Nghiên cứu tối ưu hóa trích ly polyphenol tổng, flavonoid tổng từ hoa Đậu biếc (Clitoria ternatea) bằng ma trận Placktett – Brurman và phương pháp đáp ứng bề mặt Box - Behnken

KHOA HỌC CƠNG NGHỆ NGHIÊN CỨU TỐI uu HĨA TRÍCH LY POLYPHENOL TỔNG, FLAVONOID TỔNG TÙ HOA ĐẬU BIẾC [aitoria ternate^ BẰNG MA TRẬN PLACKETT-BRURMAN VÀ PHUONG PHÁP ĐÁP ÚNG BÊ MẶT BOX-BEHNKEN Trương Văn Xạ1’ ‘, Trần Kim Thoa1 TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu tim giá trị tối ưu yếu tố tác động trực tiếp đến hàm lượng polyphenol tổng flavonoid tổng trích ly từ hoa Đậu biếc {Clitoria temateầ) Trên sở thử nghiệm đa yếu tố, nghiên cứu xác định yếu tố thí nghiệm sàng lọc ma trận Plackett-Brurman tần sò' siêu âm (kHz), nhiệt độ ( ’C), giá trị pH, thịi gian trích ly (phút), nồng độ ethanol (%) tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) Kết tli nghiệm cho thấy yếu tố tác động mạnh đến hàm lượng polyphenol tổng tần số siêu âm, pH tiuời gian trích ly Đối vói flavonoid tổng, yếu tố động mạnh pH, nồng độ ethanol tỷ lệ dung mơi/ngun liệu Thí nghiệm thực với yếu tố theo phương pháp đáp ứng bề mặt BoxBehnken đé xác định giá trị tối ưu Kết quả, hàm lượng polyphenol tổng trích ly tối ưu tần số siêu âm mixed-frequencies (328 kHz), pH 6,67 thời gian 163 phút Đối với flavonoid tổng tối ưu giá trị pH 7,0, n ồng độ ethanol 68% tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 1,5 Kiểm định thực tế mơ hình tối ưu hóa trích ly hàm ượng polphenol tổng flavonoid tổng có kết 64,42 ± 0,38 mg/g 56,06 ± 0,48 mg/g tưmg đương với dự đoán mơ hình Từ khóa: Box-Bei ưiken design, Đậu biếc, flavonoid tổng, Plackett-Brurman design, polyphenol tổng ĐẶT VÃN ĐỀ Đậu biếc {Clitoric' temateầ) loại dây leo hoang dai phát triển nhiềi vùng đất gò thuộc khu vực đồng sơng Cửu Long Hoa Đậu biếc có màu Xímh tím xanh lam đậm, chứa nhiều sắc tố anthocyanins nên đưọc sử dụng làm màu thực phẩm [z ] Đậu biếc loại ciy dược liệu có nhiều hoạt chất quý giúp phòng trị bệnh polyphenols, flavonols, flavonoids, anthocyanins [18, 7] Ma trận Plackett •Brurman design (PBD) giúp thiết kế sàng lọc thí nghiệm đa nhân tố nhằm tiet kiệm thòi gian số lượng nghiệm thức thực hiện; từ giúp phái yếu tố quan trọng cần kLảo sát nghiện cứu [17], Trong đó, phương pháp đáp ứng bề mặt (Box-Behnken design BBD) giúp tối ưu hóa giá trị yếu tố nghiên cứu [15], Ma trận PBD phương pháp BBD đuợc sử dụng để tối ưu hóa số nghiên cứu như: quy trình trích axit oleanolic từ rễ Trâm ổi {Lantana camarẩ) [1]; trích ly họp chất flavonoid từ hạt Táo gai {Crataegus monogynẩ) [16]; trích ly po yphenols từ Paris polyphylla [13], Phương pháp trích ly anthocyaiins polyphenol tổng có hỗ ‘T■ ường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Vĩnh Long trợ siêu âm trái Thiên thảo {Rubia sylvaticá) tối ưu theo mơ hình toán học PBD phương pháp đáp ứng bề mặt (Response Surface Methodology - RSM) [6], Nghiên cứu tối ưu hóa yếu tố quan trọng chi phối thí nghiệm tần số siêu âm sử dụng trích ly, tỷ lệ nguyên liệu, nồng độ dung môi ethanol, giá trị pH, nhiệt độ thời gian chiết Sử dụng phương pháp PBD RSM để tối ưu hóa quy trình trích ly dầu từ hạt Thi {Foeniculum vulgarể) Nghiên cứu tối ưu hóa yếu tố kích thước hạt, thời gian trích ly, tỷ lệ dung môi [3] Nghiên cứu thực nhằm tối ưu hóa q trình trích ly polyphenol tổng flavonoid tổng hoa Đậu biếc điều kiện trích ly có hỗ trợ siêu âm ma trận PBD phương pháp đáp ứng bề mặt BBD Sản phẩm cao chiết nguồn nguyên liệu tự nhiên tiềm ứng dụng nông nghiệp dược phẩm VẬT UỆU VÀ PHUONG PHÁP NGHIÊN cuu 2.1 Vật liệu, thiết bị Hoa Đậu biếc trưởng thành thu hái tỉnh Vĩnh Long từ 7-8 sáng Hoa rửa để nước điều kiện phịng thí nghiệm trước điều chế cao chiết Nghiên cứu tối ưu hóa q trình ly trích polyphenol tổng, flavonoid tổng hoa Đậu Email: xatv@vlute.edu.vn NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN - KỲ - THÁNG 5/2022 75 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ biếc thực bước: (1) thử nghiệm đa yếu tố, (2) sàng lọc yếu tố theo ma trận PBD, (3) tối ưu hóa theo