TIỂU LUẬN QUY TRÌNH PHÂN LẬP VÀ NHÂN GIỐNG NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH KHOA NÔNG NGHIỆP – THỦY SẢN ISO 9001 : 2015 TIỂU LUẬN QUY TRÌNH PHÂN LẬP VÀ NHÂN GIỐNG NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris) Giáo viên hướng dẫn : Th.s Nguyễn Ngọc Trai Bùi Đăng Khoa Sinh viên thực hiện: Mã số sinh viên: 117719002 Lớp: DA19CNSH Trà Vinh, tháng 07 năm 2022 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH KHOA NÔNG NGHIỆP – THỦY SẢN ISO 9001 : 2015 TIỂU LUẬN QUY TRÌNH PHÂN LẬP VÀ NHÂN GIỐNG NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris) Giáo viên hướng dẫn : Th.s Nguyễn Ngọc Trai Bùi Đăng Khoa Sinh viên thực hiện: Mã số sinh viên: 117719002 Lớp: DA19CNSH Trà Vinh, tháng 07 năm 2022 MỤC LỤC MỤC LỤC PHỤ LỤC HÌNH ẢNH PHẦN 1: MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN I Tổng quan nấm đông trùng hạ thảo 1.1 Tên gọi 1.2 Nguồn gốc hình thành: 1.3 Đặc điểm phân loại 1.4 Thành phần 10 1.5 Tác dụng dược lý đông trùng hạ thảo theo y học đại: 12 1.5.1 Chống oxy hóa: 12 1.5.2 Tác dụng kháng tế bào ung thư: 12 1.5.3 Tác dụng chống mệt mỏi stress: 12 1.5.4 Tác dụng hệ hô hấp: 12 1.5.6 Tác dụng chống sợi hoá phổi: 12 1.6 Ứng dụng đông trùng hạ thảo lâm sàng: 13 II Tình hình nghiên cứu nước nước: 13 2.1 Tình hình nghiên cứu nước: 13 2.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước: 14 2.2.1 Cordyceps sinensis: 14 2.2.2 Cordyceps militaris 16 2.2.2.1 Đặc điểm sinh học nấm Cordyceps militaris 16 a Phân loại mô tả nấm Cordyceps militaris 16 b Chu trı̀nh sống nấm Cordyceps militaris 19 c Ký chủ 19 2.2.2.2 Giá trị dược liệu Cordyceps militaris 21 b Các thành phần hóa học nấm Cordyceps militaris: 22 2.3 Các nghiên cứu nuôi cấy Cordyceps militaris: 24 2.3.1 Nguồn dinh dưỡng 24 2.3.2 Thời gian hình thành thể suất Quả thể 24 2.3.3 Yêu tố môi trường tác động đến việc nuôi cấy: 25 a Ảnh hưởng điều kiện môi trường đến q trình ni trồng nấm: 25 b Ảnh hưởng dinh dưỡng môi trường nuôi nấm: 26 c Ảnh hưởng điều kiện môi trường nuôi cấy: 26 2.3 Các nghiên cứu Đông trùng hạ thảo Việt Nam: 28 CHƯƠNG 2: SẢN XUẤT ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (CORDYCEPS MILITARIS) Ở QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM 29 I Mục đích 29 II Xây dựng quy trình ni cấy: 30 2.1 Thời gian bắt đầu hình thành thể: 30 2.2 Đặc điểm hình thành thể C militaris 30 2.3 Năng suất thể nuôi cấy: 32 III Đánh giá chất lượng Đông trùng hạ thảo 33 3.1 Hàm lượng nucleoside thị thể sợi nấm phát triển giá thể: 33 3.1.1 Hàm lượng adenosine sản phẩm: 33 3.1.3 Hàm lượng Guanosine mẫu sản phẩm: 35 3.2 Hàm lượng đạm tổng số, lipid tổng số tro tổng số: 36 3.3 Hoạt tính kháng oxy hóa: 36 PHẦN 2: QUY TRÌNH THỰC HÀNH NI CẤY NẤM CORDYCEPS MILITARIS 38 CHƯƠNG 1: QUI TRÌNH KỸ THUẬT PHÂN LẬP NẤM CORDYCEPS MILITARIS 38 I Dụng cụ, thiết bị: 38 Dụng cụ: 38 Thiết bị: 38 II Nguyên vật liệu hóa chất: 39 Nguyên vật liệu: 39 Hóa chất: 39 III Cách tiến hành 39 Chuẩn bị môi trường phân lập: 39 Sơ đồ quy trình kỹ thuật: 40 Pha môi trường phân lập: 40 Phân lập Nấm Đông trùng hạ thảo: 41 a Sơ đồ quy trình kỹ thuật: 41 b Các bước thực 41 CHƯƠNG 2: QUI TRÌNH KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY LỎNG (LẮC) NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (CORDYCEPS MILITARIS) 42 I Dụng cụ, thiết bị hóa chất: 42 Dụng cụ: 42 Thiết bị: 42 II Nguyên vật liệu hóa chất 42 Nguyên vật liệu: 42 Hóa chất: 43 III Cách tiến hành: 43 Chuẩn bị môi trường giống lắc: 43 Tiến hành pha môi trường 43 Tiến hành pha lít môi trường 44 Cách tiến hành tạo môi trường giống lắc: 44 a Sơ đồ mô tả: 44 b Các bước thực hiện: 44 CHƯƠNG 3: QUI TRÌNH NI NẤM ĐƠNG TRÙNG HẠ THẢO (CORDYCEPS MILITARIS) TRÊN GIÁ THỂ GẠO LỨC 46 I Dụng cụ, thiết bị: 46 Dụng cụ: 46 Thiết bị 46 II Nguyên vật liệu hóa chất 46 Nguyên vật liệu 46 Hóa chất 46 III Cách tiến hành: 46 Chuẩn bị môi trường dịch thể: 46 Tiến hành pha mơi trường cho 10 lít nước 47 a Pha môi trường: 47 b Tiến hành chủng giống: 48 PHẦN 3: KẾT QUẢ CỦA QUÁ TRÌNH PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO 49 I KẾT QUẢ NUÔI CẤY GIỐNG GỐC: 49 II KẾT QUẢ CỦA QUÁ TRÌNH TẠO GIỐNG LẮC 49 III KẾT QUẢ NUÔI CẤY ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO TRÊN MÔI TRƯỜNG GẠO LỨC 50 PHẦN 4: TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC BẢNG Bảng 1: Các hợp chất hoạt tính sinh học phân lập từ Cordyceps sp 11 Bảng 2: Một số ký chủ thuộc phân lớp khác nấm Cordyceps militaris 20 Bảng 3: Thành phần acid béo Cordyceps militaris 23 Bảng 4: Đặc điểm hình thái thể nấm C militaris chất điều kiện không chiếu sáng 31 Bảng 5: Đặc điểm hình thái thể nấm C militaris chất điều kiện có chiếu sáng 32 Bảng 6: Hàm lượng adenosine có thể hệ sợi nấm 34 Bảng 7: Hàm lượng cordycepin thể hệ sợi nấm 34 Bảng 8: Hàm lượng guanosine có thể hệ sợi nấm 35 Bảng 9: Hàm lượng đạm tổng số, lipid tổng số tro tổng số nấm C militaris 36 Bảng 10: Khảo sát Trọng lượng, chiều dài sợ nấm số lượng sợi nấm 50 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH Hình 1: Hình thái nấm Cordyceps sinensis Hình 2: Hình thái nấm Cordyceps sinensis (shashidhar ctv, 2013) 14 Hình 3: Hình thái nấm Cordyceps sinensis (Holliday Cleaver, 2004) 14 Hình 4: Cordyceps sinensis tìm thấy đồng cỏ độ cao 4200m mực nước biển Tibet 15 Hình 5: Các đoạn kẽm hây dây điện chêm vào thân nấm Cordyceps để tăng trọng lượng 16 Hình 6: Nấm Cordyceps militaris mặt cắt dọc thể chứa bào tử 17 Hình 7: Cordyceps militaris (www.jscr.jp) 18 Hình 8: Các lồi đơng trùng hạ thảo 18 Hình 9: Sự đa dạng hình thái C militaris 18 Hình10: Các dạng bào tử nấm Cordyceps militaris 20 Hình 11: Cordyceps militaris ni trồng điều kiện khác 25 Hình 12: Thời gian bắt đầu hình thành thể nấm C militaris 30 Hình 13: Hình thái thể nấm C militaris điều kiện chiếu sáng khác 31 Hình 14: Năng suất thể nấm C militaris loại chất khác 32 Hình 15: Khả kháng oxi hóa mẫu dịch chiết 37 Hình 16: Các thiết dụng cụ sử dụng phân lập 38 Hình 17: Các thiết bị sử dụng phân lập 39 Hình 18: Các hóa chất sử dụng cho phân lập 39 Hình 19: Các thao tác thực pha môi trường phân lập 40 Hình 20: Các bước tiến hành phân lập 41 Hình 21: Các thiết bị sử dụng pha chế môi trường lỏng 42 Hình 22: Các hóa chất sử dụng pha chế môi trường lỏng 43 Hình 23: Các bước thực pha chế mơi trường lỏng 43 Hình 24: Các bước thực tạo giống lắc 44 Hình 25: Các bước pha môi trường dịch thể 47 Hình 26: Các bước tạo môi trường gạo lức 48 Hình 27: Các bước tiến hành chủng giống 48 Hình 28: Nấm đơng trùng hạ thảo Cordyceps militaris sau ngày phân lập 49 Hình 29: Giống lắc sau ngày lắc máy 49 Hình 30: Nấm đơng trùng hạ thảo Cordyceps militaris sau 60 ngày nuôi cấy môi trường gạo lức 50 PHẦN 1: MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN I Tổng quan nấm đông trùng hạ thảo 1.1 Tên gọi Đông trùng hạ thảo (Chinese caterpillar fungus), gọi trùng thảo, hạ thảo đông trùng hay đông trùng thảo, loại đông dược quý có chất dạng ký sinh lồi nấm Cordyceps sinensic (thuộc nhóm Ascomycetes) thể sâu Hepialus fabricius Phần dược tính đơng trủng hạ thảo chứng minh chất chiết xuất từ nấm Cordyceps sinensic Tên gọi "đông trùng hạ thảo" xuất phát từ quan sát thực tế thấy vào mùa hè nấm Cordyceps sinensic mọc chồi từ đầu sâu nhô lên khỏi mặt đất (Nguyễn Thị Liên Thương ctv 2014) 1.2 Nguồn gốc hình thành: Vào mùa đơng nhìn cặp cá thể giống sâu (cơn trùng), cịn đến mùa hè chúng trơng giống lồi thực vật (thảo mộc) Riêng tên “Đông trùng hạ thảo” ghi chép vị thuốc xuất lần “Bản thảo cương mục” vào đời nhà Minh danh y Lý thời Trân (năm 1575), Đông Trùng Hạ Thảo xếp ngang với nhân sâm công chữa bệnh – thuộc vào loại toàn diện (Nguyễn Thị Liên Thương ctv 2014) Chu trình sống Cordyceps:  Cordyceps thuộc họ nấm, ký sinh thân trùng Mùa Đông, nấm ký sinh vào côn trùng, phát triển thành hệ sợi nấm (đây giai đoạn vô tính), sử dụng nguồn dinh dưỡng từ thể trùng giết chết côn trùng  Mùa hạ, sợi nấm vơ tính chuyển sang giai đoạn hữu tính, hình thành nấm quan chứa bào tử vô tính nhú lên khỏi mặt đất gốc dính liền vào thân sâu Hình 1: Hình thái nấm Cordyceps sinensis 1.3 Đặc điểm phân loại Chi nấm Cordyceps có tới 600 lồi khác Tuy nhiên người ta nghiên cứu nhiều loài Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc Cordyceps militaris (L ex Fr.) Link Từ năm 1964, có loại Cordyceps sinensis coi dược liệu có dược điển C sinensis Đơng trùng hạ thảo cịn sống, người ta trơng rõ hình sâu, với