KHẢO SÁT THÀNH PHẢN HOÁ HỌC CỦA CÂY KHÓ QUA (Momordica charantia 1) VÀ HOẠT TỈNH KHÁNG ĐÁI THÁO

LỜI CẢM ƠN Luận văn thực phịng Hóa Hợp Chất Thiên Nhiên – Viện Cơng Nghệ Hóa Học – Viện Khoa học Cơng Nghệ Việt Nam, năm 2009 Với lòng trân trọng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn đến: Ban Giám hiệu trường Đại Học Tôn Đức Thắng, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học Ứng dụng Bộ Môn Công nghệ sinh học, tất quý thầy cô giáo trang bị cho kiến thức tảng vững suốt thời gian học trường, niên khóa 2005-2010 ThS Phùng Văn Trung, anh truyền đạt cho kiến thức chuyên môn nhiều kinh nghiệm nghiên cứu quí báu suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp PGS-TS Nguyễn Ngọc Hạnh, cô động viên tạo nhiều điều kiện để tơi hồn thành tốt luận văn ThS Phan Nhật Minh, anh nhiệt tình hướng dẫn động viên tơi suốt thời gian nghiên cứu Các anh chị bạn thực đề tài luận văn phòng Hoá Hợp Chất Thiên Nhiên, năm 2009 giúp đỡ tơi suốt q trình học tập Cuối tơi cảm ơn người thân gia đình giúp đỡ, động viên, tạo điều kiện từ vật chất đến tinh thần cho học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn TP.Hồ Chí Minh, tháng 01, năm 2010 Sinh viên thực Vy Thị Thanh Nhân i TÓM TẮT Đề tài: “KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CÂY KHỔ QUA (Momordica charantia L.) VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG ĐÁI THÁO ĐƯỜNG” Đề tài thực từ tháng 09/2009 đến 12/2009, Phòng Hợp Chất Thiên Nhiên - Viện Cơng Nghệ Hố Học Qua q trình chiết tách lập, chúng tơi có kết sau: • Định danh hợp chất tinh khiết: 3β,7β,25-trihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al • Định tính phần lớn nhóm hợp chất: Flavonoid, sterol, tanin, alkaloid, saponin, đường khử, glycoside có dây khổ qua • Khảo sát hoạt tính kháng đái tháo đường chất phân lập với số IC50=36 μg/l ii MỤC LỤC TRANG Trang tựa Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt .viii Danh mục bảng x Danh mục hình xi Danh mục sơ đồ, đồ thị xii CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC ĐÍCH CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY KHỔ QUA 2.1.1 Mô tả 2.1.2 Phân bố sinh thái 2.1.3 Y học dân gian khổ qua 2.1.3.1 Rễ 2.1.3.2 Thân 2.1.3.3 Lá 2.1.3.4 Hoa 2.1.3.5 Trái 2.1.3.6 Hạt iii 2.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ KHỔ QUA 2.2.1 Các cơng trình nghiên cứu nước 2.2.1.1 Thành phần hóa học 2.2.1.2 Tác dụng dược lý 2.2.2 Các cơng trình nghiên cứu giới 2.2.2.1 Thành phần hóa học 2.2.2.2 Một số Triterpene glucoside phân lập từ khổ qua 10 2.2.2.3 Một số Steroid phân lập từ khổ qua 20 2.2.2.4 Tác dụng dược lý 21 2.3 SƠ LƯỢC VỀ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG 22 2.3.1 Tình hình bệnh đái tháo đường giới Việt Nam 22 2.3.2 Bệnh đái tháo đường 23 2.3.2.1 Khái niệm 23 