phương pháp đáp ứng bề mặtBBD Nghiên cứu sử dụng hệ thống bể siêu âm kích thước 600 X 380 X 350 mm, có kết nối trực tiếp vói nguồn phát sóng siêu âm (IDS 2415/SM; Crest Ultrasonic) Bộ nguồn siêu âm phát sóng theo chế độ: (1) phát tần số sóng siêu âm ba mức cố định 58, 132 192 kHz nút điều chỉnh; (2) phát sóng siêu âm liên tục (mixed-frequencies) từ mức 178 kHz đến 482 kHz đinh ốc điều chỉnh, cố định tần số phát sóng siêu âm sử dụng nút pull đinh ốc Mẫu trích ly cho vào bể siêu âm sau tần số sóng siêu âm hoạt động mức cài đặt 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thử nghiệm đa yếu tố Điều kiện trích ly ban đầu thiết lập sau: 400 ml ethanol 50% 200 g hoa Đậu biếc (tỷ lệ 2/1, v/w), hỗn họp xay nhuyễn máy xay (TOSHIBA BL-T60) phút Hỗn họp trích ly điều chỉnh pH 6,0 (sử dụng axit citric) Sau đó, hỗn họp cho vào bình tam giác 250 ml đặt vào hệ thống bể siêu âm có kết nối trực tiếp với nguồn phát sóng siêu âm điều chỉnh tần số 192 kHz Bể siêu âm kết nối vói hệ thống tuần hồn lạnh hoạt động liên tục nhằm giữ cho nhiệt độ mẫu trích ly ổn định 30°C q trình trích ly Thời gian trích ly 30 phút Sau trích ly siêu âm, mẫu dịch chiết lọc qua Na2SO4 khan làm giàu hệ thống cô quay chân không nhiệt độ 50°C, áp suất 0,095 atm tốc độ quay 110 vịng/phút (với máy quay WEV-1010, bể điều nhiệt tuần hoàn lạnh MaXircu CL-12 bơm chân khơng WEV-0095) Sau đó, mẫu sấy đối lưu (tủ sấy DS-80) nhiệt độ 50°C đến bay hết dung môi Các sản phẩm cao chiết trữ -4°c Sáu yếu tố khảo sát ảnh hưởng hàm lượng polyphenol tổng flavonoid tổng trích ly từ hoa Đậu biếc gồm: tần số siêu âm (58,132,192 kHz), nồng độ ethanol (50, 60, 70, 80, 90 100%), tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (1/1, 2/1, 4/1, 6/1, 8/1 10/1 v/w), nhiệt độ trích ly (30, 40 50 60°C), giá trị pH (5,0, 6,0, 7,0, 8,0) thịi gian trích ly (30, 60, 90, 120 phút) Trong đó, khảo sát yếu tố yếu tố thay đổi cịn yếu tố khác khơng thay đổi sau lần thử nghiệm; yếu tố khảo sát lần lặp lại 76 2.2.2 Thiết kếma trận PBD phương pháp đáp ứngbềmặtBBD Để xác định yếu tố mức độ ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng polyphenol tổng flavonoid tổng trích ly từ hoa Đậu biếc ma trận PBD thiết kế với yếu tố gồm: tần số siêu âm (kHz), nhiệt độ (°C), giá trị pH, thời gian trích ly (phút), nồng độ ethanol (%) tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) (Bảng 1) Ba yếu tố có ảnh hưởng đến kết khảo sát chọn để tiến hành thí nghiệm theo phương pháp đáp ứng bề mặt BBD để xác định giá trị tối ưu nghiên cứu mức (-1, 0, +1) (Bảng 3) 2.2.3 Kiểm định thực tếmị hình tối ưu hóa Dựa vào kết thực nghiệm thu từ thí nghiệm theo BBD phần mềm Design-Expert 13.0.5.0® phân tích đề xuất yếu tó ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tổng, flavonoid tổng tối ưu dựa ba yếu tố khảo sát Sau thí nghiệm kiểm định mơ hình thực vói lần lặp lại 2.2.3 Phương pháp xấc định polyphenol tổng Định lượng polyphenol tổng phương pháp sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu [20], có điều chỉnh Đường chuẩn galic acid vói dãy nồng độ 0,01; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 mg/ml chuẩn bị methanol Hỗn họp phản ứng gồm 0,1 ml mẫu cao chiết ml Folin-Ciocalteu 10% để phản ứng phút nhiệt độ phịng (30±2°C); sau thêm ml Na2CO3 2% ủ tối 45 phút Mẫu thí nghiệm tiến hành đo quang phổ hấp thụ 765 nm (máy quang phổ LABOMED UV-2602) Hàm lượng polyphenol tổng mẫu cao chiết tính dựa vào đường chuẩn gallic acid (GAE) theo công thức , c*v sau: polypenol tổng (mg GAE/g cao chiết) = _ Trong đó: c hàm lượng polyphenol tổng suy từ đường chuẩn gallic acid (mg/ml), V thể tích dịch chiết (ml), m khối lượng cao chiết có V (g) 2.2.4 Phươngpháp xác định ũavonoid tổng Phương pháp định lượng flavonoid tổng, có điều chỉnh [4] Đường chuẩn quercetin vói dây nồng độ 25, 50, 100, 200, 400 mg/ml chuẩn bị methanol Hỗn họp phản ứng gồm 0,5 ml mẫu cao chiết 1,5 ml methanol, để ổn định phút Sau đó, thêm 0,1 ml A1C1310% cho phản ứng phút Cuối cùng, thêm 0,1 ml CH3COOK IM 2,8 NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIEN nông thôn - KỲ - THÁNG 5/2022 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ r 11 nước cất, lắc 'à để ổn định 45 phút nhiệt độ phòng Mầu thí nghiệm đo quang phổ hấp thụ tú 415 nm Hàm lượng flavonoid tổng mẫu cao chiết tính dựa vao đường chuẩn quercetin (QE) theo cơng thức sau: flavonoid tổng (mg QE/g cao chiết) = -7- Trong đq: c hàm lượng flavonoid tổng m suy từ đường chuẩn quercetin (mg/ml), V thể tích dịch chiết (m), m khối lượng cao chiết có trang V (g) 2.2.5 XửlýsốliỘL Phần mềm Design-Expert (phiên 13.0.5.0®, Stat-Ease Inc., USA) sử dụng để phân tích phưong sai (ANOVA) thử nghiệm yếu tố, tír h tốn hệ số pnưong trinh hồi quy đề xuất giải pháp cho mơ hình tối ưu hóa KẾT QUÁ NGHIÊN cuu VÃ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát hàm lượng polyphenol tổng flavonoid tổng thử nghiệm yếu tố Kết nghiên cứu cho thấy, hàm lượng flavonoid tổng thấa hon polyphennol tổng tất 2ác yếu tố khảo sát (Hình 1) Hàm lượng flavonoid tổng polyphennol tổng có khuynh hướng tăng dần tần số sóng siêu âm lớn (Hình 1A) thịi gian trích ly dàng dài (1D) Xu hướng o M-Total flavotiotc a 70 j M ễ 60 55 ị T ■-Total polyphenol mixed frequencies 32 192 u rasound power (kHz) 58 ngược lại với yếu tố dung môi/nguyên liệu lớn hàm lượng flavonoid tổng polyphennol tổng có xu hướng giảm (Hình 1F) Trong đó, yếu tố khác điều chung xu hướng đạt giá trị cao sau giảm dẩn Cụ thể, nhiệt độ trích ly 40°C, sau giảm dần đến nhiệt độ khảo sát 60°C (Hình IB); pH 7,0 đạt giá trị cao (Hình 1C); hàm lượng polyphennol tổng đạt giá trị cao ethanol 80%, flavonoid tổng ethanol 70% (Hình 1E) Kết nghiên cứu cho thấy, yếu tố nhiệt độ nồng độ ethanol tăng flavonoid polyphenol tăng, nhiên nhiệt độ nồng độ ethanol tiếp tục tăng flavonoid polyphenol giảm Kết tưong đồng vói kết nghiên cứu hàm lượng polyphenol tổng trích ly từ trái Thiên thảo (Rubia sylvatica) Phong đại (Acer saccharurrì) đạt giá trị cao nồng độ ethnaol 60% thịi gian trích ly 50 phút sau giảm hai yếu tố tiếp tục tăng [5, 6], Tưong tự kết nghiên cứu xác định hàm lưọng pholyphenol, flavonoid tổng trích ly từ cám gạo đen gạo tím (Oryza sativa L.) có xu hướng đạt giá trị cao nồng độ ethanol 70% thịi gian trích ly 60 phút [8] 30 70 I 65 j X Total flavouoid Total flavonoid -• total polyphenol = 60 40 50 Extraction temperature (°C) ■ Total polyphenol 60 j ia50- 11 too I I > _ t _ — » ' _ 25 -I * 20 ——— —r - -r—— - 30 60 90 120 Extraction time (min) 70 Ị o I 50 60 80 90 Ethal 10I concentration (%) 100 ị -*-Total flavonoid -A-Total polyphenol 65 60 ị 1/1 2/1 4/1 6/1 8/1 10/1 Liquid - Solid ratio (v/w) Hinl 11 Kết khảo sát tần số siêu âm (A), nhiệt độ (B), pH (C), thời gian (D), nồng độ ethanol (E) tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (F) ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tổng flavonoid tổng trích ly từ hoa Đậu biếc NƠNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIEN nịng thơn - KỲ - THÁNG 5/2022 77 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 3.2 Sàng lọc yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tổng flavonoid tổng trích ly từ hoa Đậu biếc ma trận PBD Từ kết khảo sát hàm lượng polyphenol tổng flavonoid tổng thử nghiệm đa yếu tố giá trị yếu tố chọn để tiến hành đánh giá mức độ ảnh hưởng ma trận PBD Mỗi yếu tố xác định giá trị vị trí xung quanh hàm lượng polyphenol tổng flavonoid tổng đạt giá trị cao Giá trị yếu tố lần lượt: siêu âm (192 kHz phát sóng siêu âm liên tục), nhiệt độ (40°C 50°C), pH (6,0 7,0) thời gian (90 phút 120 phút) (Hình 1) Hàm lượng polyphenol tổng flavonoid tổng trích ly từ hoa Đậu biếc thực theo ma trận PBD với 12 thí nghiệm, thí nghiệm lần lặp lại (Bảng 1) Bảng Yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tổng flavonoid tổng trích ly từ hoa Đậu biếc ma trận PBD Hàm lượng Các yếu tố Flavonoid Nồng Polyphenol Thòi Tỷ lệ Tần số siêu âm (kHz) Nhiệt pH Nghiệm gian độ (v/w) tổng (mg/g) tổng (mg/g) độ thức (phút) ethanol (°C) (%) 45,59 ±2,01 37,21 ±2,01 2/1 120 60 40 6,0 192 60,13 ±2,35 60 1/1 32,09 ± 0,96 90 40 6,0 192 44,47 ± 1,70 2/1 35,37 ± 1,10 90 70 50 7,0 192 39,02 ± 1,37 120 70 1/1 38,29 ± 1,34 6,0 50 192 50,27 ± 1,30 42,66 ± 1,21 70 2/1 7,0 90 40 192 63,02 ± 2,06 46,32 ± 0,86 120 60 1/1 7,0 50 192 44,14 ±0,86 37,54 ± 1.64 70 1/1 6,0 90 40 phát sóng siêu âm liên tục 66,42 ±2,11 49,72 ± 1,33 60 1/1 90 50 7,0 phát sóng siêu âm liên tục 43,34 ± 2,04 49,96 ± 0,96 90 60 2/1 50 6,0 phát sóng siêu âm liên tục 52,83 ± 1,90 53,62 ± 1,49 2/1 120 60 40 7,0 10 phát sóng siêu âm liên tục 56,65 ± 1,60 59,12 ±0,79 120 70 1/1 40 7,0 phát sóng siêu âm liên tục 11 42,30 ± 2,03 2/1 55,72 ± 1,09 120 70 50 6,0 phát sóng siêu âm liên tục 12 Kết phân tích thống kê ANOVA yếu tố pholyphenol tổng trích ly từ bắp cải tím (Zea ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tổng (pvalue maysV- var- ceratinầ> Thái Lan bị chi phôi mạnh = 0,0339) flavonoid tổng (pvalue = 0,0327) trích ly yếu tố tần số siêu âm thịi gian trích ly giá từ hoa Đậu biếc ma trận PBD có ý nghĩa trt pH chọn cho thiêt kê thi nghiệm BBD [14] thống kê mức pvalue = 0,0106) tỷ lệ (p-value = 0,0392) Kết tương đồng với nghiên cứu xác định nồng độ dung môi ethanol tỷ lệ nguyên liệu ảnh hưởng lớn đến hàm lượng flavonoids trích ly từ lồi chanh leo (Passiũora sp.) phổ biến Barzil [11] Như vậy, yếu tố ảnh hưởng mạnh đến hàm lượng flavonoid tổng pH, nồng độ ethanol tỷ lệ chọn cho thiết kế thí nghiệm BBD Kết phương trình tuyến tính xác định ma trận PBD lần lượt: Polyphenol tổng: Y = + 44,18 + 5,53A + 0,6092B + 3,49C + 4,06D + 0/5992E + 0,3375F Flavonoid tổng: Y = + 51,30 + 0,8825A - NƠNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIEN nơng thơn - KỲ - THÁNG 5/2022 KHOA HOC CÔNG NGHỆ (,4342B + 4,44C - 1,27D - 5,16E - 3,60F Trong đó: A ì tần số siêu âm, B nhiệt độ, c pH; D thòi gian; E nồng độ ethanol; F tỷ lệ dung r lôi/nguyên liệu 3.3 Tối ưu hóa éác yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tổtìg flavonoid tổng trích ly từ hoa Đậu biếc phương pháp đáp ứng bề mặt E ox-Behnken design (BBD) Dựa vào kết phân tích thống kê ANOVA ma trận PBD thi yếu tố có ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tổng flavonoid tổng chọn để tiến hành thí nghiệm theo phương pháp đáp ứng bề mặt BBD đé xác định giá trị tối ưu nghiên cứu mức (-1, 0, +1) (Bảng 2) Bảng Ba yếu tố khảo sát giá trị ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tổng flavonoid tổng trích ly từ hoa Đậu biểc phương pháp đáp ứng bẻ mặt BBD _ c ác yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng Mức polyphenol tổng flavonoid tổng khảo sát Thời gian Nồng độ Tần số siêu âm (kHz) pH Tỷ lệ (v/w) pH (phút) ethanol (%) -1 132 5,0 60 5,0 50 0,5/1 192 6,0 6,0 120 60 1/1 +1 phát í óng siêu âm liên tục 7,0 180 7,0 70 2/1 Kết tối ưu h( a hàm lượng polyphenol tổng hình 4,02, cho thấy mơ hình đáng tin cậy Giá trị từ thực nghiệm với 15 thí nghiệm thiết kế %cv cho biết mức độ xác thí nghiệm, phần mềm Design Expert 13.0.5.0® (Bảng 3) Kết thí nghiệm có độ tin cậy thấp thường có giá trị %cv qi ả phân tích thống kê ANOVA cho yếu tố tối ưu cao ngược lại [6] Tóm lại, kết nghiên cứu cho he a hàm lượng polypi enol tổng trích ly từ hoa Đậu thấy mơ hình tối ưu hóa hàm lượng polyphenol tổng bỉóc phương ph; p BBD có giá trị pvalue có thí nghiệm thực đáng tin cậy mị hình 0,0020 (có j nghĩa mức 5%); không phù họp (Lack of Fit) 38,68 (không ý nghĩa) Hệ số hồi quy (R2) mơ hình 0,9783, nghĩa có 97,83% số liệ r thực nghiệm tương thích với số liệu dự đốn theo mơ hình; đó, giá trị R2 dự đốn (0,3369) phù họp với R2 điều chỉnh (0,9468) với độ lệch 0,1099 (nhỏ 2) Tỷ lệ tín hiệu so vói nhiều 0,217 (lớn rấ nhiều), điều chứng tỏ tín hiệu đầy đủ để sư dụng dự đốn hàm lượng polyphenol Ngồi ra, hệ số biến thiên (%CV) mơ Phương trình bậc hai dùng mơ hình để dự đốn hàm lượng polyphenol tổng trích ly từ hoa Đậu biếc là: Polyphenols = + 54,53 + 4,26A + 2,93B + 0,4338C + 5,50AB + 1,62BC + 3,32A2 - 6,79 B2 Trong đó: A tần số siêu âm, B nhiệt độ, c pH, D thời gian, E nồng độ ethanol, F tỷ lệ dung môi/nguyên liệu