đuôi cành nhỏ, mọc Khi sấy khơ, có mùi cá, đốt lên có mùi thơm Phần "lá" hình dạng giống ngón tay, dài khoảng - 11cm sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu non mà thành Đầu sâu non giống tằm, dài chừng 3-5 cm, đường kính khoảng 0,3 0,8 cm Bên ngồi có màu vàng sẫm nâu vàng với khoảng 20-30 vằn khía, vằn khía gần đầu nhỏ Phần đầu có màu nâu đỏ, giống tằm, có tất cặp chân, đôi rõ Chất đệm nấm hình que cong mọc từ sâu non, dài sâu non chút Sâu non dễ bẻ gãy, ruột bên căng đầy, màu trắng vàng; chất đệm nấm dai bên ruột rỗng, có màu trắng ngà 1.4 Thành phần Các phân tích hố học cho thấy sinh khối (biomass) đơng trùng hạ thảo có 17 đến 19 loại acid amin khác nhau, có D-mannitol, có lipid, có nhiều nguyên tố vi lượng (Na, K, Ca, Mg, Al, Mn, Cu, Zn, Bo, Fe cao phospho) Quan trọng sinh khối đơng trùng hạ thảo có nhiều chất -6- hoạt động sinh học mà nhà khoa học khám phá dần, nhờ tiến ngành hoá học hợp chất tự nhiên Nhiều hoạt chất đông trùng hạ thảo có giá trị dược liệu thần kỳ Trong phải kể đến cordiceptic acid, cordycepin, adenosine, hydroxyethyl- adenosine Đáng ý nhóm hoạt chất HEAA ( Hydroxy-Ethyl - AdenosineAnalogs) Đơng trùng hạ thảo cịn chứa nhiều loại vitamin (trong 100g đông trùng hạ thảo có 0,12 g vitamin B12; 19 mg vitamin A; 116,03 mg vitamin C, ngồi cịn có vitamin B2 (riboflavin), vitamin E, vitamin K ), ngồi cịn có khoảng 25 - 30 % protein, 8% chất béo đường mannitol Theo Holiday Cleaver (2004), đông trùng hạ thảo sử dụng loại “thần dược” từ năm 620 sau CN, vào thời nhà Đường Trung Quốc (618-907) Năm 1994, Trung Quốc thức xếp loại đông trùng hạ thảo dược phẩm Sau đó, đơng trùng hạ thảo sử dụng nhiều dịch SARS xuất Trung Quốc vào năm 2003 Gần đây, đông trùng hạ thảo chứng minh có tác dụng điều trị bệnh tim mạch, hơ hấp, gan, thận, ức chế hình thành khối u, …(Chen et al., 2006; Kuo, Sua, Yang, Huang, & Chen, 2006; Wang & Shiao, 2000) 10 bình thủy tinh, sau hơ khử khuẩn miệng bình lữa đèn cồn đậy bình đóng nấp lại Ta thực thao tác đến hết môi trường lắc Sau cho giống nấm phân lập vào môi trường ta tiến hành đưa lên máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút vòng 4-5 ngày sử dụng để ni cấy đơng trùng hạ thảo 45 CHƯƠNG 3: QUI TRÌNH NI NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (CORDYCEPS MILITARIS) TRÊN GIÁ THỂ GẠO LỨC I Dụng cụ, thiết bị: Dụng cụ: - Ống đong - Cốc 500ml - Bình thủy tinh 500ml - Hộp nhựa - Dao - Xô Thiết bị - Nồi điện - Máy khuấy từ - Máy đo pH - Cân số lẽ - Nồi hấp tuyệt trùng autoclave II Nguyên vật liệu hóa chất Nguyên vật liệu Giống lắc lắc máy từ 5-7 ngày Hóa chất - PGA (Khoai tây) - Dextrose - Yeast extreet - MgSO4 - K2HPO4 - Đường cát III Cách tiến hành: Chuẩn bị môi trường dịch thể: - PGA (Khoai tây) kg - Dextrose 100g - Yeast extreet 100g - MgSO4 10g 46 - K2HPO4 15g - Đường cát 300g - Trứng gà 20 - pH 6,2 Tiến hành pha mơi trường cho 10 lít nước a Pha mơi trường: Hình 25: Các bước pha mơi trường dịch thể - PGA (Khoai tây) sau loại bỏ phần vỏ sẻ rữa sạch, sau tiến hành cân trọng lượng kg sau cắt nhỏ cho vào nồi đun sau cho khoảng 300 - 500ml nước cất vào nồi đun đến thấy hết dịch Sau dùng vải mỏng lọc hết phần dịch - Cân trọng lượng xác thành phần gồm: Dextrose, Yeast extreet, MgSO4, K2HPO4, Đường cát dịch PGA (Khoai tây) lọc sẳn cho vào xô lớn Đong nước cất cho thêm vào để đạt 10 lít nước sau tiến hành điều chỉnh pH 6,2 47 Hình 26: Các bước tạo mơi trường gạo lức - Cho 60g gạo lức vào hộp nhựa, sau cho 100ml môi trường chuẩn bị sẳn vào phần hộp gạo lức, đậy nập lại (hở cạnh) tiến hành hấp khử trùng 30 phút nhiệt độ 1210C sau để nguội chuẩn bị chủng giống b Tiến hành chủng giống: * Sơ đồ mơ tả: Hình 27: Các bước tiến hành chủng giống - Giống lắc sau 4-5 ngày dùng máy lắc có chứa giống nấm đơng trùng hạ thảo đặc sử dụng để chủng giống đông trùng hạ thảo môi trường gạo lức Khi chọn giống lắc để sử dụng nên chọn bình giống có độ đặc vừa phải khơng nên chọn bình giống q đặc cịn q lõng Khơng chọn bình giống mà màu sắc giống nấm bám phần thành bình có màu sắc khác lạ so với bình cịn lại Dùng giống lắc chuẩn bị sẳn cho vào tủ cấy để tiến hành chủng giống - Trước tiến hành cấy giống tiến hành vệ sinh tủ cấy, bật đèn UV để vệ sinh bề mặt sau tiến hành chủng giống Chúng ta Cho khoảng 10-15 ml dịch lắc vào hộp chứa gạo lức hấp khử trùng để nguội sau đóng nấp hộp kín Tiến hành chủng giống hết mơi trường gạo lức Đem hộp nấm chủng vào khu vực lạnh trì nhiệt độ khoảng 25-260C, tiến hành chăm sóc đón nấm 48 PHẦN 3: KẾT QUẢ CỦA Q TRÌNH PHÂN LẬP VÀ NI CẤY NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO I KẾT QUẢ NUÔI CẤY GIỐNG GỐC: Hình 28: Nấm đơng trùng hạ thảo Cordyceps militaris sau ngày phân lập Nấm đông trùng hạ thảo phân lập từ hệ sợi tảng nguồn nấm tươi chất lượng cao với thao tác quy trình phân lập tiến hành cụ thể tỉ mỹ từ bước pha môi trường nuôi cấy đến bước phân lập tủ cấy vô trùng nên hệ tơ sau đưa vào bóng tối để ni sợi nhiệt độ khoảng 25-260C sau ngày ta quan sát hệ sợ phát triển tốt nấm lan rộng phát triển bề mặt môi trường thạch đĩa pêtri, đồng thời khơng có dấu hiệu bị nhiễm loại nấm khác II KẾT QUẢ CỦA Q TRÌNH TẠO GIỐNG LẮC Hình 29: Giống lắc sau ngày lắc máy 49 Giống lắc sau 7-10 ngày lắc máy lắc với tốc độ 180 vịng/phút ta thấy giống có màu vàng nhạt đặc trưng giống nấm đông trùng hạ thảo, dịch lắc xệt lại, điểm tiếp giáp dịch giống lắc phần bình thủy tinh có bám vòng nấm màu vàng Quan sát cảm quan ta nhận thấy giống lắc phát triển tốt dụng để nuôi cấy Đông trùng hạ thảo III KẾT QUẢ NUÔI CẤY ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO TRÊN MÔI TRƯỜNG GẠO LỨC Hình 30: Nấm đơng trùng hạ thảo Cordyceps militaris sau 60 ngày nuôi cấy môi trường gạo lức Nấm Đông trùng hạ thảo sau 60 ngày tiến hành ni điều kiện phịng lạnh, nấm phát triển tốt khơng có hộp nấm bị nhiễm loại nấm mốc Nấm phát triển có màu Đỏ nhạt đặc trưng giống nấm Đông trung hạ thảo Bảng 10: Khảo sát Trọng lượng, chiều dài sợ nấm số lượng sợi nấm H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 Trọng lượng (g) 150 150 149 170 169 162 172 Số sợi nấm (sợi) 153 141 177 214 225 194 174 Tb chiều dài nấm (mm) 54,52 60,64 63,75 55,03 58,31 64,20 60,97 * Ghi chú: H1: Hộp số 1; H2: Hột số 2; H3: Hộp số 3; H4: Hộp số 4; H5: Hộp số 5; H6: Hộp số 6; H7: Hộp số Kết cho thấy hộp có khối lượng nặng 172g (H7) nhẹ 150g (H1 H2), Trọng lượng trung bình hợp 160,29 g; Hộp có số lượng sợi nấm nhiều 225 sợi (H5) số lượng sợi nấm 141 (H2), Trung bình số sợi nấm 182,57; Sợi nấm có chiều dài 63,75 mm (H3), có chiều dài ngắn 54,52 mm (H1), chiều dài trung bình sợi nấm 59,63 mm Kết cho thấy trọng lượng hộp nấm có ảnh hưởng đến số lượng sợi nấm hộp khơng có ảnh hưởng đến chiều dài trung bình sợi 50 nấm hộp, mà chiều dài trung bình hộp nấm chiệu ảnh hưởng hàm lượng dinh dưỡng chất nuôi trồng điều kiện nuôi trồng như: ánh sáng, nhiệt độ…trong nhà trồng có tác động trực tiếp đến giai đoạn sinh trưởng nấm đông trùng hạ thảo Tuy nhiên thấy khơng phải có trọng lượng lớn số lượng sợi nấm sẻ nhiều hộp nấm có diện tích định nấm phát triển đến ngững khơng thể phát triển số lượng sợi nấm thêm nữa, mặc khác hộp nấm có nhiều sợi nấm to số lượng sợi nấm sẻ giảm lại (bảng 10) 51 PHẦN 4: TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước: BS Trần Văn Năm, Đông trùng hạ thảo y học, 2014 Nguyễn Thị Liên Thương ctv (2016) Nấm đông trùng hạ thảo cordyceps militaris: đặc điểm sinh học, giá trị dược liệu yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni trồng nấm Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ 44 (2016): 9-22 Trần Văn Năm ctv (2014) Chuyên đề: Đông trùng hạ thảo – công dụng, xu hướng sản xuất thương mại Trung tâm Thông tin Khoa học Công nghệ TP HCM Tài liệu nước: Basith M., Madelin M.F., 1968 Studies on the production of perithecial stromata by Cordyceps militaris in artificial culture Canadian Journal Botany 46:473–480 Bushan Shrestha, Weimin Zhang, Yongjie Zhang, Xingzhong Liu 2012 The medicinal fungus Cordyceps militaris: research and development German mycology society and Springer Myco Progress Byung-Tae P., Kwang-Heum N., Eui-Cha J., Jae Wan P., Ha-Hyung K., 2009 Antifungal and Anticancer Activities of a Protein from the Mushroom Cordyceps militaris Korean Journal of Physiol Pharmacology 13: 49 - 54 Chang, H L., Chao, G R., Chen, C C., Mau, J L., 2001 Non-volatile taste components of Agaricus blazei, Antrodia camphorata