2.3.2.2 Phân loại 23 2.3.2.3 Nguyên nhân 24 2.3.3 Hóa dược trị đái tháo đường 24 2.3.3.1 Ức chế α-glucosidase 24 2.3.3.2 Nhóm Sulfonylurea 25 2.3.3.3 Nhóm Meglitinide 25 2.3.3.4 Nhóm Biguanide 26 2.3.3.5 Nhóm Thiazolidinedione (TZD) 26 2.3.3.6 Insulin 26 2.4 PHƯƠNG PHÁP ỨC CHẾ MEN α-GLUCOSIDASE 26 2.4.1 Men α-glucosidase 2.4.2 Vai trò α-glucosidase trình hình thành glucose 27 iv CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 28 3.1.1 Thời gian 28 3.1.2 Địa điểm 28 3.2 THIẾT BỊ VÀ HOÁ CHẤT 28 3.2.1 Thiết bị 28 3.2.2 Hóa chất 28 3.3 NGUYÊN LIỆU 29 3.4 ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG TRÁI KHỔ QUA 29 3.4.1 Khảo sát diện hợp chất alkaloid 29 3.4.1.1 Thuốc thử alkaloid 29 3.4.1.2 Định tính alkaloid 30 3.4.2 Khảo sát diện hợp chất flavonoid 30 3.4.2.1 Thuốc thử flavonoid 30 3.4.2.2 Định tính flavonoid 30 3.4.3 Khảo sát diện hợp chất sterol 30 3.4.3.1 Thuốc thử sterol 30 3.4.3.2 Định tính sterol 31 3.4.4 Khảo sát diện hợp chất saponin 31 3.4.4.1 Thuốc thử saponin 31 3.4.4.2 Định tính saponin 32 3.4.5 Khảo sát diện hợp chất đường khử 33 3.4.6 Khảo sát diện hợp chất tanin 33 3.4.6.1 Thuốc thử tanin 33 3.4.6.2 Định tính tanin 33 v 3.4.7 Khảo sát diện hợp chất glycoside 33 3.4.7.1 Thuốc thử glycoside 33 3.4.7.2 Định tính glycoside 34 3.5 CHIẾT XUẤT, CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ 34 3.5.1 Chiết xuất 34 3.5.2 Cô lập tinh chế 35 3.5.2.1 Các phương pháp sắc ký sử dụng 35 3.5.2.2 Sắc ký cột thường cao Chloroform (T3) 37 3.6 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ MEN α-GLUCOSIDASE 37 3.6.1 Hóa chất – Thiết bị 37 3.6.1.1 Hóa chất 37 3.6.1.2 Thiết bị 38 3.6.2 Phương pháp ngiên cứu hoạt tính ức chế men α-Glucosidase 38 3.6.2.1 Nguyên tắc 38 3.6.2.2 Phương pháp tiến hành 39 3.6.2.3 Chuẩn bị mẫu thử 39 3.6.3 Xây dựng đường chuấn PNP 40 3.6.4 Tính phần trăm ức chế số IC50 40 3.6.4.1 Tính phần trăm ức chế 40 3.6.4.2 Chỉ số IC50 41 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 42 4.1 KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG DÂY LÁ KHỔ QUA 42 4.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TRƯNG VẬT LÝ, KHẢO SÁT VÀ NHẬN DANH CÁC CHẤT 44 vi 4.2.1 Kết sắc ký cột thường cao T3 44 4.2.2 Chất MCD1 46 4.2.2.1 Nhận danh cấu trúc hóa học MCD1 46 4.2.2.2 Công thức cấu tạo MCD1 47 4.3 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ MEN α-GLUCOSIDASE 54 4.3.1 Kết xây dựng đường chuẩn cho PNP 54 4.3.2 Kết khảo sát hoạt tính ức chế men α-glucosidase MCD1 55 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 5.1 CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẠT ĐƯỢC 57 5.2 KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHU LỤC vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Atb : Độ hấp thu trung bình B.W : Body Weight (trọng lượng