Bảng Bố trí thi nghiệm theo phương pháp BBD để tối ưu hóa hàm lượng polyphenol Nghiệm thức tổng trích ly từ hoa Đậu biếc Các yếu tố Tần số siêu âm Thòi gian pH (kHz) (phút) 6,0 180 132 6,0 120 192 180 7,0 192 7,0 120 phát sóng siêu âm liên tục 6,0 60 132 120 5,0 phát sóng siêu âm liên tục 6,0 60 phát sóng siêu âm liên tục 5,0 120 132 180 6,0 phát sóng siêu âm liên tục Hàm lượng polyphenol tổng (mg/g) NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIÊN NỊNG THƠN - KỲ - THÁNG 5/2022 52,52 ± 0,96 50,44 ± 1,16 52,09 ± 1,80 62,22 ± 0,79 55,22 ±2,12 47,56 ± 1,33 61,33 ± 1,52 51,60 ±0,76 63,74 ± 1,76 79 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 10 11 12 13 14 15 132 192 192 192 7,0 5,0 120 60 41,45 ± 1,82 45,02 ± 0,75 5,0 7,0 180 60 192 192 6,0 6,0 120 120 43,67 ± 1,81 46,98 ± 0,53 53,89 ± 1,32 Kết mị hình đáp ứng bề mặt cho thấy hàm lượng polyphenol tổng tăng giá trị tần số siêu âm tăng; ngược lại giảm giá trị pH nhỏ hon 6,0 (Hình 2) Điều phù họp vói kết nghiên cứu Das cs (2017); Muangrat cs (2018) xác định tần số siêu âm yếu tố chi phối mạnh đến hàm lượng polyphenol trích từ cám gạo đen bắp tím (Zea mays L var ceratinầ) phưong pháp đáp ứng bề mặt RSM [8, 14] Tần số siêu âm cao có khả gây xâm thực chu kỳ co giãn vật liệu Những chu kỳ phá vỡ thành tế bào vật liệu điều thuận lọi cho xâm nhập truyền dung mơi thẩm thấu vào bên vật liệu, tăng tốc độ trích ly [9, 14], Như vậy, kết thực nghiệm phù họp với kết 54,39 ± 1,70 mơ hình, kết đáng tin cậy tìm tần số siêu âm phù họp yếu tố ảnh hưởng đến trình trích ly polyphenol tổng từ hoa Đậu biếc Tuy nhiên, biểu đồ đáp ứng bề mặt chưa đạt điểm hội tụ cao, nghiên cứu tiếp tục chọn thí nghiệm mà phần mềm Design Expert 13.0.5.0® tư vấn để chọn giá trị tối ưu Các giá trị tối ưu xác định dựa vào hàm lưọng polyphenol tổng cao giá trị ba biến khảo sát số trịn có khả thực nghiệm kiểm định Kết chọn hàm lưọng polyphenol tổng đạt cao 65,739 ± 1,979 mg/g vói giá trị tư vấn từ phần mềm tần số siêu âm mức phát sóng siêu âm liên tục (328 kHz), pH 6,67 thời gian 163 phút Hình Bề mặt đáp ứng polyphenol tổng theo tần số siêu âm giá trị pH phần mềm Design Expert Kết tối tru hóa hàm lượng flavonoid tổng từ %cv mơ hình 4,13 Như vậy, kết thực thực nghiệm vói 15 thí nghiệm thiết kế nghiệm phù họp với kết mơ hình tối ưu phần mềm Design Expert 13.0.5.0® (Bảng 4) Kết hóa hàm lượng flavonoid thống kê ANOVA cho yếu tố tố ưu hóa hàm lưọng flavonoid tổng trích ly từ hoa Đậu biếc phưong pháp BBD có giá trị pvalue mơ hình 0,0137 (có ý nghĩa mức 5%); không phù họp (Lack of Fit) 11,36 (không ý nghĩa) Hệ số R2 0,9607 Giá trị R2 dự đoán (0,8341) phù họp với R2 điều chỉnh (0,9351) với độ lệch 0,101 Tỷ lệ tín hiệu so với nhiễu 11,316, điều chứng tỏ tín hiệu đầy đủ để sử dụng dự đoán hàm lượng flavonoid Ngồi ra, hệ số 80 Phưong trình bậc hai dùng mơ hình để dự đốn hàm lượng flavonoid tổng trích ly từ hoa Đậu biếc là: Flavonoids = + 48,04 +l,05A + 3,70B + 3,77C + 2,13AB - 1.04AC + 0,8116BC + 1,89 A2 - 0,7779 - 3,69 c2 Trong đó: A tần số siêu âm, B nhiệt độ, c pH, D thời gian, E nồng độ ethanol, F tỷ lệ dung môi/nguyên liệu NỒNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIEN nông thôn - KỲ - THÁNG 5/2022 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ Bảng Bố trí thí nghiệm theo phương pháp BBD để tối ưu hóa hàm lượng flavonoid tổng trícl ly từ hoa Đậu biếc Cí : yếu tố Hàm lượng Nghiêm Ni ng độ flavonoid tổng Tỷ lệ thức ei lanol pH 10 11 12 13 14 15 7,0 6,0 7,0 5,0 6,0 6,0 6,0 7,0 5,0 5,0 5,0 6,0 6,0 6,0 7,0 (%) 60 60 60 70 50 50 60 50 60 50 60 70 70 50 70 (v/w) (mg/g) 0,5/1 1/1 2/1 1/1 0,5/1 2/1 1/1 1/1 0,5/1 1/1 2/1 2/1 0,5/1 1/1 1/1 45,23 ± 1,26 45,42 ± 0,56 51,31 ±0,33 48,23 ± 1,73 37,39 ± 0,89 42,12 ± 1,20 48,47 ± 1,02 42,48 ± 0,66 38,45 ±0,83 45,89 ±0,70 49,98 ± 1,46 51,30 ±2,04 43,49 ±0,70 45,23 ± 1,43 53,34 ± 0,85 Các yếu tố thí nghiệm tối ưu hóa hàm lượng flavonoid tổng có tương tác với cặp biểu đồ đáp ứng bề mặt phần mềm Design Expert 13.0.5.0® (Hình 3) Tuy nhiên, kết mơ hình đáp ứng bề