and Cordyceps militarismtcelia Food Chemistry 74:203-207 Che Z.M., Wang Y., Zhou L.L., 2004 Study on the breeding of a new variety of Cordyceps militaris by mutated with ultraviolet radiation Food Ferment Industry 30(8):35–38 Choi Y.S., Lee H.K., Kim S.H., 1999 Production of fruiting body using cultures of entomopathogenic fungal species Korean Journal of Mycology 27: 15– 19 Christian G.D.N E and Henry A C F., 1837 Das System der Pilze: part one Das S.K., Masuda M., Mikio S., 2010 Medicinal uses of the mushroom Cordyceps militaris: current state and prospects Fitoterapia 81:961–968 Comparative study on cultivated Cordyceps militaris and wild Cordyceps sinensis Journal of Chengdu University 33(3):82–84 De Bary A., 1887 Comparative morphology and biology of the fungi, mycetozoa and bacteria Clarendon, Oxford Dong, C.H., Yao, Y.J (2005) Nutritional requirements of mycelia growth of Cordyceps sinensis in submerged culture J Applied Microbiology, 99: 483-492 52 Dong, C.H., Yao, Y.J (2007) In vitro evaluation of antioxidantactivities of aqueous extracts from natural and cultured mycelia of Cordyceps sinensis Food Science and Technology Vol 41: 669-677 Farlow W.G., Seymour A.B., 1888 A provisional host-index of the fungi of the United States: part Polypetalae, Cambridge Fengyao W., Hui Y., Xiaoning M., Junqing J., Guozheng Zh., Xijie G and Zhongzheng G., 2011 Structural characterization and antioxidant activity of purified polysaccharide from cultured Cordyceps militaris African Journal of Microbiology Research 5(18): 2743-2751 Gao S.Y., Wang F.Z., 2008 Research of commercialized cultivation technology on Cordyceps militaris North Hortic 9:212–215 Gao X.H., Wu W., Qian G.C., 2000 Study on influences of abiotic factors on fruitbody differentiation of Cordyceps militaris Acta Agriculture Shanghai 16: 93– 98 Gao X.H., Wu W., Qian G.C., 2000 Study on influences of abiotic factors on fruitbody differentiation of Cordyceps militaris Acta Agriculture Shanghai 16: 93– 98 Gong C.L., Pan Z.H., Zheng X.J., 2006a Anti oxidation of cultured Cordyceps militaris growing on silkworm pupa In: Proceedings of International Workshop on Silk handcrafts cottage industries and silk enterprises development in Africa, Europe, Central Asia and the Near East, & Second Executive Meeting of Black, Cas-pian seas and Central Asia Silk Association (BACSA), Bursa, Turkey, pp 615−620 Gong C.L., Pan Z.H., Zheng X.J., 2006b Immunoregulation function of artificially Cordyceps militaris growing on pupae of silkworm Bombyx mori for mice In: Proceedings of International Workshop on Silk handcrafts cottage industries and silk enterprises develop-ment in Africa, Europe, Central Asia and the Near East, & Second Executive Meeting of Black, Caspian seas and Central Asia Silk Association (BACSA), Bursa, Turkey, pp 633−638 Gu Y.X., Wang Z.S., Li S.X., 2007 Effect of multiple factors on accumulation of nucleosides and bases in Cordyceps militaris Food Chemistry 102:1304–1309 Halpern G.M., 1999 Cordyceps: China’s healing mushroom Avery, New York Harada Y., Akiyama N., Yamamoto K., Shirota Y., 1995 Production of Cordyceps militaris fruit body on artificially inoculated pupae of Mamestra brassicae in the laboratory Transactions of the Mycological Society of Japan 36: 67–72 Holliday JC, Cleaver P, Loomis-Powers M, and Patel D (2004) Analysis of quality and techniques for hybridization of medicinal fungus Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc (Ascomycetes) International journal of medicinal mushroom Vol 6: 53 151-164 (2006) Quality control of Cordyceps sinensis, a valued traditional Chinese medicine J Pharmaceutical and Biomedical Analysis Vol 41: 1571-1584 Hong I.P., Kang P.D., Kim K.Y., 2010 Fruit body formation on silkworm by Cordyceps militaris Mycobiology 38:128–132 Huang S.J., Tsai S.Y., Lee Y.L., 2006 Nonvolatile taste components of fruiting bodies and mycelia of Cordyceps militaris Food Science Technology 39:577–583 Hur H., 2008 Chemical Ingredients of Cordyceps militaris Mycobiology 36(4):233-235 Investigation on artificial fruiting of Cordyceps militaris Korean Journal of Mycology 30: 6–10 Sung J.M., Park Y.J., Han S.K., 