ánh

m ờ, đục

Tr ực khuẩn G (+), hình que ngắn, các t ế bào dạng đơn, đôi, hai đầu hơi tròn kích thước 2 x1,2 -5 x 1,5 µm T ế bào còn non đứng riêng l ẻ, tế bào già tròn và nhẵn hơn, đôi khi có hình thoi, tù hai đầu

5 B licheniformis

Khu ẩn lạc dạng R, tròn,

to, ở giữa có núm lồi lên

có màu vàng nh ạt

Vi khu ẩn Gram dương, hình que dài tương đối đồng đều ở hai đầu vuông t ạo thành chuỗi từ 2 - 4 vi khu ẩn, kích thước 2 x 0,5 – 5 x 1,5 µm

6 Nitrobacter sp

Khu ẩn lạc khô, hình tròn,

có nhi ều nếp nhăn màu

tr ắng trên bề mặt

Hình que, Gram (- ), sinh trưởng riêng r ẽ, trong những cặp tế bào

ho ặc tạo thành những chuỗi ngắn

7 Nitrosomonas sp Khu ẩn lạc khô, hình tròn, Dạng hình que ngắn hoặc hình

màu tr ắng, xuất hiện vòng tròn có màu tr ắng trên bề

m ặt khuẩn lạc, không có

n ếp nhăn

b ầu dục, kích thước từ 1-2 x 3

µm, Gram âm, có màng nh ầy, có tiêm mao dài

8 S cerevisiae

Khu ẩn lạc tròn, dạng giọt, đồng nhất, có màu trắng đục, bề mặt khuẩn lạc trơn bóng

D ạng hình ovan, đôi khi hình

tr ứng, nảy chồi Kích thước trung bình 4-6 µm

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố pH, nhiệt độ, tỷ lệ giống (%) đến quá trình lên men

- Các nhóm vi khu ẩn có thể sinh trưởng và phát triển mạnh ở pH = 7, nấm men thích hợp

ở giá trị pH = 6

- Nhi ệt độ là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng tăng trưởng của vi sinh vật Qua

kh ảo sát chúng tôi nhận thấy các nhóm vi khuẩn phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ

35-370C, n ấm men tăng trưởng mạnh ở 290

C

- Lượng giống bổ sung vào quá trình lên men khoảng 5% là thích hợp để thu sinh khối tế bào

3.3 Khảo sát khả năng tăng trưởng của các chủng giống

Qua quá trình kh ảo sát, hầu hết các giống sản xuất tăng trưởng mạnh trong thời gian từ 30

gi ờ đến 48 giờ Sau thời gian 50 giờ pha suy tàn biểu hiện rõ rệt Do vậy, chúng ta cần phải

ti ến hành thu sinh khối các giống với các khoảng thời gian cụ thể như sau:

• L acidophilus t ừ 30 giờ đến 36giờ

• L sporogenes từ 36 giờ đến 42 giờ

• B subtilis và B megaterium t ừ 30 giờ đến 36 giờ

• B licheniformis từ 42 giờ đến 48 giờ

• Nitrosomonas và Nitrobacter t ừ 30 giờ đến 36giờ

• Sacharomyces cerevisiae t ừ 30 giờ đến 36giờ

3.6 Quy trình s ản xuất chế phẩm

Sau khi đã kiểm tra một số đặc tính của chủng giống Chúng tôi tiến hành cấy chuyền, nhân gi ống sản xuất và tiến hành lên men thu sinh khối hai sản phẩm men tiêu hóa (Elacmen),

ch ế phẩm xử lý môi trường ao nuôi thủy sản (Biozeo), với các thông số lên men cụ thể như sau:

- Môi trường lên men: Sử dụng môi trường MRS cho các chủng thuộc chi (Lactobacillus, Bacillus), môi trường Vinogratxkii đối với các chủng nitrate hóa, Môi trường Hansen cho n ấm men

- pH môi trường: vi khuẩn (pH = 7.0), nấm men (pH = 6.0)

- Nhi ệt độ lên men: vi khuẩn (t0

C = 370C), n ấm men (t0

C = 290C),

- Th ời gian lên men:

• L acidophilus: 36giờ

• L sporogenes: 42 gi ờ

• B subtilis và B megaterium: 36 gi ờ

• B licheniformis: 48 gi ờ

• Nitrosomonas và Nitrobacter: 36gi ờ

• Sacharomyces cerevisiae: 36giờ

3.6.1 Quy trình s ản xuất chế phẩm men vi sinh Elacmen, Elacvit

M tr ường lỏng,

t0, th ời gian

Ph ối trộn

Tá chất + 4 chủng VSV

Vitamin PP,

B 2 , B 6

Bán thành ph ẩm

Ch ủng đông khô

Ph ục hồi

M.trường lỏng,

t0, th ời gian

C ấy phân vùng

Nhân gi ống cấp 1

M trường rắn,

t0, th ời gian

Lên men chính

G ặt thu sinh khối

t ế bào

C ố định tế bào

B ột gốc

Ly tâm

M tr ường rắn,

t0, thời gian

Ch ất mang

Xay mịn Kiểm nghiệm

Thành ph ẩm

Elacmen, Elacvit

Ki ểm nghiệm

cu ối

Bao bì, nhãn mác, đóng gói

3.6.2 Quy trình s ản xuất chế phẩm xử lý môi trường Biozeo

Ph ối trộn

Tá chất + 5

chủng VSV

Ch ủng đông khô

Ph ục hồi

M.tr ường lỏng,

t0, th ời gian

C ấy phân vùng

Nhân gi ống cấp 1

M trường rắn,

t0, thời gian

Lên men chính

G ặt thu sinh khối

t ế bào

C ố định tế bào

B ột gốc

Ly tâm

M trường rắn,

t0, thời gian

Chất mang

Xay mịn Kiểm nghiệm

Thành ph ẩm Biozeo

Ki ểm nghiệm

cu ối

Bao bì, nhãn mác, đóng gói