mặt hàm lưọng flavonoid tổng chưa đạt điểm hội tụ cao, nghiên cứu tiếp tục chọn mà phần mềm Design Expert 13.0.5.0® tư vấn để chọn đưọc giá trị tối ưu Các giá trị tối ưu xác định dựa vào hàm lượng polyphenol tổng cao giá trị ba biến khảo sát số trịn có khả thực nghiệm kiểm định đưọc Kết chọn hàm lưọng flavonoid tổng đạt cao 55,097 ± 1,459 mg/g vói giá trị yếu tố pH 7,0, ethanol 68% tỷ lệ dung mòi/nguyên liệu 1,5 B: Ethanol (%) Hình Bề mặt đáp ứng flavonoid tổng theo tỷ lệ dung môi/nguyên liêu nồng độ ethanol phần mềm Design Expert Hiện nay, việc sử c ụng sóng siêu âm q xơi đỏ [10] Kết nghiên cứu xác định trình trích ly, thu nhận hợp chất, đặc biệt hàm lượng phenolic tổng trích ly tần số 20, họp chất có hoạt tính ỉinh học từ nguồn khác 490 986 kHz sau 30 phút trích ly 1628 ± quan tâm, tính chất thuận tiện, 30, 1097 ± 60 1228 ± 38 mg/1, khác biệt không ý nghĩa mức 95% Trong đó, hàm lưọng hiệu trích ly cao, (lung mơi tiêu thụ ít, dễ vận anthocyanin trích ly tần số 986 kHz lớn hàn 11, chi phí thấp ảnh hưởng đến môi trường khác biệt ý nghĩa so với hai tần số cịn lại; tần số 20 Són? siêu âm có tần số thấp lưọng cao, tần số siêu âm thường đưọc chọn để 490 kHZ khác biệt không ý nghĩa mức 95% Tần số trích ly họp chất hí ạt tính sinh học từ thực vật xử lý siêu âm 20 kHz hiệu để trích ly khoảng 20 - 45 kHz Trong đó, số nghiên họp chất hoạt tính sinh học; bên cạnh đó, nghiên cứu cứu đạt kết qu ỉ trích ly họp chất sinh xác định sử dụng tần số siêu âm 490 học tốt tần số siêu âm vừa phải [10, 12, 19] kHz với thời gian phù họp để trích ly họp chất hoạt Golmohamadi cs (2( 13) nghiên cứu sử dụng tính sinh học từ mâm xơi đỏ [10] Karabegovic sóng siêu âm tần số 20, 490 986 kHz để trích ly cs (2018) nghiên cứu sử dụng sống siêu âm tần họp chất phenolic tổng anthocyanin từ mâm số 42, 211, 1038 kHz để trích ly phenolic tổng NƠNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIÊN NÔNG THÔN - KỲ - THÁNG 5/2022 81 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ flavonoid tổng từ Sen đá (Sempervivum marmoreum L.) [12], Kết tần số 42, 211, 1038 kHz sau 150 phút trích ly thi hàm lượng phenolic tổng 84,6 ± 2,99, 65,2 ± 2,13 40,5 ± 0,72 mg/g; hàm lượng flavonoid tổng 18,8 ± 0,31, 17,9 ± 1,36, 12,7 ± 0,37 mg/g Nghiên cứu xác định mức tần số 42 kHz 211 kHz khác biệt không ý nghĩa thống kê mức 95% Nghiên cứu xác định bên cạnh việc sử dụng tần số siêu âm thấp để trích ly họp chất sinh học từ sen đá tần số siêu âm vừa phải (211 kHz) lựa chọn với thài gian trích ly 150 phút 3.4 Kiểm định thực tế mơ hình tối ưu hóa trích ly hàm lượng polyphenol tổng flavonoid tổng trích ly từ hoa Đậu biếc Theo mơ hình dự đốn thi hàm lượng polyphenol tổng đạt cao (65,739 ± 1,979 mg/g) với giá trị yếu tố tần số siêu âm mức phát sóng siêu âm liên tục (328 kHz), pH 6,67 thời gian 163 phút Kiểm định mơ hình thực tế hàm lượng polyphenol tổng thực theo quy trinh đề xuất với lần lặp lại (Bảng 5) Trong đó, hàm lượng polyphenol tổng xác định 64,42 ± 0,38 mg/g tưong đưong so với mơ hình dự đốn 65,739 ± 1,979 mg/g Do đó, kết đề xuất tối ưu hóa q trinh trích ly polyphenol tổng từ hoa đậu biếc mơ hình BBD hồn tồn phù họp đáng tin cậy Bảng Kiểm địrih mơ h mh thực tế trích ly polyphenol tổng f avonoic tổng từ hoa Đậu biếc Polyphenol tổng (mg/g) Flavonoid tổng (mg/g) Lặp lại Lặp lại Lặp lại Trung binh 64,32 64,09 64,84 64,42 ± 0,38 55,59 56,54 56,04 56,06 ± 0,48 Theo mơ hình dự đốn hàm lượng flavonoid tổng đạt cao (55,097 ± 1,459 mg/g) giá trị yếu tố pH 7,0, ethanol 68% tỷ lệ dung mơi/ngun liệu 1,5 Kiểm định mơ hình thực tế hàm lượng flavonoid tổng trích ly từ hoa Đậu biếc trinh bày bảng Trong đó, hàm lượng flavonoid tổng xác định 56,06 ± 0,48 mg/g cao hon so với mơ hình dự đốn KẾT LUẬN Sáu yếu tố thử nghiệm ban đầu sàng lọc chọn yếu tố có ảnh hưởng đến hàm 82 lượng polyphenol tổng (tần số siêu âm, giá trị pH, thời gian) hàm lượng flavonoid tổng (pH, nồng độ ethanol, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu) ma trận Plackett-Burman Kết bề mặt đáp ứng BoxBehnken hàm