2006 Selection of superior strains of Cordyceps militaris with enhanced fruiting body productivity Mycobiology 34: 131–137 Jae-Sung K., Kumar S., Se-Eun P., Bong-Suk C.i, Seung K., Nguyen T H., Chun-Sung K., Han-Seok C., Myung-Kon K., Hong Sung C., Yeal P., Sung-Jun K., 2006 A Fibrinolytic Enzyme from the Medicinal Mushroom Cordyceps militaris Journal of Microbiology 44(6):622-31 Jones K., 1997 Cordyceps: tonic food of ancient China Sylvan, Washington Kamble V.R and Agre D.G., 2012 Reinvestigation of insect parasite fungus Cordyceps militaris from Maharashtra Bionano Frontier 5(2):224-225 Khan M.A., Tania M., Zhang D.Z., 2010 Cordyceps mushroom: a potent anticancer nutraceutical Open Nutraceuticals Journal 3:179–183 Kim S.W., Hwang H.J., Xu C.P., 2003 Optimization of submerged culture process for the production of mycelial biomass and exo-polysaccharides by Cordyceps militaris C738 Journal of Apply Microbiology 94:120–126 Kobayasi Y., 1941 The genus Cordyceps and its allies Science Reports of the Tokyo Bunrika Daigaku section B 84(5):53–260 Kobayasi Y., 1981 Revision of the genus Cordyceps and its allies Bulletin of the National Science Museum Tokyo 7:1–13 Kobayasi Y., 1982 Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella Transactions of the Mycological Society of Japan 23:329–364 Herbal, New York Kwon J.S., Lee J.S., Shin W.C., 2009 Optimization of culture conditions and medium components for the production of mycelial biomass and exopolysaccharides with Cordyceps militaris in liquid culture Biotechnology and Bioprocess Engineering 14:756–762 Leatherdale D., 1970 The arthropod hosts of entomogenous fungi in Britain Entomophaga 15:419–435 Li C.B., Tong X.D., Bai J., 2004 Artificial stromata production of Cordyceps militaris Journal of Dalian National University 6(5):29–31 54 Li C.L., Liu X.L., Zheng X.Q., 2011 Mutagenesis of Cordyceps militaris protoplast for high production of exopolysaccharide Indian Microbiology 41(2):51–56 Li M.N., Wu X.J., Li C.Y., 2003 Molecular analysis of degeneration of artificial planted Cordyceps militaris Mycosystema 22:277– 282 Li N., Song J.G., Liu J.Y., Zhang H., 1995 Compared chemical composition between Cordyceps militaris and Cordycpes sinensis Journal of Jilin Agriculture University 17, 80–3 (in Chinese) Lim L., Lee C., Chang E., 2012 Optimization of solid state culture conditions for the production of adenosine, cordycepin, and D mannitol in fruiting bodies of medicinal caterpillar fungus Cordyceps militaris (L.:Fr.) Link (Ascomycetes) International Journal of Medicinal Mushrooms 14:181–188 Lin Q.Q., Qiu X.H., Zheng Z.L., 2010 Characteristics of the degenerate strains of Cordyceps militaris Mycosystema 29:670– 677 Lin W.H., Tsai M.T., Chen Y.S., Hou R.C., Hung H.F., Li C.H., Wang H.K., Lai M.N., Jeng K.C., 2007 Improvement in sperm production in subfertile boars by Cordyceps militaris The American Journal of Chinese Medicine.35(4):631-41 Liu D., He L.L., Wang Z.Q., 2006 The influences of subculture of Cordyceps militaris to colonial morphology and fruitbody yield Journal of Shenyang Agriculture University 37:538–541 Liu M.M., Ning S.Y., Cui X.Y., 2008 Optimization of submerged culture condition for Cordyceps militaris using response surface methodology China Agricultural Science 24(5):127–131 Liu X.L., Zhou J.Z., Huang K.H., 2009 Study on preparation and regeneration of protoplast of Cordyceps militaris Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiens 21(9):119–120 Liu Z.Y., Yao Y.J., Liang Z.Q., 2001 Molecular evidence for the anamorphteleomorph connection in Cordyceps sinensis Mycological Research 105: 827–32 Lu J.M., Zeng Z.J., He H.Q., 2005 Culture technique of Cordyceps militaris on artificial media Guangdong Agricultural Science 2:88–89 Ma L.P., Zhao J.F., Liu K.Y., 2008 Research on the isolation condition of Cordyceps militaris protoplast Journal of Anhui Agricultural Science 36:14612– 14613 Ma T., Feng Y., Wu X.P., 2007 Primary investigation of a host insect of Cordyceps militaris and analysis of its main ingredients Forest Resources 20:63– 67 Mains E.B., 1958 North American entomogenous species of Cordyceps Mycologia 50:169–222 