thể) CHCl3 : Chloroform COSY : Correlation Spectroscopy (phổ tương quan H H) d : Doublet (mũi đôi) dd : Doublet of doublet (NMR) đđ : Đậm đặc DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO : Dimethyl sulfoxide EP : Ether petrol EtOAc : Ethyl acetate EtOH : Ethanol Glc : Glucose HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation (phổ tương quan nhiều nối H C) HSQC : Heteronuclear Single Quantum Correlation (phổ tương quan nối H C) IC50 : 50% Inhibition Concentration (ức chế nồng độ 50%) J : Coupling constant (hằng số ghép) m : Multiplet (mũi đa) MeOH : Methanol mp : Melting point (điểm chảy) NMR : Nuclear Magnetic Resonance (cộng hưởng từ hạt nhân) viii PNP : p-nitrophenol PNP-Glc : p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside ppm : Parts per million Rf : Retention factor (yếu tố chậm trễ) s : Singlet (mũi đơn) t : Triplet (mũi ba) TLC : Thin Layer Chromatography (sắc ký lớp mỏng) TZD : Thiazolidinedione UV : Ultra Violet α-Glc : α-glucosidase δ : Chemical shift (độ dịch chuyển hóa học) MCD1 : Tên chất tinh khiết ix DANH MỤC CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1: Công thức mẫu thử hoạt tính 40 Bảng 4.1: Kết định tính hợp chất hữu dây khổ qua 42 Bảng 4.2: Kết sắc ký cột thường cao Chloroform (T3) .44 Bảng 4.3: Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR; DEPT HMBC MCD1 47 Bảng 4.4: Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR; COSY HSQC MCD1 49 Bảng 4.5: Dữ liệu phổ 13C-NMR DEPT MCD1 .50 Bảng 4.6: So sánh liệu phổ 13C-NMR MCD1với tài liệu tham khảo .52 Bảng 4.7: Kết độ hấp thu A, Atb % ức chế PNP chuẩn theo nồng độ 54 Bảng 4.8: Kết độ hấp thu A, Atb % ức chế MCD1 theo nồng độ .55 x ` Phụ lục 2b: Phổ 13C-NMR MCD1 ` Phụ lục 2c: Phổ 13C-NMR MCD1 ` Phụ lục 3a: Phổ COSY MCD1 ` Phụ lục 3b: Phổ COSY MCD1 ` Phụ lục 3c: Phổ COSY MCD1 ` Phụ lục 3d: Phổ COSY MCD1 ` Phụ lục 4a: Phổ DEPT90, DEPT135 MCD! ` Phụ lục 5a: Phổ HMBC MCD1 ` Phụ lục 5b: Phổ HMBC MCD1 ` Phụ lục 5c: Phổ HMBC MCD1 ` Phụ lục 5d: Phổ HMBC MCD1 ` Phụ lục 5e: Phổ HMBC MCD1 ` Phụ lục 6a: Phổ HSQC MCD1 ` Phụ lục 6b: Phổ HSQC HSQc ` Phụ lục 6c: Phổ HSQC MCD1 ... = -1 8.5o (C=1.0; pyrydine) - Là 28-O-β-D-xylopyranosyl( 1-3 )-? ?–D-xylopyranosyl( 1-4 )-? ?-Lrhamnopyranosyl( 1-2 )-[ α-L-rhamnopyranosul( 1-3 ) ]-? ?-D-fucopyranosyl gypsogenin- 3-O- β-D-galactopyranosyl( 1-2 )-. .. β-sitosterol-3-O-β-glucoside; 3-O-[β-D-glucosyl]-stigmasta-5,25(27)-diene • 3-O-[6’-O-palmitoyl-β-D-glucosyl]-stigmasta-5,25(27)-diene; 3-O-[6’-O-stearoyl-β-D-glucosyl]-stigmasta-5,25(27)-diene ` − Sterol: Elasterol;... I[38] - Dạng bột, màu trắng, [α]24D = -1 3.5o (C=0.5; pyridine) - Là 28-O-β-D-xylopyranosyl ( 1-4 )- α-L-rhamnopyranosyl( 1-2 )-[ α-Lrhamnopyranosyl ( 1-3 )- β-D-fucopyranosyl gypsogenin 3-O- β-Dgalactopyranosyl