lượng polyphenol tổng theo đề xuất từ phần mềm Design Expert với giá trị yếu tố là: tần số siêu âm mức phát sóng siêu âm liên tục (328 kHz), pH 6,67 thời gian trích ly 163 phút Thực tế thí nghiệm thu hàm lượng polyphenol tổng xác định 64,42 ± 0,38 mg/g tưong đưong vói giá trị mơ hình ước tính Trong đó, bề mặt đáp ứng Box-Behnken hàm lượng flavonoid tổng với giá trị yếu tố là: pH 7,0, ethanol 68% tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 1,5 Thực tế thí nghiệm thu hàm lượng flavonoid tổng xác định 56,06 ± 0,48 mg/g cao hon giá trị mơ hình ước tính TÀI LIỆU THAM KHÀO Banik, R M., & Pandey, D K (2008) Optimizing conditions for oleanolic acid extraction from Lantana camara roots using response surface methodology Industrial crops and products, 27(3), 241-248 Bishoyi, A K, & Geetha, K A (2012) Polymorphism in flower colour and petal type in Aparajita (Clitoria tematea) Open Access Journal of Medicinal and Aromatic Plants, 3(2), 12 Boudraa, H., Kadri, N., Mouni, L., & Madani, K (2021) Microwave-assisted hydrodistillation of essential oil from fennel seeds: Optimization using Plackett-Burman design and response surface methodology Journal of Applied Research on Medicinal and Aromatic Plants, 23, 100307 https://doi.Org/10.1016/j.jarmap.2021.100307 Chang, c c., M H Yang, H M Wen and J c Chem (2002) Estimation of total flavonoid content in propolis by two complementary colorimetric methods Journal of food and drug analysis 10(3): 178-182 https://doi.org/10.38212/2224-6614.2748 Chen, F., Zhang, Q., Fei, s., Gu, H., & Yang, L (2017) Optimization of ultrasonic circulating extraction of samara oil from Acer saccharum using combination of Plackett-Burman design and BoxBehnken design Ultrasonics sonochemistry, 35, 161175 NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIÊN NÔNG THÔN - KỲ - THÁNG 5/2022 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ Chen, X Q„ lú, z H., Wang, z J., Liu, L L., Zhang, Y (2020) Ultrasound- Sun, T T., Ma, J z., (2018) Direct ultrasound-assisted extraction and characterization of phenolic compounds from fresh assisted extraction of total anthocyanins from Rubia houseleek sylvatica Nakai fruit and radical scavenging activity leaves Hemijska of the extract Industrial Crops and Products, 150, https://doi.org/10.2298/HEMIND170402017K 112420 (Sempervivum L.) marmoreum industrija, 72 13-21 (1), 13 Mohd, T„ Belwal, T., Bhatt, I D„ Pande, V., https://doi.Org/10.1016/j.mdcrop.2020.112420 & Nandi, s K (2018) Polyphenolics in leaves of Chong, F c., &: Gwee, X F (2015) Ultrasonic Paris polyphylla: An important high value Himalayan extraction of anthocyanin from Clitoria tematea surface medicinal herb Industrial Crops and Products, 117, 66-74 rr ethodology Natural product research, 29 (15), 14 Muangrat, R., Pongsirikul, I., & Blanco, p H flowers response using 1485-1487 (2018) hltps://doi.org/10.1080/14786419.2015.1027892 anthocyanins and total phenolic compounds from Ultrasound assisted extraction of Das, A B„ Goud, V V., & Das, c (2017) dried cob of purple waxy com using response Extraction of phenolic compounds and anthocyanin surface methodology Journal of Food Processing from black and purple rice bran (Oryza sativa L.) and using ultrasound: pf ytochemical A comparative profi ling Industrial Preservation, 42 (2), el3447 analysis and Crops and 14 Myers, R H., Khuri, A I., & Carter, w H 332-341 (1989) Response surface methodology: 1966-1988 Products, 95, htps://doi.org/10.1015/j.indcrop.2016.10.041 https://doi.org/10.llll/jfpp.13447 Technometrics, 31(2), 137-157 E., Ferreiro-Gonzalez, M., 15 Pan, G., Yu, G„ Zhu, c., & Qiao, J (2012) Carrera, c., Palma, M., Barroso, c G., & Barbero, G Optimization of ultrasound-assisted extraction (UAE) F (2017) Optimization of the ultrasound-assisted of flavonoids compounds (FC) from hawthorn seed Espada-Bellido exiraction of and anthocyanins total phenolic compounds in mulberry (Morus nigrẩ) pulp Food 23-32 chemistry, 219, htt?s://doi.org/10.1016/j.foodchem.20i6.09.122 