D.J., Jones K., Hughes K., 2002 Botanical medicines: the desk reference for major herbal supplements, 2nd edn Haworth 55 Mizuno T., 1999 Medicinal Effects and Utilization of Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes) and Isaria Fr (Mitosporic Fungi) Chineese Caterpiller Fungi, “Tochukaso” (Review) International Journal of Medicinal Mushrooms 1:251-261 Moore R.T., 1964 Fine structure of mycota: 12 Karyochorisis – somatic nuclear division – in Cordyceps militaris Z Zellforsch 63:921–937 Müller-Kögler E., 1965 Cordyceps militaris (Fr.) Link: Beobachtun-gen und Versuche anlässlich eines Fundes aufTipula paludosa Meig (Dipt., Tipul.) Z Angew Entomol 55:409–418 Ni H., Li H.H., Huang W.F., 2007 Research and product develop-ment of Cordyceps militaris and its bioactive substances Review Science and Technology 25(15):75–79 Panigrahi A., 1995 Fungus C militaris infestation in the pupa of the tea pest Andraca bipunctata Walker Environmental Ecology 13:942–946 Paterson R.R.M., 2008 Cordyceps—a traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory? Phytochemistry 69:1469–1495 Paul M K., Paul F C., David W M and Stalpers J A., 2008 Dictionary of the Fungi; CABI Peng Zh.,Yongliang X., Guohua X., Chenghui X., Xiao H., Siwei Zh., Huajun Zh., Yin Huang, Yan Zh., Shengyue W., Guo-Ping Zh., Xingzhong L., Raymond J St L and Chengshu W., 2011 Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris, a valued traditional chinese medicine Genome Biology,12: 116 Peng Zheng, Yongliang Xia, Guohua Xiao, Chenghui Xiong, Xiao Hu, Siwei Zhang, Huajun Zheng,Yin Huang, Yan Zhou, Shengyue Wang, Guo-Ping Zhao, Xingzhong Liu, Raymond J St Leger and Chengshu Wang 2011 Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris, a value traditional Chinese medicine BioMed Central, http://genomebiology.com/2011/12/11/R116 21pp Ren W.Y., Zhao H., Wu Z.K., 2009 Techniques for fast and high yielding cultivation of the valuable edible and medicinal mushroom, Cordyceps militaris China Agricultural Technology Extension 25(5):28–29 Russell R., Paterson M 2008 Cordyceps – A traditional Chinese medicine and anotherfungal therapeutic biofactory? Phytochemistry 69 (2008) 1469–1495 Sato H and Shimazu M., 2002 Stromata production for Cordyceps militaris (Clavicipitales: Clavicipitaceae) by injection of hyphal bodies to alternative host insects Applied Entomology and Zoology 37:85–92 Seulmee S., Sungwon L., Jeonghak K., Sunhee M., Seungjeong L., ChongKil L., Kyunghae C., Nam-Joo H., Kyungjae K., 2009 Cordycepin Suppresses Expression of Diabetes Regulating Genes by Inhibition of Lipopolysaccharideinduced Inflammation in Macrophages Immune Network 9(3):98-105 56 Shanor L., 1936 The production of mature perithecia of Cordyceps militaris (Linn.) Link in laboratory culture Journal of the Elisha Mitchell Scientific Society 52:99–105 Shih I.L., Tsai K.L., Hsieh C.Y., 2007 Effects of culture conditions on the mycelial growth and bioactive metabolite production in submerged culture of Cordyceps militaris Biochemical Engineering Journal 33, 193–201 Shonkor K D., Shinya F., Mina M and Akihiko S., 2010 Efficient Production of Anticancer Agent Cordycepin by Repeated Batch Culture of Cordyceps militaris Mutant Lecture Notes in Engineering and Computer Science 20-22 Shonkor Kumar Das, Mina Matsuda, Akihiko Sakurai, Mikio Sakakibara 2010 Medicinal uses of the mushroom Cordyceps militaris: current state and prospects Fitoterapia 81: 961-968 Shrestha B., Lee W.H., Han S.K., Sung J.M., 2006 Observations on Some of the Mycelial Growth and Pigmentation Characteristics of Cordyceps militaris Isolates Mycobiology 34(2):83-91 Shrestha B., Park Y.J., Han S.K., 2004 Instability in vitro fruiting of Cordyceps militaris Journal of Mushroom Science and Production 2:140–144 Shrestha B., Sung J.M., 2005 Notes on Cordyceps species collected from central region of Nepal Mycobiology 33:235–239 Shrestha B., Zhang W.M., Zhang Y.J., 2010 What is the Chinese caterpillar fungus Ophiocordyceps sinensis (Ophiocordycipitaceae)?.Mycology 1:228–236 Stensrud Ø., Hywel-Jones N.L., Schumacher T., 2005 Towards a phylogenetic classification of Cordyceps: ITS nrDNA