Nứ.do, c (2013) Effect of ultrasound frequency on ant oxidant activity, total phenolic and anthocyanin puree Ultrasonics 1316-1323 httỊ »s://doi.org/10.1016 /j.ultsonch.2013.01.020 de Jesus, o N., de Oliveira, E J., David, J p., & David, J M (2017) Accelerated solvent extraction of exploiting a Box-Behnken design and quantification of five flavonoids by HPLC- DAD in Passiflora species Microchemical 28-35 Journal, 132, http ỉ://doi.org/10.1016/j.microc.2016.12.021 12 Karabegovic, I T., Stojicevic, s of optimum multifactorial 17 Terahara, N., Oda, M., Matsui, T, Osajima, Y., Saito, N., Toki, K., & Honda, T (1996) Five new anthocyanins, tematins A3, B4, B3, B2, and D2, from Clitoria tematea flowers Journal of natural products, 59(2), 139-144 https://doi.org/10.102 l/np960050a 11 Gomes, s V., Portugal, L A., dos Anjos, J p., phe lolic compounds 16 Plackett, R L., & Burman, J p (1946) The design experiments Biometrika, 33(4), 305-325 10 Golmohamadi, A., Moller, G., Powers, J., & cor tent of red spberry SOL ochemistry, 20(29, (HS) Ultrasonics Sonochemistry, 19 (3), 486-490 s., Velickovic, D T., Nikolic, N C., & Lazic, M L 18 Truong Văn Xạ, Nguyễn Trung Trực, Huỳnh Thị Phưong Thảo (2021) Anh hưởng sóng siêu âm lên hàm lưọng anthocyanins trích ly từ bắp cải tím (Brassica oleracea var capitate) rau dền đỏ (Amaranthus tricoloi) Tạp chí Nơng nghiệp PTNT, 3-4: 82-87 19 Yadav, R N s., & Agarwala, M (2011) Phytochemical analysis of some medicinal plants Journal ofphytology, 3(12) NỒNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIÊN NÔNG THÔN - KỲ - THÁNG 5/2022 83 KHOA HỌC CÒNG NGHỆ STUDY OPTIMIZATION OF TOTAL POLYPHENOL, TOTAL FLAVONOID FROM FLOWER Cỉitoria ternatea EXTRACT USING THE DESIGN OF PLACKETT-BURMAN MATRIX AND THE RESPONSE SURFACE METHODOLOGY BOX-BEHNKEN Truong Van Xa, Tran Kim Thoa Summary This study aims at identifying the optimal values of different factors directly influencing the total polyphenol and total flavonoid from flower Clitoria ternatea extract On the basis of multi-factor experiment, six factors were screened using a Plackett-Burman experimental design to determine the variables that significantly influence the extraction yield of total polyphenol and total flavonoid, namely ultrasound power, extraction temperature, pH value, extraction duration, ethanol concentration and liqui/solid ratio Results showed that the ultrasound power mixed-frequencies, pH value and extraction duration had the strongest influences on the total polyphenol For total flavonoid, pH value, ethanol concentration and liqui/solid ratio These three factors were subsequently optimized using the response surface methodology Box-Behnken Optimal values of the ultrasound power mixed-frequencies, pH 6.67 value and extraction duration 163 had the total polyphenol; pH 7.0 value, ethanol 68% and and liqui/solid ratio 1.5 had the total flavonoid These values formed a model which was tested; results total polyphenol and total flavonoid were 64.42 ± 0.38 mg/g and 56.06 ± 0.48 mg/g, respectively Keywords: Box-Behnken design, Clitoria tematea, flavonoids, Plackett-Brurman design, polyphenols Người phản biện: PGS.TS Lê Anh Đức Ngày nhận bài: 15/10/2021 Ngày thông qua phản biện: 15/11/2021 Ngày duyệt đăng: 22/11/2021 84 NỊNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIEN nơng thơn - KỲ - THÁNG 5/2022 ... lôi/nguyên liệu 3.3 Tối ưu hóa éác yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tổtìg flavonoid tổng trích ly từ hoa Đậu biếc phương pháp đáp ứng bề mặt E ox -Behnken design (BBD) Dựa vào kết phân tích... xuất tối ưu hóa q trinh trích ly polyphenol tổng từ hoa đậu biếc mơ hình BBD hoàn toàn phù họp đáng tin cậy Bảng Kiểm địrih mơ h mh thực tế trích ly polyphenol tổng f avonoic tổng từ hoa Đậu biếc. .. 76 2.2.2 Thiết k? ?ma trận PBD phương pháp đáp ứngbềmặtBBD Để xác định yếu tố mức độ ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng polyphenol tổng flavonoid tổng trích ly từ hoa Đậu biếc ma trận PBD thiết kế