sequence data confirm divergent lineages and paraphyly Mycological Research 109: 41–56 Sung G.H., Spatafora J.W., 2004 Cordyceps cardinali ssp nov., a new species of Cordyceps with an east Asian-eastern North American distribution Mycologia 96:658–666 Sung J.M., Park Y.J., Lee J.O., 2007 Effect of preservation periods and subcultures on fruiting body formation of Cordyceps militaris in vitro Mycobiology 34:196–199 Supplements American Journal of Chinese Medicine 35(4):631-41 Wang L., Zhang W.M., Hu B., 2008 Genetic variation of Cordyceps militaris and its allies based on phylogenetic analysis of rDNA ITS sequence data Fungal Divers 31:147–155 Wang X.L., Yao Y.J., 2011 Host insect species of Ophiocordyceps sinensis: a review ZooKeys 127:43–59 Wang X.Q., Chen C.Q., Zhang R., 2002 Methodological studies on cultivation of Cordyceps militaris on pupae of Antheraea pernyi Journal of Anhui Agricultural Science 30:965-968 Wol-Soon J., Yoo-Jin C., Hyoun-Ji K., Jae-Yun L., Byung-Hyouk N., JaeDong L., Sang Wha L., Su-Yeong S and Min-Ho J., 2010 The Anti-inflammatory 57 Effects of Water Extract from Cordyceps militaris in Murine Macrophage Mycobiology 38(1): 46-51 Xie C.Y., Gu Z.X., Fan G.J., 2009a Production of cordycepin and mycelia by submerged fermentation of Cordyceps militaris in mixture natural culture Applied Biochemistry and Biotechnology 158:483–492 Xie C.Y., Liu G.X., Gu Z.X., 2009b Effects of culture conditions on mycelium biomass and intracellular cordycepin production of Cordyceps militaris in natural medium Annua Microbiology 59:293–299 Xiong C.H., Xia Y.L., Zheng P., 2010 Developmental stage-specific gene expression profiling for a medicinal fungus Cordyceps militaris Mycology 1:25–66 Yahagi N., Yahagi R., Takano F., 2004 Growth of ascoscarps from cultured Cordyceps militaris(L.:Fr.) Fr and Cordyceps formicarum Kobayasi in an agar medium Nippon Kingakukai Kaiho 45:15–19 Yan H., Zhu D., Xu D., Wu J and Bian X., 2008 A study on Cordyceps militaris polysaccharide purification, composition and activity analysis African Journal of Biotechnology (22): 4004-4009 Young-Joon A., Suck-Joon P., Sang-Gil L., Sang-Cheol S and Don-Ha C., 2000 Cordycepin: Selective Growth Inhibitor Derived from Liquid Culture of Cordyceps militaris against Clostridium spp Journal of Agricultural and Food Chemistry 48: 2744−2748 Yu H.M., Wang B.S., Huang S.C., 2006 Comparison of protective effects between cultured Cordyceps militaris and natural Cordyceps sinensis against oxidative damage Journal of Agriculture and Food Chemistry 54:3132–3138 Yue D.C., Yang Y.P., Wang S.F., 1982 Preliminary study on stroma formation of Cordyceps militaris strain (Briefing) Journal of China Medicinal Materrial 05:7 Yue G.G.L., Lau C.B.S., Fung K.P., 2008 Effects of Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris and their isolated compounds on ion transport in Calu3 human airway epithelial cells Journal of Ethno-pharmacology 117:92–101 Yuko O., Jung-Bum L., Kyoko H., Akio F., Dong Ki P and Toshimitsu H., 2007 In Vivo Anti influenza Virus Activity of an Immunomodulatory Acidic Polysaccharide Isolated from Cordyceps militaris Grown on Germinated Soybeans Journal of Agricultural and Food Chemistry 55: 10194–10199 Zhang J.Y., Wu K.L., Duan J., 2010 Influence of air permeability on growth of Cordyceps militaris Guangdong Agricultural Science 4:45–47 Zhang X.K and Liu W.X., 1997 Experimental studies on planting Cordyceps militaris (L ex Fr.) Link with different culture materials Edible Fungi China 16(2):21–22 Zhang Y.J., Li E., Wang C.S., 2012 Ophiocordyceps sinensis, the flagship fungus of China: terminology, life strategy and ecology Mycology 3:2–10 Zhang Z., Lei Z., Lu Y., 2008 Chemical composition and bioactivity changes in stale rice after fermentation with Cordyceps sinensis Journal of Bioscience and Bioengineering 106: 188–93 58 Zhou H.Y., Bian Y.B., 2007 Identification and selection of high cordycepinyielding protoplast fusion products of Cordyceps militaris Acta Edulis Fungi 14(2):65–70 Zhou L.H., Luo L.M., 2009 Preparation and regeneration of protoplasts from Cordyceps militaris Hubei Agricultual Science 48:1621–1624 59